PT88166B - Processo para a obtencao de poliosideos capsulares de stafilococos - Google Patents

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Description

O presente invento tem por objecti vo um processo para a ovtenção de poliosídeos capsulares carac teristicos de Staphylococcus aureus, caracterizado por, se obter estes poliosídeos^ se utilizarem cepas de estafi1ococos coagulase negativa.
Os poliosídeos capsulares obtidos podem ser utilizados para a preparação de vacinas contra Staphylococcus aureus e de produtos de diagnóstico.
INSTITUT PASTEUR
PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE POLIOSÍDEOS CAPSULARES DE ESTAFI LOCOCOS presente invento diz respeito a um processo para a obtenção de poliosídeos capsulares de estafi1ococos e mais particularmente a um processo para a obtenção de poliosídeos capsulares característicos de Staphylococcus aureus.
S, aureus produz um número muito grande de antigenes extra- e intra-celu1 ares, entre os quais numerosas toxinas e enzimas. Conhece-se bem a implicação de_s tas metabolites nas intoxicações alimentares ou na constituj_ ção de abcessos. No entanto, não pôde ser estabelecido qualquer correlação entre a presença destes antigéneos e as propriedades invasivas de S. aureus, isto é, a sua capacidade para desencadear uma septicémia.
Os poliosídeos capsulares são fac tores de patogenicidade bem conhecidos pelas bactérias como Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Nei sseri a meningitidis. E por esta razão que se têm realizado numerosas tentativas de isolamento de cepas de estafilococos capsu lados. Algumas cepas capsulares foram descritas na literatura da especialidade (cepas Smith, M e T). No entanto, o facto de as cepas de S. aureus isolados nos doentes apareceram desprovidas de cápsulas no exame de colónias em gelose ou no exame microscópico dos germes, levou a maioria dos autores a concluir que esta bactéria não é habitualmente capsulada.
No entanto, em publicações surgidas depois de 1970, Walter W. Karakawa demonstrou, por um lado, a existência de poliosídeos capsulares em vários isolamentos clínicos de estafilococos e, por outro lado, que os antigénes capsulares protegiam a bactéria da fagocitose pelas po1inuc1eares. Em 1980, Walter Karakawa e Willie Vann (Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus, págs. 285-293.In J.B. Robbins, J.C. Hill e J. C. Sadoff (ed.). Se minars in infectios disease. vol, 4. Bacterial vaccines.
-3Thieme Stratton. Inc. New York) demonstraram por critérios essencialmente imunológicos, a existência de pelo menos 8 tipos capsulares de S. aureus.
A purificação e a caracterização bioquímica e imunológica do poliosídeo capsular de tipo 8 foram realizadas em 1984 (d.M. Fournier et al, Infect. Immun. 45 : 87-93) e um método de tipificação capsular de S. aureus foi descrito em 1985 (W.W. Karakawa et al. J. Clin. Microbiol. 22 : 445-447).
Estudos epidemiológicos realizados em grande número de cepas S. aureus isolados em doentes mostraram que 70 a 80% destas cepas possuiam um ou outros dos poliosídeos capsulados 5 e 8 (por exemplo R.D. Arbeit et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2 : 85-91. 1984).
Foram preparados anti-corpos nonoclonais específicos dos poliosídeos capsulares 5 e 8 (Η. K. Hochkeppel et al. J. Clin. Microbiol. 25 : 526-530. 1987, e M.J. Nelles et al. Infect. Immun. 49 : 14-18. 1985).
A par do Staphy1ococcus aureus, que ê um estafilococo coagulase positiva, isto ê, que produz uma coagulase livre (ver Bergey's Manual), conhece-se numerosas espécies de estafilococos que são estafi1ococos coagulase negativa, isto é, não produzem coagulase livre. Estas espécies coagulase negativa foram classificadas por KLOOS e SCHLEIFER; (Int. J. Bacteriol: 25, págs. 50-61; págs. 62-79).
Entre estas espécies coagulase negativa, pode-se citar:
Staphy1ococcus simulans Staphylococcus xylosus
Staphylococcus cohnii
Staphy1ococcus saprophiticus
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus warneri
Staphylococcus hominis
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus capitis
Estes estafilococos coagulase negativa são habitualmente não patogénicos para o homem e para o animal. Não se identificou qualquer poliosídeo capsular idêntico aos descritos nos S. aureus nas cepas de estafilococos coagulase negativa. Pelo contrário, M.J. Nelles et al (já citado) revelaram que 3 cepas de S. epidermidis não produzem poliosídeo capsular de tipo 5 ou de tipo 8).
No entanto a requerente descobriu que determinadas cepas de estafilococos coagulase negativa produzem poliosídeos capsulares idênticos aos de Staphylococcus aureus e geralmente em quantidades mais importantes que Staphylococcus aureus. A frequência de tais cepas é de cerca de 2% no homem.
Consequentemente, o presente inve£ to tem por objecto um processo para a obtenção de poliosídeos capsulares característicos de Staphylococcus aureus, caracterizado por, para se obter estes poliosídeos capsulares, se utilizar cepas de estafi1ococos coagulase negativa.
Mais particularmente, o invento tem por objecto um processo caracterizado por:
a - se seleccionar entre as cepas de estafilococos coagulase negativa uma cepa produtora de um poliosídeo capsular característico de Staphylococcus aureus.
-5b - se cultivar a cepa seleccionada c - se extrair o poliosídeo capsular e d - se purificar o poliosídeo capsular.
presente invento tem igualmente por objecto as aplicações destes poliosídeos, nomeadamente de vacina contra Staphylococcus aureus e de produtos de diagnóstico, bem como cepas isoladas e seleccionadas produtoras de poliosídeos capsulares característicos de Staphylococcus aureus.
A seleccão de uma cepa produtora de um poliosídeo capsular característico de Staphylococcus aureus . pode ser facilmente realizada
- quer a partir de bactérias intactas, por aglui tinação de uma suspensão bacteriana por meio de anticorpos específicos dos poliosídeos capsulares de Staphylococcus aureus , nomeadamente de anticorpos monoclonais, tais como os já descritos, utilizados em solução ou previamente fixos por exemplo sobre um suporte, tal como partículas de latex,
- quer por detecção de poliosídeo capsular em extractos bacterianos obtidos, por exemplo,
- por lavagem das bactérias ou - apõs lise bacteriana, obtida por autoclavagem ou por utilização de uma enzima específica do estafi1ococo, tal como a lisostafina.
a·.
poliosídeo capsular pode ser posto em evidência nestes extractos bacterianos por métodos imunológicos ou por métodos físico-químicos.
Entre os métodos imunológicos pode
-se citar
-6a - a imunoprecipitação em gel de agarose (dupla difusão)
- imunoelectroforese em fuso (ver em especial J.M. Fournier et al e Hochkeppel et al, já citados).
anticorpo específico do poliosídeo capsular está incluído num gel de agarose equilibrado numa solução tampão com pH de 8,6 (pH ao qual o anticorpo não migra). 0 extracto bacteriano é depositado num poço cavado no gel depois sujeito à acção de um campo electrico que faz migrar o poliosídeo capsular eventualmente presente no extrac to. A medida que se dá a sua migração, o poliosídeo capsular combina-se com o anticorpo e forma um precipitado cuja frente se desloca até que não haja mais poliosídeo capsular livre. Após secagem, fixação e coloração do gel, a medida da altura da flecha observada permite determinar a quantidade de poliosídeo capsular presente no extracto bacteriano.
- as reacções imunoenzimáticas de tipo ELISA.
Entre os métodos fisico-químicos, pode-se citar os métodos que evidenciam a presença de um ou vários constituintes do poliosídeo capsular:
- cromatografia em fase gasosa,
- cromatografia líquida sob alta pressão
- cromatografia de permuta de iões -fiItração sobre gel
- cromatografia de afinidade
- dosagens químicas de açúcares aminados.
A partir das capas se 1eccionadas , obtem-se o poliosídeo capsular em três etapas:
cultura de bactérias
- extracção do poliosídeo capsular,
- purificação do poliosídeo capsular
1) Cultura das bactérias:
Como meio de cultura, pode-se utilizar nomeadamente o meio Columbia (Difco), líquido ou sólido (melhor produção de poliosídeo capsular por bactérias cultivadas em meio sólido), com um período de duração de cultura de uma noite a 379C, por exemplo.
2) Extracção do poliosídeo capsular:
Podem utilizar-se dois processos:
- autoc1 a vagem,
- lise das bactérias pela lisostafina.
a) Extracção por autoc1 a vagem :
As bactérias cultivadas em meio sólido são postas em suspensão em água fisiológica tamponada (AFT) (5 ml para uma caixa de Petri de 9 cm de diâmetro) a seguir autoclavados durante uma hora a 121QC. Após centrifugação de 20 minutos a 25 000 g, o sobrenadante é recolhido e o resíduo é extraído de novo nas mesmas condições. Após centrifugação de 20 minutos a 25 000 g, os dois sobrenadantes são reagrupados, dializados em água destilada e 1iofi1izados. Obtem-se assim um extracto bruto (EB).
Para 100 caixas de Petri obtem-se aproximadamente 10 g de resíduo bacteriano húmido e 2g de EB.
As bactérias cultivadas em meio líquido são mortas por adição de fenol e de êtanol (1,5%, 24h
-8à temperatura do laboratório), e depois recuperadas por centrifugação de 20 minutos a 25000 g ou ultra filtração, por exemplo, num filtro Durapore de tipo HV 0,45 micrómetros de Millipore. 0 resíduo bacteriano é reposto em suspensão na AFT (0,1 g de resíduo húmido/ml de AFT), a seguir extraído por autoclavagem nas condições anteriormente descritas.
b) Extracção pela lisostafina:
residuo bacteriano é posto em suspensão na AFT (0,5 g/ml ) contendo 25 mg de lisostafina por litro. A suspensão é agitada durante uma noite a 379C, depois centrifugada durante 20 minutos a 25000 g. 0 sobrenadante é dializado em água destilada e a seguir liofilizado.
3) Purificação do poliosídeo capsular:
Um método preferido de purificação ê o seguinte:
a) Tratamento enzimatico de EB:
EB é retomado em AFT (10 mg/ml), e tratado pela DNase e RNase (0,1 mg/ml, 6 h a 379C) e a seguir pela proteasa (1 mg/ml, uma noite a 37QC). 0 produto é a seguir dializado em água destilada e liofilizado. Dois gramas de EB dão aproximadamente 0,7 g de extracto tratado com enzimas (ETE). Este tratamento permite eliminar a maior parte das proteínas e dos ácidos nucleicos.
b) Cromatografia de permuta de iões:
ETE é retomado numa solução tampão acetato de sódio (0,05 M, pH6) contendo cloreto de sódio (0,1 M), sendo a seguir passado por um permutor de iões e por exemplo DEAE-celulose)ajustado pela mesma solução tampão. A maior parte das proteínas contidas no ETE não são absorvidas
-9no permutador de iões e são então eliminadas por uma lavagem do permutador de iões com a solução tampão de ajustamento.
No entanto, o poliosídeo capsular, o ãcido teicóico e os ácidos nucleicos permanecem fixos no permutador de iões.
poliosídeo capsular ê eluido fazendo-se passar pelo permutador de iões uma solução tampão contendo uma concentração mais elevada de cloreto de sódio.
A título de exemplo, o poliosídeo capsular de tipo 5 é eluído com uma solução tampão acetato de sódio (0,05 M, pH 6) contendo cloreto de sódio na concentração de 0,15 M. Para eluir o poliosídeo capsular de tipo 8, a concentração de cloreto de sódio deve ser de 0,18 M. Os eluidos são recolhidos num colector de fracções, e as fracções que contêm poliosídeo capsular (detectado por uma reacção imunológica utilizando-se anticorpos específicos) são reagrupadas, dializadas em ãgua destilada e depois 1iofi1izadas.
Obtem-se aproximadamente 20 mg de extracto purificado no permutador de iões (EPI) a partir de 0,7 g de ETE. Esta cromatografia de permuta de iões permite eliminar a maior parte das proteínas, dos ácidos nucleicos e do ácido teicóico.
c) Filtração em gel :
EPI é reconstituído numa solução de cloreto de sódio (0,2 M) e filtrada num gel de Sepharose 4B-CL. As fracções contendo poliosídeo capsular, detectado por reacção imunológica, são reagrupadas, dializadas em água destilada e liofilizada.
produto liofilizado constitui o poliosídeo capsular purificado.
poliosídeo capsular é contaminado por menos de 1% de proteínas, menos de 0,5% de ácidos nu-10cleicos e menos de 0,05% de ácido teicóico. A partir de 20 mg de EPI, obtem-se aproximadamente 10 mg de poliosídeo capsular purificado. Finalmente, a partir de 10 g de resíduo bacteriano húmido recolhido em 100 caixas de Petri, obtem-se aproximadamente 10 mg de poliosídeo capsular purificado.
A título de exemplo, isolaram-se as seguintes cepas de estafi1ococos coagulase negativa que produzem poliosídeo capsular idêntico ao do Staphylococcus aureus.
Para a selecção das cepas produto,-ras de poliosídeo capsulares caracter i st icos de Staphylococcus aureus, põs-se em contacto com a suspensão bacteriana, uma quantidade de anticorpos específicos destes poliosídeos capsulares. A detecção dos poliosídeos capsulares obtidos após lise bacteriana foi feita por imunoelectroforese em fuso (técnica descrita por J.M. FOURNIER já citado) ou por Elisa.
Cada cepa altamente produtora de poliosídeos capsulares foi caracterizado por estas duas técnicas.
Número da cepa 850206 860638 850071 850279
Número do depósito na CNCM 1-685 1-682 1-684 1-683
Morfologia Cocei gram positivo Cocei gram pos i ti vo Cocc i gram pos i ti vo Cocei gram positivo
Cata 1 ase + + + +
.-Fermentação da glucose em meio MEVAG + + + +
DNAse - - - -
Coagu1 ase - - - -
T i po capsu1 ar 5 5 8 8
Estas cepas apresentam as seguintes características de identificação bioquímica pelo sistema Api Staph.
Número da cepa 850206 860638 850071 850279
D-g1ucose + + + +
D-fructose + + + +
D-Manose + + + +
Ma 1 tose + + + +
Lactose - + + +
D-Trehalose + + + +
D-Man itol - - -
X i1i tom - - - -
D-Mé1i b i ose - - - -
Nitrato de potáss i o + - + +
-;-naf t i 1 fosfato - - - -
piruvato de sódio + - + -
Raf i nose - - - -
Xi lose - - - -
Sacarose + + + +
cx-met i 1 - D- g 1 icos í deo - - - -
N-acet i 1 - -gl icosamina + + + +
Arg i n i na + - - -
Ureia - + - -
Staphy1 o- Staphy1 o- Staphylo- Staphylo-
coccus coccus coccus coccus
Espêc i e haemoly- hom i n i s hom i n i s hom i n i s
t i cus
1 2 2 2
''VjísS
Segundo a classificação de Kloos e Schleifer
antibiograma destas cepas é o seguinte:
Número de cepa 850206 860638 850071 850279
Penicilina G R S S R
Jjxac i 1 i na R S S S
Tobramicina R S S S
Gentam i c i na R S S S
Tetrac ic1ina R S S R
Eritromicina R R S S
C1i ndam i c i na S S S s
Pristinamicina S S S s
Trimetoprima + Su lfam ida R s S s
Rifampicina S s S s
Acido fusídico R S s s
Vancomicina S s s s
R = resistente
S = sensível
A título de exemplo, a utilização do processo de obtenção dos poliosídeos capsulares extraídos 9 por autoclavagem de 10 bactérias permitiu obter as quantidades indicadas no Quadro seguinte. Estes valores são apenas indicativos, porque a produção de poliosídeo capsular ê bastante variável de uma cultura para outra.
Número da cepa Espéc i e T i po Capsu 1 ar
Produção de poliosídeo capsular (mi crogramas)
850206 S. haemolyticos 1 5 30
860638 S. hominis 2 5 4
850071 S. hominis 2 8 20
850279 S. hominis 2 8 5
Os poliosídeos capsulares obtidos a partir de cepas de estafilococos coagulase negativa podem ser utilizados para:
a) a preparação de vacinas contra Staphy1ococcus aureus. para uso humano ou veterinário para - uma protecção individual ou - da obtenção de soros imunes utilizáveis para a preparação de anticorpos anti-poliosídeo capsular podendo ser utilizados em imunoterapia passiva ou para o diagnóstico por técnicas de aglutinação, ELISA, RIA ou Western blot de acordo com os métodos conhecidos do perito na técnica de espec ia 1 idade ;
b) a preparação de produtos de diagnóstico para um diagnóstico no homem, no animal ou em produtos agro-alimenta res e nomeadamente para:
- a detecção nos produtos biológicos de anticorpos específicos do poliosídeo capsular, ou - a detecção de polio sídeo capsular nos isolamentos clínicos de estafi lococos coa gulase positiva ou coagulase negativa.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇOES:
    1?. - Processo para a obtenção de poliosídeos capsulares caracteristicos de Staphylococcus aureus, caracterizados por, para se obter estes poliosídeos capsulares, se utilizarem cepas de estafi1ococos coagulase negat i va.
  2. 2-. - Processo de reivindicação 1, caracterizado por:
    acordo com a a- se seleccionar entre as cepas de estafilococos coagulase negativa, uma cepa produtora de um poliosídeo capsular caracteristico de Staphylococcus aureus.
    b- se cultivar a cepa seleccionada c- se extrair o poliosídeo capsular e d- se purificar o poliosídeo capsular.
  3. 3?. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se seleccionar uma cepa de estafilococo coagulase negativa produtora dum poliosídeo capsular caracteristico de Sthaphylococcus aureus por reacção de aglutinação ao meio de anticorpos específicos dos poliosídeos capsulares de Staphylococcus áureos.
  4. 44 5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se seleccionar uma cepa de estafilococo coagulase negativa produtora dum poliosídeo capsular caracteristico de Sthaphylococcus áureos por detec-18ção do poliosídeo capsular num extracto bacteriano de cepa.
  5. 59. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o extracto bacteriano ser um extracto obtido por lavagem das bactérias.
  6. 63. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o extracto bacteriano ser um extracto obtido após lise bacteriana.
  7. 7- . - Processo de acordo com quaj_ quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se extrair o poliosídeo capsular após autoc1avagem.
  8. 8- . - Processo de acordo com quaj_ quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se extrair o poliosídeo capsular após lise das bactérias por um agente de lise.
  9. 9?. - Processo de acordo com qua£ quer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se purificar o poliosídeo capsular extraído por tratamento enzimátj_ co seguido de uma cromatografia de permuta de iões e de uma fiItração sobre gel.
  10. 10-. - Processo de acordo com quaj_ quer uma das reivindicações 1 a 9. caracterizado por se utilizar uma cepa de estafilococo coagulase negativa depositada na CNCM com os números 1-682. 1-683, 1-684 ou 1-685.
  11. 11a. - Poliosídeo capsular caracterizado por ser obtido por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
  12. 12s. - Processo para a preparação de um produto de diagnóstico caracterizado por se utilizar um poliosídeo preparado de acordo com as reivindicações anteriores, para detecção dos estafilococos coagulase positiva ou negativa.
  13. 13 a. - cepas purificadas de estafilococo coagulase negativa, caracterizadas por serem produtoras de poliosídeo capsular caracteristico de Staphylococcus aureus.
  14. 14a. - Cepas de acordo com a reivindicação 13, caracterizadas por estarem depositadas na CNCM com os números 1-682, 1-683, 1-684 e 1-685.
  15. 15a. - Método para a utilização das cepas de acordo com a reivindicação 13 ou da reivindica-20cão 14 caracterizado por se obter poliosídeos capsulares ca racteristicos de Staphylococcus aureus.
    Lisboa, 1 de Agosto de 1988
PT88166A 1987-08-03 1988-08-01 Processo para a obtencao de poliosideos capsulares de stafilococos PT88166B (pt)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8711006A FR2619122B1 (fr) 1987-08-03 1987-08-03 Procede d'obtention de polyosides capsulaires de staphylocoques, polyosides obtenus, applications de ces polyosides et souches pour la mise en oeuvre du procede

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