ES2218602T3 - Vacunas vivas contra patogenos gram-negativos que expresan o-antigenos heterologos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE CEPAS VEHICULO DE VACUNAS GRAMNEGATIVAS VIVAS ATENUADAS, QUE RESULTAN UTILES PARA LA EXPRESION Y LA ADMINISTRACION DE O - ANTIGENOS HETEROLOGOS (O - PS) PROCEDENTES DE PATOGENOS GRAM-NEGATIVOS. DICHAS CEPAS SON DEFICIENTES EN CUANTO A LA EXPRESION DE O - PS HOMOLOGOS DEBIDO A UNA MODIFICACION GENETICA DEFINIDA, PREFERIBLEMENTE UNA DELECION, Y POR TANTO SON CAPACES DE EXPRESAR DE FORMA EFICAZ UN O - PS HETEROLOGO DESEADO, DE TAL FORMA QUE SE ENCUENTRE UNIDO DE FORMA COVALENTE AL NUCLEO LPS HOMOLOGO O HETEROLOGO DEL LIPIDO A. LA PRESENTE INVENCION TRATA ADEMAS DE CEPAS VEHICULO DE VACUNAS VIVAS QUE CONTIENEN UN GEN HETEROLOGO O UNA SERIE DE GENES HETEROLOGOS QUE CODIFICAN O - PS. PREFERIBLEMENTE, ESTAS CEPAS CONTIENEN ADEMAS LOS GENES NECESARIOS PARA LA SINTESIS DE LPS HETEROLOGO COMPLETO LISO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN TRATA DE VACUNAS VIVAS QUE INCLUYEN DICHAS CEPAS, PREFERIBLEMENTE PARA LA INMUNIZACION CONTRA PATOGENOS ENTERICOS GRAM-NEGATIVOS.

Description

Vacunas vivas contra patógenos gram-negativos que expresan O-antígenos heterólogos.

La presente invención se refiere a cepas portadoras de vacunas gram-negativas vivas atenuadas, que son útiles para la expresión y administración de O-antígenos (O-PS)heterólogos de patógenos gram-negativos. Estas cepas son deficientes en la expresión de O-PS homólogos, debido a una deleción definida dentro del gen rfbA, rfbB, rfbD y/o rfbE, o cualquier combinación de éstos, y, por tanto, son capaces de expresar un O-PS heterólogo deseado en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmunológica, de tal forma que está acoplado de forma covalente al lípido A del núcleo del LPS homólogo o heterólogo. La presente invención además se refiere a cepas portadoras de vacunas vivas que contienen un gen heterólogo o un grupo de genes heterólogos que codifican O-PS. Preferiblemente, dichas cepas además contienen los genes necesarios para la síntesis de LPS heterólogo liso completo. La presente invención también se refiere a vacunas vivas que comprenden dichas cepas, preferiblemente para la inmunización contra patógenos entéricos gram-negativos.

Los patógenos entéricos gram-negativos son la causa de una diversidad de enfermedades que se presentan con un amplio espectro de síntomas, que varían desde diarrea acuosa suave a síntomas graves que ponen en peligro la vida como fiebre, diarrea sanguinolenta, perforación o ulceración del estómago o intestino, por sí solos o juntos. Los ejemplos de estas enfermedades incluyen fiebre tifoidea, shigelosis, cólera, infecciones por Escherichia coli enterotoxinogénicas, enteropatogénicas y enterohemorrágicas, e infecciones con Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni.

La primera etapa del proceso infeccioso se produce en la superficie mucosa dentro del tracto digestivo. Por tanto, la interferencia con esta etapa inicial de la infección antes de la aparición de los síntomas ofrece un enfoque particularmente atractivo. El medio más eficaz para lograr esto sería evocar una respuesta inmunológica protectora local mediante el uso de una vacuna administrada por vía oral (Mestecky, J. Clin. Immunol., 7 (1987), 265-276; McGhee y Kiyono, Infect. Agents Dis., 2 (1993), 55-73; Walker, Vaccine, 12 (1994), 387-400). En el momento actual, se ha otorgado la patente a dos vacunas vivas atenuadas orales para uso en seres humanos, siendo éstas la cepa Ty21a de Salmonella typhi para la prevención de la fiebre tifoidea, y la cepa CVD103-HgR de Vibrio cholerae para la prevencion del cólera (Germanier y Fürer, J. Infect. Dis., 131 (1975), 553-558; Levine et al., Lancet, ii (1988), 467-470).

Existe un gran conjunto de pruebas que indican que la protección contra varios patógenos entéricos, como S. typhi, E. coli y especies de Shigella, está asociada con la inducción de una respuesta inmunológica contra los componentes de la superficie celular, de forma específica el resto O-antigénico de LPS, denominado habitualmente O-polisacárido (O-PS). Por ejemplo, la inmunidad a la shigelosis, después de que se produce la recuperación de la enfermedad adquirida de forma natural o inducida de modo experimental, está correlacionada con un aumento sustancial en los anticuerpos anti-LPS específicos del serotipo séricos (DuPont et al., J. Infect. Dis., 125 (1972), 5-11; DuPont et al., J. Infect. Dis., 12 (1972), 12-16; Herrington et al., Vaccine, 8 (1990), 353-357). Además, estudios epidemiológicos también han descubierto que la protección contra infecciones por Shigella en el campo está asociada con niveles mayores de anticuerpos anti-LPS séricos (Cohen et al., J. Infect. Dis., 157 (1988), 1068-1071). Pueden detectarse unos niveles altos de anticuerpos séricos contra LPS de Shigella en individuos que residen en áreas en las que estas especies de Shigella son endémicas, probablemente adquiridos mediante la exposición natural y/o la infección con estos patógenos.

El LPS es un constituyente esencial de la membrana externa de gram-negativos y puede constituir hasta 70% de los componentes de la superficie celular. El LPS está compuesto de tres regiones: la más interna es el lípido A, que está incrustado en la bicapa de la membrana externa de fosfolípidos. El polisacárido del núcleo está unido al resto del lípido A normalmente a través de 2-ceto,3-desoxioctonato (KDO). El núcleo normalmente está compuesto de 5 a 7 azúcares. Hasta la fecha, se han identificado siete tipos de moléculas del núcleo dentro de la familia Enterobacteriaceae, y se han nombrado Ra, R1, R2, R3, R4, K-12 y B. Comparado con Enterobacteriaceae, V. cholerae posee una estructura del núcleo inusual porque contiene fructosa y una única molécula KDO en el núcleo interno (Kondo et al., Carbohydrate Res., 231 (1992), 55-64). La biosíntesis del núcleo de LPS está codificada por el locus rfa. Entre la familia Enterobacteriaceae, los loci rfa y rfb no parecen conectados. Por contraste, existen algunas pruebas que sugieren una conexión próxima de al menos parte de estos dos loci para V. cholerae (Manning et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, Y. (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology).

La porción más externa de la molécula de LPS está compuesta del O-PS, que consiste en unidades de sacáridos repetidas de longitud variable (Lüderitz et al., Curr. Top. Membr. Trans., 17 (1982), 79-151; Raetz, Annu. Rev. Biochem., 59 (1990), 129-170). La región O-PS de la molécula de LPS confiere seroespecificidad a la bacteria. La molécula de LPS interacciona de forma estrecha con otras moléculas expresadas sobre la superficie de la membrana externa, como porinas y otras proteínas de la membrana externa (OMP), que determinan la permeabilidad de la membrana externa. Se sabe que el ensamblaje de OMP, así como la secreción de proteínas desde la célula, se ve afectado por mutaciones en el LPS de E. coli (Laird et al., J. Bacteriol., 176 (1994), 2259-2264; Stanley et al., Mol. Microbiol., 10 (1993), 781-787).

La seroespecificidad es conferida no sólo por los azúcares presentes en el O-PS, sino también por su secuencia y enlaces químicos (Lüderlitz et al., Curr. Top. Membr. Trans., 17 (1982), 79-151). Por tanto, el O-PS es muy variable entre las especies de bacterias gram-negativas, mientras que el polisácarido del núcleo es relativamente constante dentro de un género o especie concreto (Lüderlitz et al., Curr. Topics in Membranes and Transport, 17 (1982), 79-151; Jansson et al., Eur. J. Biochem., 115 (1981), 571-577). Por ejemplo, el género Shigella incluye un total de 47 serotipos conocidos divididos en las cuatro especies patógenas predominantes, que son S. dysenteriae (subgrupo A, 12 serotipos), S. flexneri (subgrupo B, 13 serotipos), S. boydii (subgrupo C, 18 serotipos) y S. sonnei (subgrupo D, un serotipo) (Ewing, en: Ewing, W.H., ed., Edwards and Ewing's identification of Enterobacteriaceae, 4ª edición, Nueva York: Elsevier Sci. Publish. Comp. (1986), 135-172). Por ejemplo, en S. sonnei, el O-PS consiste en una unidad de disacárido repetida con dos azúcares inusuales, el ácido 2-amino-2-desoxi-L-alturónico enlazado a 2-acetamido-4-amino-2,4,6-tridesoxi-D-galactosa mediante un enlace 1,4 (Kenne et al., Carbohydrate Res., 78 (1980), 119-126). Por constraste, el O-PS del serotipo 1 de S. dysenteriae (que es la causa más común de disentería) está compuesto de bloques repetidos de ramnosa-ramnosa-galactosa-N-acetilglucosamina (Ewing y Lindberg, en: Bergan, T. (ed.), Methods in microbiology, vol. 14, Academic Press, Londres, pp. 113-142). El O-PS de V. cholerae 01 está compuesto de 17-18 subunidades de perosamina, cada una de las cuales está acilada con ácido 3-desoxi-L-glicerotetrónico. También se ha descubierto quinovosamina en bajas concentraciones, pero su emplazamiento dentro del O-PS de V.cholerae 01 es desconocido (Redmond, FEBS Lett., 50 (1975), 147-149; Kenne et al., Carbohydrate Res., 100 (1982), 341-349).

Las enzimas implicadas en la biosíntesis de O-PS enterobacteriano están codificadas por el locus rfb. En el caso de las especies de Shigella, otro gen, denominado rfc, codifica la O-PS-polimerasa, que actúa polimerizando la unidades repetidas individuales para producir cadenas de longitud variable. En la mayoría de las especies de Shigella, los loci rfb/rfc están localizados sobre al cromosoma (Klena y Schnaitman, Microbiol. Rev., 57 (1993), 655-682). Sin embargo, en algunas especies de Shigella, todo o parte del locus rfb está localizado sobre un episoma plásmido (Maurelli y Sansonetti, Ann. Rev. Microbiol., 42 (1988), 127-150). Otro gen, denominado rfe, que está implicado en la síntesis del antígeno común enterobacteriano (ECA) también es necesario para la síntesis de O-PS en especies de Salmonella de los grupos de O-antígeno C1 y L (Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev. 54 (1988), 195-222; Mäkelä et al., J. Gen. Microbiol., 60 (1970), 91-106), así como en algunos serotipos de E. coli y en S. dysenteriae de tipo 1 (Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev., 54 (1988), 195-222; Schmidt et al., J. Bacteriol., 127 (1976), 755-762; Klena y Schnaitman, Microbiol. Rev., 57 (1993), 655-682). Otro gen, denominado rfp, codifica una galactosil-transferasa y es necesario para la producción de O-PS de longitud completa en S. dysenteriae de tipo 1 (Klena y Schnaitman, Microbiol. Rev., 57 (1993), 655-682). Además, puede lograrse la conversión del serotipo mediante la sustitución de un azúcar O-PS provocada por ciertos fagos lisogénicos para especies de Salmonella y S. flexneri (Clark et al., Gene, 107 (1991), 43-52; Verma et al , Gene, 129 (1993), 101).

En el caso específico de V. cholerae, el locus rfb completo está codificado por los cromosomas. Los genes implicados en la síntesis de perosamina (rfbABDE), en el transporte de O-PS polimerizado hasta la superficie celular (rfbGHI), y en la transferencia de ácido tetrónico sobre la subunidad de perosamina (rfbKLMNO) se organizan secuencialmente para constituir un único operón. Además, cuatro genes de función desconocida, denominados rfbPQRS, constituyen el extremo 3' del operón. Directamente adyacente al operón rfb se encuentra el gen rfbT, que determina la seroespecificidad Inaba y Ogawa de las cepas 01 de V. cholerae. En fechas recientes se determinó que las cepas de serotipo Inaba son mutantes rfbT (Manning et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, \phi (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology).

Como se indicó anteriormente, la inducción de una respuesta inmunológica intestinal local puede ser el medio más eficaz mediante el cual prevenir la infección por una serie de patógenos entéricos. Un método probado y eficaz para lograrlo es mediante el uso de cepas de vacunas vivas atenuadas orales. Las cepas de vacunas como S. typhi Ty21a y V. cholerae CVD103-HgR, indicadas anteriormente, sufren un proceso infeccioso abortivo, induciendo con ello una respuesta inmunológica que se parece mucho a la provocada por la infección natural. Las dos cepas anteriores poseen la ventaja diferenciada de ser extremadamente seguras en seres humanos (Levine et al., Rev. Infect. Dis., 11 (1989), supl. 3, 552-567; Cryz et al., Infect. Immun., 61 (1993), 1149-1151; Levine y Kaper, Vaccine, 11 (1993), 207-212).

Se ha descubierto que la seguridad es el atributo más difícil de conseguir en el desarrollo de cepas de vacunas orales vivas. Lo más habitual es que las cepas de vacunas candidatas inducen una respuesta inmunológica protectora, pero con una proporción inaceptable de reacciones adversas, o son seguras pero no protectoras (Lindberg, en Vaccine and Immunotherapy, Cryz Jr., S.J. (ed.), Nueva York: Pergamon Press Inc. (1991), pp. 95-112; Levine y Hone, en Vaccine and Immunotherapy, Cryz Jr., S.J. (ed.), Nueva York: Pergamon Press Inc. (1991), pp. 59-72).

Dadas las cuestiones anteriores, resulta deseable utilizar cepas de vacunas vivas atenuadas orales aprobadas como portadores para la administración de antígenos de vacunas heterólogos al tracto intestinal. Los intentos de utilizar la cepa Ty21a de S. typhi como portador para los antígenos de vacuna no han producido resultados prometedores (Curtiss III, en: New generation vaccines, Woodrow, G.C. y Levine, M.M. (eds.), Nueva York: Marcel Dekker Inc. (1990), pp. 161-188; Cárdenas y Clements, Clin. Microbiol. Rev., 5 (1992), 328-342). Esto, en gran parte, puede atribuirse al hecho de que esta cepa se desarrolló utilizando un potente mutágeno químico que induce múltiples mutaciones. Por tanto, no se conoce la mutación atenuante concreta. Además, la cepa Ty21a no se replica bien in vivo, lo cual requiere que se administren múltiples dosis de la vacuna. Por contraste, la cepa de vacuna CVD103-HgR se construyó utilizando la tecnología del DNA recombinante, permitiendo identificar las lesiones genéticas concretas (Ketley et al., FEMS Microbiol. Lett., 111 (1993), 15-22). Además, esta cepa parece que se replica bien in vivo, según se pone de manifiesto por el hecho de que se requiere sólo una única dosis de vacuna para inducir un nivel alto de inmunidad frente al cólera experimental (Levine et al., Lancet, ii (1988), 467-470).

Los intentos iniciales de utilizar las cepas anteriores como portadores preven el desarrollo de vacunas bivalentes. En este caso, la cepa recombinante coexpresa dos antígenos O-PS. Sin embargo, se ha demostrado que el desarrollo satisfactorio de estas cepas de vacunas bivalentes es extremadamente difícil por una diversidad de razones, algunas de las cuales están surgiendo ahora. En primer lugar, los datos experimentales han demostrado que el enlace covalente entre el resto O-PS y la región del núcleo de LPS parece ser un prerrequisito para la inducción eficaz de inmunidad (Beckmann et al., Nature, 201 (1964), 1298-1301; Kuhn et al., FEMS Microbiol. Rev., 54 (1988), 195-222; Attridge et al., Microb. Path., 8 (1990), 177-188; Baron et al., Infect. Immun., 55 (1987), 2797-2801). En segundo lugar, la coexpresión de dos entidades O-PS a menudo produce el enmascaramiento de un antígeno, restando fuerza con ello a la respuesta inmunológica (Attridge et al., Microb. Path., 8 (1990), 177-188; Forrest et al., Vaccine, 9 (1991), 515-520). En tercer lugar, la cepa recombinante también debe expresar de forma completa los antígenos protectores asociados con la cepa portadora. Por último, la expresión del antígeno extraño no debe afectar de modo adverso la capacidad de la cepa bivalente para replicarse in vivo o colonizar las superficies mucosas.

Los siguientes ejemplos ilustran los problemas prácticos enfrentados en la construcción de cepas de vacunas bivalentes. Formal et al. (Infect. Immun., 34 (1981), 746-750) han introducido el plásmido de virulencia 120 Mda1 de S. sonnei en S. typhi Ty21a mediante conjugación. La cepa híbrida resultante, denominada 5076-1C, expresa el antígeno O-PS de S. sonnei codificado por el plásmido sobre la superficie de Ty21a como un material de tipo capsular no unido al núcleo de LPS de S. typhi (Seid et al., J. Biol. Chem., 259 (1984), 9028-9034). La inmunización de voluntarios con esta cepa produjo una respuesta vigorosa de anticuerpos anti-LPS de S. sonnei. Sin embargo, en estudios de exposición a sujetos sensibilizados, diversos lotes de esta vacuna fueron incapaces de ofrecer, de forma constante, una protección significativa contra la enfermedad de S. sonnei (Herrington et al., Vaccine, 8 (1990), 353-357; Black et al., J. Infect. Dis., 155 (1987), 1260-1265; Vand De Verg et al., Infect. Immun., 58 (1990), 2002-2004). La razón concreta de esta protección variable no se ha identificado. Las explicaciones posibles incluyen: 1) la presencia del antígeno de S. sonnei sobre la superficie de la cepa Ty21a interfiere con su capacidad para colonizar de forma eficaz; 2) se demuestra que el plásmido de virulencia es genéticamente inestable dentro de Ty21a, produciendo deleciones espontáneas que interfieren con la expresión de O-PS de S. sonnei y otros antígenos asociados con la virulencia; 3) la expresión del plásmido de S. sonnei en Ty21a conduce a un efecto perjudicial que se manifiesta sólo in vivo, como una supervivencia, multiplicación o colonización reducidas.

Se construyó una cepa de vacuna bivalente introduciendo los genes que codifican la biosíntesis de O-PS de V. cholerae en Ty21a, produciendo la cepa EX645. Esta cepa induce una respuesta inmunológica modesta anti-LPS de V. cholerae cuando se administra a voluntarios, aunque el O-PS heterólogo estaba acoplado al núcleo de LPS (Forrest et al., J. Infect. Dis., 159 (1989), 145-146). Sólo se produjo un nivel modesto de protección contra el cólera experimental después de la inmunización con EX645. Posteriores estudios demostraron que el O-PS de S. thyphi, más largo, probablemente enmascara las unidades O-PS de V. cholerae, algo más cortas, siendo la causa de la mala respuesta inmunológica. Se desarrolló un derivado de EX645, denominado EX880, inactivando los genes implicados en la expresión del O-PS de S. typhi. Se descubrió que EX880 induce una respuesta de anticuerpos anti-LPS de V. cholerae mucho más vigorosa, comparado con EX645 (Attridge et al., Infect. Immun., 59 (1991), 2279-2284). La respuesta anti-LPS de S. typhi fue mínima.

Los loci rfb/rfc y rfa_{R1} de S. sonnei se introdujeron en CDV103-HgR mediante el uso de plásmidos compatibles (Viret et al., Mol. Microbiol., 7 (1993), 239-252). Esto permite la expresión eficaz del O-PS de S. sonnei acoplado al núcleo de LPS. Sin embargo, cuando estos mismos loci genéticos se introducen en el cromosoma de CVD103-HgR (cepas CH3 y CH9), poco o nada del O-PS de S. sonnei se acopló covalentemente al núcleo de LPS (Viret y Favre, Biologicals, 22 (1994), 361-372). En su lugar, el material se expresó sobre la superficie de CVD103-HgR como un material de tipo capsular.

Las observaciones anteriores sugieren lo siguiente: 1) el O-PS heterólogo puede acoplarse de modo eficaz al núcleo de LPS homólogo o heterólogo sólo si se suprime la síntesis de O-PS homólogo; 2) bajo las condiciones apropiadas es posible acoplar covalentemente el O-PS heterólogo al núcleo exclusivo de V. cholerae, obviando con ello la necesidad de introducir genes que codifican una molécula del núcleo heteróloga; y 3) la coexpresión de dos moléculas de O-PS diferenciadas por la misma cepa portadora que produce una vacuna bivalente puede no ser posible. Por tanto, la expresión simultánea eficaz de dos moléculas de LPS completas, que presenten cada una restos O-PS diferentes, puede encontrarse más allá de la capacidad de una única cepa hospedante. Las razones posibles incluyen la interferencia con la expresión de los genes respectivos a nivel transcripcional, la competición por los componentes limitantes implicados en la biosíntesis de la estructura de la membrana externa, como las moléculas implicadas en la transposición de la molécula de O-PS hacia la superficie externa de la célula, o la competición entre las moléculas de O-PS para la transferencia o la unión a los sitios disponibles sobre la molécula del núcleo de LPS.

En un intento para evitar estos problemas previamente espontáneos, se aislaron mutantes indefinidos de V. cholerae CVD103-HgR que son deficientes en la síntesis de O-PS. Estas cepas son capaces de apoyar la unión covalente de O-PS de S. sonnei codificado por los loci rfb/rfc integrados cromosómicamente, con un núcleo de LPS. Sin embargo, la naturaleza indefinida de la(s) mutación(es) presente(s) en estas cepas las hace inaceptables para el uso en seres humanos.

Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar cepas portadoras de vacunas vivas atenuadas que sean útiles para la expresión y administración del O-antígeno (O-PS) heterólogo de bacterias gram-negativos, de tal forma que el O-PS heterólogo puede inducir una respuesta inmunológica, y que sean seguras y aceptables para su administración como vacunas.

La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Se ha descubierto, de forma sorprendente, que una deleción definida dentro del gen rfbA, rfbB, rfbD y/o rfbE, o cualquier combinación de éstos, puede introducirse en una cepa de vacuna viva atenuada, que no interfiere con las funciones de la cepa portadora requeridas para que dicha cepa sea adecuada como portador para un antígeno heterólogo, y que conduce a una deficiencia de dicha cepa en la síntesis de O-PS homólogo, permitiendo con ello la expresión de un O-PS heterólogo deseado en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmunológica, de tal forma que el O-PS heterólogo está acoplado covalentemente al núcleo de LPS y puede inducir una respuesta inmunológica.

Las realizaciones de la presente invención, entre otras cuestiones, permiten la construcción de cepas de vacunas monovalentes con las siguientes características: 1) el uso de una cepa de vacuna viva atenuada oral, preferiblemente V. cholerae CVD103-HgR, adecuada para un uso en seres humanos como portadora de antígenos heterólogos, 2) la modificación de dicha cepa portadora para hacer que sea deficiente en la síntesis de O-PS homólogo mediante la introducción de mutaciones concretas, por ejemplo, dentro del gen rfb que no sean letales, detener la síntesis de O-PS de Inaba homólogo y permitir la expresión y acoplamiento covalente de O-PS heterólogo al núcleo de LPS, 3) contienen los genes necesarios para la producción de moléculas de LPS polimerizadas heterólogas derivadas de otros patógenos entéricos y su expresión, lográndose la expresión estable mediante la integración de los genes heterólogos clonados en un sitio que no afecta de modo adverso al fenotipo de la cepa portadora, y de forma específica, de los rasgos que le permiten inducir una respuesta inmunológica protectora después de la administración oral, 4) la expresión de genes O-PS heterólogos de tal manera que el O-PS codificado está acoplado de forma covalente al núcleo de LPS de la cepa portadora, o a un núcleo de LPS heterólogo producido por la cepa portadora después de la introducción del locus rfa apropiado, 5) la molécula de LPS que porta el resto O-PS heterólogo se expresa sobre la superficie de la cepa portadora, preferiblemente integrada en la proteína de la membrana externa, y 6) se mantiene el genotipo/fenotipo de la cepa portadora que hace que sea adecuada para el uso en seres humanos.

Para desarrollar estas cepas de vacunas se introdujeron diversas modificaciones genéticas en los genes para la expresión de O-PS en la cepa portadora para la eliminar la síntesis de O-PS. De forma sorprendente, la deleción del locus rfb Inaba completo (aproximadamente 20 kb) tiene un efecto letal sobre CVD103-HgR y sus derivados que portan rfb/rfc de S. sonnei (cepas CH3 y CH9). Por tanto, se supone que debe haber genes que codifican las funciones esenciales dentro o adyacentes al locus rfb, y que las cepas que no tienen estas funciones no pueden multiplicarse, probablemente debido a su incapacidad para sintetizar una estructura de la membrana externa que funcione. Por tanto, se intentó introducir deleciones específicas, por ejemplo, dentro de tres regiones diferenciadas del locus rfb. El objetivo era intentar introducir deleciones no letales en el locus rfb que, además de detener la expresión del esto O-PS de Inaba homólogo, apoyen el acoplamiento covalente del O-PS de S. sonnei heterólogo al núcleo de LPS de Inaba. El primero de estos constructos era un mutante rfbEGHI. El locus rfbE codifica la perosamina-sintetasa, mientras que los loci rfbG, H e I están implicados en el transporte de O-PS de Inaba a través de la membrana externa (Manning et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, \phi. (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology). Se descubrió que la deleción rfbEGHI era letal en CVD103-HgR. En una segunda cepa, la deleción del locus rfbN (que está implicado en la síntesis del sustituyente de perosamina ácido 3-desoxi-L-glicerotetrónico) produjo, de forma inesperada, sólo una débil producción de O-PS de S. sonnei heterólogo que no estaba unido al núcleo de Inaba. Por tanto, las funciones génicas específicas dentro del locus rfb de Inaba son útiles para la expresión de los genes rfb de S. sonnei heterólogos y su acoplamiento covalente al núcleo de LPS de V. cholerae de una manera todavía no identificada. Después, los loci rfbA y rfbB se inactivaron delecionando un fragmento de 1,2 kb que solapa la unión entre los dos loci. Estos loci están implicados en la síntesis del componente de perosamina del O-PS de Inaba. De forma específica, la proteína RfbA está asociada con enzimas que tienen actividad fosfomanosa-isomerasa o manosa-1-fosfatoguanil-transferasa, mientras que los loci rfbB codifican una fosfomano-mutasa putativa. La introducción de la mutación rfbA/rfbB en CVD103-HgR que contiene los loci rfb/rfc de S. sonnei permite la expresión y el acoplamiento covalente de O-PS de S. sonnei al núcleo de LPS de Inaba, produciendo moléculas LPS híbridas de longitud completa. Se descubrió que las cepas recombinantes que expresan la deleción rfbA/rfbB de Inaba, junto con los loci rfb/rfc de S. sonnei con o sin el núcleo R1, eran genotípica y fenotípicamente estables tras un subcultivo in vitro. Además, estas cepas poseen todas las características de la cepa CVD103-HgR que la hacen adecuada para un uso en seres humanos, incluyendo 1) ausencia de actividad de la toxina del cólera, 2) producción de la subunidad B no tóxica de la toxina del cólera, 3) expresión de pilina corregulada por toxinas, y 4) la capacidad de crecer en presencia de niveles elevados de iones mercurio.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una cepa de vacuna viva atenuada contra patógenos entéricos gram-negativos que se caracteriza por las siguientes propiedades:

(a) la eliminación de la expresión de O-PS homólogo debido a una deleción definida dentro del gen rfbA, rfbB, rfbD y/o rfbE, o cualquier combinación de éstos, y

(b) la expresión de O-PS heterólogo en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunológica, de tal manera que dicho O-PS heterólogo está covalentemente acoplado al núcleo de LPS.

Dichas deleciones preferiblemente no deben provocar la aparición de revertidos. Las deleciones adecuadas según la presente invención pueden ser introducidas por un experto en la técnica seguiendo las indicaciones dadas en los ejemplos a continuación. Estas deleciones no deben interferir con las funciones de la cepa portadora requeridas para que dicha cepa sea adecuada como portadora para un O-PS heterólogo, pero deben ser suficientes para eliminar la expresión del O-PS homólogo. Por ejemplo, dichas deleciones que afectan a la biosíntesis del O-PS homólogo no deben afectar de forma adversa a la expresión de genes que son esenciales para la síntesis del LPS completo formado por O-PS heterólogo, por ejemplo, los genes implicados en la síntesis del lípida A, el núcleo de LPS, la síntesis y el transporte hacia la superficie celular externa, y el anclaje de las moléculas de LPS en la membrana externa.

Debido a dichas deleciones, dichas cepas sintetizan moléculas de LPS que sólo consisten en el lípido A homólogo y un núcleo de LPS homólogo y/o heterólogo, en una realización específica que se describe a continuación.

En una realización preferida, la cepa de vacuna porta una deleción dentro del gen rfbA y/o rfbB.

Lo más preferido es una cepa de vacuna, en la que dicha modificación genética es una deleción que se corresponde con la deleción mostrada para pSSVI225-20 en la figura 1. Esta deleción está localizada en el inicio del operón rfb_{inaba} e implica la eliminación de un fragmento HindIII de 1,2 kpb. Inactiva los genes rfbA y rfbB que están implicados en la biosíntesis de la subunidad de perosamina del O-antígeno.

Las cepas de vacunas adecuadas pueden ser seleccionadas por un experto en la técnica, dependiendo del objetivo deseado. Estas cepas son, por ejemplo, CH19, CH21, CH22, CH24, CH25 o CH30, descritas a continuación.

En una realización preferida, dicha cepa de vacuna es una cepa de E. coli, una cepa del género Shigella, S. typhi, O1 ó O139 de V. cholerae, Helicobacter pylori o Campylobacter jejuni. Las cepas de S. typhi preferidas son S. typhi Ty21a, S. typhi CVD908, o S. typhi CVD908 que contiene otras mutaciones atenuantes. Los ejemplos de otras mutaciones atenuantes son mutaciones en los genes viaB o htpR que codifican señales transcripcionales como el factor RpoS sigma, o en genes implicados en los rasgos de virulencia, como la resistencia al estrés ambiental o la capacidad para adaptarse a nuevas condiciones de crecimiento, o en genes implicados en la síntesis de ácidos aromáticos.

Las cepas de V. cholerae preferidas son V. cholerae CVD103, V. cholerae CVD103-HgR, CVD110, CVD111, CVD112, Bengal-15 o Peru-14.

Las cepas de Shigella preferidas son S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii o S. flexneri de serotipo Y.

Las anteriores cepas de vacunas pueden utilizarse para la expresión eficaz de O-PS heterólogo. Para este fin, un gen heterólogo o un grupo de genes heterólogos que codifican O-PS se insertan en la cepa de vacuna mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante métodos descritos en los ejemplos a continuación.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a cepas de vacunas que se caracterizan además por la presencia de un gen heterólogo o un grupo de genes heterólogos que codifican O-PS.

La inserción de dicho(s) gen(es) que codifica(n) un O-PS heterólogo debe llevarse a cabo de tal manera que (i)
dicho(s) gen(es) se expresa(n) de forma estable y permite(n) la síntesis de LPS liso de longitud completa, esencialmente indistinguible de la cepa de origen, y (ii) se forma un híbrido LPS intacto, compuesto del lípido A de la cepa de vacuna acoplado con la región del núcleo homóloga. Por tanto, cuando se inserta(n) dicho(s) gen(es), el experto en la técnica debe:

i) utilizar una cepa portadora bacteriana exenta de genes que codifican el O-PS homólogo,

ii) utilizar un plásmido, por ejemplo, pMAK700oriT, compuesto de todos los genes que codifican el O-PS heterólogo, flanqueados por las regiones genéticas homólogas que se corresponden con el locus en el que dichos genes O-PS heterólogos se van a insertar, y

iii) después proceder como se describe en el ejemplo 3 a continuación.

En una realización preferida de las cepas de vacunas, el(los) gen(es) heterólogo(s) está(n) presente(s) sobre un vector plásmido, o está(n) integado(s) de forma estable en el cromosoma de dicha cepa en un sitio de integración definido, que no es esencial para inducir una respuesta inmunológica protectora por la cepa portadora.

El grupo de genes heterólogos debe clonarse en un vector de deleción compuesto de un replicón termosensible, por ejemplo, pMAK700oriT, y una región genética homóloga que se corresponde con el gen en el que la inserción va a tener lugar. Los genes heterólogos se clonarán en la mitad de la región homóloga. Para la integración de los genes heterólogos, este plásmido debe introducirse en una cepa portadora adecuada y, después, manipularse como en los ejemplos 5, 6, 7 y 8 a continuación.

Los sitios adecuados para la integración del(los) gen(es) heterólogo(s) en el cromosoma de la cepa de vacuna son genes que no afectan de ninguna manera las propiedades de la cepa, necesarias para su inmunogenicidad y seguridad.

En una realización preferida, dicho gen heterólogo o grupo de genes heterólogos se integran en los loci hlyA, hlyB, rfbA y/o rfbA/rfbB de V. cholerae.

Otra realización preferida particular se refiere a una cepa de S. typhi, en la que dicho gen heterólogo o grupo de genes heterólogos se integran en cualquiera del gen de producción de H_{2}S, los genes ilv, viaB, htpR que codifican las señales transcripcionales como el factor RpoS sigma, los genes implicados en los rasgos de virulencia, como la resistencia al estrés ambiental o la capacidad para adaptarse a nuevas condiciones de crecimiento, o cualquier gen implicado en la síntesis de ácidos aromáticos. Los genes implicados en la resistencia al estrés ambiental o la capacidad para adaptarse a nuevas condiciones de crecimiento son genes del sistema OmpR-EnrZ, el sistema PhoP-PhoQ, y el sistema de regulación de la transcripción cya-crp. Los genes implicados en la síntesis de ácidos aromáticos son, por ejemplo, aroA, aroC y aroD.

Como alternativa, las anteriores cepas de vacunas contienen los genes rfa, rfe, rfp y/o cualquier otro gen(es) adicional(es) necesario(s) para la síntesis de LPS heterólogo liso completo, que se integran en tándem en un único sitio cromosómico o se integran independientemente en sitios individuales.

Otros genes necesarios para la síntesis de LPS heterólogo liso completo son, por ejemplo, rfc y rff. Un experto en la técnica puede realizar la integración de los anteriores genes de tal manera que se expresan de forma correcta y coordinada, según métodos conocidos o, por ejemplo, como se describe en Hamilton et al., J. Bacteriology, 171 (1989), 4617-4622.

Estas cepas de vacunas permiten la expresión de O-PS heterólogo que está acoplado covalentemente con la región del núcleo de LPS heterólogo que, preferiblemente, muestra un grado de polimerización esencialmente indistinguible del de LPS nativo producido por el patógeno entérico. Estas cepas de vacunas pueden modificarse, si se desea, de tal forma que son deficientes en la síntesis del núcleo de LPS homólogo.

En una realización preferida, los genes rfa heterólogos codifican el núcleo de LPS Ra, R1, R2, R3, R4, K-12 o B, preferiblemente el núcleo R1.

La invención también se refiere a una vacuna viva que comprende la anterior cepa de vacuna, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un tampón para neutralizar la acidez gástrica y/o un sistema para administrar dicha vacuna en un estado viable al tracto intestinal.

Dicha vacuna comprende una cantidad inmunoprotectora y no tóxica de dicha cepa de vacuna. Las cantidades adecuadas pueden ser determinadas por un experto en la técnica y son, de forma típica, desde 10^{7} a 10^{9} bacterias.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables, los tampones neutralizantes adecuados y los sistemas de administración adecuados pueden ser seleccionados por un experto en la técnica.

En una realización preferida, dicha vacuna viva se utiliza para la inmunización contra patógenos entéricos gram-negativos.

La vía de administración de las vacunas de la presente invención puede ser cualquier vía adecuada que administre una cantidad inmunoprotectora de la vacuna al sujeto. Sin embargo, la vacuna se administra preferiblemente por vía oral o intranasal.

La invención también se refiere al uso de las anteriores cepas de vacunas para la preparación de una vacuna viva para la inmunización contra patógenos entéricos gram-negativos. Para este uso, las cepas de vacunas se combinan con los vehículos, tampones y/o sistemas de administración descritos anteriormente.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

En resumen, se ilustra la utilidad de los mutantes de deleción rfbA/rfbB de Inaba como portadores o vectores para antígenos O-PS heterólogos. El locus rfb de V. cholerae O139 se clona en un fragmento de aproximadamente 32 kb y se integra en el locus hlyA::mer del mutante de deleción rfbA/rfbB. Este constructo expresa O-PS de O139 que se acopla al núcleo de Inaba y es reconocido por anticuerpos anti-O139 específicos. De forma similar, los loci rfb/rfp de S. dysenteriae que permiten la producción de O-PS se clonaron en un fragmento de 13,8 kb y se integran en el mutante de delección rfbA/rfbB de CVD103-HgR según se describió anteriormente. En este constructo, el O-PS de S. dysenteriae se produce sobre la superficie celular, se acopla covalentemente al núcleo y es reconocido por anti-O-PS de S. dysenteriae específicos. Sin embargo, este constructo expresa sólo moléculas de LPS muy cortas, en lugar de la estructura de tipo escalera completa asociada con el LPS de S. dysenteriae nativo. Sin embargo, la adición del gen rfe de E. coli, el cual se cree que está implicado en la polimerización de O-PS, sobre un plásmido o integrado en el cromosoma del constructo, produce la síntesis de un LPS con un fenotipo indistinguible del de LPS de S. dysenteriae nativo.

Ejemplo 1 Clonación y cartografiado físico del locus rfb de V. cholerae CVD103-HgR

Preparación del banco de genes. Un banco de genes de DNA de V. cholerae CVD103-HgR se preparó en el cósmido de bajo número de copias pLAFR5 (Keen et al., Gene, 70 (1988), 191-197). Los fragmentos de DNA del DNA cromosómico de CVD103-HgR aislado se generaron mediante restricción con Sau3A parcial y se fraccionaron según el tamaño en un gradiente de sacarosa. Las fracciones que contenían los fragmentos de 20 a 30 kb se purificaron y se acoplaron al vector cortado con ScaI y BamHI. La mezcla acoplada se encapsuló in vitro (kit de encapsulación Gigapack II Plus, Stratagene GMBH, Zürich, Suiza) según las instrucciones del fabricante. El DNA encapsulado entonces se transfectó en la cepa HB101 de E. coli y el cultivo resultante se colocó en placas LB que contenían tetraciclina 12,5 \mug/ml (placas LBTc) para seleccionar los transfectantes. Las colonias resistentes se reunieron, se formaron partes alícuotas y las partes alícuotas se conservaron en glicerol al 40% a -70ºC.

Selección del banco de genes. Una parte alícuota congelada del banco de cósmidos se diluyó y se colocó en placas LBTc. Las colonias que surgieron se trasladaron a filtros de nitrocelulosa. Los filtros entonces se procesaron para la inmunodetección según protocolos publicados (Sambrook et al., Molecular cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor EEUU (1989)). Los filtros se sondaron con el anticuerpo monoclonal (mAb) específico de Inaba/Ogawa VCO4 (denominado anteriormente H4; Gustafsson y Holme, J. Clin. Microbiol., 18 (1983), 480-485) lo cual permitió el aislamiento de varios clones independientes, que siguieron siendo muy positivos cuando se volvieron a ensayar con el mismo mAb. Después se caracterizaron tres clones denominados pSSVI255-3, pSSVI255-5 y pSSVI255-7.

Análisis de restricción de pSSVI255-3, pSSVI255-5 y pSSVI255-7. El patrón de restricción obtenido con una diversidad de enzimas de restricción indica un alto grado de solapamiento entre los tres clones. Los tres clones se cartografiaron utilizando EcoRI, SacI y PstI. Con la ayuda de una secuencia de DNA conocida de un fragmento SacI de aproximadamente 20 kb que incluye el locus rfb de E1 Tor Ogawa V. cholerae cepa 017 (Manning et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, Y. (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology) pudo determinarse la localización exacta del locus rfb en cada clon. Basándose en esta información, se utilizó exclusivamente el clon pSSVI255-7 (figura 1) para los trabajos posteriores.

Ejemplo 2 Construcción de plásmidos de deleción para la introducción de deleciones cromosómicas en V. cholerae

Para maximizar la probabilidad de obtener una deleción satisfactoria dentro del locus rfb de V. cholerae se seleccionaron cuatro fragmentos diferenciados dentro del locus rfb para ser delecionados de modo individual. La figura 1 resume los diversos vectores de deleción que se generaron. Los plásmidos pSSVI205-1 y pSSVI205-2 se construyeron eliminando 23,5 kb de DNA entre los sitios SacI externos en pSSVI255-7, y subclonando, en ambas orientaciones, el inserto remanente en el sitio de extremos romos HindIII de pMAK700oriT (figura 2). Este último plásmido se corresponde con el vector suicida pMAK700 (Hamilton et al., J. Bacteriol., 171 (1989), 4617-4622) que se hizo movilizable mediante la adición de la región oriT del plásmido pJFF350 (Fellay et al., Gene, 76 (1989), 215-226). El plásmido pSSVI255-12 se corresponde con pMAK700oriT que porta el fragmento central salI-HindIII de 10,5 kb de pSSVI225-7, del cual se delecionó el fragmento BamHI interno de 3,8 kb. Esta deleción inactiva los genes rfbEGHI. El gen rfbE es la perosamina-sintetasa putativa, mientras que rfbG, H e I están implicados en el transporte de los componentes de O-PS codificados por rfb_{inaba} a través de la membrana externa (Manning et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives (1994), Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, \phi. (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology). Los plásmidos pSSVI255-19 y pSSVI255-20 se derivaron ambos de pSSVI255-7 mediante subclonación de fragmentos de restricción definidos en el vector de alto número de copias pMTL22p (Chambers et al., Gene, 1988, 68:139-149), la deleción de la región central, y la posterior subclonación del inserto resultante en pMAK700oriT. El pSSVI255-19 se corresponde con el fragmento ClaI de 5,3 kb (posición en el mapa 15770 a 21030, figura 1) del cual se delecionó el fragmento SalI de 1,9 kb interno. La deleción solapa el gen rfbN, el cual se cree que está implicado en la síntesis del sustituyente de perosamina ácido 3-desoxi-L-glicerotetrónico. El pSSVI255-20 se corresponde con el fragmento BamHI-SacI de 5,3 kb localizado al comienzo del operón rfb_{Inaba} (posición en el mapa 18500 a 23400), del cual se delecionó el fragmento HindIII de 1,2 kb interno. Esta deleción inactiva los genes rfbA y rfbB que están directamente implicados en la biosíntesis de la subunidad de perosamina del O-antígeno. La función de RfbA está muy asociada a las proteínas con actividad fosfomanosa-isomerasa o manosa-1-fosfatoguanil-transferasa, y RfbB es una fosfomano-mutasa putativa.

Ejemplo 3 Introducción de deleciones rfbAB en cepas portadoras diana: construcción de las cepas CH15, CH19 y CH30

Los diversos plásmidos descritos en el ejemplo 2 se trasladaron, en primer lugar, mediante electroporación a la cepa de movilización S17.1 de E. coli (Simon et al., Bio/Technology, 1 (1983), 784-791) y después se movilizaron en V. cholerae CVD103-HgR. Además, el pSSVI255-20 se movilizó en la cepa de vacuna E1 Tor Ogawa CVD111.

Los transconjugados se aislaron mediante cultivo en placas a 30ºC en placas BHI-Cm selectivas. Los transconjugados entonces se propagaron a 30ºC en cultivos líquidos (medio BHI-Cm) y las diluciones adecuadas se colocaron en placas BHI-Cm y se incubaron a 30ºC o 41-42ºC. De forma típica, la eficacia del cultivo en placas a 41-42ºC era aproximadamente 10^{4} veces menor que a 30ºC. Puesto que, en virtud de su replicón termosensible, el plásmido es incapaz de replicarse a 41ºC o más, deben surgir colonias en la temperatura no permitida a partir de las escasas células que portan el plásmido de deleción completo en su cromosoma. Una serie de colonias capaces de crecer a 41-42ºC después se depositaron en línea sobre placas BHI-Cm incubadas a 41-42ºC. La selección de las células exentas de las secuencias del vector se realizó depositándolas en línea sobre placas BHI no selectivas incubadas a 30ºC. Posteriormente, la selección inmunológica permitió el aislamiento de colonias que respondían de forma negativa al mAb VCO4. Este anticuerpo reconoce los O-PS de Ogawa y de Inaba. Estas colonias se volvieron a seleccionar para confirmar que habían perdido el rasgo de resistencia al cloranfenicol inherente al vector.

Estos integrantes estables, sin embargo, no siempre se aislaron, indicando que algunas deleciones eran letales. Por tanto, la formación de cepas en las que el locus rfb completo o los genes rfbEGHI están delecionados no puede conseguirse. La cepa obtenida mediante la introducción de la deleción rfbN en CVD103-HgR utilizando pSSVI255-19 se denominó CH15, y los mutantes de deleción rfbAB en CVD103-HgR y CVD111 utilizando pSSVI255-20 se denominaron CH19 y CH30, respectivamente. Estas cepas de deleción se caracterizaron genéticamente mediante hibridación Southern utilizando sondas específicas para el locus rfb. Se descubrió que la estructura genética de todas las cepas ensayadas se conformaba a las expectativas.

Ejemplo 4 Introducción de deleciones rfbAB en cepas de V. cholerae recombinantes que expresan O-PS de S. sonnei por sí solo o junto con el núcleo de LPS de E. coli rfaR1. Construcción de las cepas CH13, CH14, CH17, CH21

Los plásmidos anteriormente descritos se movilizaron en cepas CH3 y CH9 como se describe en el ejemplo 3.

Al igual que para CVD103-HgR, la introducción de la deleción del locus rfb completo en CH3 o CH9 no pudo lograrse, probablemente debido a su efecto letal. De forma similar, la introducción de la deleción SalI de 2 kb de pSSVI255-19 o la deleción de HindIII de 1,2 kb de pSSVI255-20 no tuvo éxito en la cepa CH3. Los mutantes de deleción rfbEGHI que surgen de la integración de pSSVI255-12 en CH3 y CH9 se denominan CH13 y CH14, respectivamente. La inserción de la deleción rfbN en CH9 utilizando pSSVI255-19 se denominó CH17, y un mutante de deleción de CH9 que porta la deleción rfbAB de pSSVI255-20 se denominó CH21. Estos mutantes de deleción se caracterizaron genéticamente mediante hibridación Southern utilizando sondas específicas para los loci rfb_{Inaba} o rfb/rfc_{sonnei}, además de una sonda para el gen hylA, la diana de integración para el locus rfb/rfc_{sonnei}. Se descubrió que el genotipo de todas las cepas ensayadas se conformaba a las expectativas.

Ejemplo 5 Integración del locus rfb/rfc_{sonnei} en CH19. Construcción de la cepa CH22

Puesto que no se pudo producir un mutante de deleción de CH3 utilizando pSSVI255-20 se construyó una cepa genotípicamente similar, CH22, mediante el enfoque inverso, es decir, la integración de los genes de rfb/rfc_{sonnei} que porta el plásmido pSSVI201-1 (figura 3) en el cromosoma de CH19. El pSSVI201-1 se utilizó inicialmente para la construcción de la cepa CH9. El plásmido se movilizó de la cepa S17.1 de E. coli (pSSVI201-1) en CH19. Entonces una agrupación de transconjugados se sometió al procedimiento de integración exactamente como se describe en el ejemplo 2, excepto que la presencia del locus rfb/rfc_{sonnei} intacto se comprobó en cada etapa del procedimiento mediante selección inmunológica utilizando el mAb Sh5S (Viret et al., Infect. Immun., 60 (1992), 2741-2747). Un integrante Cm^{S}/Sh5S+ estable se aisló y se denominó CH22 (figura 4).

Ejemplo 6 Integración del locus rfb de V. cholerae O139 cepa MO45 en CH19: construcción de la cepa CH25

Construcción y selección de un banco de genes de DNA. Un banco de genes cromosómicos derivado de V. cholerae O139 cepa MO45 de tipo salvaje, la cepa epidémica de referencia O139, se construyó en pLAFR5 siguiendo el mismo procedimiento que el descrito para el ejemplo 1. El banco entonces se seleccionó inmunológicamente utilizando un anticuerpo policlonal de conejo específico de MO45. Un total de 13 clones de cósmidos se aislaron que reaccionaban fuertemente con el anticuerpo policlonal. Estos clones entonces se sometieron a un análisis de restricción utilizando una diversidad de enzimas de restricción para determinar el nivel de solapamiento.

Expresión de LPS en E. coli . Se realizaron preparaciones a pequeña escala (minipreps) de LPS a partir de las cepas seleccionadas basándose en el patrón de restricción de los plásmidos. Partes alícuotas de estas minipreps, junto con minipreps de LPS de los controles negativos CH19 y HB101 (pSSVI212-15) y el control positivo MO45 se analizaron entonces mediante SDS-PAGE teñido con plata e inmunotransferencia (análisis de la transferencia Western) utilizando, como anticuerpo primario, el suero policlonal anti-O139 descrito anteriormente. El anticuerpo de revelado era una anti-IgG de conejo procedente de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Boehringer Mannheim AG, Rotkreuz, Suiza). Los procedimientos para el análisis de la transferencia del gel sobre una membrana de nitrocelulosa, la posterior incubación con anticuerpos y la detección fueron como se describió previamente (Viret et al., Infect. Immun., 60 (1992), 2741-2747).

Los resultados, indicados en la figura 5, indican que la mayoría de los clones muestra un patrón de LPS idéntico al de MO45 (carril 4, característico de todas las cepas O139) en el intervalo de tamaño pequeño (carriles 6-11). Sin embargo, sólo un clon, pSSVI212-3 (carril 5), era idéntico al patrón de LPS de MO45 completo, es decir, con material de bajo y alto peso molecular, siendo el último típico de los polisacáridos capsulares. La respuesta ligeramente no específica de la cepa portadora CH19 (carriles 2, 9-11) puede ser debida a algunos epitopos comunes en el núcleo de LPS de las cepas O1 y O139. Puesto que los polisacáridos capsulares se consideran necesarios para producir una respuesta inmunológica significativa contra patógenos O139, se eligió el pSSVI212-3 para posteriores trabajos.

Construcción de CH25. Otros análisis de restricción de pSSVI212-3 indican que no había ningún sitio de restricción NotI en el inserto de aproximadamente 30 kb. Sin embargo, hay sitios NotI disponibles dentro del vector cósmido pLAFR5 en ambos lados del inserto a 1,0-1,5 kb del sitio de clonación. Por consiguiente, el fragmento NotI de aproximadamente 32 kb que contiene el locus rfb de O139 se subclonó con extremos romos en el sitio SalI del vector de integración pSSVI209 (figura 6) para producir pSSVI220. El plásmido pSSVI20 entonces se electroporó en E. coli S17.1 y se movilizó en CH19. El procedimiento de integración del locus rfb de O39 en el locus hlyA::mer es como se describió en el ejemplo 4, excepto que la presencia del locus rfb de O139 intacto se comprobó utilizando el antisuero policlonal anti-O139 descrito anteriormente, que se había preadsorbido contra CH19. Se descubrieron varias colonias cultivadas a 30ºC sin selección de antibióticos que eran Cm^{S} y reactivas con el anticuerpo anti-O139. Una de estas colonias se guardó y la cepa se denominó CH25.

Ejemplo 7 Integración del locus rfb/rfp de S. dysenteriae en el cromosoma de CH19: construcción de la cepa CH23

Construcción del plásmido de integración pSSVI208-2. La fuente del locus rfb/rfp de S. dysenteriae 1 fue el plásmido pSS37 (Sturm et al., Microb. Path., 1 (1986), 289-297). El inserto XbaI-EcoRV de pSS37 en primer lugar se clonó en tándem con el módulo Sce-Km (Viret, BioTechniques, 14 (1993), 325-326) en el sitio SalI del vector de bajo número de copias pGB2 (Churchward et al., Gene, 31 (1984), 165-171) para producir pSS37-1K. El inserto de 13,8 kb entonces se escindió con SalI y se clonó en el sitio SalI del vector de integración pSSVI199S (figura 7) en ambas orientaciones para producir pSSVI208-1K y pSSVI208-2K. El módulo SceI-Km de pSSVI208-2K entonces se escindió mediante restricción SceI y autoacoplamiento del plásmido para producir pSSVI208-2 (figura 8).

Construcción de CH23. El plásmido pSSVI208-2 se electroporó en E. coli S17.1, se movilizó en CH19, y los transconjugados se seleccionaron en placas LB-Cm a 30ºC. La posterior integración se realizó como se describe en el ejemplo 4, excepto que se utilizó un antisuero de conejo policlonal anti-S. dysenteriae 1 para la selección de las colonias que contenían el locus rfb/rfp. Se descubrieron varias colonias cultivadas a 30ºC sin selección de antibióticos que eran Cm^{S} y reactivas con el anticuerpo anti-S. dysenteriae 1. Una de estas colonias se denominó CH23.

Ejemplo 8 Integración del gen rfe de E. coli en CH23. Construcción de la cepa CH24

Base lógica para el uso del gen rfe . Experimentos previos han demostrado que la expresión del locus rfb/rfp de S. dysenteriae 1 en V. cholerae no da como resultado la producción de una escalera de LPS completa, como se observa con el LPS de S. dysenteriea 1 nativo. Sin embargo, pudo demostrarse que la coexpresión del gen rfe de E. coli, que codifica la enzima UDP-N-acetilglucosamina::undecaprenil-fosfato N-acetilglucosamina-1-fosfato-transferasa (Meier-Dieter et al., J. Biol. Chem., 267 (1992), 746-753), junto con el locus rfb/rfp de S. dysenteriae permite solucionar el defecto, dando como resultado la producción de una escalera de LPS indistinguible de la de S. dysenteriae 1.

Construcción del plásmido de integración pSSVI219. Por consiguiente, se construyó un plásmido para la integración del gen rfe en el cromosoma de CH23. El fragmento XmaIII-ClaI de 1,5 kb del plásmido pRL100 (Meier-Dieter et al., J. Biol. Chem., 267 (1992), 746-753) se subclonó con extremos romos en el sitio BamHI con extremos romos por Klenow del plásmido pMAK/hlyA para producir pSSVI219 (figura 9).

Construcción de CH24. El plásmido pSSVI219 se electroporó en E. coli S17.1, se movilizó en CH23 y los transconjugados se seleccionaron en placas LB-Cm a 30ºC. Los posteriores procedimientos de integración fueron como se describe en el ejemplo 4, excepto que se utilizó un anticuerpo monoclonal específico de O-PS de S. dysenteriae (DysH26, sin publicar) para la selección de colonias con el gen rfe intacto. El mAb DysH26 reconoce de forma específica el LPS de S. dysenteriae muy polimerizado y, por tanto, discrimina entre las células que contienen un gen rfe activo o inactivo. Se descubrieron varias colonias cultivadas a 30ºC sin selección de antibióticos que eran Cm^{S} y positivas para mAB DysH26. Una de estas colonias se denominó CH24.

Ejemplo 9 Expresión de O-PS heterólogo a partir de loci rfb integrados en mutantes de V. cholearea rfb_{Inaba}

Expresión del locus rfb/rfc de S. sonnei por sí solo o junto con el locus rfa_{R1} de E. coli . Se estudió la expresión de LPS de S. sonnei e Inaba en CH3 y CH9 y sus respectivos derivados Inaba-negativos en geles SDS-PAGE teñidos con plata y en inmunotransferencias utilizando el mAb Sh5S (Viret et al., Infect. Immuno., 60 (1992), 2741-2747) o VCO4. La figura 10 representa la expresión de LPS de S. sonnei e Inaba en los diversos mutantes de deleción y sus respectivas cepas de origen. Todas las deleciones rfb_{Inaba} suprimen la producción de O-PS de Inaba (paneles A y C, carriles f a l frente a los carriles b, d y e). Un descubrimiento inesperado fue que estas deleciones también afectan a la producción de O-PS de S. sonnei heterólogo en diversos grados. Las cepas CH3 y CH9, que portan un locus rfb_{Inaba} intacto (carriles d y e, respectivamente) expresan ambas cantidades limitadas de O-PS de S. sonnei unido al núcleo (panel A). Cuando se introdujeron en estas cepas (CH13/CH14 y CH15, respectivamente) deleciones en los genes implicados en la síntesis de tetronato o la síntesis de perosamina/transporte de O-PS de Inaba, el O-PS de S. sonnei se expresó mal y permanecía sin unir (carriles f, g e i del panel B). Por contraste, las deleciones específicas para la síntesis de perosamina (cepas CH21 y CH22) permitieron la expresión de grandes cantidades de O-PS de S. sonnei heterólogo unido al núcleo, representado como las estructuras de tipo escalera de LPS típicas en la parte inferior del gel (panel A y B, carriles k y l).

Expresión de O-PS de S. dysenteriae de tipo 1 en CH23 y CH24. La expresión de LPS de S. dysenteriae en CH23 y CH24 se estudió en geles SDS-PAGE teñidos con plata y en inmunotransferencias utilizando el mAb MASD-1 (Fält y Lindberg, Microb. Path., 16 (1994), 27-41) que reconoce LPS de bajo y alto peso molecular de S. dysenteriae. La figura 11 demuestra claramente que la expresión de LPS completo depende de la presencia del gen rfe (carriles 2, 5, 6, 8, 10). Por tanto, CH24 (carril 10) produce una escalera de LPS que imita a la de los controles positivos CH19 y CH3-I^{-} coinfectados con pSSVI208-1 y pRL100 (carriles 5 y 6, respectivamente) y E. coli DH5\alpha (pSS37) (carril 2). Por contraste, CH23 (carril 7) sintetiza sólo una pequeña cantidad de material de bajo peso molecular. Las cepas CH23 (pSSVI219) y CH24 (carriles 8 y 10, respectivamente) sintetizan un LPS algo menos polimerizado que sus homólogos que portan los loci rfb/rfp en un plásmido (carriles 5 y 6). Por tanto, la diferencia parece debida al bajo número de copias del locus rfb/rfp en CH24 frente a las cepas que portan los loci sobre plásmidos.

Expresión de V. cholerae O139 OA. La expresión de LPS de V. cholerae O139 en CH25 se estudió en inmunotransferencias utilizando el antisuero policlonal anti-O139 adsorbido sobre CH19. La figura 12 demuestra que CH25 (carriles 4 y 5) produce LPS de bajo y alto peso molecular típicos de la cepa de tipo salvaje de O139 MO45 (carril 3). La comparación del LPS de CH25 con el LPS de cepas en las que el locus rfb de O139 loportan vectores plásmidos de bajo número de copias en E. coli (carriles 6 y 7) indica que la disminución en el número de copias como resultado de la integración cromosómica del locus rfb de O139 en CH25 no produce una reducción correspondiente en la cantidad de LPS producido.

Ejemplo 10 Caracterización fisiológica de la cepa portadora CH19 y cepas de vacunas candidatas CH21 y CH22

Las propiedades fisiológicas de los mutantes de deleción rfb_{Inaba} genéticamente definidos cultivados a 30ºC se resumen en la tabla 2. El fenotipo de los mutantes de deleción resultó muy influido por el cultivo en diversos medios, mientras que CVD103-HgR no resultó influido. Cuando se cultivan a 37ºC, todas las cepas, incluyendo CVD103-HgR, muestran una movilidad drásticamente reducida. La incapacidad de CVD103-HgR para sintetizar el O-PS de Inaba después de la introducción de la deleción rfbAB (cepa CH19) produjo un fenotipo que era bastante diferente del de los homólogos que expresan O-PS de S. sonnei, CH21, CH22. Por tanto, CH19 es poco móvil, crece principalmente como células individuales o filamentos cortos y, de forma más sorprendente, se agrega de manera espontánea en todos los medios ensayados. La expresión de O-PS de S. sonnei en el entorno de deleción rfbAB (cepa CH22) restablece muchos rasgos expresados por CVD103-HgR, como movilidad y crecimiento en forma no agregada, principalmente no filamentosa. La coexpresión del núcleo R1 en la cepa CH21 produjo un crecimiento filamentoso y una disminución de la movilidad.

Ejemplo 11 Mayor caracterización fisiológica de CH21 y CH22

Se estudió la estabilidad de ambas cepas. Un cultivo de la cepa de ensayo se cultivó en fase estacionaria a 37ºC en medio LB, se diluyó 200 veces en el mismo medio y después se incubó hasta la fase estacionaria a 37ºC. En cada ronda, las diluciones del cultivo estacionario se colocaron en placas con medio LB para la determinación de la estabilidad. La estabilidad genética se define como la proporción de colonias que aún expresan el fenotipo deseado (expresión de O-PS de S. sonnei o pérdida de O-PS de V. cholerae) después de 50 o más generaciones de crecimiento. Se descubrió que ambas cepas expresan de forma estable (>99,9%) el O-PS de S. sonnei. Se descubrió una proporción similar que mantenía y expresaba el núcleo R1 de LPS en la cepa CH21. Por otra parte, todas las colonias ensayadas no expresaron el O-PS de Inaba de V. cholerae.

Las cepas CH21 y CH22 también se ensayaron para determinar su inocuidad mediante el ensayo de células Y1-adrenales (Sack y Sack, Infect. Immun., 11 (1975), 334-336), para determinar la producción de la subunidad B de la toxina del cólera utilizando el ensayo de unión a gangliósido GM1 (Svennerholm y Holmgren, Curr. Microbiol., 1 (1978), 19-23), y para determinar su resistencia al mercurio. Para este último ensayo se cultivaron cultivos de CVD103-HgR, CH21 y CH22 durante la noche con agitación en medio BHI a 37ºC. Los cultivos en fase estacionaria se diluyeron 200 veces en 2 ml de BMI que contenía una serie de concentraciones de HgCl_{2} (BHI/HgCl_{2}), o 40 veces en 20 ml de BHI. Estos últimos cultivos se incubaron otra vez durante 2 horas a 37ºC y de nuevo se diluyeron 40 veces en 2 ml de medio BHI/HgCl_{2} que contenía diversas concentraciones de HgCl_{2}. Todos los cultivos entonces se incubaron durante hasta 3 días a 37ºC con agitación. Los cultivos positivos se registraron mediante examen visual en los días 1, 2 y 3. En los tres ensayos, CH21 y CH22 eran indistinguibles de CVD103-HgR.

Se sabe que la pilina corregulada por toxinas, el producto del regulón tcp, es un factor importante para la adhesión de V. cholerae a las células intestinales. Para evaluar la expresión de tcpA, el gen que codifica la pilina, se sondaron transferencias Western de extractos de células completas de CVD103-HgR, CH21 y CH22, ensayados sobre geles de SDS-PAGE, con antisuero específico de pilina. Los resultados que aparecen en la figura 5 indican que ambos CH21 y CH22 producen cantidades de pilina similares a las de CVD103-HgR.

Ejemplo 12 Inmunogenicidad de la cepa CH22

Sueros de ratones inmunizados con células CH22 completas muertas se ensayaron para determinar la presencia de anticuerpos anti-LPS de Inaba de CVD103-HgR y S. sonnei de fase I. Como control, se utilizaron sueros no inmunológicos o sueros de ratones inmunizados con células CVD103-HgR enteras muertas. Como se muestra en la tabla 3, la inmunización con CH22 induce altas valoraciones de anticuerpos anti-LPS de S. sonnei pero ningún anticuerpo anti-LPS de Inaba. Por contraste, los sueros de ratones inmunizados con CVD103-HgR producen sólo anticuerpos anti-LPS de Inaba. Los sueros de los ratones control no reaccionaron con ninguno de los antígenos de LPS de ensayo.

Leyendas de las figuras Figura 1 Mapa de restricción del clon rfb de Inaba pSSVI255-7 y sus vectores de deleción derivados

Las flechas representan la dirección de la transcripción del gen rfaD y el operón rfb_{Inaba}. Las zonas blancas definen los diversos genes rfb, y las zonas rayadas indican las regiones funcionales. Estos datos se infieren de resultados publicados (Manning, P.A. et al., pp. 77-94, en Vibrio cholerae and Cholera: molecular to global perspectives, Wachsmuth, K., Blake, P.A. y Olsvik, \phi (eds.), Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1994). Las líneas de la parte inferior se corresponden con los insertos de plásmidos indicados a la derecha. Las porciones de línea doble gruesa representan regiones homólogas utilizadas para la integración cromosómica y la excisión de secuencias del vector. El resto de las porciones (líneas finas) representan las regiones cromosómicas delecionadas de cada plásmido.

Figura 2 Mapa de restricción del vector suicida movilizable pMAK700oriT

ori101, origen de la replicación de pSC101; rep101, gen para la proteína de iniciación de la replicación sensible a la temperatura; cam, gen de resistencia al cloranfenicol; oriT, origen de la transferencia de RP4/RK2. Las coordenadas se dan en pares de bases.

Figura 3 Mapa de restricción del plásmido de integración del locus rfb/rfc_{sonnei} pSSVI210-1

Las flechas representan la dirección de la transcripción de los genes indicados. Las zonas blancas representan el vector pMAK700oriT. La zona rayada interrumpida sobre la línea del mapa representa el locus rfb/rfc de S. sonnei. La interrupción indica que su tamaño real es mayor que el representado. Las líneas finas son las regiones homólogas con el DNA cromosómico de CVD103-HgR. hlyA, extremo 5' del gen hylA; mer, operón de resistencia al mercurio; cat, gen de resistencia al cloranfenicol; rep101ts, gen para la proteína de iniciación de la replicación sensible a la temperatura; oriT, origen de la transferencia RP4/RK2.

Figura 4 Estructura genética de CH22 en el locus hlyA::rfb_{sonnei}

El mapa superior representa la estructura del locus hlyA::mer en CH19, es decir, antes de la integración de la región rfb_{sonnei} en el sitio SalI. Las flechas indican la dirección de la transcripción de los genes indicados.

Figura 5 Análisis SDS-PAGE de minipreparaciones de LPS de clones rfb de O139 en E. coli HB101 y V. cholerae CH19

Panel A: teñido con plata. Panel B: análisis de la transferencia Western utilizando antisuero específico de O139 de conejo policlonal adsorbido sobre CH19. Carriles: 1, marcadores de peso molecular; 2, CH19; 3, HB101 (pSSVI212-15), control negativo; 4, MO45, control positivo; 5, HB101 (pSSVI212-3); 6, HB101 (pSSVI212-10); 7, HB101 (pSSVI212-13); 8, HB101 (pSSVI212-16); 9, CH19 (pSSVI212-10); 10, CH19 (pSSVI212-13); 11, CH19 (pSSVI212-16).

Figura 6 Mapa de restricción del vector de integración pSSVI209

Las abreviaturas y los símbolos son como en la figura 3.

Figura 7 Mapa de restricción del vector de integración pSSVI199S

Las abreviaturas y los símbolos son como en la figura 3.

Figura 8 Mapa de restricción del plásmido de integración de los loci rfb/rfp de S. dysenteriae pSSVI208-2

Las abreviaturas y los símbolos son como en la figura 3. Zonas con rayado a la izquierda, locus rfp; rayado a la derecha, locus rfb.

Figura 9 Mapa de restricción del plásmido de integración del gen rfe de E. coli pSSVI219

Las flechas indican la dirección de la transcripción de los genes indicados. Zonas blancas: región homóloga con el genoma de CVD103-HgR; zona negra: gen rfe; línea fina + zonas punteadas, vector pMAK700oriT. CmR, gen de resistencia al cloranfenicol. hlyB, extremo 5' del gen hlyB roto; hlyB', extremo 3' del gen hlyB roto. El resto, igual que en la figura 3.

Figura 10 Análisis SDS-PAGE de la expresión de O-PS en diversos mutantes rfb_{Inaba} de CVD103-HgR, CH3 y CH9, y en CH22

Paneles: A, gel teñido con plata; B, inmunotransferencia con MAb específico de S. sonnei Sh5S; C, inmunotransferencia con el MAb específico de O-PS de V. cholerae VCO4. Carriles: a, patrón de peso molecular; b, CVD103-HgR; c, S. sonnei 482-79 (pWR105); d, CH3; e, CH9; f, CH13; g, CH14; h, CH15; i, CH17; j, CH19; k, CH21; l, CH22.

Figura 11 Análisis de la transferencia Western de minipreparaciones de LPS de CH23, CH24 y cepas portadoras de V. cholerae con los loci rfb/rfp portados por plásmidos por sí solo o junto con el gen rfe portado por plásmido

Carriles: 1, marcadores de peso molecular; 2, DH5\alpha (pSS37); 3, CH19; 4, CH19 (pSSVI208-2); 5, CH19 (pSSVI208-2/pRL100); 6, CVD-I^{-} (pSSVI208-2/pRL100); 7, CH23; 8, CH23 (pSSVI219); 9, CH23 (pRL100); 10, CH24. Anticuerpo sonda: MAb específico de O-PS de S. dysenteriae de ratón MASD-1.

Figura 12 Análisis de la transferencia Western de minipreparaciones de LPS de clones rfb de O139 en E. coli HB101 y V. cholerae CH25

Carriles: 1, marcadores de peso molecular; 2, HB101 (pSSVI215), control negativo; 3, MO45, control positivo; 4 y 5, CH25; 6, HB101 (pSSVI215-1_{2}); 7, HB101 (pSSVI215-2_{3}). Anticuerpo sonda: antisuero específico de O139 de conejo policlonal adsorbido sobre CH19.

1

2

3

4

5

6

TABLA 2 Caracterización fenotípica de mutantes LPS de Inaba y CVD103-HgR

7

^{a} Las cepas se cultivaron en fase estacionaria a 30ºC en el medio indicado.
^{b} Determinado de modo microscópico.
^{c} La mayoría de los filamentos consistían en \geq10 células.
^{d} Grandes agrupaciones de células adherentes.
^{e}	-: no presente
	+: presente en 1% al 20% de la población.
	++: presente en 20% al 60% de la población.
	+++: presente en 60% al 100% de la población.

TABLA 3 Respuesta de anticuerpos después de la inmunización con V. cholerae cepas CH22 o CVD103-HgR

Cepa inmunizante^{a}	Media geométrica de las valoraciones de anticuerpos^{D}
	LPS de S. sonnei de fase I	LPS de Inaba de V. cholerae
Ninguna	<10	<10
CH22	3.313 (650-10.200)	<14 (<10-71)
CVD103-HgR	<10	260 (57-730)

^{a} Grupos de siete ratones se inmunizaron por vía intramuscular en los días 0 y 14 con 5x10^{7} células inactivadas con calor. Se les administró una dosis de refuerzo por vía intraperitoneal en el día 21. Los ratones control no se inmunizaron. Todos los ratones se sacrificaron el día 28. ^{b} Los sueros se ensayaron de forma individual para detectar anticuerpos específicos de LPS utilizando S. sonnei de fase 1 o Inaba de V. cholerae purificados como antígenos de revestimiento en un ensayo ELISA. Las valoraciones se expresan como la media geométrica (intervalo) de las recíprocas de la dilución mayor que producen una DO_{405 \ nm} de 0,4.

Claims (19)

1. Una cepa de vacuna viva atenuada contra patógenos entéricos gram-negativos que se caracteriza por las siguientes propiedades:

(a) la eliminación de la expresión de O-PS homólogo debido a una deleción definida dentro del gen rfbA, rfbB, rfbD y/o rfbE, o cualquier combinación de éstos, y

(b) la expresión de O-PS heterólogo en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunológica, de tal manera que dicho O-PS heterólogo está covalentemente acoplado al núcleo de LPS.

2. La cepa de vacuna de la reivindicación 1, en la que dicha modificación genética está dentro del gen rfbA y/o rfbB.

3. La cepa de vacuna de la reivindicación 2, en la que dicha modificación genética es una deleción que se corresponde con la deleción que aparece para pSSVI255-20 en la figura 1, que es pMAK700 (figura 2) con el fragmento de 0,75 kb oriT EcoRI-BamHI procedente de pJFF350 que porta el fragmento SacI-BamHI del locus rfb_{inaba} de V. cholerae CVD103HgR en las coordenadas 5000 a 10340, del cual se ha delecionado el fragmento HindIII central.

4. La cepa de vacuna de la reivindicación 3, que es V. cholerae CVD103-HgR \DeltarfbAB (CH19) preparado utilizando pSSVI255-20 según se define en la reivindicación 3, o V. cholerae CVD111 \DeltarfbAB (CH30) preparado utilizando pSSVI255-20 según se define en la reivindicación 3.

5. La cepa de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es una cepa de E. coli, una cepa del género Shigella, S. typhi, O1 ó O139 V. cholerae, Helicobacter pylori o Campylobacter jejuni.

6. La cepa de vacuna según la reivindicación 5, que es S. typhi Ty21a, S. typhi CVD908, o S. typhi CVD908 que contiene más mutaciones atenuantes.

7. La cepa de vacuna según la reivindicación 5, que es V. cholerae CVD103, V. cholerae CVD103-HgR, CVD110, CVD111, CVD112, Bengal-15 o Peru-14.

8. La cepa de vacuna según la reivindicación 5, que es S. dysenteriea, S. sonnei, S. boydii o S. flexneri de serotipo Y.

9. La cepa de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se caracteriza además por la presencia de un gen heterólogo o un grupo de genes heterólogos que codifican O-PS.

10. La cepa de vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho gen heterólogo o grupo de genes heterólogos están presentes sobre un vector plásmido, o están integrados, de forma estable, en el cromosoma de dicha cepa en un sitio de integración definido que no es esencial para que la cepa portadora induzca una respuesta inmunológica protectora.

11. La cepa de vacuna según la reivindicación 10, que es una cepa de V. cholerae, en la que dicho gen heterólogo o grupo de genes heterólogos están integrados en cualquiera de los loci hlyA, hlyB, ctxA, rfbA, rfbB y/o rfbA/rfbB de V. cholerae.

12. La cepa de vacuna según la reivindicación 10, que es una cepa de S. typhi, en la que dicho gen heterólogo o grupo de genes heterólogos están integrados en cualquiera del gen de producción de H_{2}S, los genes ilv, viaB, htpR que codifican señales transcripcionales como el factor RpoS sigma, los genes implicados en los rasgos de virulencia como la resistencia al estrés ambiental o la capacidad para adaptarse a nuevas condiciones de crecimiento, o cualquier gen implicado en la síntesis de ácidos aromáticos.

13. La cepa de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que además el gen rfa, rfe, rfp y/o cualquier otro gen necesario para la síntesis de LPS heterólogo liso completo están integrados en tándem en un único sitio cromosómico, o están integrados de forma independiente en sitios individuales.

14. La cepa según la reivindicación 13, en la que los genes rfa codifican el núcleo de LPS Ra, R1, R2, R3, R4, K-12 y/o B, preferiblemente el núcleo R1.

15. La cepa según la reivindicación 9 ó 10, siendo dicha cepa V. cholerae \DeltactxA hlyA::mer hlyA::rfb/rfc/c_{sonnei} hlyB::rfa_{R1} \DeltarfbAB (CH21) obtenida utilizando pSSVI255-20 según se describe en la reivindicación 3 para la generación de la deleción, la cepa CVD103-1 HgR \DeltarfbAB hlyA::rfb/rfc_{sonnei} (CH22), la cepa CVD103-HgR \DeltarfbAB hlyA::rfb_{dysenteriae} hlyA::rfe (CH24), o la cepa CVD103-HgR \DeltarfbAB hlyA::rfb_{O139} (CH25).

16. Una vacuna viva que comprende la cepa de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un tampón para neutralizar la acidez gástrica y/o un sistema para administrar dicha vacuna en un estado viable al tracto intestinal.

17. La vacuna viva de la reivindicación 16 para la inmunización contra patógenos entéricos gram-negativos.

18. La vacuna viva de la reivindicación 16 ó 17 para la administración oral o intranasal.

19. El uso de una cepa de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15 para la preparación de una vacuna viva para la inmunización contra patógenos entéricos gram-negativos.