CN107080840A - 轮状病毒‑霍乱联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种轮状病毒‑霍乱联合疫苗及其制备方法，所述疫苗包括：a.霍乱疫苗，包括霍乱弧菌肠毒素蛋白(CT)及联合蛋白佐剂，其中联合蛋白佐剂通过基因重组构建在霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白一端，霍乱弧菌肠毒素A亚单位蛋白与霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白通过连接片段相连，形成重组CT全蛋白作为抗原；及b.轮状病毒疫苗。本发明轮状病毒‑霍乱联合疫苗采用重组的蛋白亚单位作为载体，连接同源的毒性蛋白亚单位，重组后的蛋白不仅具有良好的载体功能，可以是毒力亚单位更好更快的进入接种者细胞内，引发免疫反应，同时重组后的蛋白载体还具有良好的佐剂效力，可以刺激机体产生黏膜免疫反应，提高疫苗接种者对于抗原的抵抗能力。

Description

轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

一、病原微生物与疫苗

能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面还取决于机体的抵抗力即免疫力。病原性细菌引起传染的能力大小，就是细菌的毒力或致病性。细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。

细菌产生的毒素可分为外毒素和内毒素两大类。外毒素是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。其化学组成是蛋白质，抗原性强，毒性也强，但极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。常见的如：白喉棒杆菌产生的白喉外毒素、破伤风梭菌产生的破伤风毒素、霍乱弧菌产生的肠毒素、肉毒梭菌产生的肉毒毒素等。大多数革兰氏阴性细菌能产生内毒素，实际上它存在于细菌细胞壁的外层，属于细胞壁的组成部分，一般情况下并不分泌到环境中，只有当细菌溶解后才释放出来，因而称为内毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。

同种生物的不同个体，当它们与病原菌接触后，有的患病，有的则安然无恙，原因在于不同个体的免疫力不同。免疫就是指机体识别和排除抗原异物(如病原微生物等)的一种保护性反应。一般来讲，它对机体是有利的，在异常条件下，也可能损害机体。人体的免疫分为非特异性免疫和特异性免疫。其中特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或产物所产生的特异抵抗力。而疫苗即是科学家研制出来使机体产生特异性免疫抵抗病原微生物对人体侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制备而成的。细菌、病毒和立克次氏体等病原微生物制成疫苗，注射机体后，使机体产生特异性或致敏性淋巴细胞，分泌抗体，达到特异性免疫效果。

而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫苗保护人体不受致病性微生物的侵害。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。更先进的有用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白缀合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗。通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的病原微生物对人类健康的挑战。

二、黏膜免疫

黏膜免疫系统广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。机体约有95％的细菌、病毒和寄生虫的感染都起始于黏膜表面。黏膜免疫系统是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，具有独特结构和功能的独立免疫系统，对于防治病原体的定植和侵入有着积极意义。有别于传统的免疫系统，黏膜免疫系统是大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮或黏膜下固有层(弥散淋巴组织)，或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴组织，机体50％以上的淋巴组织和80％以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。黏膜免疫可以诱导局部黏膜产生分泌性IgA(sIgA)、IgM和IgG等保护性抗体，并可诱导其它部位的黏膜也产生sIgA，这是黏膜免疫保护作用的主要机制。此外，黏膜免疫还诱导黏膜CTL反应，并且产生分泌IFN-C的CD4⁺T细胞，这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的。因此黏膜免疫是保护机体免于病原体侵犯的重要屏障，在疫苗的设计中具有重要意义。

基于黏膜免疫的疫苗由于诱导的免疫往往反应较弱，持续时间短，难以取得理想的免疫保护效果。目前认为，如重组蛋白、合成多肽和DNA等抗原的免疫原性较弱是重要原因之一，因此需要设法提高免疫反应的强度，并且还有一些疫苗需要转变免疫反应类型，以突出黏膜免疫等。这些方面的问题使佐剂的使用显得尤为迫切和重要，因此对于黏膜免疫佐剂的研究已经成为感染免疫和疫苗领域的一个研究热点。目前，已报道的黏膜免疫佐剂主要可分为三类：第一类是细菌性物质，包括蛋白(主要是细菌毒素)和核酸；第二类是各种细胞因子；第三类是抗原递送系统。

细菌毒素中作为黏膜免疫佐剂最常使用的是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)和霍乱毒素(CT)，人们对其已进行了较多研究。紧密连接毒素(zonula occludens toxin，Zot)、细胞毒性坏死因子(cytotoxic necrotizing factor 1，CNF1)和皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)等是新近报道的具有黏膜佐剂功能的细菌毒素。LT和CT都是细菌毒素，其核苷酸序列同源性约80％，结构也基本相同。CT主要诱导抗原特异的CD4⁺Th2型细胞，而LT则能诱导混合的CD4⁺Th1和Th2型细胞。CT和LT是强有力的黏膜免疫佐剂，但由于其具有毒性阻碍了其在人用疫苗领域的应用，因此构建去除毒性或降低毒性，同时保留佐剂属性的突变体是十分必要的。

LT是迄今在人和动物实验中已被鉴定的最有效的黏膜免疫原之一。它能有效地介导针对LT的CD4⁺T细胞和B细胞反应。经消化道途径(口服或胃内途径)注射LT给小鼠，均可诱导高分泌性和全身性抗体应答，小鼠呼吸道分泌物和小肠内容物中均可查到大量的抗LT的IgA抗体。取小肠黏膜作切片，在黏膜固有层淋巴集结可看到大量的浆细胞。LT诱导的黏膜分泌性抗体应答最强烈的是抗原沉积部位，但并不局限于抗原沉积部位，在其他黏膜效应部位也有同样的应答发生。

LT和LTB都具有良好的免疫原性，LTB含有引起T特异性抗体应答的大部分优势抗原表位，两者均能有效地启动机体产生局部和全身的T细胞和B细胞免疫应答，还能使T、B细胞产生长期的记忆反应。

三、大肠杆菌及其流行病学

大肠杆菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)的简称，被德国细菌学家Theodor Escherich最早于1885年从婴儿粪便中分离，是肠杆菌科(Entero-bacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)的成员，原名为Bacterium coli commune，意思是指肠道常见细菌。实际上，只有少数一部分E.coli菌株可在肠道内直接导致宿主疾病，而大多数E.coli在肠道内是不致病的，但如果移位至肠道外面的组织或器官则可能引起肠外的感染。致病性E.coli并非为条件致病菌(如抵抗力降低、正常菌群比例失调或移位等)，而是某些血清型群(型)的大肠杆菌本身即为病原菌。对于肠内的致病性大肠杆菌，依据致病机理、临床症状和流行病学特点等的不同主要有以下几种类型：产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingE.coli，STEC)、肠出血性大肠奸菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)和肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)等。此外，还有尿道致病性大肠杆菌(Uropthogenic E.coli，UPEC)、吸脱型大肠杆菌(Attaching and Effacing E.coli，AEEC)、产坏死性毒素大肠汗菌(NecrotoxigenicE.coli，NTEC)、肠黏附性大肠奸菌(Enteroaggregative E.coli，EAEC)和肠集聚性大肠奸菌(Enteroaggregative E.coli，EAggEC)等。

其中最常见的是ETEC引起的腹泻。ETEC最早流行于20世纪60年代晚期，是人和动物传染性腹泻的重要病原体之一。一些资料表明，ETEC是霍乱流行区土著成人居民中引起霍乱综合征的最常见病因；是发达国家乃至发展中国家儿童、旅行者腹泻最常见病因；也是水源与食物被粪便污染而引的起腹泻、恶心、低烧、腹部绞痛等重要因素之一。

ETEC产生2种不同类型毒素即不耐热肠毒素(Heat-labile toxin，LT)和耐热肠毒素(Heat-stable toxin，ST)。LT和ST这两种毒素的物理性质有较大的不同，ST在100℃，30min基本不失活，但LT在65℃，30min即完全失活。ST分子量较低(<9000ku)，无抗原性，可分为ST1和ST2两种，其中ST1在流行病学上起着重要作用，二者都激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cGMP水平升高，扰乱电介质代谢，引起腹泻。LT与ST不同之处在于，LT为一种免疫蛋白，与霍乱肠毒素(Cholrea toxin，CT)有着较为密切关系，组成一个毒素家族。ETEC也可引起人体产生霍乱样腹泻，爽便性状和脱水症状与霍乱相似。

根据毒素来源的不同，LT可分为人源(LT-h/hLT)和猪源(LT-p/pLT)两人种类，它们化学性质和免疫特性均极为相似。根据编码基因不同，LT又分为两种类型：LT1和LT2。LT1由胞浆中的大质粒编码，在自然界中最为常见，是LT发挥生物学活性的主要成分。一般所说的LT大多都指LT1；而LT2由染色体DNA编码产生。虽然它们的组成和作用方式相似，但无基因同源性及交叉免疫原性。以下所说的LT均指LT1。

编码LT的基因全长1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌细胞装中的大质粒上。LT操纵子含有2个结构基因，分别为编码B亚单位的toxB基因和编码A亚单位的toxA基因，它们串连在一起并会被转录成1条mRNA链。其中toxB基因位于toxA基因3'的末端，它的核糖体结合位点(GGGA)位于toxA基因内，而且toxA3'端2个密码子(TTATGA)和toxB 5'端2个密码子(ATGAAT)有4个核苷酸相互重叠。B亚单位编码区基因全长372bp，编码由124个氨基酸组成的多肽；A亚单位编码区基因全长777bp，编码259个氨基酸的多肽。toxB在起始密码子前的3个核苷酸处有SD序列，其中的5个核苷酸可与16S核糖体RNA3'端12个核苷酸中的5个互补，且近ATG端碱基为A。这些结构有利于提高核糖体的结合效率，且toxB mRNA的二级结构也有利于toxB基因的翻译，从而导致了在同一个启动子下游，toxB虽然位于远端，表达量却超过toxA的5倍之多。这种较为特殊的结构可能更便于毒素启动子对2个亚基起到较好的调控作用，调节它们的表达量，使之易于达到毒素合成的最好状态。

胞浆中的A、B亚单位都以携带信号肽的前体存在。当穿越细胞膜后才会组装成完整的LT。B亚单位的作用是与真核细胞膜表面的GM-1神经节苷脂受体特异性结合，以便利于A亚单位进入靶细胞。A亚单位具有GTP依赖性的ADP-核糖基化转移酶活性，通过G蛋白介导的ADP-核糖基化反应扰乱细胞内cAMP的降解与平衡，刺激cAMP含量增高，从而引发毒性效应。LT-h和LT-p作用于不同的G蛋白，前者是Gs蛋白，后者是Gi蛋白，而最终效果都是导致蛋白激酶A失活，引起一系列的生化反应，引起cAMP含量增高，刺激肠道黏膜水与电解质的过度分泌，导致腹泻。

LTB作为免疫佐剂的功能已被证实，且具有越来越高的关注度，但LTB单独作为载体蛋白的研究却少之又少，单独的LTB蛋白目前仅作为LTA的载体使用，这大大限制了LTB的使用范围。LTB由于其具有良好的结构基础，与其他蛋白融合表达后构建的蛋白载体具有广泛的使用前景。

四、霍乱弧菌及其流行病学

霍乱是一种威胁人类生存的烈性肠道传染病，是我国甲类传染病之一。自有历史记载以来，全球共有七次霍乱大流行，每次大流行都导致数十万乃至上百万人感染，成千上万人死亡。时至今日，霍乱仍在全球多个国家肆虐。

霍乱是由霍乱弧菌所致的烈性肠道传染病，临床上以剧烈无痛性泻吐、米泔水样大便、严重脱水、肌肉痛性痉挛及周围循环衰竭等为特征。20世纪60年代，国际上曾研制出多种肠道外霍乱疫苗，但由于不良反应重，保护力仅在50％以内，保护期短，WHO生物标准化专家委员会决定于1999年起停止使用。

口服疫苗能诱导肠道产生抗体，而肠道又是抗击霍乱的前线。不仅如此，口服疫苗还能降低医疗成本，避免不必要的医疗伤害，因此，近年来口服霍乱疫苗取得了较大发展。

目前可获得的口服霍乱疫苗主要有：灭活全菌体霍乱疫苗(WC疫苗)、灭活全菌体加B亚单位霍乱疫苗(WC/rBs疫苗)和减毒霍乱活菌苗(CVD103-HgR减毒活疫苗)。

灭活全细胞菌苗(WC)最初是针对O1群霍乱的，在越南的现场试验中取得了不错的保护效果(Trach DD，Clemens JD，Ke NT，et al.Field tial ofa locally produced，killed，oral cholera vaccine in Viet Nam.Lancet，1997，349(9047)：231-235.)，各年龄组8个月后的有效率为66％，但只在越南和印度尼西亚等少数国家生产。随后，根据WHO腹泻病疫苗筹划指导委员会的建议，研制成第2代灭活的全细胞二价菌苗，这种菌苗由O1群和O139霍乱弧菌全细胞构成，其中包含了5×1010cfu福尔马林灭活的O139。在Hanoi的研究是口服2剂，每剂1.5ml，间隔2周，但是免疫效果不理想。

霍乱毒素B亚单位-灭活霍乱弧菌全菌体疫苗(BS-WC)在WC疫苗基础上增加了霍乱毒素B亚单位(BS)。BS是优于霍乱类毒素但稍次于霍乱毒素的良好免疫原。用BS和灭活霍乱弧菌全菌体疫苗(WC)构成的组合疫苗(BS-WC)于1985～1989年在孟加拉霍乱流行区进行了现场试验。63498人接种疫苗后最初6个月的免疫保护率为85％，3年后降至51％，证明BS-WC疫苗对霍乱有良好的保护作用。在预防O1群霍乱方面，这种由重组的霍乱毒素B亚单位和灭活的O1群霍乱全细胞组成的口服疫苗，已经取得了不错的效果，因此，世界卫生组织对这种疫苗给予推荐。在上世纪90年代，该疫苗已在瑞典批准注册生产。但这种疫苗需要在口服时使用抗酸剂以中和胃酸，因此不良反应比较大。而且在霍乱爆发地，本身就缺乏干净的水源，还需要大量的水溶解抗酸剂，无形中提高了用药的成本。

在BS-WC疫苗进入人体试验证明其具有良好的安全性、免疫原性和较高保护率的基础上，口服霍乱疫苗的研制工作又向更深层次推进一步，即采用重组BS(rBS)代替天然霍乱BS，构建了rBS-WC霍乱口服菌苗。中国军事医学科学院生物工程研究所马清钧等研究员，研制出了国家一类新药rBS-WC口服霍乱疫苗。这是我国科学家自主研制的口服霍乱疫苗，成为世界卫生组织正式推荐的口服霍乱疫苗之一。

CT是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素，由一个毒性A亚基(CTA)和五个完全相同的B亚基(CTB)组成，形成AB5结构。A亚基是一条单链，合成后常在194、195残基间裂解为CTA1与CTA2，以二硫键连接。其中CTA1具有ADP-核糖基转移酶活性，与CT的佐剂作用有密切关系，CTA2则连接CTA1和CTB。CTB的5个亚基彼此以非共价键结合成五聚体，再通过CTA2环绕CTA形成AB5结构。CTB五聚体的亚基间的结合力很强，大于它们与A亚基的结合力。

CTB近年来作为免疫载体的应用受到广泛的重视，CTB作为无毒单位，具有结合GM1的功能，是毒性亚单位A紧密结合在肠道黏膜细胞表面，使融合蛋白更易与消化道黏膜作用，进而引起一系列生理生化反应，产生更强的免疫效果，CTB还可以作为某些外源多肽的稳定载体，当它与化学偶联或基因融合的抗原同时进入体内之后，会激起融合表位抗原的免疫原性，使机体产生强烈的免疫反应，达到免疫保护作用。

CTB具有很强的免疫原性，可增强细菌病毒以及其他抗原的免疫原性，特别是经过黏膜免疫途径，不仅可以增强血清的特异性IgG抗体应答，还可诱导较强的特异性能黏膜IgA免疫应答，具有能加强抗原表位的抗原性的特点。CTB可以刺激抗原递呈细胞中树突状细胞对抗原的运输能力，树突状细胞用于运输抗原到淋巴器官，并激活抗原性CD4+和CD8+T细胞。CTB可以激活树突状细胞的成熟，使树突状细胞的树突更长，体积更大。CTB细胞还可以调节系内的T细胞反应，以及体内抗体的产生。

CTB是良好的免疫佐剂，但其与CTA结合后，由于具有较强的毒性，使其大大体现出抗原特性而无法起到免疫佐剂的效果，当CT完整蛋白与其他疫苗联合使用时，很难真正起到佐剂的效果，进而削弱了联合免疫的效果。因此怎样在联合疫苗中使CT蛋白发挥出佐剂效果，是申请人研究的重点。

五、轮状病毒及其流行病学

轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的主要病原体之一。全球每年约有1。11亿小于5岁的婴幼儿患RV腹泻，每年约有35万至59万婴幼儿死于RV腹泻，其中82％发生在发展中国家。流行病学方面，在发达国家和发展中国家，轮状病毒的发病率没有显著差异，这表明改善生活卫生环境对控制轮状病毒腹泻没有显著效果。目前对于RV引起的腹泻尚无特效药，疫苗接种成为有效且唯一的预防控制RV腹泻的手段。现阶段广泛使用的三种RV疫苗均为减毒活疫苗，虽然能有效地减低轮状病毒感染的发病率和死亡率，但仍存在潜在的致病危险，疫苗有可能因发生逆行突变而在人体内恢复毒力。

轮状病毒属呼肠病毒科，轮状病毒属。电镜下直径约为65～75nm，无包膜，有双层外壳，含11个节段的双链RNA基因组。基因长度从680～3300bp不等，11个基因共编码6个结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4，VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1～NSP6)。VP4和VP7具有型特异性抗原决定簇，可以产生诱导保护性免疫应答的特异性中和抗体，VP6具有群特异性抗原决定簇，NSP4蛋白则具有肠毒素作用，是引起腹泻的重要因素。

人类轮状病毒非常多样化。到目前为止，由于G和P蛋白的自由组合和分离导致至少42种不同的P-G血清型组合得到确定，致使不同的菌株的产生。幸运的是，只有少数特别的轮状病毒毒株具有全球传播感染人类的能力。国际上通用的RV基因型分型是以蛋白编码框(ORF)核苷酸序列同源性比较来确定的。常用的轮状病毒血清(基因)分型主要由两个结构蛋白VP4和VP7决定。根据VP7基因，轮状病毒被分为19种G型(血清型)；根据VP4基因，轮状病毒被分为28种P型(基因型)。VP4血清型，目前发现有两种型：G1G3和G4为同一型为P1A。G2为P1B。

市面上目前使用的轮状疫苗有葛兰素史克公司生产的Rotarix(G1P型)，默克公司生产的Rotateq(G1～G4P型)以及我国兰州生物制品研究所生产的罗特威(G10P)型。其中活轮状病毒疫苗Rotarix和Rotateq在多国超过六万人的大型临床Ⅲ期评估研究中发现没有引起任何多余的肠套叠的风险。但这两种疫苗的售价略高，众多发展中国家无法承担大面积的接种免疫。而罗特威仅在中国地区生产销售，其局限性也是可预见的。各国医疗卫生组织均在积极研发新型轮状病毒疫苗，但目前还未有公认的突破性进展。

由于轮状病毒与霍乱病毒均为引起腹泻反应，且发病环境相似度较高，为了减轻疫苗接种者的经济负担及接种次数，急需研发一种可以联合免疫轮状病毒及霍乱病毒的联合疫苗。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明的第一个目的在于提供一种轮状病毒-霍乱联合疫苗，所述疫苗包括：

a.霍乱疫苗，包括霍乱弧菌肠毒素蛋白(CT)及联合蛋白佐剂，其中联合蛋白佐剂通过基因重组构建在霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白一端，霍乱弧菌肠毒素A亚单位蛋白与霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白通过连接片段相连，形成重组CT全蛋白作为抗原；及

b.轮状病毒疫苗。

联合蛋白佐剂为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白(LTB)。

本发明中采用CTA与CTB-LTB结合，为本发明的优选方案，本发明中的轮状病毒-霍乱联合疫苗可采用的霍乱抗原包括但不限于CTA，同理，联合蛋白佐剂包括但不限于LTB，任何可以以本发明中方式实施重组的各亚单位均应认为落入本发明的保护范围之中。

重组CT全蛋白为重组CT-LTB蛋白，构建的LTB-CTB核酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，编码的载体蛋白序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

编码LTB蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

编码CT蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

轮状病毒-霍乱联合疫苗为喷雾剂型、液体剂型、胶囊剂型、冻干粉剂、片剂和丸剂中的任何一种。轮状病毒-霍乱联合疫苗还包括蔗糖，用于作为霍乱抗原的冻干制剂的冻干保护剂。

本发明的另一目的在于提供一种轮状病毒-霍乱联合疫苗的制备方法，步骤包括：

s1：根据CT和LTB的CDS区核酸序列，设计两对引物，构建pET28a-CT-LTB质粒，PCR扩增后，通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，凝胶回收CT-LTB片段和表达载体pET28a；

s2.连接转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆后进行单克隆扩增，IPTG诱导后鉴定。

与现有技术相比，本发明轮状病毒-霍乱联合疫苗采用重组的蛋白亚单位作为载体，连接同源的毒性蛋白亚单位，重组后的蛋白不仅具有良好的载体功能，可以是毒力亚单位更好更快的进入接种者细胞内，引发免疫反应，同时重组后的蛋白载体还具有良好的佐剂效力，可以刺激机体产生黏膜免疫反应，提高疫苗接种者对于抗原的抵抗能力，并且黏膜反应不良反应少，本联合疫苗不仅减少了接种次数，延长了接种时间，还从根本上大大减轻了接种者的身体不适，具有良好的经济价值。

附图说明

图1是本发明提供的构建pET28a-CT-LTB质粒的质粒示意图。

图2是本发明提供的重组CT-LTB蛋白SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

一、重组LTB和CT蛋白的克隆和原核表达

LT与CT等一样，LT是由A、B两种亚单位(LT-A和LT-B)组成的AB5型六聚体蛋白。A、B两个亚单位通过非共价键结合，单独的亚单位没有生物活性，只有结合在一起才具有全毒素的生物学和化学特性。A亚单位是毒素的毒力中心，分子量约为28KD，具有ADP-核糖基化酶活性。用还原反应可将A亚单位切成A1(LT-A1)和A2(LT-A2)两个片段，A1片段和A2片段分别呈折叠结构和螺旋结构，二者通过二硫键相连。A1是LT毒素的活性部分，A2是与B亚单位相连的部分。当连接A1与A2的二硫键被还原时，具有酶活性的A1亚单位即被释放出来。B亚单位由两个α螺旋和六个β片层结构组成，其N-端的一个半胱氨酸残基与C-端的一个半胱氨酸残基形成二硫键，将分子的两个末端连接在一起。五个分子量约为11.5KD的分子排列在一起呈环状结构，可与鞭细胞上特异性受体神经苷酯GM1结合。A亚单位通过A2片段插入B亚单位五聚体中央，组成一个完整的LT分子。

由于LTB和CTB的具有较高的同源性，因此在CT片段插入LTB的片段，以引物连接，搭桥进行PCR，可扩增得到重组CT-LTB载体蛋白全长片段。当插入CT全CDS序列时，可扩增得到重组CT-LTB载体蛋白。

根据GeneBank登录的CT和LTB核酸序列和氨基酸序列，具体序列如下：

LTB核酸序列(375bp)如序列表SEQ ID NO：1所示，由此核酸序列编码出的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

CT核酸序列(1236bp)如序列表SEQ ID NO：3所示，由此核酸序列编码出的CT氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

选择pET28a作为载体，根据GeneBank登录的LTB和CT的CDS序列，设计引物如下：

CT-Fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--BamHⅠ酶切位点--CT蛋白N端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：7所示)具体如下：

5’-CG--GGATCC--atgattaaattaaaatttggtgttt--3’

CT-Rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--Eco311酶切位点--CT蛋白C端序列--LTB蛋白N端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：8所示)具体如下：

5’-CTAG--GGTCTC--atc—CGCCGTAAATAAAACATAACATTTTACTTTATTCAT-3’

LTB-Fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--Eco311酶切位点--LTB蛋白N端序列--CT蛋白C端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：9所示)具体如下：

5’-CTAG-GGTCTC--ATG--agcccacctc agtgggcttt tttgtggttc gat-3’

LTB-Rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--XhoⅠ酶切位点--LTB蛋白C端序列。引物(如序列表SEQ ID NO：10所示)具体如下：

5’-CC--CTCGAG--CTAGTTTTTCATACTATTGAATTGGGGGTTTTATT-3’

如图1所示，构建pET28aCT-LTB质粒。构建的pET28a质粒的全序列如序列表SEQ IDNO：5所示，编码的氨基酸序如序列表SEQ ID NO：6所示。

载体和PCR产物通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，凝胶回收LTB和CT片段。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，连接转化大肠杆菌BL21，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和Xho Ⅰ双酶切鉴定的约1600bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，阳性筛选后测序，将测序结果在NCBI网站进行比对，结果完全正确。

二、重组CT-LTB蛋白的诱导表达和纯化

重组CT-LTB蛋白在20℃诱导30h，IPTG浓度为0.3mmol/L，诱导条件最佳。诱导后去适量超声波裂解产物的上清和沉淀进行SDS-PAGE，同时设诱导前的蛋白做为对照。破菌后，发现表达蛋白质以包涵体形式存在。将包涵体洗涤后，用8mol/L的尿素溶解，经复性液复性，再经谷胱甘肽转硫酶(GST)亲和层析柱纯化，得到纯度约为93％的重组融合蛋白。SDS-PAGE结果显示重组菌裂解沉淀中出现一条约45kD的额外条带，与预期结果相近。由于蛋白主要以包涵体的形式表达，因此选择较低温度的长时间诱导，以保证蛋白表达量。诱导表达的纯化结果如图2所示，条带1为蛋白Marker；2为诱导前总的蛋白；3为诱导后总的蛋白；4为细菌破碎液离心后上清；5为细菌破碎液离心后沉淀；条带6为冻干后的重组CT-LTB载体蛋白。

重组蛋白经质谱鉴定，确定为重组CT-LTB蛋白。

三、重组CT-LTB蛋白的免疫效果评价

3.1 重组CT-LTB蛋白的纯化

将CT-LTB/BL21(DE3)接种LB(含50μg/ml卡纳霉素)液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。离心机离心收集菌体。超声破菌，之前的SDS-PAGE显示，重组蛋白表达以包涵体的形式。先后用TE+300mM Nacl，TE+1％Triton-100洗涤包涵体后，8000rpm离心20min获得包涵体，洗涤后，溶解于3mol/L urea，20mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH4.0溶液中，经CM柱离子交换层析纯化，可得到与目标蛋白大小相符的目的蛋白。最后待重组蛋白稀释复性至24h后，超滤器低温快速浓缩至原体积的1.2倍，过阴离子交换柱QSepharoseF.F，收集目的蛋白峰，凝胶检测蛋白含量达到95％以上，用PBS(pH7.4)透析除盐后，BCA法测蛋白浓度含量约0.5mg/mL。

3.2 小鼠活体实验

取健康小鼠30只，分为3组，第一组给药重组CT-LTB蛋白，第二组给药纯CT蛋白，第三组做阴性对照，腹腔注射给药，每组每次给药1mg/只(溶解于0.2ml生理盐水中)，免疫程序为0，2，4周，一周后进行第一次取样，每隔7天各组处死2只小鼠取样。取样时收集血清和小肠黏液，每次采样前断食24h，不断水，以减少肠道内容物。取血清检测各组小鼠血清IgG抗体水平，每组处死小鼠1只检测小肠黏液中IgA抗体水平。具体实验结果如表1所示。

表1小鼠三次免疫后抗体滴度测定(几何平均值)(1：)

	血清IgG抗体效价	唾液IgA抗体效价
			重组CT-LTB蛋白	30152	23108
纯CT蛋白	28730	5429
			阴性对照	0	0

由实验结果可知，重组CT-LTB蛋白作为抗原进行免疫，不仅可以引起足够滴度的血清免疫，更由LTB区域发挥了良好的黏膜免疫效果，引起了数倍于纯CT蛋白的IgA抗体。

3.3 结合产物的量化生产

在3.1中的纯化蛋白加入蔗糖作为冻干保护剂，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到重组霍乱疫苗冻干制剂。

其中冻干步骤具体为：

1.配制浓度为70％、经121℃灭菌处理15min的蔗糖母液；

2.将实施例1所得分离纯化的重组CT-LTB蛋白置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓度至10％，得混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；

3.将步骤2所得半成品进行预冻，预冻时快速降温至-55℃，维持15h～20h；

4.将步骤4所得预冻后半成品进行第一阶段干燥：升温至-45℃～-40℃维持50h，升温至-40℃～-33℃维持22h；

5.将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥：设定不同时间内升温至0℃～30℃，不同升温阶段继续维持28h；再制备冻干原液中蔗糖浓度为10％的重组霍乱疫苗，冻干疫苗的制备方法可参考现有技术制备，在此不做赘述。

四、活轮状病毒霍乱联合疫苗的免疫学评价

4.1 制备活轮状病毒霍乱联合疫苗

由于本发明中的联合疫苗以提高轮状病毒与霍乱弧菌的联合免疫能力，通过引起强烈的黏膜免疫从而提高接种者对于肠道性病毒的抵抗能力为主要的改进方向，故本实施例中可采用现有技术制备轮状疫苗，轮状疫苗包括灭活轮状疫苗及减活轮状疫苗。

本实施例中选择Vero细胞培养疫苗用轮状病毒P[2]G3株，进行病毒增殖后纯化，得到纯化后有完整感染性的P[2]G3病毒颗粒，且病毒基因组经检测没有发生改变，残余Vero细胞DNA含量不超过500pg。

以纯化后的P[2]G3病毒液作为霍乱结合产物冻干蛋白的复溶液，也就是说，在临用前将P[2]G3病毒液加入霍乱疫苗重组蛋白的冻干制剂中，将重组蛋白复溶，混合均匀后可进行肌肉注射。

4.2 活轮状病毒霍乱联合疫苗的免疫学检验

4.2.1 轮状病毒的抗原检测

由于选择的轮状病毒毒株为A群轮状病毒，用于检测野生A群轮状病毒抗原试剂盒即可。酶联免疫法(EIA)检测大便标本中是否含有轮状病毒抗原。检测试验室为病毒病研究所腹渴病毒研究所室。标本首先融解，然后取样并加入病毒保存液溶解，最后按照EIA试剂盒说明书在反应孔中操作。

小鼠分三组进行试验，每组3个平行，每个平行10只小鼠，检测结果取各组平行平均值。第一组接种或轮状病毒霍乱联合疫苗，第二组接种市售罗特威疫苗，第三组阴性对照。接种疫苗后14d内，采集小鼠粪便，每份取5～10g或5～10ml左右，在试剂盒中进行EIA检测。统计各组出现腹泻的小鼠数量，计算平均腹泻率。检测结果如表3所示。

表3EIA检测结果

由表3可知，本实施例中的轮状病毒霍乱联合疫苗与市售轮状疫苗相比，引起了更强的免疫反应，两种疫苗之间的拮抗作用或竞争关系非常小。同时接种不会引发接种者强烈不适(免疫缺陷者除外)，且本联合疫苗的腹泻率与商品疫苗相比，不良反应类似，但产生不良反应的时间短，也就是说排毒期较短。

4.2.2 联合疫苗的抗体滴度检测

检测步骤同3.2活体检验步骤，两次检验的区别仅在于，给药种类不同。对比给药时霍乱疫苗选择可唯适肠溶胶囊(Oravacs)。口服给药。

采用间接ELISA检测血液中IgG含量及小肠中IgA含量。血液中IgG抗体滴度检测结果见如下表4，小肠中IgA抗体滴度检测结果见如下表5：

表4血液中IgG抗体滴度检测结果

	7d	14d	21d	28d	35d
						轮状病毒-霍乱联合疫苗	103	411	328	295	84
轮状病毒P[2]G3株	127	398	372	301	243
						可唯适	107	263	351	280	97
阴性对照	0	0	0	0	0

表2小肠中IgA含量检测结果

	7d	14d	21d	28d	35d
						轮状病毒-霍乱联合疫苗	219	321	402	359	202
轮状病毒P[2]G3株	65	96	152	88	61
						可唯适	98	106	223	182	103
阴性对照	0	0	0	0	0

由检测结果可知，市售的传统疫苗在血清抗体滴度方面与本发明中的联合疫苗水平类似，但很少能够引起黏膜免疫，且引起时间短产生的特异性抗体少，因此本发明中的轮状病毒-霍乱活疫苗在黏膜层引起了足够的免疫反应，刺激机体产生足够多且应答时间长的特异性抗体，因此具有更加良好的免疫效果。

4.2.3 联合疫苗的稳定性检测

轮状病毒-霍乱联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周，外观检查和鉴别试验未见异常，pH值和抗原含量保持相对稳定，进行小鼠试验也未发现抗体水平发生明显差异。说明轮状病毒-霍乱联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周的稳定性良好。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 375

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB DNA序列

<400> 1

atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atatgcacac 60

ggagctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 120

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 180

attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 240

tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 360

agtatgaaaa actag 375

<210> 2

<211> 124

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> LTB 氨基酸序列

<400> 2

MNKVKCYVLF TALLSSLYAH GAPQTITELC SEYRNTQIYT INDKILSYTE SMAGKREMVI 60

ITFKSGETFQ VEVPGSQHID SQKKAIERMK DTLRITYLTE TKIDKLCVWN NKTPNSIAAI 120

SMKN 124

<210> 3

<211> 1236

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CT DNA序列

<400> 3

gttttgatca attatttttc tgttaaacaa agggagcatt atatggtaaa gataatattt 60

gtgtttttta ttttcttatc atcattttca tatgcaaatg atgataagtt atatcgggca 120

gattctagac ctcctgatga aataaagcag tcaggtggtc ttatgccaag aggacagagt 180

gagtactttg accgaggtac tcaaatgaat atcaaccttt atgatcatgc aagaggaact 240

cagacgggat ttgttaggca cgatgatgga tatgtttcca cctcaattag tttgagaagt 300

gcccacttag tgggtcaaac tatattgtct ggtcattcta cttattatat atatgttata 360

gccactgcac ccaacatgtt taacgttaat gatgtattag gggcatacag tcctcatcca 420

gatgaacaag aagtttctgc tttaggtggg attccatact cccaaatata tggatggtat 480

cgagttcatt ttggggtgct tgatgaacaa ttacatcgta ataggggcta cagagataga 540

tattacagta acttagatat tgctccagca gcagatggtt atggattggc aggtttccct 600

ccggagcata gagcttggag ggaagagccg tggattcatc atgcaccgcc gggttgtggg 660

aatgctccaa gatcatcgat gagtaatact tgcgatgaaa aaacccaaag tctaggtgta 720

aaattccttg acgaatacca atctaaagtt aaaagacaaa tattttcagg ctatcaatct 780

gatattgata cacataatag aattaaggat gaattatgat taaattaaaa tttggtgttt 840

tttttacagt tttactatct tcagcatatg caaatggaac acctcaaaat attactgatt 900

tgtgtgcaga ataccacaac acacaaatac atacgctaaa tgataagata ttttcgtata 960

cagaatctct agctggaaaa agagagatgg ctatcattac ttttaagaat ggtgcaactt 1020

ttcaagtaga agtaccaggt agtcaacata tagattcaca aaaaaaagcg attgaaagga 1080

tgaaggatac cctgaggatt gcatatctta ctgaagctaa agtcgaaaag ttatgtgtat 1140

ggaataataa aacgcctcat gcgattgccg caattagtat ggcaaattaa gatataaaaa 1200

agcccacctc agtgggcttt tttgtggttc gatgat 1236

<210> 4

<211> 382

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> CT 氨基酸序列

<400> 4

mvkiifvffi flssfsyand dklyradsrp pdeikqsggl mprgqseyfd rgtqmninly 60

dhargtqtgf vrhddgyvst sislrsahlv gqtilsghst yyiyviatap nmfnvndvlg 120

aysphpdeqe vsalggipys qiygwyrvhf gvldeqlhrn rgyrdryysn ldiapaadgy 180

glagfppehr awreepwihh appgcgnapr ssmsntcdek tqslgvkfld eyqskvkrqi 240

fsgyqsdidt hnrikdelmi klkfgvfftv llssayangt pqnitdlcae yhntqihtln 300

dkifsytesl agkremaiit fkngatfqve vpgsqhidsq kkaiermkdt lriaylteak 360

veklcvwnnk tphaiaaism an 382

<210> 5

<211> 1566

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CT-LTB DNA

<400> 5

atggtaaaga taatatttgt gttttttatt ttcttatcat cattttcata tgcaaatgat 60

gataagttat atcgggcaga ttctagacct cctgatgaaa taaagcagtc aggtggtctt 120

atgccaagag gacagagtga gtactttgac cgaggtactc aaatgaatat caacctttat 180

gatcatgcaa gaggaactca gacgggattt gttaggcacg atgatggata tgtttccacc 240

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tattatatat atgttatagc cactgcaccc aacatgttta acgttaatga tgtattaggg 360

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ttttcaggct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 780

aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca aatggaacac 840

ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatacat acgctaaatg 900

ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 960

ttaagaatgg tgcaactttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 1020

aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgc atatcttact gaagctaaag 1080

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caaattaaga tataaaaaag cccacctcag tgggcttttt tgtggttcga tatgaataaa 1200

gtaaaatgtt atgttttatt tacggcgtta ctatcctctc tatatgcaca cggagctccc 1260

cagactatta cagaactatg ttcggaatat cgcaacacac aaatatatac gataaatgac 1320

aagatactat catatacgga atcgatggca ggcaaaagag aaatggttat cattacattt 1380

aagagcggcg aaacatttca ggtcgaagtc ccgggcagtc aacatataga ctcccagaaa 1440

aaagccattg aaaggatgaa ggacacatta agaatcacat atctgaccga gaccaaaatt 1500

gataaattat gtgtatggaa taataaaacc cccaattcaa ttgcggcaat cagtatgaaa 1560

aactag 1566

<210> 6

<211> 506

<212> Protein

<213> Unknown

<220>

<223> CT-LTB 氨基酸序列

<400> 6

mvkiifvffi flssfsyand dklyradsrp pdeikqsggl mprgqseyfd rgtqmninly 60

dhargtqtgf vrhddgyvst sislrsahlv gqtilsghst yyiyviatap nmfnvndvlg 120

aysphpdeqe vsalggipys qiygwyrvhf gvldeqlhrn rgyrdryysn ldiapaadgy 180

glagfppehr awreepwihh appgcgnapr ssmsntcdek tqslgvkfld eyqskvkrqi 240

fsgyqsdidt hnrikdelmi klkfgvfftv llssayangt pqnitdlcae yhntqihtln 300

dkifsytesl agkremaiit fkngatfqve vpgsqhidsq kkaiermkdt lriaylteak 360

veklcvwnnk tphaiaaism anmnkvkcyv lftallssly ahgapqtite lcseyrntqi 420

ytindkilsy tesmagkrem viitfksget fqvevpgsqh idsqkkaier mkdtlrityl 480

tetkidklcv wnnktpnsia aismkn 506

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CT-Fwd引物序列

<400> 7

cgggatccat gattaaatta aaatttggtg ttt 33

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> CT-Rev引物序列

<400> 8

ctagggtctc atccgccgta aataaaacat aacattttac tttattcat 49

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-Fwd引物序列

<400> 9

ctagggtctc atgagcccac ctcagtgggc ttttttgtgg ttcgat 46

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> LTB-Rev引物序列

<400> 10

ccctcgagct agtttttcat actattgaat tgggggtttt att 43

Claims (8)

1.一种轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：所述疫苗包括：

a.霍乱疫苗，包括霍乱弧菌肠毒素蛋白(CT)及联合蛋白佐剂，其中联合蛋白佐剂通过基因重组构建在霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白一端，霍乱弧菌肠毒素A亚单位蛋白与霍乱弧菌肠毒素B亚单位蛋白通过连接片段相连，形成重组CT全蛋白作为抗原；及

b.轮状病毒疫苗。

2.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：联合蛋白佐剂为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白(LTB)。

3.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于，重组CT全蛋白为重组CT-LTB蛋白，构建的LTB-CTB核酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，编码的载体蛋白序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：编码LTB蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于，编码CT蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：轮状病毒-霍乱联合疫苗为喷雾剂型、液体剂型、胶囊剂型、冻干粉剂、片剂和丸剂中的任何一种。

7.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗，其特征在于：轮状病毒-霍乱联合疫苗还包括蔗糖，用于作为霍乱抗原的冻干制剂的冻干保护剂。

8.根据权利要求1所述的轮状病毒-霍乱联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤包括：

s1：根据CT和LTB的CDS区核酸序列，设计两对引物，构建pET28a-CT-LTB质粒，PCR扩增后，通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，凝胶回收CT-LTB片段和表达载体pET28a；

s2.连接转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆后进行单克隆扩增，IPTG诱导后鉴定。