CZ20003470A3 - Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití - Google Patents

Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití Download PDF

Info

Publication number
CZ20003470A3
CZ20003470A3 CZ20003470A CZ20003470A CZ20003470A3 CZ 20003470 A3 CZ20003470 A3 CZ 20003470A3 CZ 20003470 A CZ20003470 A CZ 20003470A CZ 20003470 A CZ20003470 A CZ 20003470A CZ 20003470 A3 CZ20003470 A3 CZ 20003470A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gly
ala
asp
gene
bacterium
Prior art date
Application number
CZ20003470A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301520B6 (cs
Inventor
Steven Neville Chatfield
Original Assignee
Peptide Therapeutics Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peptide Therapeutics Limited filed Critical Peptide Therapeutics Limited
Publication of CZ20003470A3 publication Critical patent/CZ20003470A3/cs
Publication of CZ301520B6 publication Critical patent/CZ301520B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití
Oblast techniky
Vynález se týká zeslabených bakterií užitečných ve vakcinách, zvláště k ochraně proti enterotoxigennínu E. coli CETEC) způsobujícímu průjmově onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Principem vakcinace je vyvolat imunitní odezvu v hostiteli a tím zajistit ochranu proti následnému napadení patogenem. Toho se dá dosáhnout očkováním živým zeslabeným kmenem patogenu, tedy kmenem majícím sníženou virulenci, takže nevyvolá chorobu způsobovanou virulentním patogenem.
Klasicky se selektovaly zeslabené vakcinové kmeny bakterií a virů jedním ze dvou rozdílných způsobů. Vytvořily se mutanty buď zpracováním organismu mutagenními chemickými sloučeninami nebo opakovanou pasáží organismu in vitro. Použití obou způsobů však vede k zeslabeným kmenům, ve kterých je způsob zeslabení nejasný. Tyto kmeny se obzvlášt obtížně charakterizují z hlediska možného přechodu na kmen standardního typu, jelikož zeslabení může vyvolat jednotlivé Csnadno reversibilni) nebo mnohonásobné mutační děje. Kromě toho je obtížné získat kmeny mající optimální imunogenní vlastnosti vzhledem k mnohonásobným mutačním dějům a může být nutno použít více kmenů k zajištění ochrany proti patogenu.
Pomocí moderních genetických technik je nyní možno konstruovat geneticky definované zeslabené bakteriální kmeny, ve kterých mohou být vytvořeny stabilní zeslabující delece. Touto technologií byla vytvořena řada místně zaměřených mutantů salmonely ¢2, 4, 5, 9, 12, 16, 17, 18). Byly popsány mutace čet2 ných genů, včetně aro genů (například aroA, aroC, aroD a aroE), pur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp a phoP.
Nyní byly dobře charakterizovány mutanty salmonely aroA a ukázalo se, že jsou výtečnými živými vakcinami proti salmonelóze v případě četných druhů živočichů. Kromě toho, ke snížení možnosti reverze na virulenci rekonbinačními ději, byly mutace začleněny do dvou nezávislých genů, jako je aroA/purA a aroA/aroC. Identické mutací ve kmenech salmonely přizpůsobených hostiteli, jako je S. typhi (lidí) a S. dublin (koček) vedly také k vytvoření řady kandidátů jednodávkových vakcin, které se s úspěchem osvědčily v klinických (Hohmann E.L., 0letta C-A, Killeen K-P. a Miller S.I., Vaccine 14, str. 19 až 24, 1996; Levlne N.M., Galen J., Barry E. a kol., J. Biotech. 44, str. 193 až 196, 1995) a obecných pokusech (Jones P.V. , Dougan G., Haywood C., MacKensie N. , Collins P. a Chatfield S.N., Vaccine 9, str. 29 až 36, 1991).
Kmen Salmonella typhimurium se stabilními mutacemi v ompC a ompF popsal Chatfield a kol. (Chattfield S.N., Dorman C.J., Hayvard C. a Dougan G., Infection & Immunity 59, str. 449 až 452, 1991). Při orálním podání myším BALB/c byl kmen zeslaben, s 50¾ smrtelnou dávkou (LD50) přibližně 1000-násobně. Intravenozní LD50 však byla snížena přibližně 10-krát, což poukazuje na význam porinů, jež dodávají bakteriím schopnost infikovat orální cestou.
Exprese genů ompC a ompF je řízena ompR. Pickard a kol. (Pickard D., Li J.L., Roberts Μ. , Maskell D., Hone D., Levine Μ., Douglas G. a Chatfield S., Infection and Immunity 62, str. 3984 až 3993, 1994) popisuje klonování ompB operonu, zahrnující geny ompR a envZ ze Salmonella typhi Ty2 kosraidové banky a charakterizaci DNA sekvenční analýzou. Sekvenčních hodnot DNA bylo použito k identifikaci vhodných restrikčních míst pro vytvoření definované delece 517 bp uvnitř otevřeného čtecího rámce genu ompR. Tato delece byla zavedena homolagovou rekombinací do chromosomů dvou kmenů S. typhi, které již měly definované delece v obou genech aroC a aroD. Mutanty S. typhi ompR vykazovaly výrazný pokles exprese porinů ompC a ompF, jak bylo doloženo zkoumáním vnější membrány preparátů. Ukázalo se také, že dvousložkový regulační systém ompR-envZ má významnou úlohu v regulaci Vi polysacharidové syntese v S.typhiVe studiích na živočiších bylo použito zeslabeného S. typhimurium jako nosiče k dodávání heterologových antigenů do imunitního systému (Chatfield S.N., Strahan Κ. , Pickard D., Charles I.G., Hormaeche C.E. a Douga 6., Mícrobiol. Pathog. 12, str.145 až 151, 1992b: Fairweather N.F., Chatfiel S.N., Makoff A.J. a kol. Infect. Immun. 58, str. 1323 až 1329, 1990: Strugnell R.A., Dougan G-, Chatfield S.N., a kol., Infect. Imraun. 60, str. 3994 až 4002, 1992?. To zvyšuje potenciál vývoje multivalentních vakcin k použití na lidech (Gomaz-Duarte O.G., Galen J., Chatfield S.N., Vaccine 13, str.1596 až 1602, 1995?.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je bakterie zeslabené nevratnou mutací v genu aroC, genu ompF a genu ompC a také vakcina ji obsahující.
Má se zato, že kombinace mutací aroC/ompF/ompC poskytuje vakcinu s vynikajícími vlastnostmi- Například se má zato, že kombinace aroC/ompF/ompC může být lepší než kombinace aroC/ompR ze dvou důvodů:
1. Mutace ompR může způsobovat vyšší úroveň zeslabení než kombinace mutací ompF/ompC, jelikož ompR může regulovat řadu jiných genů než ompF a ompC, které jsou významné pro přežití bakterií in vivo. Kombinace ompF/ompC může tedy dovolovat přežití bakterií ve vakcinovaném hostiteli po delší dobu a lépe, což vede k lepší ochraně.
• · · · · • · X * · · · · • · · · · · ·
9 · · X · · · • · · · 9 · · • ·
I ··
2- Mutace ompR může způsobovat sníženou imunogenitu ve srovnání s kombinací mutací ompF/ompC, jelikož ompR může regulovat expresi antigenů významných pro imonogenitu.
Vhodné bakterie pro účely vynálezu
Bakteriemi, používanými k přípravě vakcln podle vynálezu, jsou obecně bakterie infikující orální cestou. Mohou jimi být bakterie, které proniknou do eukaryotických buněk a rostou v nich a/nebo bakterie vytvářející kolonie na povrchu sliznic. Obecně jde o bakterie gram-negativní.
Bakterie mohou být rodu Escherichia, Salmonela, Vibrio, Haemofilus, Neisseria, Yersinia, Bordetela nebo Bručela. Příklady takových bakterií jsou Escherichia coli - způsobující průjmy u lidí, Salmonella typhimurium - způsobující salmonelózu u četných druhů živočichů, Salmonella typhi - způsobující tyfové onemocnění lidí, Salmonella enteritidis - způsobující otravu lidské potravy, Salmonella choleraesuis - působující salmonelózu vepřů, Salmonella dublin - způsobující systemické a průjmové onemocnění hovězího dobytka, zejména telat, Haemophilus influenza - způsobující meningitidu, Neisseria gonorrhoeae - způsobující kapavku, Yersinia enterocolitica - způsobující celé spektrum onemocnění lidí od současného zánětu žaludku a tenkého střeva (gastroenteritis) až po fatální septicemickou chorobu, Bordetella pertussis - způsobující černý kašel a Bručella abortus - způsobující zmetání a neplodnost hovězího dobytka a stav známý jako brucelóza lidí.
Pro vynález se hodí obzvláště kmeny E.coli a Salmonella. Stejně jako vakciny proti infekci Salmonellou, může být zeslabené Salmonelly použito jako nosiče heterologových antigenů z jiných organismů do imunitního systému orální cestou. Salmonelly jsou mocnými imunogeny a jsou schopny podnítit systemické a lokální buněčné a proti látkové odezvy. Systémy k vyvolá5
vání exprese heterologových antigenů v Salmonelle in vivo jsou znány. Je například známo, že promotory nirB a htrft jsou účinnými podněty antigenové exprese in vivo.
Vynález lze aplikovat na enterotoxigenní E. co li CETEC) ETEC je třída E. coli způsobující průjmové onemocnění. Jejich kolonie se usazují v blízkosti tenkého střeva. Standardním kmenem ETEC je ATCC H10407.
Infekce ETEC jsou jedinou nejčastější příčinou cestovatelských průjmů, čítající 3 až 9 milionů případů do roka mezi návštěvníky rozvojových zemí. V endemických oblastech jsou infekce ETEC významnou příčinou dehydratačních průjmů novorozenců a malých dětí, které zavinují ročně 800000 úmrtí v méně než pěti zemích na světě. V rozvojových zemích počet případů infekcí ETEC, vedoucí ke klinickému onemocnění, klesá s věkem, což naznačuje, že imunity proti infekci ETEC lze dosáhnout. Na rozdíl od toho neinformovaní dospělí z průmyslových zemi, kteří navštíví endemické oblasti, jsou vysoce náchylní k infekcím ETEC. Avšak při delším pobytu nebo při opakovaných návštěvách endemických oblastí náchylnost k infekcím ETEC klesá, což naznačuje, že živá zeslabená bakterie k vakcinaci ETEC se může ukázat jako úspěšná.
Podle vynálezu se využívá netoxigenního kmene ETEC nazývaného E1392/75/2A. Tento kmen vzniká spontánně z toxického mutantu delecí toxinových genů. Při studiích na lidech se dociluje orální vakcinaci živým kenem E1392/75/2A 75¾ ochrany proti konkureční ETEC expresující toxin z různého serotypu. Avšak přibližně u 15 vakcinovaných jedinců se vyskytl průjem jako vedlejší účinek vakciny. Kmen vyžaduje další zeslabení ke snížení vedlejších účinků, dříve než ho lze považovat za potenciální vakcinu a vynález se týká způsobu, jak tohoto zeslabení dosáhnout.
• 9 · · · · · 9 9 9 9 * · · 9 9 9 9 · · · ·
9 9 9 9 9 ♦ 9 9 9 9
9 9 · · · 9 9 9 9
9··· 99 999 99 «· «9
Seq Id c-1 ukazuje sekvenci genu E.coli aroC,
Seq Id č. 3 ukazuje sekvenci genu E.coli ompC,
Seq Id č. 5 ukazuje sekvencí genu E.coli ompF.
Další mutace (
Do bakterií podle vynálezu může být začleněna jedna nebo několik dalších mutací k vytvoření kmenů obsahujících mutace přídavně k aroC, ompC a ompF. Takovou další mutací může být C i > zeslabující mutace v genu jiném než aroC, ompC a ompF, (i i) mutace k zajištění selekce in vivo z buněk udržujících plasmid (například plasmid expresující heterologový ant-igen), nebo (iii) mutace k zabránění exprese toxinového genu.
Další zeslabující mutací může být mutace, o které je již známo, že je zeslabující. Mezi takové mutace patří aro geny (například aroA, aroD a aroE), pur, htrA, ompR, galE, cya, crp, phoP a surft (například Chatfield S.N., Charles I.G., Makoff A.J. a kol. Biotech. 10, str. 888 až 892, 1992a; Curtiss III, R. a Kelly S.M., Infect. Iramun. 55, str. 3035 až 3043, 1987; Dougan 0., Chatfield S. , Pickard D., Bester J., 0 Callaghan D. a Maskell D., J. Inf. Dis. 158, str. 1329 až 1335, 1988; 9. Hone D., Morona R., Attridge S. a Hackett J., J. Infect. Dis., 156, str. 167 až 1, 1987; Miller S.I., Kukral A-Ma Mekalanos J.J., Proč. Nat. Acad. Sci, USA 86, str. 5054 až 5058, 1989; Pickard D., Li J.L., Roberts Μ. , Maskell D-, Hone D., Levine Μ., Douglas G. a Chatfield S., Infection and Immunity 62, str.3984 až 3993, 1994; EP-B-0322237 (Doudan a kol.); EP-B-0400958 (Dougan a kol.); a EP-B-0524205 (Dougan a kol.).
Mutace, k zajištění selekce k údržení plasmidu, může být provedena mutací genu, který je nezbytný pro přežití bakterie. Plasmid, nesoucí nezbytný gen, je pak zaveden do bakterie tak, že přežít mohou pouze buňky nesoucí plasmid. To může být uži• * ·· 4 ·· «· · · • · · · · · · · * · * • · · * · · · « · · · ··· ··· * · · • · · · · · ··· · · · · tečné tehdy, když plasmid obsahuje například heterologový antigen, který má být expresován bakterií.
Mutace k zabránění exprese toxinového genu může být provedena ke snížení veškerých vedlejších účinků způsobených vakcinací bakteriemi. Například v případě vakcinace kmeny E.coli, jako je ETEC, může být žádoucí mutovat geny tepelně labilního toxinu (LT) nebo tepelně stabilního toxinu (ST), aby nebyly expresovány.
Povaha mutací
Mutace, zavedené do bakteriální vakciny, obvykle vyřadí úplně funkci genu. Toho se dá dosáhnout buď naprostým zrušením syntézy jakéhokoliv polypeptidů z genu nebo provedením mutace vedoucí k syntéze nefunkčního polypeptidů. Ke zrušení syntézy polypeptidů vede buď vypuštění celého genu nebo jeho 5 -zakončení. Delece nebo vložení do kódovací sekvenece genu může být použito k vytvoření genu, který syntetizuje pouze nefunkční polypeptid (například polypeptid obsahující pouze N-koncovou sekvenci proteinu standardního typu).
Mutace jsou nevratné. Jde o mutace, které vykazují v podstatě nevratnost do standardního typu, je-li bakterie použito jako vakciny. Takové mutace zahrnují začlenění nebo deleci. Začlenění a delece jsou s výhodou velké, typicky o délce nejméně 10 nukleotidů, například 10 až 600 nukleotidů. S výhodou se vypustí celá kódující sekvence.
Bakterie, použitá ve vakcině, obsahuje s výhodou pouze definované mutace, tedy mutace, které jsou charakterizovány. Je zřejmě nežádoucí použít jako vakciny bakterie, která má ve svém genomu nechakterizované mutace, nebot hrozí nebezpečí, že necharakterizované mutace mohou udělit bakterii vlastnosti, které způsobí nežádoucí vedlejší účinky.
♦ ♦ ·♦ > * · 4 > · « «
Zeslabující mutace mohou být začleněny způsoby dobře známými pracovníkům v oboru CJones P.V., Dougan G., Haywood C., MacKensie N-, Collins P. a Chatfield S.N., Vaccine 9, str. 29 až 36, 1991). Mezi vhodné způsoby patří klonování sekvence DNA genu standardního typu do vektoru, například plasmidu a vložení selektovatelného markéru do klonované sekvence DNA nebo vypuštění části sekvence DNA vedoucí k její inaktivaci. Vypuštění může být provedeno například přerušením sekvence DNA pomocí restrikčních enzymů, které vystřihnou ve dvou místech nebo právě vně kódovací sekvenci a spojí oba konce zbývající sekvence. Plasmid, nesoucí inaktivovanou sekvenci DNA, může být transformován do bakterie známými technikami, jako je elektroporace a konjugace. Vhodnou selekcí je pak možno identifikovat mutant, ve kterém se inaktivovaná sekvence DNA rekombinovala na chromosom bakterie a sekvence DNA standardního typu se stala nefunkční homologovou rekombinací.
Exprese heterologových antigenů
Genovým inženýrstvím může být zeslabená bakterie podle vynálezu upravena k expresi antigenů, který není expresován nativní bakterií <hetero1ogový antigen”>, takže zeslabená bakterie působí jako nosič heterologového antigenů. Antigen může pocházet z jiného organismu, takže vakcina zajistuje ochranu proti jinému organismu. Může být vyrobena multivalentní vakcina, která nejenom zajišťuje imunitu proti virulentnímu původci zeslabené bakterie, ale zajišťuje také imunitu proti jinému organismu. Kromě toho může být zeslabená bakterie upravena k expresi více než jednoho heterologového antigenů a v tom případě mohou být hetereologové antigeny ze stejných nebo z odlišných organismů.
Heterologovým antigenem může být úplný protein nebo část proteinu obsahující epitop. Antigen může být z jiné bakterie, z viru, z kvasinky nebo z houby. Speciálně může být antigenová sekvence z následujících organizmů: E. coli (například ETEC), tetanus, virus hepatitidy A, B nebo C, lidský rinovirus typu 2 nebo 14, virus herpes simplex, poliovirus typu 2 nebo 3, virus kulhavky a slintavky, virus chřipky, coxsackie virus nebo Chlamydia trachomatis. Mezí vhodné antigeny patří netoxické složky tepelně labilního toxinu E. coli, antigeny E. coli K88, antigeny kolonizačního faktoru ETEC, protein P.69 z B. pertussis a tetanový toxinový fragment C.
Kolonizační faktory ETEC a jejich složky jsou prvními kandidáty pro expresi jako heterologové antigeny- K navození průjmového onemocnění musejí být patogenní kmeny ETEC schopny kolonizovat střevo a vytvořit ent-erotoxiny. Pro většinu kmenů byly identifikovány kolonizační faktory (CF) ETEC, které jsou potřeba k přilnutí ke sliznici střeva. V téměř všech případech jsou CE expresovány jako třásně na vnějším povrchu bakterie. Byla identifikována velká řada CF, přičemž převládající jsou CFAI, CRAII (zahrnující CS1, CS2, CS3) a CFAIV (zahrnující CS4 CS5 a CS6).
Vakcina ETEC ideálně poskytuje ochranu proti řadě antigenů kolonizačních faktorů k zajištění ochrany proti různým kmenům. Aby toho bylo dosaženo, bylo by potřeba expresovat četné kolonizacní faktory v jednom kmeni. Alternativně by bylo možno provést stejné zeslabení v řadě různých kmenů ETEC, každého s jiným koIonizačním faktorem. To by zahrnovalo deleci toxinů z takových kmenů.
DNA kódující heterologový antigen je expresována z promotoru, který je aktivní in vivo. Dvěma promotory, které se ukázaly jako dobře fungující v salmonele, jsou promotor nirB (VO 92/15689 (Charles a kol.); Everest P., Allen J. Papakonstantinopoulou A., Mastroení P., Roberts M. a Dougan 6., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 97 až 101, 1995) a promotér htrA (Everest. P. , Allen J. Papakonstantinopoulou A., Mastroení P. , ·· ·· • · · · * • · · · · • · « · · • · · • · ·· ··· · · » ·«·· 4··· ·· ··· ·· ·· ··
Roberts M. a Dougan G., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 9? až 101, 1995). K expresi antigenů kolonizačniho faktoru ETEC múze být použito promotorů standardního typu.
Konstrukce DNA, obsahující promotor operativně připojený k DNA kódující heterologový antigen, se může připravit a transformovat na zeslabenou bakterii o sobě známými způsoby. Produkty transformace, obsahující konstrukci DNA, mohou být vyčleněny například skrínováním pro selektovaný markér na konstrukci. Bakterie obsahující konstrukci mohou být pěstovány in vitro dříve než se zformulují před podáním hostiteli k vakcinačním účelům.
Formulace vakciny
Vakcina se může formulovat známými způsoby formulování zeslabených bakteriálních vakcin. S výhodou je vakcina určena pro orální podání, například v lyofi 1izované zakapslované formě. Takové kapsle mohou být opatřeny enterickým povlakem, obsahujícím například Eudragate S ™, Eudragate L” ™, acetát celulózy, ftalát celulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózu. Těchto kapslí se může použít jako takových, nebo alternativně může být lyofi 1izovaný materiál před podáním rekonstituován, například jako suspense. Rekonstituce se s výhodou provádí v pufru při vhodné hodnotě pH k zajištění životnosti bakterií. K ochraně zeslabených baterií a vakciny před žaludeční kyselinou se s výhodou podává před každým podáním vakciny hydrogenuhličitan sodný. Jinak může být vakcina připravena pro parenterální, intranasální nebo intramuskulární podání.
Vakciny se může použít při vakcinaci savců, zejména lidí, avšak také zvířecího hostitele. Infekci, způsobené mikroorganismy, obzvláště pathogeny, může být zabráněno podáním účinné dávky vakciny, připravené podle vynálezu. Použité dávkování určuje lékař v závislosti na různých faktorech včetně velikos11
ti a hmotnosti hostitele a typu formulované vakciny. Pro dospělého člověka o hmotnosti 70 kg může však být vhodná dávka pro orální podání 107 až 1011 bakterií v dávce.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.
Seznam obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn systém pro konstruování definovaných delecí v cílových genech pomocí sestřihování převrstvením extenze mutagenese PCR.
Primer ft zahrnuje restrikční místo 1
Primer B zahrnuje restrikční místo 2
Primer C zahrnuje restrikční místo 3 a 4
Primer D zahrnuje restrikční místo 3 a 4
Na obr. 2 jsou očekávané sekvence cílových genů po rekombinaci a selekci pro delece.
Bolt -Stop a start kodony
Zavedena italic-restrikční enzymová místa nižší pčípad- extra n.t. adováno k příměrům k předcházení vytváření primorového dimeru --- standardní typ genu
N.B. aroC delece odstraňuje 16 n.t. 3' ke stopovému kodonu
Na obr. 3 je znázorněno klonování delečních kazet do plasmidu PCVD442.
Na obr. 4 je znázorněna analýza SDS-PAGE vnějších membrán připravených z kmenů ETEC za podmínek nízké C L-kultivační půda prostá soli) a vysoké CL-kultivační půda prostá soli + 15 sacharózy) osmo 1 ar i ty. ři=markery. vzorek 1 = PTL010, vzorek 2 =F’TL002, vzorek 3= PTL003, vzorek 4 = aroC ZkompC, vzorek 5 = ékompF.
• * • · • · · fcfcfcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfc • fcfc · fc fcfc · • · · fcfcfcfc • fc fcfcfc fcfc fc • fcfc fcfcfc* fcfcfc fcfc *« fcfc
Na obr. 5 je exprese CS1 a CS3 v delečních kmenech po růstu na CFA agaru. Stejný počet buněk 2 každého kmene je uložen na 15¾ SDS-PAGE gelu westernovým přenosem s monospeclfickými antl-CSl nebo anti-CS3 polyklonálníml protilátkami. Kontrolou pro proti látkovou specificitu byly plné buněčné lysáty buněk TG1 expresujících hlavní pilin protein CS1, nebo vyčištěný hlavní pilin protein z CS3. Pruh M, se překlenuje markéry nízké molekulové hmotnosti. pruh 1 indukované buňky TG1 obsahující PKK223, pruh 2 indukované buňky TG1 obsahující pKKCsl, pruh 3 kmen CS1-ETEC, pruh 4 PTL010. pruh 6 PTL002, pruh 7 PTLOO3, pruh 8 vyčištěný hlavní pilin protein.
Na obr. 6 je Southernový přenos mutantu loci. DNA byla extrahována z ETEC standardního typu CE1392/75-2A), PTLOO1 ChrtA aroC), PTL002 CaroC ompR) a PTL003 CaroC ompC ompF) jak vyznačeno. digerována restrikční endonukleázou EcoRV a eletroforézována pulzujícím polem přes 1¾ agarózu. DNA byla přenesena z gelu na nylonové membrány Hybond N+ CAmersham) a hybridizována sondami DNA odvozenými z míst aroC, htrA, ompR, ompC, nebo ompF, jak znázorněno. Pásmové obrazce jsou konsistentní s mutantovými místy delece.
Na obr. 7 jsou odezvy IgA u dobrovolníků, kterým byla podána vakcina podle vynálezu. Na ose x jsou dny, na ose y je čistý supernatant ELISA O.D.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce a charakterizace kmene podle vynálezu
Návrh delecí a konstrukce plasmidů pCVDÁAroC, pCVD/1 OmpC a pCVDáOmpF ·· ·« « « · φ • · φ φ • · φ φ • φ φ φ
Deleee byly určeny k odstranění úplného otevřeného čtecího rámce cílového genu. Za použití sekvence genomu E.coli jako matrice, byly určeny primery PCR k zesílení fragmentů párů bází 500-600 lemující cílový otevřený čtecí rámec (sekvence příměrů jsou v tabulce I). Sestřihu překrytím extense pomocí PCR bylo použito k fůzi dvou lemujících sekvencí za vytvoření produktu PCR s delecí úplného genu (obr. 1). Sekvence standardního typu kolem místa deleee a předpověděné sekvence po delecl jsou znázorněny na obr. 2.
Pro každý gen byla zavedena do sestřižné oblasti dvě různá restrikční místa (tabulka II). Těch bylo použito k identifikaci deleČních klonů. Primery PCR na každém konci fragmentu PCR zavedená jedinečná restrikční místa byla použita ke klonování fragmentu do mnohočetného klonovacího místa pCVD442 (obr.
3) .
Produkty PCR se vyčistily gelovým čištěním pomocí extrakčního kitu Qiagen (obchodní jméno) a digerovány s příslušnými restrikčními enzymy před ligací na sebevražedný plasmid pCVD442 (Donnenberg M.S. a Kaper J.B. Infection and Immunity 59, str. 4310 až 4317, 1991) digerovaný tímtéž enzymem a zpracovaný alkalickou fosfatázou k zabránění vektorové samoligaci (obr.3). Ligační směs se transformovala do SY327 Ápir a nanesla na destičky L-ampici11 inu (100 pg/ml). Plasmidy z transformantů resistentních k ampicilinu se skrínovaly se zřetelem na obsah delečních kaset restrikční digescí. Generovaly se tyto plasmidy:
pCVD <6 AroC pCVD Δ,OmpC pCVDAOmpF
Sebevražedný plasmid pCVD442 může replikovat pouze v buňkách pro pir gen. Při zavedení do ne-pir kmenů pCVD442 je neschopen replikace a odolnost k ampicilinu, zavedená plasmidem, může být udržena, jestliže se plasmid integruje do chromosomu jedním homologovým rekombinantním dějem. Plasmid má také sacB gen kódující leva cukrázu, která je toxická pro gram negativní bakterie v přítomnosti sacharózy- Toho se může využít pro selektování klonů, které prodělaly druhý rekombinační děj, při kterém se sebevražedný kmen vystřihne. Takové buňky jsou odolné sacharóze avšak citlivé k ampicilinu.
Konstrukce a charakterizace kmene AroC OmpC OmpF
V tomto oddíle se popisuje chronologie konstrukce a historie kmene /AroC£. OmpC OmpF. Označením ETEC se zde míní specificky kmen E1392/75/2A nebo jeho deriváty.
Delece AroC OmpC OmpF byly zavedeny do E1392/75/2A v následujícím pořadí:
Δ AroC /AroC /OmpC —> /-AroC /OmpC /OmpF
Konstrukce ETEC Δ AroC
1) E1392/75/2A z originálních zásob v mikrobance se nanese na L-agar,
2) z těchto buněk se připraví kompetentní buňky pro elektroporaci. Zmrazí se 100 pl podíly.
3) Pomocí miniprep Qiagen Qiafliter (obchodní jméno) se oddělí pCVD/AroC z buněk SY327pir. Plasmid se zkoncentruje přibližně 10-krát vysrážením ethanolem. Shora je popsána konstrukce pCVD/AroC.
4) Smísí se 5 pl koncentrovaného plasmidu se 100 pl rozmražených buněk a podrobí se elektroporací. Celá transformace se nanese na L-ampici11lnovou destičku (50 pg/ml) a inkuo buje se přes noc při teplotě 37 C.
5) Vyroste jediná k ampicillinu resistentní kolonie.
6) Kolonie se naočkuje na L-ampici11inovou destičku (100 pg/ o
ml) a nechá se růst přes noc při teplotě 37 C (“merodiproid plate).
7) PCR pomocí primerů TT19 a TT20 (specifických pro gen aroC)
9· ·· * · · 4 · · « » · · I • · 4 ·· a kolonie sejmutá z merodiploidní destičky zesílí dva pruhy o velikostech odpovídajících velikostem standardního typu a genů AaroC. Sekvence primerů jsou vyznačeny v tabulce I.
8) Kolonie z merodiploidní destičky se nechá růst sedm hodin v a) L-ampicillínové kultivační půdě (100 ug/ml) a b) v Lkultivační půdě. Kolonie, vyrostlá na L-ampici 11inové kultivační půdě, se uloží do mikrobanky.
9) Provede se serie ředění kultury L-kultivační půdy na
a) neslaném L-agaru,
b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.
o
Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 C.
10) Počty kolon ukazují, že o 104 více kolonií vyrostlo na Lagaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což ukazuje na selekční práci sacharózy.
11) Kolonie resistantní na sacharózu se skrínují se zřetelem na přítomnost genu aroC pomocí PCR. Kolonie, vybrané ke skrínování se nanesou na L-agarovou destičku a nechají se růst přes noc při teplotě 37 C. Tato destička se uloží o
při teplotě 4 C až do dalšího testování.
12) 50 z 90 testovaných kolonií mělo pouze aroC.
13) Testuje se růst kolonie’a) na destičkách M-9 minimal media
b) na destičkách M-9 minimal media ·+· Aromixových destičkách
c) na L-Amp ¢100 ug/ml) kolonie aroC by neměly růst na M-9 minimal mediu bez Aromix nebo na L-Amp.
Aromix je směs následujících aromatických sloučenin:
Látka Konečná koncentrace hm/obj)
fenylalanin 0,004
tryptofan 0,004
tyros i n 0,004
p-aminobenzoová kyselina 0,001
dihydroxybenzoová kyselina 0,001
·· *· • · · ·
Tyto sloučeniny se vyrábějí v bakteriích standardního typu, avšak mutace aroC brání jejich syntéze.
14) 13/4 předpokládaných koloniíÁAroC vyžadovalo k růstu na N-9-minimálním mediu Aromix a byly cilivé na ampicillin.
15) Pomocí PCR se testovaly tři kolonie (č. 1, 2, 3) na přítomnost hlavního pilin proteinového genu CS1 za použití primerů MGR169 a MGR170- Všechny tři kolonie poskytly produkty PCR očekávané velikosti (700 bp.). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.
16) Kolonie 1, 2 a 3 ze skrínovací hlavní destičky se vyjmuly o
na L-agar a nechaly se růst přes noc při teplotě 37 C. Buňky z těchto tří destiček byly použity k očkování do zkumavek mikrobanky.
17) Kolonie 1, uložené v mikrobance, bylo použito k další prác i .
18) K trvalému uskladnění se kulička z mikrobankové misky naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 Ca slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazováním vysušená zásoba
E1392/75/2AΔAroC se označí PTL004. Do zbytlu 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a kultura se ínkubuje přes noc při teplotě 30 C. Přenese se 1 ml kultury, inkubované pres noc, do každé ze tří kryofiol a uloží se v tekutém dusíku.
Konstrukce ETEC £> AroC AOmpr
1) Příprava pCV zsOmpC plasmidu DNA pro elektroporaci =
Λ
Kolonie SY327 /\pir, nesoucí pCVQOmpC, se nechá růst přes o
noc při teplotě 37 C ve 100 ml L-ampici11 inu (100 ug/ml) jakožto kultivačnbí půdě. Plasmid DNA se vyčistí pomocí miniprep Qiagen Qiafilter (obchodní jméno). DNA se dále zkoncentruje ethanolovou precipitací. Konstrukce pCVDáOmpC je popsána shora.
f ·9 9 *· ·· · · ♦ Φ · Φ · · Φ · · · · • · · · ·· · · ·· · • · · · · · · * · · · ·
Φ ΦΦ Φ·· ····
ΦΦΦΦ ·Φ ··· ·· ·· ··
2) Příprava elektrokompetentních buněk'·
Buňky ETEC&AroC z mikrobankové misky, produkované ve stupni 17 předchozího oddílu se naočkují na L-agar, nechají se o
růst přes noc při teplotě 37 C, načež se uskladní při o
teplotě 4 C po dobu nepřekračující 1 týden před použitím k očkování kultur pro přípravu elektrokompetentních buněk.
3) Buňky ETECAAroC se elektroporují 5 μΐ koncentrované DNA pCVD,&OmpC a každá transformace se nanese na samostatnou L-ampici11inovou destičku (50 ug/ml) a nechá se rflst přes noc při teplotě 37 C.
4) Získá se 17 kolonií resistentních na ampicillin (předpokládané ETEC <& AroC/pCVD z\0mpC merodiploidy).
5) Tyto kolonie se nestříknou na hlavní L-ampicl11inovou destičku (100 ug/ml) a použije se jich jako matrice pro PCR s priraery TT7/TT8. Hlavní destička se nechá rflst při teplotě místnosti přes víkend. Sekvence primerfl jsou uvedeny v tabulce I.
6) Samotná kolonie (č.7) měla gen ompC.
7) Kolonie se nechá rflst pět hodin na L-kultivační pfldě.
8) Provede se serie ředění kultury L-kultivační pfldy na
a) neslaném L-agaru,
b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.
o
Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 C.
9) Počty kolon ukazují, že o 104 více kolonií vyrostlo na Lagaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což dokládá selekční práci sacharózy.
10) Skrínuje se 45 kolonií resistantních na sacharózu na gen AompC za použití primerfl TT7 a TT8. Devět kolonií mělo gen AompC, avšak většina měla stopy v.t. genu ompC- Sekvence primerfl jsou uvedeny v tabulce I.
11) K dalšímu charakterizování předpokládaných kolonií
ΕΤΕ0Δ AroC AompC se nechají rflst pět hodin v 1 ml L-kultivační pfldy a nanesou se na
a) L-agar + 100 u9/ml ampicillinu
b) L-agar *4 4 4 · ·· ·· · ·
4 4 4 4*4 · · · « • · ·· ·· · 4 ·· 4 • · · · · · · · 4 4 4 4 • ·· 4·· 444 4
4*44 44 4*4 44 44 *4
c) L-agar + 5 % sacharózy
Kolonie AOmpC by měly být resistentní na sacharózu a citlivé na ampicillin.
12) Pouze 1 kolonie (č.l) byla citlivá na ampicillin a resistentní na sacharózu.
13) Kolonie č. 1 byla kontrolována na přítomnost genů aroC, AompC a CS1 za použití PCR s primery TT19/TT20, TT7/TT8 a MGR169 a 170. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.
14) Kolonie poskytuje samostatné PCR produkty očekávané velikosti pro geny AaroC, & ompC a CS1.
15) Kolonie byla uložena v mikrobance.
16) K trvalému uskladnění se kulička z mikrobankové misky naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 Ca slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazováním vysušená zásoba E1392/75/2AΔAroC/ΔOmpC se označí PTL008. Do zbytku 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a kultura se ino kubuje přes noc při teplotě 30 C. Přenese se 1 ml této kultury, inkubované přes noc, do každé ze tří kryofiol a uloží ^e v tekutém dusíku.
Konstrukce ETEC A AroC A OmpCAOmpF
K zavedení pCVDAOmpF do E1392/75/2A ,6 AroC Λ OmpC se použije konjugace.
1) Konjugační donorové buňky SMlOlambdapir se transformují s pCVDÁOmpF. Konstrukce plasmidů pCVD OmpF je popsána shora .
2) S buňkami SM10 Apir/pCVD OmpF se konjugují buňky
ETEC AroCAOmpC. Plasmid pCVD442 zahrnuje transferový počátek, který umožňuje plasmidů přemístění z donorového kmene obsahujícího trensferové geny RP4 (například SM10 Apir) na recipientový kmen (například ETEC). Buňky
ETEC ΔaroCAompC a kmen E.coli SM101Apir, nesoucí rekornbinant. pCVD AompF se křížově naočkují na L-agarové destič19 • 4 ·· » · 4
4 44
4«
4 4 4
4 4 4
4 4 4
6)
7) ky k pokrytí plochy přibližně 10 cm2. Destičky se Inkubují o
hodin při teplotě 3? C, načež se nárůst smyje 4 ml Lkultivační půdy a suspense se nanese na McConkeyův agar <Difeo) obsahující streptomycin v množství 20 ng/ml a ampicillin v množství ng/ml. Destičky se inkubují přes noc o
při teplotě 37 Ca výsledné kolonie se kontrolují na merodiploidy PCR za pomoci vhodných oligonukleotidů jako primerů.
3) Předpokládané transkonjuganty ETEC se skrínují. Sejme se 10 kolonií z McConkeyových agarových destiček a nechají se růst přes noc na L-ampici 11inovém agaru <100 ng/ml). Přítomnost genu /LompF se kontroluje PCR primery TT1/TT2. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I.
4) Kolonie se nechají růst pět hodin na L-kultivační půdě.
5) Provede se serie ředění kultury L-kultivační půdy na
a) neslaném L-agaru,
b) neslaném L-agaru + 5 % sacharózy.
o
Destičky se inkubují přes noc při teplotě 30 C.
Počty kolon ukazují, že o 105 více kolonií vyrostlo na L-agaru než na L-agaru + 5 % sacharózy, což ukazuje na selekční práci sacharózy.
Skrínují se kolonie resistantní na sacharózu na gen ZkompF za použití primerů TT1/TT2. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I. Skrínované kolonie se nechají růst přes noc Tři kolonie ze 47 měly gen .AompF, chyběl ompF standardního typu.
8) K dalšímu charakterizování předpokládaných kolonií ETECΛAroCΔompCΔOmpF se kolonie nanesou na
a) L-agar + 100 pg/ml ampicillinu
b) L-agar
c) L-agar + 5 % sacharózy.
Kolonie AOmpF by měly být resistentní na sacharózu a citlivé na ampicillin.
9) Všechny tři kolonie byly citlivé na ampicillin a resisna L-agaru. výskyt genu K dalšímu tentní na sacharózu.
10) Kolonie se uložily do mikrobanky a jedna kolonie byla zvolena jako základní zásoba.
11) K trvalému uskladnění se kulička ze základní zásoby naočkuje do 1 ml L-kultivační půdy, nechá se růst čtyři hodiny za natřásání při teplotě 37 Ca slouží k vytvoření agarových produktů, kterých se použije k vytváření zásob sušených vymrazováním. Vymrazováním vysušená zásoba E1392/75/2A zSaroC ΔompC/š.ompF má označení PTL003 .
Do zbytlu 1 ml kultury se přidá 20 ml L-kultivační půdy a et kultura se inkubuje přes noc při teplotě 30 C. Přenese se 1 ml kultury, inkubované přes noc, do každé ze tří kryofiol a uloží se v tekutém dusíku.
Charakterizace E1392/75/2A z^AroC AOmpC AOmpF
1) Růstové požadavky:
Buňky z hlavní zásoby, vyrobené ve stupni 10 v předchozím oddíle, se naočkují na L-agarovou destičku. Současně se naočkuje 8 ml L-kultivační půdy pro chromosomální DNA prep pro Southerovy přenosy. Destička a tekutá kultura se o
nechají růst přes noc při teplotě 37 C.
Buňky z růstové destičky se naočkují na následující media a o
nechají se růst přes noc při teplotě 37 C.
Medium Růst
L-Amp žádný M9 minimální medium žádný M9 minimální + Aromix ano
M9 + sulfathiazol <100 ug/ml) žádný
M9 + sulfathiazol <100 pg/ml) + Aromix ano
L-Agar + 50 jug/ml streptomyc i nu ano
L-Agar +· 5 % sacharózy ano
Podle očekávání jsou buňky citlivé na Amp. Buňky jsou reX • X · X • XX • · ·· • · « • ··« • · ···· ·· • X X • X X >· sistentní na sacharózu, streptomycin a sulfathiazol, k růstu na minimálním mediu však potřebují Aromix.
2) LPS analysa PTL003:
a) Zmrazováním vysušená flola PTL003 se otevře. Kultura se resuspenduje v L-kultivační půdě a nanese se na L-Agar k růstu. Několik buněk se seškrábne a uschová v mikrobance.
b) Seškábne se více buněk a analyzuje se LPS profil. Není viditelný rozdíl mezi LPS profilem PTL003 a originálním kmenem E1392/75/2A.
3) Potvrzení delece PCR:
a) Odškrabek buněk se odebere z destičky připravené podle odstavce 2a, naočkuje se na L-Agar a nechá se růst přes noc.
b) Čerstvě vyrostlé buňky se použijí k PCR s příměry, které sousedí s následujícími geny: aroC, htrA, ompC, ompF, ompR.
c) Ukazuje se, že PTL003 má deleci v genech aroC, ompC a ompF, avšak nikoli v htrA nebo ompR.
4) Analysa profilu vnější membrány proteinu PTLOO3Z kmenů PTLO1O CE1392/75/2A) a z delečních kmenů PTL002 a PTL003 se připraví frakce vnější membrány proteinu. Analyzuje se také kmen se samotnou deleci ompF a kmeny s oběma delecemi aroC a ompC. Kmeny se nechají růst za podmínek nízké osmolarity CL-kultivační půda bez soli + 15 % sacharózy). Proteinový produkt OmpF se normálně expresuje ze nízké osmolarity, zatímco produkt OmpC se expresuje za vysoké osmolarity. Proteiny OmpC a OmpF mají podobnou elektroporetickou mobilitu. Jak ve vysoké, tak v nízké osmolaritě chybí kmeni PTL003 proteiny v oblasti OmpC/OmpF ve srovnání se standardním kmenem typu E1392/75/2A nebo ve srovnání s delečními kmeny zs. AroC Δ OmpC nebo/s-OmpF. Výsledky jsou vyjádřeny na obr. 4.
5) Exprese pil CS1 a CS3 na CFA agaru=
Zkoumá se exprese pil CS1 a CS3 v delečním kmeni. Přes noc se nechají růst stejné počty bakterií (2 Aeoonm jednotek) kmenů PTLO1O, PTLOO1, PTL002 a PTLD03 při teplotě 37 °C na agaru CFA a podrobí se SDS PAGE a analyzují se westernovým přenosem s raonospecifíckými polyklonálními protilátkami proti CS1 nebo CS3. Pil CS1 a CS3 jsou expresovány stejně dobře v pěti pruzích (obr.5).
CFAII-negativní derivát E1392/75/2A se konstruuje pro použití jako kontrola.
Provede se to specifickým zpracováním plasmidů kódujících CS z kmene ETEC E1392/75/2A. Krátký fragment DNA se zesílí z genu cooB pomocí PCR s oligonukleotidy CSA01 a CSAO2 jako primery a ligují se do vektoru Easy plasmid pGEM-T (obchodní název, Promega) určeného ke klonování produktů PCR. Fragment se subklonuje do pCVD442 účinkem restričních míst enzymů Sáli a Sphl. Do kmene E1392/75/2A se derivát pCVD442-cooB zavede konjugací z SM10 ^pir. Nejpravděpodobnějším výsledkem fůze derivátu pCVD442-cooB s plasmidera, obsahujícím cooB, jsou transkonjuganty resistentní vůči ampicillinu. Takové transkonjuganty se pak pěstují na L-agaru doplněném 5 % sacharózy k výběru pro ztrátu sacB genu
PCVD442. Výsledné kolonie se testují na citlivost vůči asipiclllinu a PCR pomocí CSAO1 a CSAG2 jako primerů. Jako pozitivní kontroly jsou z těchto PCR zařazeny tři kolonie E1392/75/2A. Dvě kolonie resistentní vůči sacharóze, které nedávaly žádný produkt s PCR, se naočkují na čerstvý L-agar doplněný 5 % sacharózy k získání čistých kultur. Cistě kultury se pak nechají růst na L-kultivační půdě při teplotě 37 C přibližně 16 hodin a uloží se do mikrobanky při tepo lotě -70 C. Ztráta plasmidů, kódujícího CS1, se potvrdí analýzou plasmidového profilu derivátů pomocí agarosové gelové elektroforézy. Jako CS1 negativní se potvrdily dva deriváty, byly však stále CS3+.
6) Southernův přenos PTL003=
Struktura delečních mutací. Z kultur tří delečních mutací, ·· ·· • * • ·
vypěstovaných na mikrobankovních zásobách, se extrahuje veškerá DNA, digeruje se s restrikční endonukleázou EcoRV, a dígerovaná DNA se podrobí elektrofořeze agarového gelu pulzujícím polem. DNA se z gelů přenese na nylonové membrány Hybond N+ (obchodní název) a hybriduje se příslušnými sondami DNA standardními způsoby. Výsledky (obr. 6) ukazují, že hybrxdizující chromosomalní fragmenty DNA mutantů jsou kratší než u standardního typu konsistentně s mutacemi, jež jsou delecemi.
Potvrzení nepřítomnosti toxinových tepelně stabilních (ST) a tepelně nestabilních (LT) genů ve kmeni E-coli E1392/75-2A
Pro toto potvrzení se použilo genů ST a LT-AB jako sond DNA proti totální DNA z E1392/75-2A. Totální DNA z toxin pozitivního ETEC kmene E1392/75 byla zařazena jako pozitivní kontrola, zatímco DNA z laboratorního kmene E.coli JM109 byla zařazena jako negativní kontrola. Hybridizované membrány byly ponechány jednu hodinu pod Hyperfilm-ECL (obchodní název) k získání maximálního signálu. Sondy byly připraveny za použití PCR s plasmidem DNA extrahovaným z E1392/75-2A jako matrice a oligonukleotidů EST01 a EST02 jako primerů pro ST, nebo LT-R1 a LT-O3 pro LT-AB. U totální DNA nedošlo k významné hybridizaci za použití sondy LT-AB nebo ST, přes získání velmi intenzivního signálu z pozitivní kontrolní totální DNA.
Potvrzení nepřítomnosti sekvencí pCVD442 z chromosomu deleČních mutantů
Plasmid pCVD442 byl označen a hybridizován z delečních mutantů PTLOO1, PTL002 a PTL003 s EcoRV. Celková DNA z kmene ETEC E1392/75-2A byla zařazena jako kontrola. Získal se komplexní obrazec hybridizujících fragmentů DNA. Nebyl však významný rozdíl mezi obrazcem získaným pro standardní typ a pro mutant, což naznačuje, že nebyl pravděpodobně v genomech mutantů zanechán žádný zbytná totální DNA digegerovaných ·44· ·« kovy nukleotid pCVD442. Komplexní obrazec hybridizujícich fragmentů byl nejpravděpodobněji způsoben sondou pCVD442 hybridizu1ící plasmidem složek DNA kmene E1392/75-2A a deriváty mutantů.
Tabulka I Příměry PCR
Jméno Cíl Použití Sekvence (5 * — 3’)
TT1 ompF Primer A pro klonování ATC TGT TTG TTG AGC TCA GCA ATC TAT TTG CAA CC
TT'2 ompF Primer B pro klonování TTT TTT GCC AGC ATG CCG GCA GCC ACG CGT AGT G
TT3 ompF Primer C pro klonování CTC GAG GCT TAG CTC TAT TTA TTA CCC TCA TGG
TT4 ompF Primer D pro klonování GAG CTA AGC CTC GAG TAA TAG CAC ACC TCT TTG
TT7 ompC Primer A pro klonování TTG CTG GAA AGT CGA CGG ATG TTA ATT ATT TGT G
TT8 ompC Primer B pro klonování GGC CAA AGC CGA GCT CAT TCA CCA GCG GCC CGA CG
TT9 ompC Primer C pro klonování GCT AAG CCT CGA GTA ATC TCG ATT GAT ATC CG
ttio ompC Primer D pro klonování CTC GAG GCT TAG CGT TAT TAA CCC TCT GTT A
ΙΛ • 9
ΤΤ19 aroC Primer A pro klonování CCG CGC TCG CTC TAG AGT GAA CTG ATC AAC AAT A
ΤΤ20 . aroC Primer B pro klonování ATG CGC GCG AGA GCT CAA CCA GCG TCG CAC TTT G
ΤΤ21 aroC Primer C pro klonováni CTC GAG GCA TGC TGA ATA AAA CCG CGA TTG
ΤΤ22 aroC Primer D pro klonování GCA TGC CCT CGA GGG CTCC GTT ATT GTT GTG
MGR169 CS1 Vazba v CS1 sekvenci TGA TTC CCT TTG TTG CGA AGG CGA A
MGR170 CS1 Vazba v CS1 sekvenci ATT AAG ATA CCC AAG TAA TAC TCA A
LT-R1 LT-AB Viz text GCT TTT AAA GGA TCC TAG TT
LT-03 LT-AB Viz text GGT TAT CTT TCC GGA TTG TC
EST01 ST Viz text CAT GTT CCG GAG GTA ATA TGA A
EST02 ST Viz text AGT TCC CTT TAT ATT ATT AAT A
CSAO1 CS1 Viz text TGG AGT TTA TAT GAA ACT AA
CSA02 CS1 Viz text TGA CTT AGT CAG GAT AAT TG
CS3-01 CS3 Viz text ATA CTT ATT AAT AGG TCT TT
CS3-02 CS3 Viz text TTG TCG AAG TAA TTG TTA TA
• ί» · · • · · • · · · * · • &
• · · » · »
Tabulka II
Cílový gen Místa použitá ke klonování do pCVD442 Místa zavedená ke skríningu
místo 1 místo 2 místo 3 místo 4
aroC Xbal Sací Xhol Sphl
htrA Sáli Sphl Xhol Xbal
ompC Sáli Sací BlpI Xhol
ompF Sací Sphl BlpI Xhol
ompR Sáli Sací BlpI Sphl
Příklad 2
Bezpečnost a imunogenicita zeslabeného vakcinového kmene enterotoxigenické E.coli C aroC/ ompC/ ompF) zkoušena na lidech jako dobrovolnících
Studie je zaměřena na vyhodnocení kandidáta živého zeslabeného vakcinového kmene enterotoxigenické E.coli, jemnovitě shora popsaného ΛaroC/ AompC/ΔompF PTLOD3
Příprava očkovacích dávek vakciny
Bakteriální kmen se nanese na MacConkeyflv agar k zajištění čistoty a k potvrzení identity a pět kolonií se použije k naočkování baňky obsahující 200 ml kultivační půdy luria. Inkuo buje se po dobu smi hodin při teplotě + 37 C, načež se do kultivační půdy přidá 30 ml sterilního glycerolu a připraví se o
podíly Cl ml na fiolu). Sto takových fiol se zmrazí na -70 C. Tyto fioly obsahují očkovací dávku pro vakcinový kmen.
Čistota očkovací dávky je zaručena výběrem deseti náhodných fiol a jejich testování na bakteriální čistotu a nepři27
•φ ·· φ » φ φ • · φ ·
Φ Φ »
Μ · Φ » tomnost hub. Další tři fioly se testují ke zjištění poctu bakterií ve fiolách pomocí standardního destičkového načítání se sériovým ředěním kultivační půdy.
Příprava vakciny
Vakcina se připravuje čerstvá před každou vakcinací a všechny stupně přípravy očkovací látky se provádějí v bezpečnostní kabině. Den před vakcinací se nanese 0,2 ml na povrch destiček agaru luria pomocí chomáčků sterilní vaty k přípravě bakteriálního pole. Tatáž kultivační půda se naočkuje na destičky MacConkey a agar luria k čistotě. Agarové destičky se o
inkubují 18 hodin při teplotě 37 C v utěsněném kontejneru s indikačním páskem tamperresaistant k zajištění, že destičky nebyly temperovány během inkubace. Po inkubaci se pole bakterií sklidí 5 ml sterilní solanky pufrované fosfátem CPBS) a změří se optická hustota suspense. Příslušné množství této suspense, odpovídající požadované dávce, se vnesou do lahviček jednotkové dávky se 30 ml hydrogenuhličitanového pufru a podávají se dobrovolníkům. Připraví se zvlášt dávky vakciny a ponechají se v laboratoři a okamžitě po vakcinaci dobrovolníků se vyhodnotí skutečný počet bakterií v každé dávce pomocí standarního postupu načítání kolon s desetinásobným zředěním vakciny.
Postup zřeďování bakterií byl zřízen během předběžných studií za použití kultur, připravených a inkubovaných přesně jako při přípravě vakcin podávaných dobrovolníkům. Připravily se suspense s počtem živých bakterií očíslovaných počtem kolon sériových zředění a vztažených ke zjištěné optické hustotě. Na základě těchto předběžných studií byl vyvinut standardní způsob přípravy a hodnocení správných zředění bakterií k zajištění stanovených dávek.
Příprava pufru
9 9 9 » 9 9
9 9 9
9 9 9
9. 9 9 9
9 9 9
Jako pufru se používá hydrogenuhličitanu sodného ve vodě. Pro každou dávku vakciny se připraví,150 ml deionízované vody, obsahující 2 gramy hydrogenuhličitanu sodného, a sterilně se zfiltruje. Vnese se 30 ml pufru do 50 ml sterilních fiol a dávka vakcinových bakterií se přidá do těchto fiol. Zbytek 120 ml pufru se vlije do zvláštních sterilních lahví. V době vakcinace se dobrovolníkům podá napřed 120 ml pufru, pak o minutu později 30 ml pufru obsahujícího vakcinu.
Plán vakcinace
Skupina dobrovolníků se studuje způsobem eskalace dávek. První skupina dobrovolníků dostane dávku 5xl07 bakterií, druhá skupina dávku přibližně 5xl09 a třetí skupina dávku přibližně 5x10® .
Po tři dny od čtvrtého dne dostávají dobrovolnicí Ciprofloxacin 500 mg BID. Vysadí se šestého dne a provede se hematologie a chemický rozbor pro bezpečnost. Sérum se zachová pro měřen i prot i 1átek.
Devátý a čtrnáctý den se dobrovolníci vrátí k běžné vizitě pacientů a při tom se provede intervalová historie a získají se vzorky krve k serologickýra zkouškám. Celkem se shromáždí krev (40 ml) třikrát pro sérologii, před vakcinací a devátý a čtrnáctý den po vakcinaci.
Laboratorní testy
Až dva fekální vzorky se kultivují každý den pobytu dobrovolníků v nemocnici. Pro kvalitativní kultury se přenese fekální výtěr do transportního Cary Blairova media a předá se do laboratoře, kde je přímo naočkován na MacConkeyův agar a na MacConkeyův agar obsahující selektivní antibiotika pro vakcinový kmen. Ukázalo se, že až pět kolonií se sráželo pomocí an29 • ♦ «· ·« • · * * · · • 9 · · · * • · · · · · · • ♦ · · · • · * · 1» tiséra specifického pro vakcinový kmen. Ke kvantitativní kultuře (pouze první vzorek každého dne) se fekální vzorky zváží a zředí se v PBS, se sérií 10-násobných zředění do 10-4 a pak se 100 μΐ každého zředění nanese na MacConkeyův agar s antibiotiky. Podezřelé kolonie se potvrdí srážením anti-0 sérem.
Sérum se sbírá a uchová se pro následné zkoušky na protilátky proti antigenům CFAII způsobem ELISA a na baktericldní protilátky proti vakcinovému kmeni. Z plné krve se raononukleární buňky perlferální krve oddělí, shromáždí se do citrátu a promyjí se. Tyto buňky se kultivují při hustotě IQ7 buněk o
na ml v mediu tkáňové kultury RPMI 48 hodin při teplotě 48 C. Po 48 hodinách se supernatant přelije do kryofiol a zmrazí se na teplotu -20 C před vyzkoušením na protilátky IgG a IgA CFAII způsobem ELISA.
Tabulka III
Dnem vakclnace je den 0 pre -1 0 1 2 3 4 5 6 9 14
nábor/ skríning X
HCD (moč) X X
tréning/ souhlas X
pacient ve stavu X X X X X X X X
vakcinace X
návštěva pacienta X X X
kultury stolice kvant i tat ivn í X X X X X X X X X X
kultury stolice kvalitativní X X X X X X X X X X
sérologie X X X
SBC/chem panel x
x «0 « · » · · i
I 0 0 <
> 0 0 I ► 0 0 4 » 9 9
C i prof1oxac i n 500 mg BID pro 3d
XXX
Výsledky:
Žádné příznaky nebyly patrny u žádné skutečné dávky 6,8xl07 a 3,7xl08. Při větší dávce 4,7xl09 měla 1/6 dobrovolníků průjem a 2/6 měly křeče v břiše. Bakteriální úbytek byl patrný u všech dobrovolníků při velikosti dávek 5xl09 cfu první den po vakcinaci, dokud nenastartoval podle protokolu ciprofloxacin čtvrtý den po vakcinaci. To indikuje dobrou střevní kolonizaci, což je indikativní pro možné zavedení dobré imunitní odezvy. Při obou nižších dávkách byl vakcinový kmen získán od všech dobrovolníků alespoň v jednom bodě po vakcinaci, avšak doba exkrece byla snížena ve srovnání s dobou, která byla patrná při nejvyšší dávce.
V době podání přihlášky byla analýza imunitní odezvy, vyvolané vakcinou neúplná. Byly však analysovány IgA odezvy anti-CPA II v supernatantech kultury PBMNC vyčištěné od krevních recipientů nejvyšší dávky vakciny v den 0 Cpřed vakcinací) a sedmý a desátý den po vakcinaci Cobr.7). Supernatanty byly analyzovány způsobem ELISA na zkušebních destičkách povlečených vyčištěným antigenem CFAII. Hodnoty OD, pozorované na vzorcích od sedmého do desátého dne, byly významně vyšší než hodnoty u vzorků před vakcinaci, což dokazuje navození specifické odezvy IgA v těchto časových bodech. Podle očekávání vykazují odezvy vrchol sedmý den a sníženy jsou desátý den, což je konsistentní se sekrecí primovaných buněk IgA sekretujících B buňky z krve ke sliznicovým effektorovým místům střevní asociované lymfoidní CGut Associated Lymfoid> tkáně.
Závěry:
Ukázalo se, že zeslabený živý kmen ETEC C aroC/ ompC/ OmpF) • · ·» * · * ·· ·· • •9 · · ♦ · « · · 9 • · ♦ » · * · 9 9 9 * ·· * · » · 9 · 9 4 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 je dobře snášen zdravými dospělými dobrovolníky a kolonizuje vnitřnosti způsobem konsistentním s jejich použitím jako orální vakciny k ochraně proti cestovatelskému průjmu. Bylo také doloženo vyvolání specifické imunitní odezvy sliznic.
Průmyslová využitelnost
Zeslabený živý kmen ETEC ( aroC/ ompC/ OmpF) pro výrobu vakcin zvláště k ochraně proti cestovatelskému průjmu.
X, ♦ · · · ♦ · · · · ·· ··♦ · · · · · * 9 · ♦ · · · * « · ·«»* • ft 4k « « · · ·« ·« · • · · · · · · * · · · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 « ·
- L i teratura
1. Bacon G.A., Burrows T.V. a Yates Μ., Br. J. Exp. Pathol., 31, str. 714 až 24, 1950;
2. Chatfleld S.N., Charles I.G., Makoff A.J. a kol. Biotech. 10, str. 88Θ až 892, 1992a;
3. Chatfleld S.N., Strahan K. , Pickard D., Charles I.G., Hormaeche C.E. a Douga G., Microblol. Pathog. 12, str.145 až 151, 1992b;
4. Curtiss III, R. a Kelly S.M. , Infect. Immun. 55, str. 3035 až 3043, 1987;
5- Dougan G. , Chatfield S., Pickard D., Bester J., 0 Callaghan D. a Maskell D., J. Inf. Dis. 158, str. 1329 až 1335, 1988;
6. Fairveather N.F., Chatfiel S.N., Makoff A.J. a kol. Infect. Immun. 58, str. 1323 až 1329, 1990;
7- Gomaz-Duarte O.G., Galen J., Chatfield S.N., Vaccine 13, str. 1596 až 1602, 1995;
8. Hohmann E.L., Oletta C.A, Killeen K-P. a Miller S.I., Vaccine 14, str. 19 až 24, 1996;
9. Hone D., Morona R., Attridge S. a Hackett J., J. Infect. Dis., 156, str. 167 až 1, (1987;
10. Jones P.V. , Dougan G., Haywood C. , MacKensie N., Collins P. a Chatfield, S.N., Vaccine 9, str. 29 až 36, 1991;
11. Levine N.M., Galen J., Barry E. a kol., J. Biotech- 44, str. 193 až 196, 1995;
3.
• · · ·
12. Mi Her S.I., Kukral A.M. a Mekalanos J.J., Proč. Nat. Acad. Sci, USA 86, str. 5054 až 5058, 1989;
13. Pickard D., Li J.L., Roberts Μ., Maskell D., Hone D., Levine Μ., Douglas 0. a Chatfield S., Infection and Immunity 62, str. 3984 až 3993, 1994;
14. Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989;
15. Strugnell R.A., Dougan G., Chatfield S.N., a kol., Infect. Immun. 60, str. 3994 až 4002, 1992;
EP-B-0322237
EP-B-0400958
EP-B-0524205 (Doudan a kol (Dougan a kol (Dougan a kol
V0 92/15689 (Charles a kol
20. Everest P., Allen J. Papakonstantinopoulou A., Mastroeni P., Roberts M. a Dougan G., FEMS Microbiol. Letts., 126, str. 97 až 101, 1995;
21. Chattfield S.N., Dorman C.J., Hayvard C. a Dougan G. , Infection St Immunity 59, str. 449 až 452, 1991;
22. Donnenberg M.S. a Kaper J.B., Infection and Immunity 59, str. 4310 až 4317 (1991.
fc· fcfc • fcfc • fcfcfc • · · • fcfcfc · ·
• · · · • · fcfc
Seznam sekvenc í
Cl) Obecné informace i) Přihlašovatel
A) Jméno: Peptide Therapeutics Limited
B) Ulice: ioo Fulbourn Road
C) Město'- Cambridge
D) Stát: není použitelné
E) Země: Spojené království
F) Poštovní kód CZIP): CB1 9PT ií) Název vynálezu :Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití iii) Počet sekvencí: 6 iv) Forma pro počítač
A) Typ média: Floppy disk
B) Počítač: IBM PC kompatibilní
C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS
D) Software: Patentln Release # 1.0. Version # 1.30 CEPO)
v) Platné přihlašovací údaje Číslo přihlášky:
2. Informace o sekv ID. Č.l
i) Charakteristiky sekvence
A) Délka: 1690 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina
C) Řetězcovitost.: dva řetězce
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA Cgenomická) vi) Zdroj původu
A) Organizmus: aroC E. coli ix) Charakteristiky
A) Jméno/klíč: CDS
B) lokace: 492..1562 Popis sekvence: SEQ ID N0;l xi )
3C • · *· 9 99 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 •999 9 9 9 9999
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 999 ·· 99 ··
GTC<?ACGCGG TGGATATCTC TCCAGACGCG CTGGCGGTTG CTGAACAGAA CATCGAAGAA 60
CACGGTCTGA TCCACAACGT CATTCCGATT CGTTCCGATC TGTTCCGCGA CTTGCCGAAA 120
GTGCAGTACG ACCTGATTGT CACTAACCCG CCGTATGTCG ATGCGAAGAT ATGTCCGACC 180
TGCCAAACAA TACCGCCACG AGCCGGAACT GGGCCTGGCA TCTGGCACTG ACGGCCTGAA 240
ACTGACGCGT CGCATTCTCG GTAACGCGGC AGATTACCTT GCTGATGATG GCGTGTTGAT 300
TTGTGAAGTC GGCAACAGCA TGGTACATCT TATGGAACAA TATCCGGATG TTCCGTTCAC 360
CTGGCTGGAG TTTGATAACG GCGGCGATGG TGTGTTTATG CTCACCAAAG AGCAGCTTAT 420
TGCCGCACGA GAACATTTCG CGATTTATAA AGATTAAGTA AACACGCAAA CACAACAATA 480
ACGGAGCCGT G ATG GCT GGA AAC ACA ATT GGA CAA CTC TTT CGC GTA ACC 530
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin Leu Phe Arg Val Thr
5 10
ACC TTC GGC GAA TCG CAC GGG CTG GCG CTC GGC TGC ATC GTC GAT GGT 578
Thr Phe Gly Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys Ile Val Asp Gly
20 25
GTT CCG CCA GGC ATT CCG CTG ACG GAA GCG GAC CTG CAA CAT GAC CTC 626
Val Pro Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gin His Asp Leu
35 40 45
GAC CGT CGT CGC CCT GGG ACA TCG CGC TAT ACC ACC CAG CGC CGC GAG 674
Asp Arg Arg Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gin Arg Arg Glu
55 60
CCG GAT CAG ,GTC AAA ATT CTC TCC GGT GTT ITT GAA GGC GTT ACT ACC 722
Pro Asjs Gin Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe Glu Gly Val Thr Thr
70 75
GGC ACC AGC ATT GGC TTG KG ATC GAA AAC ACT GAC CAG CGC TCT CAG 770
Gly Thr Ser Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr Asp Gin Arg Ser Gin
80 85 90
GAT TAC AGT GCG ATT AAG GAC GTT TTC CGT CCA GGC CAT GCC GAT TAC 818
Asp Tyr Ser Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr
95 100 105
ACC TAC GAA CAA AAA TAC GGT CTG CGC GAT TAT CGC GGC GGT GGA CGT 866
Thr Tyr Glu Gin Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg
110 115 120 125
TCT TCC GCC CGC GAA ACC GCC ATG CGC GTG GCG GCA GGA GCT ATT GCC 914
Ser Ser Ala Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala Ile Ala
130 135 140
AAA AAA TAT CTC GCC GAG AAA TTT GGT ATT GAA ATC CGT GGC TGC CTG 962
Lys Lys Tyr Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu
145 150 155
ACC CAG ATG GGC GAC ATT CCG CTG GAT ATC AAA GAC TGG TCG CAG GTC 1010
Thr Gin Met Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val
160 165 170
GAG CAA AAT CCG TTT TTT TGC CCG GAC CCC GAC AAA ATC GAC GCG TTA 1058
Glu Gin Asn Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu
175 180 185
GAC GAG TTG ATG CGT GCG CTG AAA AAA GAG GGC GAC TCC ATC GGC GCT 1106
Asp Glu Leu Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala
190 195 200 205
AAA GTC ACC GTT GTT GCC AGT GGC GTT CCT GCC GGA CTT GGC GAG CCG 1154
Lys Val Thr Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro
X , 210 215 220
GTC TTT GAC CGC CTG GAT GCT GAC ATC GCC CAT GCG CTG ATG AGC ATC 1202
Val Phe Asp Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile
··· • 9 · · » » • 99 · ♦ · • 999 ·· · · · · * * *
Vl·
Apť 225 230 235
AAC GCG GTG AAA GGC GTG GAA ATT GGC GAC GGC TTT GAC GTG GTG GCG 1250
Asn Ala Val Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala
240 • 245 250
CTG CGC GGC AGC CAG AAC CGC GAT GAA ATC ACC AAA GAC GGT TTC CAG 1298
Leu Arg Gly Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin
255 260 265
AGC AAC CAT GCG GGC GGC ATT CTC GGC GGT ATC AGC AGC GGG CAG CAA 1346
Ser Asn His Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gin Gin
270 275 280 285
ATC ATT GCC CAT ATG GCG CTG AAA CCG ACC TCC AGC ATT ACC GTG CCG 1394
Ile Ile Ala His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro
290 295 300
GGT CGT ACC ATT AAC CGC πτ GGC GAA GAA GTT GAG ATG ATC ACC AAA 1442
Gly Arg Thr Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys
305 310 315
GGC CGT CAC GAT CCC TGT GTC GGG ATC CGC GCA GTG CCG ATC GCA GAA 1490
Gly Arg His Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu
320 325 330
GCG AAT GCT GGC GAT CGT TTT AAT GGA TCA CCT GTT ACG GCA ACG GGC 1538
Ala Asn Ala Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly
335 340 345
GCA AAA TGC CGA TGT GAA GAC TGA TATTCCACGC TGGTAAAAAA TGAATAAAAC 1592 Ala Lys Cys Arg Cys Glu Asp *
350 355
X .
CGCGATTGCG CTGCTGGCTC TGCTTGCCAG TAGCGCCAGC CTGGCAGCGA CGCCGTGGCA 1652
AAAAATAACC CAACCTGTGC CGGGTAGCGC CAAATCGA
1690 • 9 9
999
9
9 9
9999 99
9 9 9
9 9
9 9
9 9
999 99
2. Informace o sekv ID. Č.2 i) Charakteristiky sekvence
A) Délka: 356 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární i i) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2
Met Ala Gly Asn Thr Ile Gly Gin
1 5
Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly
20
Gly Ile Pro Leu Thr Glu Ala Asp
35 40
Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr
50 55
Val Lys Ile Leu Ser Gly Val Phe
65 70
Ile Gly Leu Leu Ile Glu Asn Thr
85
Ala Ile Lys Asp Val Phe Arg Pro
100
Gin Lys Tyr fily Leu Arg Asp Tyr
A 115 120
Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala
130 135
Leu Phe Arg Val Thr Thr Phe Gly 10 15
Cys Ile Val Asp Gly Val Pro Pro 25 30
Leu Gin His Asp Leu Asp Arg Arg 45
Thr Gin Arg Arg Glu Pro Asp Gin 60
Glu Gly Val Thr Thr Gly Thr Ser 75 80
Asp Gin Arg Ser Gin Asp Tyr Ser 90 95
Gly His Ala Asp Tyr Thr Tyr Glu 105 110
Arg Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ala 125
Ala Gly Ala Ile Ala Lys Lys Tyr 140
toto toto • · ·· ·· toto to* to ·· * • toto « to toto · to ·· · • to ··
Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ile Arg Gly Cys Leu Thr Gin Met
145 150 155 160
Gly Asp Ile Pro Leu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Gin Val Glu Gin Asn
165 170 175
Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys Ile Asp Ala Leu Asp Glu Leu 180 185 190
Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser Ile Gly Ala Lys Val Thr 195 200 205
Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro Val Phe Asp 210 215 220
Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ala His Ala Leu Met Ser Ile Asn Ala Val
225 230 235 240
Lys Gly Val Glu Ile Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala Leu Arg Gly
245 250 255
Ser Gin Asn Arg Asp Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe Gin Ser Asn His 260 265 270
Ala Gly Gly Ile Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gin Gin Ile Ile Ala 275 280 285
His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser Ile Thr Val Pro Gly Arg Thr 290 295 300
Ile Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met Ile Thr Lys Gly Arg His 305 310 315 320
Asp Pro Cys Val Gly Ile Arg Ala Val Pro Ile Ala Glu Ala Asn Ala 325 330 335 • 4 44 4 44 44 44
444 4444 4444
4444 44 4 4 44 ·
44 44 444 44 4
44 444 4444 •444 44 444 44 44 44
Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly Ala Lys Cys 340 345 350
Arg Cys Glu Asp * . 355.
2. Informace o sekv ID. C.3 i) Charakteristiky sekvence
A) Délka: 1713 párů bází
B) TyP: nukleová kyselina
C) D) Řetězcovítost: Topologie: lin dva řetězce eární
i i) Typ molekuly· DNA (genomická)
vil Zdroj původu
A) Organ i zmus ' ompC E. co1 i
ix) Charakter i st i ky
A) Jméno/klίδ: CDS
B) lokace: 491 . · 1594
xi) Popis sekvence· SEQ ID NO:3
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
GTTAACAAGC GTTATAGTTT TTCTGTGGTA GCACAGAATA ATGAAAAGTG TGTAAAGAAG 60
GGTAAAAAAA ACCGAATGCG AGGCATCCGG TTGAAATAGG GGTAAACAGA CATTCAGAAA 120
TGAATGACGG TAATAAATAA AGTTAATGAT GATAGCGGGA GTTATTCTAG TTGCGAGTGA 180
AGGTTTTGTT TTGACATTCA GTGCTGTCAA ATACTTAAGA ATAAGTTATT GATTTTAACC 240
Λ . '
TTGAATTATT ATTGCTTGAT GTTAGGTGCT TATTTCGCCA TTCCGCAATA ATCTTAAAAA 300
GTTCCCTTGC ATTTACATTT TGAAACATCT ATAGCGATAA ATGAAACATC TTAAAAGTTT 360
99 • · · • · ♦ ·
Μ·· *·
99 *9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
99
TAGTATCATA TTCGTGTTGG ATTATTCTGC ATTTTTGGGG AGAATGGACT TGCCGACTGA 420
TTAATGAGGG TTAATCAGTA TGCAGTGGCA TAAAAAAGCA AATAAAGGCA TATAACAGAG 480
GGTTAATAAC ATG AAA GTT AAA GTA CTG TCC CTC CTG GTC CCA GCT CTG 529
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu
360 365 370
CTG GTA GCA GGC GCA GCA AAC GCT GCT GAA GTT TAC AAC AAA GAC GGC 577
Leu Val Ala Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly
375 380 - 385
AAC AAA TTA GAT CTG TAC GGT AAA GTA GAC GGC CTG CAC TAT TTC TCT 625
Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser
390 395 400
GAC AAC AAA GAT GTA GAT GGC GAC CAG ACC TAC ATG CGT cn GGC TTC 673
Asp Asn Lys Asp Val Asp Gly Asp Gin Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe
405 410 415
AAA GGT GAA ACT CAG GTT ACT GAC CAG CTG ACC GGT TAC GGC CAG TGG 721
Lys Gly Glu Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp
420 425 430
GAA TAT CAG ATC CAG GGC AAC AGC GCT GAA AAC GAA AAC AAC TCC TGG 769
Glu Tyr Gin Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp
435 440 445 450
ACC CGT GTG GCA TTC GCA GGT CTG AAA TTC CAG GAT GTG GGT TCT TTC 817
Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin Asp Val Gly Ser Phe
455 460 465
GAC TÁC GGT CGT AAC TAC GGC GTT GTT TAT GAC GTA ACT TCC TGG ACC 865
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr
470
475
480
• Φ 4 4 · 4 4
4 4 4 (ί 4 4 · « 4 4 »··
I» 44 4 4 4 • 444 4 4 4 4 • · 4 •444 44
4 • 4
4 »»
GAC GTA CTG CCA GAA TTC GGT GGT GAC ACC TAC GGT TCT GAC AAC TTC 913
Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe
485 490 495
ATG CAG CAG CGT GGT AAC GGC TTC GCG ACC TAC CGT AAC ACT GAC TTC 961
Met Gin Gin Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe
500 505 510
TTC GGT CTG GTT GAC GGC CTG AAC πτ GCT GTT CAG TAC CAG GGT AAA 1009
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Gin Gly Lys
515 520 525 530
AAC GGC AAC CCA TCT GGT GAA GGC TTT ACT AGT GGC GTA ACT AAC AAC 1057
Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn
535 540 545
GGT CGT GAC GCA CTG CGT CAA AAC GGC GAC GGC GTC GGC GGT TCT ATC 1105
Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile
550 555 560
ACT TAT GAT TAC GAA GGT TTC GGT ATC GGT GGT GCG ATC TCC AGC TCC 1153
Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser
565 570 575
AAA CGT ACT GAT GCT CAG AAC ACC GCT GCT TAC ATC GGT AAC GGC GAC 1201
Lys Arg Thr Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp
580 585 590
CGT GCT GAA ACC TAC ACT GGT GGT CTG AAA TAC GAC GCT AAC AAC ATC 1249
Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile
595 600 605 610
TAC CTG GCT GCT CAG TAC ACC CAG ACC TAC AAC GCA ACT CGC GTA GGT 1297
Tyr Leň1 Ala Ála Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly
615 620 625
TCC CTG GGT TGG GCG AAC AAA GCA CAG AAC TTC GAA GCT GTT GCT CAG 1345
A• ·
Ser Leu Gly Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin
630 635 640
TAC CAG TTC GAC TTC GGT CTG CGT CCG TCC CTG GCT TAC CTG CAG TCT 1393
Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser
645 650 655
AAA GGT AAA AAC CTG GGT CGT GGC TAC GAC GAC GAA GAT ATC CTG AAA 1441
Lys Gly Lys Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys
660 665 670
TAT GTT GAT GTT GGT GCT ACC TAC TAC TTC AAC AAA AAC ATG TCC ACC 1489
Tyr Val Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr
675 680 685 690
TAC GTT GAC TAC AAA ATC AAC CTG CTG GAC GAC AAC CAG TTC ACT CGT 1537
Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg
695 700 705
GAC GCT GGC ATC AAC ACT GAT AAC ATC GTA GCT CTG GGT CTG GTT TAC 1585
Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr
710 715 720
CAG TTC TAA TCTCGATTGA TATCGAACAA GGGCCTGCGG GCCCTTTTTT 1634
Gin Phe *
725
CATTGTTTTC AGCGTACAAA CTCAGTTTTT TGGTGTACTC TTGCGACCGT TCGCATGAGG 1694
ATAATCACGT ACGGAAATA 1713
2. Informace o sekv ID. C.4 i) Charakteristiky sekvence
A) Délka· 367 aminokyselin
B) Typ: am i nokyselina D) Topologie: lineární
* ·
Φ Φ » · Φ (
Φ· ΦΦ • » · · • · ·
Φ Φ · ·
Φ Φ Φ · • · · • · Φ · · Φ φφφ i i) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala 15 10 15
Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu 20 25 30
Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys 35 40 45
Asp Val Asp Gly Asp Gin Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu 50 55 60
Thr Gin Val Thr Asp Gin Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Gin
70 75 80
Ile Gin Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val
90 95
Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gin Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly 100 105 110
Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu 115 120 125
Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gin Gin 130 135 140
Arg Gly A'sn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu A
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Gin Gly Lys Asn Gly Asn
165
170
175
-X• · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · ·· • · · · · ·
Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp 180 185 190
Ala Leu Arg Gin Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp .195 200 205
Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr 210 215 220
Asp Ala Gin Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala
245 250 255
Ala Gin Tyr Thr Gin Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly 260 265 270
Trp Ala Asn Lys Ala Gin Asn Phe Glu Ala Val Ala Gin Tyr Gin Phe 275 280 285
Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gin Ser Lys Gly Lys 290 295 300
Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp
325 330 335
Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gin Phe Thr Arg Asp Ala Gly 340 345 350
Ile AsrŘTřjr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gin Phe * 355 360 365
v
2. Informace o sekv ID. C.5 i) Charakteristiky sekvence
A) Délka: 1808 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina
C) Řetězcovítost: dva řetězce
D) Topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) vi) Zdroj původu
A) Organizmus: ompF E. coli ix) Charakteristiky
A) Jméno/klíč: CDS
B) lokace: 457..1545 xi) Popis sekvence’· SEQ ID NO: 5
AAAACTAATC CGCATTCTTA HGCGGAKA GTTTTTTCTT AGCTAATAGC ACAATTTTCA 60
TACTATTTTT TGGCATTCTG GATGTCTGAA AGAAGATTTT GTGCCAGGTC GATAAAGTTT 120
CCATCAGAAA CAAAATTTCC GTTTAGTTAA TTTAAATATA AGGAAATCAT ATAAATAGAT 180
TAAAATTGCT GTAAATATCA TCACGTCTCT ATGGAAATAT GACGGTGTTC ACAAAGTTCC 240
TTAAATTTTA CTTÍTGGTTA CATATTTTTT CTTTTTGAAA CCAAATCTTT ATCTTTGTAG 300
CACTTTCACG GTAGCGAAAC GTTAGTTTGA ATGGAAAGAT GCCTGCAGAC ACATAAAGAC 360
ACCAAACTCT CATCAATAGT TCCGTAAATT TTTATTGACA GAACTTATTG ACGGCAGTGG 420
X .
CAGGTGTCAT AAAAAAAACC ATGAGGGTAA TAAATA ATG ATG AAG CGC AAT ATT 474 Met Met Lys Arg Asn Ile
5tí CTG GCA GTG ATC GTC CCT GCT CTG HA GTA GCA GGT ACT GCA AAC GCT
Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala
15 20
GCA GAA ATC-TAT AAC AAA GAT GGC AAC AAA GTA GAT CTG TAC GGT AAA
Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys
30 35
GCT GH GGT CTG CAT TAT ITT TCC AAG GGT AAC GGT GAA AAC AGT TAC
Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr
45 50
GGT GGC AAT GGC GAC ATG ACC TAT GCC CGT CTT GGT TH AAA GGG GAA
Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu
60 65 70
ACT CAA ATC AAT TCC GAT CTG ACC GGT TAT GGT CAG TGG GAA TAT AAC
Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gin Trp Glu Tyr Asn
80 85
TTC CAG GGT AAC AAC TCT GAA GGC GCT GAC GCT CAA ACT GGT AAC AAA
Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gin Thr Gly Asn Lys
95 100
ACG CGT CTG GCA HC GCG GGT CH AAA TAC GCT GAC GH GGT TCT HC
Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe
105 110 115
GAT TAC GGC CGT AAC TAC GGT GTG GH TAT GAT GCA CTG GGT TAC ACC
Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr
120 125 130
GAT ATG CTG CCA GAA TH GGT GGT GAT ACT GCA TAC AGC GAT GAC HC
Asp Mfct (_eu'Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe
135 140 145 150
HC GH GGT CGT GH GGC GGC GH GCT ACC TAT CGT AAC TCC AAC HC • 0 0 0 «··· 0 0 0 00 00 00
522
570
618
666
714
762
810
858
906
954 • ·
-á1 -
Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe
155 160 165
τπ GGT CTG GTT GAT GGC CTG AAC nc GCT ΰπ CAG TAC CTG GGT AAA 1002
Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gin Tyr Leu Gly Lys
170 175 180
AAC GAG CGT GAC ACT GCA CGC CGT TCT AAC GGC GAC GGT ΰπ GGC GGT 1050
Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly
185 190 195
TCT ATC AGC TAC GAA TAC GAA GGC τπ GGT ATC θπ GGT GCT TAT GGT 1098
Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Val Gly Ala Tyr Gly
200 205 210
GCA GCT GAC CGT ACC AAC CTG CAA GAA GCT CAA CCT CTT GGC AAC GGT 1146
Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala Gin Pro Leu Gly Asn Gly
215 220 225 230
AAA AAA GCT GAA CAG TGG GCT ACT GGT CTG AAG TAC GAC GCG AAC AAC 1194
Lys Lys Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn
235 240 245
ATC TAC CTG GCA GCG AAC TAC GGT GAA ACC CGT AAC GCT ACG CCG ATC 1242
Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro Ile
250 255 260
ACT AAT AAA τπ ACA AAC ACC AGC GGC πο GCC AAC AAA ACG CAA GAC 1290
Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gin Asp
265 270 275
GTT CTG TTA GH GCG CAA TAC CAG πο GAT πο GGT CTG CGT CCG TCC 1338
Val Leu Leu 7Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser
28Q > 285 290
ATC GCT TAC ACC AAA TCT AAA GCG AAA GAC GTA GAA GGT ATC GGT GAT 1386
Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val Glu Gly Ile Gly Asp
295 300 305 310
GTT GAT CTG GTG AAC TAC TTT GAA GTG GGC GCA ACC TAC TAC TTC AAC
Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn
- 315 320 325
AAA AAC ATG TCC ACC TAT GTT GAC TAC ATC ATC AAC CAG ATC GAT TCT
Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile Asn Gin Ile Asp Ser
330 335 340
GAC AAC AAA CTG GGC GTA GGT TCA GAC GAC ACC GTT GCT GTG GGT ATC
Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr Val Ala Val Gly Ile
345 350 355
GTT TAC CAG TTC TAA TAGCACACCT CTTTGTTAAA TGCCGAAAAA ACAGGACTTT 1585 Val Tyr Gin Phe *
360
GGTCCTGTTT TTTTTATACC TTCCAGAGCA ATCTCACGTC TTGCAAAAAC AGCCTGCGTT 1645
TTCATCAGTA ATAGTTGGAA TTTTGTAAAT CTCCCGTTAC CCTGATAGCG GACTTCCCTT 1705
CTGTAACCAT AATGGAACCT CGTCATGTTT GAGAACATTA CCGCCGCTCC TGCCGACCCG 1765
ATTCTGGGCC TGGCCGATCT GTTTCGTGCC GATGAACGTC CCG 1808
2. Informace o sekv ID. C.6 i) Charakteristiky sekvence
A) Délka: 362 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina D) Topologie: lineární i i) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6
A , '
X -
Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys
- 20 25 30
Val Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly
35 40 45
Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg
50 55 60
Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gin Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Gin Trp Glu Tyr Asn Phe Gin Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Ala Gin Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr
100 105 110
Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr
130 135 140
Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala
165 170 175
Va\ Gin Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn
180. 185 190
Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly • · ·· · · · · · · · · • · · ·♦*···· ···· ·· ··· ·· ·· ··
195 200 205
Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gin Glu Ala 210 215 220
Gin Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gin Trp Ala Thr Gly Leu
225 230 235 240
Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr
245 250 255
Arg Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe 260 265 270
Ala Asn Lys Thr Gin Asp Val Leu Leu Val Ala Gin Tyr Gin Phe Asp 275 280 285
Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp 290 295 300
Val Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly
305 310 315 320
Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile
325 330 335
Ile Asn Gin Ile Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly.Val Gly Ser Asp Asp 340 345 350
Thr Val Ala Val Gly Ile Val Tyr Gin Phe *

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY • 9 9 9 « »99 «99 ί ·♦· · · «·· 99
    9999 «9 999
    1. Bakterie zeslabená nevratnou mutací v genu aroC, v genu ompF a v genu ompC.
  2. 2. Bakterie podle nároku 1, která infikuje orální cestou.
  3. 3. Bakterie podle nároku 1 z rodu Escherichia, Salmonela, Vibrio, Haemofilus, Neisseria, Yersinia, Bordetela nebo Bručela.
  4. 4. Bakterie podle nároku 3 kmene Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enter it-idis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis a Brucella abortus.
  5. 5. Bakterie podle nároku 4 kmene enterotoxigenní E. coli CETEC).
  6. 6. Bakterie podle nároku 1 až 5, která je přídavně zeslabená mutací ve čtvrtém genu.
  7. 7. Bakterie podle nároku 6, přičemž čtvrtým genem je aroA, aroD, aroE, pur, htrft, galE, cya, crp, phoP nebo surA.
  8. 8. Bakterie podle nároku 1 až 7, přičemž mutací v každém genu je definovaná mutace.
  9. 9. Bakterie podle nároku 1 až 8, přičemž mutací v každém genu je delece celé kódující sekvence.
  10. 10. Bakterie podle nároku 1 až 9, která je geneticky konstruovaná k expresi heterologového antigenů.
    y 4 · 4 · • · · · 4 ? 4 · • 4 4 4 4 · ♦
    4* 4 « · 44 4 • 44 4·· 4444 •444 44 ·4· 4· »· ··
  11. 11. Bakterie podle nároku 10, přičemž exprese antigenu je hnána promotorem nirB nebo promotorem htrft.
  12. 12. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje bBakterii podle nároku 1 až 11 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  13. 13. Bakterie podle nároku 1 až 11 pro vakcinaci lidí nebo žvířat.
  14. 14. Enterotoxigenní buiňka E. coli zeslabená nevratnou mutací v genu aroC, v genu ompF a v genu ompC pro vakcinaci lidí nebo žvířat proti průjmu.
  15. 15. Použití bakterie podle nároku 1 až 11 pro výrobu léčiva pro vakcinaci lidí a zvířat.
  16. 16. Způsob zvýšení imunitní odezvy savců, vyznačující se tím, že se savcům podává bakterie zeslabená nevratnou mutací v genu aroC, v genu ompF a v genu ompC.
CZ20003470A 1998-03-25 1999-03-25 Bakterie zeslabená nevratnou mutací, vakcína, která ji obsahuje a její použití CZ301520B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9806449.6A GB9806449D0 (en) 1998-03-25 1998-03-25 Attenuated bacteria useful in vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20003470A3 true CZ20003470A3 (cs) 2001-07-11
CZ301520B6 CZ301520B6 (cs) 2010-03-31

Family

ID=10829280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003470A CZ301520B6 (cs) 1998-03-25 1999-03-25 Bakterie zeslabená nevratnou mutací, vakcína, která ji obsahuje a její použití

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6902906B1 (cs)
EP (1) EP1066376B1 (cs)
JP (1) JP4516210B2 (cs)
KR (1) KR100628657B1 (cs)
AT (1) ATE296881T1 (cs)
AU (1) AU763683B2 (cs)
CA (1) CA2323576C (cs)
CZ (1) CZ301520B6 (cs)
DE (1) DE69925585T2 (cs)
DK (1) DK1066376T3 (cs)
ES (1) ES2244182T3 (cs)
GB (1) GB9806449D0 (cs)
HU (1) HU225644B1 (cs)
NO (1) NO327609B1 (cs)
NZ (1) NZ507077A (cs)
PL (1) PL196076B1 (cs)
PT (1) PT1066376E (cs)
WO (1) WO1999049026A1 (cs)
ZA (1) ZA200004987B (cs)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7138237B1 (en) * 2000-05-19 2006-11-21 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis, prevention and treatment of Crohn's disease using the OmpC antigen
WO2002057780A1 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Newcastle University Ventures Ltd. Biosensor with covalently attached membrane-spanning proteins
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US7357935B2 (en) * 2003-05-14 2008-04-15 Wyeth Avian E. coli vaccine for protection against colibacillosis
US7297338B2 (en) * 2003-05-14 2007-11-20 Wyeth Avian vaccine composition for the protection of poultry against disease and infection caused by E. coli and Salmonella
EP1981536A4 (en) * 2006-02-01 2012-03-14 Gotovax Ab COLONIZATIONAL FACTOROUS ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI IN RECOMBINANT BACTERIA
JP2008054614A (ja) * 2006-09-01 2008-03-13 Nippon Inst For Biological Science 鶏大腸菌由来弱毒変異株、鶏大腸菌対策用ワクチン、免疫方法及び鶏用ワクチンベクター
CN101522210B (zh) 2006-09-18 2017-03-22 阿肯色大学评议会 增强免疫应答的组合物和方法
JP2011502165A (ja) * 2007-10-30 2011-01-20 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 鞭毛細菌に対する免疫応答を強化する組成物および方法
PT2214701T (pt) 2007-11-01 2016-11-02 Univ Guelph Composições e métodos de potenciar respostas imunes a eimeria
JP6242050B2 (ja) 2010-01-21 2017-12-06 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫応答を増強するワクチンベクターおよび方法
KR102008120B1 (ko) 2010-06-09 2019-08-07 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법
WO2014037445A1 (en) * 2012-09-05 2014-03-13 Lohmann Animal Health Gmbh Preparation of live vaccines
HK1213949A1 (zh) * 2012-12-07 2016-07-15 Elanco Tiergesundheit Ag 活疫苗制备
WO2014127185A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection
JP6530742B2 (ja) 2013-03-15 2019-06-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 腸内病原体の免疫応答を強化する組成物及び方法
JP7467027B2 (ja) 2016-05-03 2024-04-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー 免疫刺激性ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドを含む酵母ワクチンベクター並びにそれを使用する方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8730037D0 (en) 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
ATE111957T1 (de) * 1990-02-06 1994-10-15 Pasteur Institut Transformiertes shigella.
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
PL170938B1 (pl) * 1991-03-05 1997-02-28 Wellcome Found Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella PL PL

Also Published As

Publication number Publication date
DK1066376T3 (da) 2005-10-03
ZA200004987B (en) 2001-10-31
PL196076B1 (pl) 2007-12-31
CA2323576C (en) 2010-12-07
CZ301520B6 (cs) 2010-03-31
ES2244182T3 (es) 2005-12-01
DE69925585T2 (de) 2006-07-13
HUP0105430A3 (en) 2004-10-28
US6902906B1 (en) 2005-06-07
WO1999049026A1 (en) 1999-09-30
KR100628657B1 (ko) 2006-09-26
CA2323576A1 (en) 1999-09-30
AU763683B2 (en) 2003-07-31
EP1066376A1 (en) 2001-01-10
AU3045899A (en) 1999-10-18
HUP0105430A2 (hu) 2002-04-29
PL343246A1 (en) 2001-07-30
NO20004781L (no) 2000-11-08
ATE296881T1 (de) 2005-06-15
JP4516210B2 (ja) 2010-08-04
NO20004781D0 (no) 2000-09-25
NO327609B1 (no) 2009-08-31
HU225644B1 (en) 2007-05-02
KR20010042175A (ko) 2001-05-25
NZ507077A (en) 2002-10-25
EP1066376B1 (en) 2005-06-01
GB9806449D0 (en) 1998-05-27
DE69925585D1 (de) 2005-07-07
PT1066376E (pt) 2005-10-31
JP2002507414A (ja) 2002-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0139950B1 (ko) 무병원성 미생물 및 이의 용도
CA1335661C (en) Non-reverting shigella live vaccines
US8889121B2 (en) Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid
US8465755B2 (en) Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
JP2002521345A (ja) 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン
EP0500699B1 (en) Cross-protective salmonella vaccines
AU763683B2 (en) Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroC, ompF and ompC genes, useful as vaccines
Ahmed et al. Protection of adult rabbits and monkeys from lethal shigellosis by oral immunization with a thymine-requiring and temperature-sensitive mutant of Shigella flexneri Y
KR102071743B1 (ko) 신규의 약독화된 시겔라 생백신
CA2143299A1 (en) Novel bacterial vaccines using vaccine strains of pathogenic bacteria
ES2218602T3 (es) Vacunas vivas contra patogenos gram-negativos que expresan o-antigenos heterologos.
JP2004337175A (ja) 無毒性微生物及びその使用：サルモネラ
JP2009531029A (ja) 弱毒化サルモネラ生ワクチン
JPH05502381A (ja) Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ中の制限酵素断片欠損の単離法およびその調製物
JP2002536339A (ja) 細菌毒性におけるｄｎａメチル化の必須な役割に基づいて病原性細菌感染を処置および予防するための組成物および方法
US6905691B1 (en) Vaccines containing attenuated bacteria
RU2455024C1 (ru) Аттенуированные бактерии bordetella pertussis, вакцина против возбудителя коклюша
EP1037664A1 (en) Vaccines containing attenuated bacteria
MXPA00009354A (en) Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroc, ompf and ompc genes, useful as vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130325