CN106243230A - 一种具有霍乱弧菌毒素a亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用 - Google Patents

一种具有霍乱弧菌毒素a亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明将经过人工设计的霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌的DNA序列进行合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的融合蛋白免疫原性好，特异性强，能够有效通过粘膜进入生物机体，并能使机体产生中和抗体，可作为免疫佐剂用于生物制品的制备，市场价值显著。

Description

一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工 蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及病毒免疫领域，具体地，涉及具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用。
背景技术
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。
免疫佐剂种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。
佐剂的作用包括：(1)增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；(2)佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；(3)佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；(4)良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
黏膜是机体防御外来入侵的第一道天然屏障，在机体的免疫中担当着重要任务。黏膜系统包括消化道系统、呼吸系统、生殖系统等表面覆盖的黏膜系统。许多传染性疾病感染是主要发生在粘膜系统或是从粘膜表面开始入侵的。因此很多情况下，通过疫苗来诱导粘膜系统的保护性抗体是这些疾病的防治所必需的。然而，通过粘膜途径给予可溶性抗原存在两个问题：在粗糙的粘膜环境中如何保持抗原的完整性、如何增强抗原的免疫原性。因此需要专门的呈递系统和佐剂。目前研究的比较多的佐剂有：CT/LT、内源性分子(细胞因子、趋化因子等)、CpG、皂角苷等。细菌毒素及其衍生物作为粘膜佐剂——霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素霍乱毒素(Choleratoxin，CT)是由革兰氏阴性细菌——霍乱弧菌(Vibriocholerae)分泌的一种蛋白，它是亚洲霍乱疾病中引起严重腹泻的化学物质。而大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是由肠道毒素型E coli(ETEC)产生的。它们是目前研究得最多的粘膜免疫佐剂。
CT、LT及其衍生物的粘膜佐剂活性研究CT和LT都是很强的粘膜佐剂，当它们和抗原连结在一起或者和抗原简单混合后经口或鼻内免疫，能诱导有效的黏膜及系统免疫应答。这种毒素蛋白的佐剂作用最早是由Clements等证明的，研究指出LT可以增加联合免疫的抗原(OvA)的血清抗体反应，增加幅度是比单独用OVA及PBS对照组分别高30、90倍。研究发现，CT和LT能影响粘膜免疫反应过程中的许多步骤。可能对这些步骤的影响各自或者协同的使CT和LT拥有了强大的佐剂活性。CT和LT产生的影响有：a.影响肠内上皮细胞的通透性，使共同免疫的抗原能够更好的被细胞所吸收；b.能够促进抗原被各种细胞吸收；c.促进B细胞分化，使IgA的形成增加；d.复合物的刺激对T细胞的增殖和细胞因子的产生能起到刺激或者抑制的作用。但是由于CT和LT的毒性太强了，并不能直接用于人身上。因此，近年来有许多研究都尝试把这些蛋白的佐剂作用和它们的毒性作用分开，希望能研究出没有毒性的CT和LT作为人类粘膜免疫的佐剂。
CT是细菌蛋白毒素AB5家族的成员，具有两个亚单位，CTA和CTB。5个CTB和1个CTA非共价结合成圆桶状五聚体，能够高亲和力地与细胞表面的神经节苷脂GM1结合，具有优良的免疫原性。通常认为CTA具有毒性，因而开发应用较少，本发明建立CTA的部分氨基酸结合金黄色葡萄球菌的局部氨基酸的人工蛋白，具备无毒和良好免疫原性的CTA佐剂来源。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物学活性高的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用。
本发明的第一个方面提供了一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，具有：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。
本发明的第二个方面是提供编码所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的基因。优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的第三个方面是提供了所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的表达载体。优选的，所述原核表达载体是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与pET30a载体进行连接所获得的。
本发明的第四个方面是提供含有所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白、其编码基因或原核表达载体的宿主细胞。可选的，所述宿主细胞可以为BL21(de3)大肠杆菌株。
本发明的第五个方面提供所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建表达载体，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白。
本发明的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的氨基酸序列中，其中来自霍乱弧菌毒素A亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其与金黄色葡萄球菌氨基酸序列通过GGGSGGGSGGGS连接；来自金黄色葡萄球菌的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中，有重复的两个SEQ ID NO.4所示金黄色葡萄球菌的氨基酸序列，重复序列以GGGS进行连接。
含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的生物制品属于本发明的保护范围。
含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的检测试剂属于本发明的保护范围。
含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的疫苗佐剂属于本发明的保护范围。
本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白在制备疫苗佐剂或疫苗中的用途。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白在制备疫苗佐剂或疫苗中的用途。
本发明提供的上述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白免疫原性好，特异性强，能够有效通过粘膜进入生物机体，并能使机体产生中和抗体，可作为免疫佐剂用于生物制品的制备，市场价值显著。
附图说明
图1为本发明具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的Western Blot分析。
图2为具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白与细胞表面的神经节苷脂GM1结合活性，从左到右依次是BSA，水，煮过的本发明蛋白，本发明蛋白。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白蛋白的制备和纯化
将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列(SEQ ID NO.2所示)进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化pET30a质粒为基础载体，构建pCTA，该表达载体表达的蛋白带HIS标签于蛋白C端，有利于后期亲和层析纯化。
(一)大肠杆菌BL21DE3感受态细胞的制备
1.从37℃过夜培养的新鲜平皿中挑单个菌落，接种于3ml无抗生素的LB液体培养基，37℃240rpm振荡培养4～5小时。
2.取上述培养物0.8ml加到200ml无抗生素的LB培养基中(置于1L三角瓶中)，37℃240rpm振荡培养至OD600值达到0.45左右。
3.将菌体细胞转移到50ml的离心管中，冰浴上放置1.5小时。
4. 4℃环境下3000rpm离心10分钟，弃去上清，回收细胞，将管倒置1分钟以使残留的培养液流尽。
5.以10ml用冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体沉淀，冰浴10分钟。
6. 4℃环境下3000rpm离心10分钟，弃去上清，将管倒置1分钟以使残留的CaCl2溶液流尽。
7.菌体沉淀用4ml 0.1mol/L CaCl2溶液重悬。
8.用冷却的无菌吸头向感受态细胞悬液中加入0.6ml灭过菌的甘油，轻柔混匀后分装至无菌1.5ml离心管中，保存于－70℃超低温冰箱。
(二)具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白表达载体转化进入大肠杆菌BL21DE3表达菌株
1.将50ng pCTA加入到100ul感受态细胞悬液中，轻轻混匀后在冰上放置30分钟。
2. 42℃水浴90秒。
3.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟。
4.向离心管中加入800ul不含任何抗生素的LB液体培养基，之后在37℃摇床上缓慢振荡便于细菌复苏。
5. 45分钟后取适当体积的菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，用玻璃棒轻轻涂匀。
6.将平板置于室温直至液体被完全吸收。
7.倒置平板，37℃培养12～16小时后可见到单菌落出现。
(三)具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的小量表达
1.用毛细管从转化后37℃过夜培养的平皿上挑取单个菌落接种到1.5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃240rpm振荡培养4～5小时。
2.待菌液OD值达到约0.5时，每管留取菌液样品100ul暂存于4℃，试管中加入终浓度1.0mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养1～2小时。
3.取1ml诱导表达后的菌液，10000rpm离心1分钟，倒掉上清，用100ul去离子水重悬菌体沉淀后加入等量2×加样缓冲液(0.1mol/L Tris·Cl，0.2mol/L 2–巯基乙醇，4﹪SDS，0.2﹪溴酚蓝，20﹪甘油)，混匀。
4.于沸水中加热3～5分钟，取20ul样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用恒定电流40mA。
SDS－PAGE凝胶的配制过程如下：
4.1下层分离胶配方(15﹪)
4.2在分离胶上方轻轻加入一层异丙醇，分离胶凝固后弃除异丙醇并倒入浓缩胶
4.3上层浓缩胶配方(5﹪)
4.4最后插上梳子，等待浓缩胶凝固。
5.电泳约50分钟后指示剂溴酚蓝到达分离胶底部，此时停止电泳，小心地将凝胶从玻璃板上剥离，之后用0.25﹪考马斯亮蓝R250溶液(溶于甲醇︰去离子水︰冰乙酸＝4.5︰4.5︰1的混合液中)进行染色。
6.染色30分钟后倒掉染色液，清水稍微冲洗，加入脱色液脱色，脱色液配方为甲醇︰去离子水︰冰乙酸＝4.5︰4.5︰1。
7.脱色30～50分钟可以观察结果，挑选表达量高的克隆(得到BL21DE3CTA)准备用留取的菌液样品活化后进行大量表达。
(四)具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的大量表达
1.将小量表达效果较好，表达量很高的菌株重新活化，接种于3ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃240rpm振荡培养约3小时。
2.取上述活化的菌液300ul再次接种到300ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃240rpm振荡培养过夜。
3.等比例加入预热的LB液体培养基，37℃240rpm振荡培养至OD600值达到0.6左右时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养4～5小时。
4.收集菌液，4000rpm离心10分钟，倒掉上清。
5.管底沉淀用50ml普通裂解液(0.05﹪Triton-X100，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0)重悬，反复吹打直至混匀。
6.准备冰浴，对重悬起的细菌沉淀进行超声波破碎(200W，超声20秒，间歇20秒，作用20次)。
7. 4℃12000rpm离心10分钟，分开上清和沉淀，保存于-20℃并分别进行SDS-PAGE分析。
(五)具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的纯化
具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的表达产物为包涵体，按一下方法纯化：
(1)菌体用PBS或生理盐水洗涤，用溶解液(Tris-base 50mM，EDTA 0.5mM，NaCl50mM，甘油5％，DTT 5mM)重悬菌体，超声波破碎至清亮；
(2)然后4℃，10000rpm离心10min，弃上清；
(3)用PBS或生理盐水洗涤沉淀2-3次；
(4)往沉淀中加19.7mL溶解液及0.3mL 20％的SKL(十二烷基肌氨酸钠)贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置30min至2h；
(5)4℃，10000rpm离心10min，取上清；
(6)加20％PEG 4000至终浓度为0.2％，加50mM的氧化型谷胱甘肽至终浓度为lmM，加100mM的还原型谷胱甘肽至终浓度为2mM，静置30min至2h(亦可4℃复性过夜)；
(7)以PBS(pH 8.0)或TE(pH 8.0)4℃透析，-20℃保存备用。
纯化后的蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中来自霍乱弧菌毒素A亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其与金黄色葡萄球菌氨基酸序列通过GGGSGGGSGGGS连接；来自金黄色葡萄球菌的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在SEQ IDNO.1的氨基酸序列中，有重复的两个SEQ ID NO.4所示金黄色葡萄球菌的氨基酸序列，重复序列以GGGS进行连接。
(六)具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的Westernblotting分析
将经过IPTG诱导表达蛋白和对照进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白电转移至尼龙膜，以兔抗CT血清作为第一抗体，以辣根过氧化物酶(HI冲)偶联的羊抗兔IgG作为第二抗体，进行Western blotting分析，一抗和二抗分别以1：1000和l：2000用封闭液(溶解于TBST溶液的5％脱脂奶粉)稀释。结果见图1,箭头所指为能够被兔抗识别的蛋白，确认本发明融合蛋白的成功表达。
实施例2具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白蛋白的细胞膜靶向性
具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的神经节苷脂结合活性分析，证明具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白具有良好的细胞膜靶向性。
用浓度为3ug/mL神经节苷脂包被聚乙烯塑料板，同时以蒸馏水，其他融合蛋白和BSA作为对照，分别重复3孔，4℃包被过夜后弃包被物，用封闭液(溶解于PBS溶液的1％BSA)37℃封闭1h，弃尽包被物，PBS冲洗3次，加入纯化的重组CTA(约50ng)，同时以1％BSA作为阴性对照，37℃孵育lh，PBS洗3次，加入兔抗CT血清(1：4000溶解于封闭液中)，37℃孵育lh，PBS洗涤3次，每次扣干，加入HRP标记二抗(1：2000)，37℃孵育lh，PBS洗涤3次，每次扣干，然后加TMB底物显色30min后加入终止液，测定450nm下吸光值。结果见图2。
实施例3具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的免疫效果
具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白与埃博拉表面糖蛋白(GP)的动物滴鼻免疫方案，验证在本发明蛋白的辅助下，可以通过滴鼻免疫的方式产生高滴度GP抗原特异性的中和抗体。
抗原佐剂配伍以及免疫剂量和程序如下：
1实验材料石蟹猴：4雌2雄共6只
本发明蛋白(纯度高于95％)
GP抗原(纯度高于95％)
2免疫步骤
将石蟹猴随机分组，保证每组内为2雌1雄，分别编号为A1，A2，A3；B1，B2，B3。A组为实验组，B组为对照组。
对A组实验动物施以本发明蛋白+GP(1：1/m：m)混合液体滴鼻实验，剂量为200ul，蛋白总量为0.1mg。对B组实验动物施以本发明蛋白+PBS相同剂量的免疫。免疫时间分别为第1天，第15天。
对实验动物每天进行观察，记录。每周对猴子采血一次，分别为第一天(免疫前)，第8天。第14天(二次免疫前)，第21天。采血量为2ml，分别装在2只采血管内。
3中和抗体评价
获得的猴子血清56℃灭活30分钟，中和实验步骤如下：
1.细胞培养瓶培养Vero细胞，当培养瓶中细胞数量足够时，用0.25﹪胰酶消化所有细胞，接种到96孔板上继续培养，使用含有10﹪胎牛血清和1﹪抗生素的DMEM作为基础培养液，保持每孔接种细胞数目约5～8×103个，接种细胞时按照下述方法进行计数：
吸取20ul细胞悬液，立即将细胞悬液移到血细胞计数板小室的边缘，挤出细胞悬液，利用毛细作用使之充满计数板和盖玻片间的空隙，小室内液体的体积以刚好流到计数板凹槽的边缘为准
细胞悬液的密度＝角上四个大方格的细胞数目之和×104/4
2.培养两天后细胞生长至96孔板底部的80﹪，移去细胞培养液，之后加入200ul无血清的生长培养基洗细胞面三次，倍比稀释第21天采集的猴子血清，分别1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024稀释倍数进行微量中和试验，用第一天采集的血清作为对照组。
3.取500ul各个稀释度的猴子血清与攻击用的埃博拉病毒液(6.5TCID50/ml)等量混合后中和1小时，将混合液接种到十孔Vero指示细胞，每孔100ul，同时做正常细胞空白对照，4小时后弃去病毒血清混合液并更换成含有5﹪胎牛血清的DMEM作为维持培养液，培养三天后通过显微镜观察呈现细胞病变的孔数和未病变的孔数。
表1第21天血清的体外中和实验○未病变●病变
结果表明第21天的猴子血清含有中和抗体，提示本发明蛋白可用于粘膜佐剂。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，其特征在于，具有：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.含有权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的表达纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和XhoI酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建表达载体，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白。
6.含有权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的生物制品。
7.含有权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的粘膜疫苗免疫佐剂。
8.权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白或权利要求2所述的基因在制备用于检测霍乱弧菌试剂盒中的用途。
9.权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白或权利要求2所述的基因在制备疫苗佐剂中的用途。
10.权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白或权利要求2所述的基因在制备疫苗中的用途。
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