JPH05501401A - 組換え微生物との転移増殖によるワクチン又はトキソイド製剤及び免疫の方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換え微生物との転移増殖によるワクチン又はトキソイド製剤及び免疫の方法 発明の分野 本発明は、病原抗体を発現するための組換えＤＮＡ技術により形質転換された固 有微生物と体の範囲を転移増殖することによる病原疾病に対するワクチン又はト キソイド製剤及び免疫の方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、ヘルペスウィルスの免疫学的に有意な抗体を発現す るために組換えＤＮＡ技術により形質転換された乳酸桿菌と主道路を転移増殖す ることによるヘルペスに対するワクチン製剤及び免疫の方法に関する。

発明の背景 病Ｗ微生物は、疾病を生じうる全ての微生物であり、病原性はホストへの登場を 得、生理的又は解剖学的変化を生ずる微生物能力をいう。疾病を開始するために 、病原微生物が体に十分な数入らなければならないだけでなく、それらの多くが 「入口の門」と呼ばれるあるルートを経て入らなければならない。この登場のモ ードは、ある細胞及び組織を攻撃するその能力に依存する債々の微生物に対し異 なる。例えば消化器官は腸チフス及びコレラ細菌に対する入口の門である。結核 、ジフテリア、及び肺炎双菌微生物は呼吸器官から入り気管支及び肺に感染を起 こす。淋菌、ヘルペスウィルス及び幾らかの他の性的に伝えられた微生物はそれ らが生殖器官を容易に攻撃できる原生器官から一般に入る。さらに他の細菌は皮 膚のすり傷又は穴から入り局所感染を起こすか体から循環系に拡がる。

防御免疫は、これらの病原微生物による侵入を防ぎ又はこれに打ち勝つホストの 能力である。免疫は病原感染からのホストの回復の結果として獲得されうるか、 或は、ワクチン又はトキソイドの投与により予防のために誘導されうる。

ワクチンは死滅した、又は生存しているか弱毒化した微生物或いはそれらの抗原 部分の懸濁液である。トキソイドは、ある細菌により生成された、毒が除かれた が依然として抗原的に活性な毒である。

これらの免疫ｗ、（ワクチン又はトキソイド）の注射は、特異的抗体に対する免 疫応答を刺激する。この同一の又は抗原的に関連する病原に続いてさらすとホス トの免疫は病原に対する防御を助ける。

予防接種によってもたらされた感染に対する防御は、全ての主要クラスのイムノ グロブリン：ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＧの関係で、免疫応答の体液の腕を経て主 として作動する。中和１ｇＭ％　ＩｇＡ及び！加えて、細胞−仲介免疫の横転（ ｒｏｌｌ）は免疫応答の型及び強度に影響するように見える。一方局所免疫は病 原入口の地域に限定され、ＩｇＡ抗体の局所生成及び遊離により伝えられる。分 泌性ＩｇＡ抗体は、病原がその標的細胞と接触する前に病原を中和することによ り作用し、即ち、感染の移植及び形成を防ぐ。ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体も又、分泌 しているように思えるがごく低濃度である。

ワクチン又はトキソイドの開発が投与において、各特殊な疾病の病原論が考えら れなければならない。というのはホストにおける病原微生物の入口の門及び位置 がどのクラスの抗体が防御の役割を与えるかを決定するからである。例えば感染 の７オーカスが呼吸性路の繊毛のある上皮にあるウィルス呼吸性感染では、ウィ ルスは主に粘膜の表面に放され、下にある組織に侵入しない。その結果、分泌物 中の抗体はホストの防御に主な役割を演じ、一方循環抗体はそれらが分泌物に濾 過される範囲で関係する。

感染疾病の防御における主な目標はワクチン又はトキソイドの免弱毒化株は、現 在、ヒトにおける腸チフス、ポリオ、インフルエンザ、狂犬病、麻疹及びＢ型肝 炎を含む多くの疾病に対する免疫に広く用いられる。（マニュアル・オブ・クリ ニカル・ラボラトリイ・イムノロシイ、第３版、ローズ、フリートマン及ヒファ ヘイ、エイニスエム、ディー、シー、１９８６）。ビルレンスが大部分外毒素、 例えば、ジフテリア及び破傷風によるこれらの細菌感染に対し、解毒された、し かし抗原的に活性なトキソイドは、毒素を中和するのに用いることができる。加 えて、分子生物学及びペプチド合成における最近の発達は、免疫予防に用いるた めの精製ウィルス蛋白又は合成ペプチドを生成させた。（ファンダメンタル・ヴ アイロロジイ・フィールズ及びナイプ、レイブン・プレス、ニューヨーク、１９ ８６）。

はとんどの場合、不活性化ウィルスワクチンは、卵（インフルエンザ、型Ａ及び Ｂ）、サル腎細胞培養（ポリオウィルス、型Ｌ　２及び３）又はヒトディグロイ ド細胞培養（ポリオウィルス、狂犬病）で生育され、次いでホルマリンで不活性 化されたウィルスから造られる。これらのワクチンは、感染のリスクがほとんど ないか全くなく免疫の利点を提供するが、活性ウィルス感染よりもかなり効果が 少ない。

ワクチンウィルスを首尾よく不活性化するのに失敗すると、ホルマリンー不活性 化麻疹ウィルスワクチンのように特に重大な結果となる。初めにこのワクチンは 麻疹を防止したが、数年後、ワクチンはその免疫を失った。続いて麻疹ウィルス で感染するとワクチンは強調された全身性症状及び肺炎で異型性疾病を発達させ た。ウィルスを不活性化するのに用いられたホルマリンは、麻疹Ｆ蛋白の抗原ワ クチンは、Ｈ−蛋白免疫を含むがＦ−蛋白免疫を含まないアンバランスな応答を 発達させた。不活性化インフルエンザウィルスワクチンが数年後その有効性を失 うようにみえることも、これに対する基礎は知られていないが、判っている。

弱毒化ワクチンは生きているが弱められた微生物を含む。それらは、ホストに通 常はとんど危険のないおだやかな感染を生ずることにより働く。生きたウィルス ワクチンの主な利点は、免疫系の全ての相、全身性及び局所のイムノ・グロブリ ン及び仲介細胞の活性化である。さらに生のウィルスワクチンによって誘導され た免疫は、不活性化ワクチンにより誘導されたものよりも一般により永続性があ り、より有効で、より交叉反応性である。加えて多くの生のウィルスワクチンは 、投与が容易であり、相対的に安価である。生の弱毒化ウィルスワクチンの不利 な点は、生の外来試薬、例えば他のウィルスの混入の可能性及び幾らかの生のウ ィルスワクチン、例えば麻疹ウィルス、風疹ウィルス及び黄熱ウィルスワクチン が、ワクチンが作られた疾病の穏やかな症状を起こしうる低レベルの残余ビルレ ンスを維持するという事実を含む。より重大な問題は、まれな数の群がウィルス 、例えばポリオワクチンウィルスのワクチン株に特に傷害性で無力となること、 又は生のワクチンウィルスによる感染が免疫欠損の個体中で起きることを含む。

最後に安定性は不安定なワクチンウィルスに重大な問題であり、あるワクチンの 低温度での保存及び移動の必要（麻疹ワクチン）は、この維持が困難である幾ら かの熱帯地域での有用性を限定する。

病原微生物による感染に対する免疫は、各微生物と結合する抗原により促進され る免疫応答の発達に依存する。ある場合、ウィルスのように、ウィルスの表面に 存在する抗原は重要な役割を演じる。

他の例では、ジフテリア又は破傷風のように免疫は生成した抗原毒素に対する特 異的抗体の作用である。従って病原疾病に対する免疫予防の成功の方法は、これ らの「防御抗原」即ち、無傷の病原微生物に対する免疫を促進するこれらの抗原 の出現を要する。

最近、免疫に重要な防御表面抗原が広範囲のウィルスについて確認された。（７ アンダメンタル・ヴアイロロジイ、フイールズ及びナイノ、レイヴン・プレス、 ニューヨーク、１９８６）、特異的防御抗原の構造又は形態の知識で、同一構造 を有し、無傷の病原微生物と反応性の抗体を誘発しうる合成又は生合成分子が製 造できる。

これらの防御抗原の生成に、２つの違うアプローチが探求された。

一つは病原体の表面に免疫的に重要な地域を表現する合成ペグチドの生成を含む 。他は厘核又は真核細胞に病原抗原をコードするＤＮＡ配列を結合することを含 む組換えＤＮＡ技術である。続いてクローンされた病原体ＤＮＡはホスト細胞中 に病原体抗原として発現できる。例えば口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、ＶＰ　Ｉ カプシド蛋白、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）表面抗原、インフルエンザＡウィ ルス血球凝集素、狂犬病ウィルス表面グルコプロティン及びヘルペスウィルスの ｇＤ蛋白が細菌中に発現した。

上で述べたワクチンの潜在的障害に加えて、最近の免疫技術に関連して多くの他 の問題がある。幾らかの病原微生物は、それ自身、十分なワクチンを発達させる ための不明確を生ずる特賞を有する。

例えば多くのウィルスは、ホストの防御系の完全な活動（ｆｕｌｌ　ｐｌａｙ） からそれらを保護する傾向のある局所感染を生成するだけである。

又、組織培養中又はチンパンジー以外の動物中にＢ型肝炎ウィルスを生ずる能力 がないことは慣用の生ワクチンの発達を阻止した。（ネイチャー、３０２．４９ ０−４９５（１９８３））。

防御抗原ワクチンの利用は、それが上で述べた無傷のウィルス免疫原と関係して いる事件の幾らかを出し抜くのを可能にするので、興味のある選択対象である。

しかしながら、適当な病原体遺伝子のクローン化ＤＮＡコピーを含む発現ベクタ ーにより向けられた細菌又は酵母における関連防御抗原の合成は、常にワクチン 中での利用のための豊富な量の抗原を提供しうるものではない。多くのウィルス 抗原（例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原、水庖性ロ内炎つィルスＧ蛋白及び狂犬 病ウィルスグリコプロティン）はエセリシア・コリに発現したとき、細胞に不安 定であるか致死である。そして、細菌プロモーターを用い大量にインフルエンザ ウィルス表面グリコプロティンへモグルチニン（ＨＡ）を直接発現する試みは失 敗した。（プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オプ・サイエ ンス、７８．５３７６）。

発明の要約 多くの固有微生物は人体及び他の種の動物に充満している。これらの微生物を無 害の共生的微生物と病原種のはっきりしたカテゴリーに分ける固くしっかりした ルールはないけれども、微生物学者はそれらをそれ相応に表示し、分類すること を試みた。ホストと共同して存在する微生物はホストの防御機能を妨げるが同時 に体組織に侵入することができない。これらの微生物はホストの種々の区域に転 移増殖でき正常定住者として一般にみなされる。健康人の口に固有の微生物の中 にはブドウ球菌、単球菌、ビリダンス連鎖球菌、腸球菌及び乳酸桿菌がある。こ れらの微生物は口内、歯の間のすきま、及び歯プラークの中及び下に存在する。

鼻やのどに通常存在する細菌は依然異なる形、例えば肺炎双球菌及び連鎖球菌か らなり、腸に存在する細菌の型は、食物及びｐＨで変る存在する食物材料の型に よりかなりの範囲に決定される。多くの微生物は正常な雌生殖路から培養できる が、有用な好気性ミクロ７０−ラは乳酸桿菌により支配される。（マニュアル・ オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ、第２版、レネッテ、スポウメディン グ及びトリアント・出版、アメリカン・ソサイエティ・７オマ・マイクロバイオ ロジイ、ワシントン、ディ・シー、１９７４）。

我々は、防御抗原を発現するため組換えＤＮＡ技術により形質転換した固有の微 生物で体の地域を移転増殖することにより病原疾病に対して免疫する方法を提案 する。転移増殖された被転換体微生物は粘膜表面で増殖しこれにより防御抗原へ の免疫応答を惹起し、個体を続く無傷の病原にさらすことから防ぐ。

詳細な説明 私の発明に記載された方法は既知の病原に対して個体を免疫するのに用いうるが 、好ましい実施態様は単純性ヘルペスウィルス（Ｈ５Ｖ）に対する免疫用である 。従って以下の記載は主にＨ５Ｖに対する免疫に向けられるが、発明はこの使用 に限られることを意図するものではない。

単純性ヘルペスウィルスはヒトの最も通常の感染試薬の中にある。

１年当りのヘルペス感染の新しいケースの数は正確には判っていないが、少くと も数十刃であると見積られる（ジェイエイエムエイ２５３．１６０１（１９８５ ））。少くとも２つのウィルスの明らかな抗原型、Ｈ５Ｖ−１とＨ３Ｖ−２があ る。両抗原型は、再発の皮膚疾病及びウィルス脳炎を含む持続性及び潜伏感染を 起こす。

Ｈ５Ｖ−２に対するワクチンを開発する数多くの試みがなされた。

弱毒化生ワクチンで潜伏感染を生成するについての関心が死滅した、そしてより 特異的にサブユニットワクチンに注意を移した。これらのサブユニットワクチン に対する原理候補者はＨ３ＶグリコプロティンＤ（Ｈ５ＶｇＤ）であり、ウィル スの主な構造抗原は、体液及び細胞免疫の誘導に関与する（ジャーナル・オブ・ パイロロジイ、４１１４７８（１９８２））。しかしながら、非経口的に投与さ れたＨ３ＶｇＤワクチンの最近の調節された試みは幾らか期待に反する結果を生 じた（アブストラクツ、アイシーエイエイシー、１９８７）。

はとんどの努力はワクチンの抗原成分の開発に集中したが、ワクチン投与のルー トにも興味が持たれ、感染の部位で免疫は非経口投与を助長するかに興味が持た れた。一般に非経口的に与えられた抗原は、粘膜表面で免疫を促進することが少 ないと信じられる（ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロシイ、７．２６５ （１９８７）。

さらに臨床データは、ブイ・コレラに対する非経口免疫は、局所に適用した抗原 に対する粘膜応答を抑制しうろことを示唆する（ジャーナル・オブ・イムノロシ イ、１２４．３０７（１９８０））。しかしながら、Ｈ３Ｖ−２のチミジンキナ ーゼネガチプ株で膣内に（ｉｎｔｒａｖａｇ　ｉｎａ　１１　ｙ）免疫されたマ ウスは未免疫のコントロールマウスにＮｕ致死であった膣内チャレンジに対して 防御することが見いだされた（ジャーナル・オブ・パイロロジイ、５１，７４７ （１９８４））。

乳酸桿菌はヒトの膣に見られる最も普通の好気微生物である。メチニコ７は乳酸 桿菌がうまく存在するのに必要であることを提案しくエイニスエム・ニュース５ ４、ｌ　２（１９８８））、レイド等は、微生物が尿路感染に対して防御しうろ ことを発見した。（インフェクション・アンド・イムニティ、４９．２３０（１ ９８５））。加えて乳酸桿菌は通常、雄の尿道に見出された。（ジャーナル・オ プ・クリニカル・マイクロバイオロジイ、６．４８２（１９７７））。

私は、Ｈ５Ｖグリコプロティンを発現するために組換えＤＮＡ技術により形質転 換した乳酸桿菌の固有株で雌の生殖路を転移増殖することによりＨ５Ｖに対し個 体を免疫するためのワクチンを提案する。この技術も又、尿道を転移増殖するこ とにより雄に応用できる。

乳酸桿菌に対するホストベクター系の最近の開発は遺伝子をこれらの細菌に導入 することを可能にする。（エフイーエムニス・マイクロバイオロジイ・レビュー ス、４６．２９７−３１２（１９８７））。

しく解読わくにあるかどうかを確立するためのマーカーを含む。アミラーゼ部分 は、結果として乳酸桿菌により付着Ｈ５ＶｇＤを分泌する。βグルコシダーゼマ ーカーは、乳酸桿菌の抗生物質抵抗性様の転移増殖と潜在的床がりを避けるため にむしろ抗生物質抵抗性マーカーが用いられる。別法として抗生物質抵抗性遺伝 子を用いることができ、微生物が抵抗性である抗生物質が転移増殖抵抗性株の生 存を支持するため７０−ラが存在するのを排除するために用いられる。

乳酸桿菌における棟構造に有用なベクターは、多くの乳酸桿菌中でクローニング するための効果的な伝播者として既に記載されている。（エフイーエムエスーマ イクロバイオロジイＱレビュース、４６．２９７−３１２（１９８７）、ジャー ナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ、６．４８２（１９７７）、イ ンフエク・ディス・タリフ・オブ・エフ・アメル、２（１）、１（１９８８）、 トレンズ・イン・バイオチクノロシイ、３．２７３−２７５（１９８５）、パイ オキミー、７０．５０３−５１７（１９８８）。本発明の方法は単純性ヘルペス ウィルスのグリコプロティン用遺伝子のベクターを経由して膣（又は雄における 尿道）の主な種であることが通常水された乳酸桿菌への挿入を含む。組換え乳酸 桿菌はβガラクトシダーゼの生成による次いでＨ３ＶｇＤ断片を伴うニトロセル ロース紙リフトのハイブリッド形成によるＨ５ＶｇＤ挿入のため固体媒体でスク リーンされる。陽性コロニーを取り培養し、細胞を固定し、それらを抗−Ｈ３Ｖ ｇＤ抗体とインキュベートし、次いでそれらをフルオレラセン接合イムノグロブ リンで染色することによりＨＳＶｇＤの発現について試験される。それらは次い でフライド上に乗せ、フルオレッセンス顕微鏡により試験する。加えて細菌又は 細菌ブロスは、エリサ系又はポリアクリルアミドゲル及びウェスタンプロットに おいてＨＳＶｇＤについて試験できる。どちらかのケースで、ＨＳＶｇＤに対す る抗体は防御系に使用しうる。

組換え乳酸桿菌は膣に接種される。転移増殖された動物モデル内での感染の存在 は乳酸桿菌含有培地（ＬＣＭ）で−目間隔に膣を流すことにより測定され、その アリコツトは直ちにＬＣＭ塩基を用いる寒天プレートに塗布される（ジャーナル ・オブ・マイクロバイオロジイ、４８．９９４（１９８４））。−晩３７℃でイ ンキュヘーション後、リフト（ｌｉｆｔ）をニック標識Ｈ３ＶｇＤプローブにハ イブリッド形成されたニトロセルロース紙でなす。挿入を含むコロニーの割合及 びそれらの消失の速度を次いで計算する。

単純性ヘルペスウィルスに対する免疫応答の生成は、膣の分泌及びヘルペスに対 する抗体の存在についての血清を試験することにより確立される。これは我々が 既に記載した抗−Ｈ３Ｖエリサを修飾することによりなされる。（ジャーナル・ オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ、２６．７８１（１９８８）−）。Ｉ ｇＡについての試験は、抗−ヒト試薬よりもむしろ抗−α結合及び抗−マウスを 用いてなされる。血清反応の陰性範囲は接種に先だち、膣の分泌及びマウスの血 清を試験することにより確立される。試験は、１週間で開始し、次いで転移増殖 で実施され１週間くり返す。

ＨＳＶｇＤに対する免疫応答の証拠が存在すると、次いで動物は、ヘルペスウィ ルスの用量で膣内に誘導され、これは未防御マウスでの死、潜伏感染又はヘルペ ス、膣炎の他の臨床徴候を生ずることを示した。効果は死亡率、を髄神経節の潜 伏ウィルス感染、並びに未防御マウスにおける及びヘルペスウィルスグリコプロ ティンに対する遺伝子を含む乳酸桿菌を接種したマウスにおけるウィルス発散を 比較することにより研究する。

実施例１ 構造物の製造 ＨＳ　ＶｇＤに対する構造遺伝子を乳酸桿菌の形質転換に適したベクター内でク ローン化する。多クローニング部分を伴うベクターで開始するのが好ましい。こ れにバチルス・アミロリグイファシエンスのプロモータ及びσ−アミラーゼ遺伝 子の分泌リーダー配列を加えＨＳ　ＶｇＤ分泌を指図する。この分野の当業者は 乳酸桿菌において作用する他のプロモーター配列がα−アミラーゼプロモーター 配列と置換できることを知るであろう。Ｈ３ＶｇＤ構造遺伝子を次いで正しい解 読わくにプロモーター及び分泌リーダー配列と共に挿入する。

Ｈ３ＶｇＤ遺伝子は合成オリゴヌクレオチドを用い突然変異誘発され（ｍｕｔａ ｇｅｎｉｚｅ）先端を切られ、そして新しい配列がＤＮＡ配列により実証される 。先端が切られた形は、適当なプロモーター及び分泌リーダー配列とベクターに 移管される。

この分野の当業者は、この強要されたクローニングが特異的な方向づけであるよ うモしてσ−アミラーゼ分泌リーダーのＨＳ　ＶｇＤ遺伝子生成物への枠内はん 訳融合を生成するようにデザインされ、全ての他の利用しうる技術を用いうる。

連結混合物をチャシイにより記載されたようにエレクトロポレーションによりエ ル・カセイに変換される（トレンズ・バイオチクノロシイ、３．２７３−２７５ （１９８５））。

変換された混合物はメディウム（ＬＣＭ）を運ぶ乳酸桿菌に接種され、２時間３ ７°Ｃで分化される。一部を１０μｇ／ＩＩ＋２クロラムフェニコール（ｃｍ） を含むＬＣＭプレートに延ばし、プレートをガス−バック（ＢＢＬ）中３７℃で ２日間インキュベートする。コロニイ（被変換体）を精製のためＬＣＭ−ｃｒｎ プレート上に画線する。当業者は別法として、コロニイはニトロセルロース上に ［引上げ（ｌｉｆｔｅｄ）Ｊることができ、Ｈ５ＶｇＤコード化配列の存在のた めにＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によりプローブできることを認識するであ ろう。

上記されるＨ３ＶｇＤ含有制限断片（即ち、Ｈｌｎｄｆｆｌに対するＥｃｏＲ■ ）は、でたらめの初回抗原刺激技術により放射標識され、Ｈ３ＶｇＤ遺伝子を含 有するコロニー用にプローブとして用いられる。でたらめの被変換体コロニーの 培養株又はこれらのＨ５ＶｇＤ遺伝子プローブへのハイブリッド形成したものを この分野で知られた乳酸桿菌に対する標準方法によりプラスミド含量について分 析する。被変換体から分離されたプラスミドの制限酵素消化物のアガロースゲル 分析を用いて、スクリーニングはＨ５ＶｇＤ遺伝子が正確な定位に挿入されたか どうかを確かめ、完全なコードづけ配列が挿入されたことを証明するであろう。

当業者は、無傷のＨ３ＶｇＤポリペプチドコード付は配列に融合されたσ−アミ ラーゼ遺伝子を運ぶ正しいコード付は配列を分析するのに利用しうるユニークな 制限部位を知るであろう。

当業者は上記した構造がシャトルベクターとしてＰＮＺ１２及びその誘導体を用 いてエセリシャ・コリ内に作られ、次いでエル、カセイ又は膣７０う内の乳酸桿 菌の他の主な株に転換できることを認識するであろう。別法としてｐＩＬ２５３ が乳酸桿菌に直接クローニングとして用いることができる。

実施例２ 上記実施例１に記載される望ましい組換え構造を運ぶ選択されたコロニーをＩＱ のＬＣＭ−１０μｇ／＋ｉ４クロラムフェニコール培地に３７℃で１８時間培養 する。コントロールの培地はベクターのみを含む。細菌を遠心により集め、増殖 のメディウムから分離する。増殖メディウムをｌｏｍｆ２に濃縮し、リン酸緩衝 食塩水（ＰＢＳ）に対し透析する。

細胞−結合Ｈ３ＶｇＤを測定するため細菌の試料をＵＶ−顕微鏡法により、又、 分裂細胞含量の分析により直接アッセーする。これらの方法は以下の通りである 。

（１）細胞をＰＢＳに再び懸濁し、遠心し、３回ＰＢＳ中で洗浄する。

最終ペレット中の細菌の少しの試料を顕微鏡スライド上に置き室温で空気乾燥す る。次いで細菌を固め、ウサギ抗−Ｈ３ＶｇＤ抗体とインキュベートし、ＰＢＳ ですすぎ、フルオレラセン接合抗−ウサギグロブリンでインキュベートし、アル カリグリセロール緩衝液ですすぎ、増し、フルオレッセンス顕微鏡法によりフル オレッセンスを試験する。

（２）上で洗浄したベレット細菌のアリコツトをガラスピーズミル（バイオスペ ック、バーテスヴイル、オクラホマ）中で分裂させる。細胞残骸と不溶物質を遠 心により沈降させる。細菌上清は以下（３）におけるように分析される。

（３Ｘ２）からの細菌上清及び透析濃縮増殖メディウムを電気泳動試料緩衝液で １＝１に希釈する。ＨＳＶｇＤ蛋白を１１％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 分離し、１００Ｖで２．５時間エレクトロブロッティングによりニトロセルロー ス膜に転移する。膜を０．３％ツイーン−２０（ＰＴＢ）を含むＰＢＳ中で洗浄 し、４％正常ヤギ血清及びウサギ抗−ｇＤを含むＰＴＢの溶液で一晩反応させ、 ＰＴＢで洗浄し、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ヤギ抗−ウサギＩ ｇＧとインキュベートし、ＰＴＢで洗浄し、ストレプタビジンー西洋ワサビペル オキシダーゼ又はストレプタビジンーアルカリホスファターゼと反応させる。色 は４−クロロ−１−ナフトール（西洋ワサビペルオキシダーゼ用）又は５−ブロ モ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−）ルイジン塩／ニトロブルー・テト ラゾリウムクロリド（アルカリホスファターゼ用）で発達させる。

ゲルレーンは以下の通りである。（１）形質転換した乳酸桿菌からの増殖メディ ウム上清、（２）溶解、形質転換した乳酸桿菌からの細菌上清、（３）ＨＳＶｇ Ｄコントロール、（４）乳酸桿菌の非形質転換培養からのブロス、（５）乳酸桿 菌の溶解、非形質転換培養からの細菌上清及び（６）分子量マーカー。溶解、形 質転換乳酸桿菌からの上清中のアミラーゼ−Ｈ３ＶｇＤ溶解蛋白の存在は、微生 物がＨ３ＶｇＤを生成していることを確認する。増殖メディウム上溝中のアミラ ーゼ−Ｈ３ＶｇＤ溶解蛋白の存在は微生物がＨ５ＶｇＤを生成し分泌しているこ とを確認する。

実施例３ 転移増殖の方法 当業者は、ＨＳＶ−２による膣内攻撃に対する若いマウスの感性が年齢で直接変 わるように見えることを識別するので、６週令雌ＢＡＬＢ／ＣＪマウスを用いる 。（アーカイブス・オブ・ヴアイオロジイ、９３．５１（１９８７））。

形質転換乳酸桿菌の対数期ブロスを８００ｘｇで遠心する。ペレットの容量を連 続的に希釈し、微生物の数を不透明度標準により評価する。当業者は評価された ヒト膣が約１０７微生物／ｍＱを含むことを識別するので（レビュース・オブ・ インフエクテイアス・ディシーズ、１３４．４８６−４８９（１９７６））、少 なくとも微生物のこの数がマウス膣内で０．０１０ｍαの容量で置かれる。

実施例４ 転移増殖が完成したかどうかの測定 形質転換乳酸桿菌でのマウムの転移増殖は、膣壁を検量ループでこすり落り、直 ちにＬＣＭの基で、寒天プレート上にコロニー数用に画線することにより測定す る。試料は２週間、各３日以下の転移増殖を得る。

寒天プレートを１晩３７℃でインキュベートし、コロニーの全数を数える。リフ トはニック−標識ＨＳＶｇＤプローブにハイブリツド形成されたニトロセルロー ス紙でなされる。Ｈ５ＶｇＤ挿入を含むコロニーの割合はコロニーの全数当りの 放射標識コロニーの数により計算される。持続性の割合は、動物の転移増殖に続 く増加する間隔でこの割合を測定することにより計算される。

実施例５ Ｈ５ＶｇＤに対する免疫応答の測定 形質転換した転移増殖細菌により生成したＨ９ＶｇＤに対する免疫応答は抗−Ｈ ５ＶｇＤ抗体についての血液及び膣分泌を試験することにより測定される。分泌 はトリス緩衝食塩液（ｐＨ７，４）の０゜０１５１＋ＩＱアリコツトで膣をさら っと洗いそして吸引することにより集める。血液材料を集め血清を標準技術によ り分離する。

抗−Ｈ５ＶｇＤ抗体は、既に記載したエリサ系の修飾により検出する（ジャーナ ル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ、２６．７８１（１９８８））。

プレートをＨ８ｖｇＤ又はコントロールでコートし、すすぐ、希釈した材料（血 液又は膣分泌）を加え、インキュベートし、すすぐ。アルカリホスファターゼに 結合した抗−マウスＩｇＡを加え、インキュベートし、すすぐ。基質を加えてイ ンキュベートし、次いで水酸化ナトリウムで反応を止める。発達した色は４０５ ｎｍで読む。

抗−Ｈ５ＶｇＤ抗体についてのマウスの試験は一週続く転移増殖開始し、−週間 くり返す。動物が血清反応陽性になると、これらを２続けて行なうサンプリング が抗体中増加を示さなくなるまで試験する。次いで動物をＨＳＶ−１１で攻撃す る（実施例６参照）。

実施例６ ウィルス攻撃 Ｈ３ＶｇＤに対する免疫応答が明らかであるとき（実施例５参照）、マウスをＨ ３Ｖ−２株３３３、マウスで使用に適用されたヒト分離物で攻撃する。

未防御マウスでの力価測定はＨ５Ｖ−２の１０２ないしｌ　Ｑ　’ｐｆｕを含む Ｏ，Ｏ１＋＋２の膣接種材料を用い実施する。プラーク力価測定は既に記載した アッセーを用いてヴエロ（ｖｅｒｏ）細胞でなす（ジャーナル・オブ・クリニカ ル・マイクロバイオロジイ、１４．３７６−３７９（１９８４））。膣内に攻撃 した未防御動物の５０％に死を生ずるに十分なＨ５Ｖ−２の用量（即ちＩＬＤ、 。）を攻撃実験例に用いる。

（１）死亡率、（２）を髄神経節の潜伏感染及び（３）膣感染を髄神経節感染を 試験するため、両側のを髄神経節を感染３週間後にマウスから除く。を髄を細分 化し、ｃ、　ｐ、　ｅ、について観察される細胞単層上に直接置く（インフエク ション・アンド・イムニティ、１６．６９−７４（１９７７））。

膣感染を検出するため、形質転換乳酸桿菌で転移増殖したマウスの原材料中のＨ ３Ｖ−２の力価をコントロールマウスと比較する。

膣スワブをＨ３Ｖで接種後８日間、２目間隔で得る。スワブを１鱈の組織培養液 中に置き、転移増殖した、及び未転移増殖のコントロール動物中のウィルスの量 を比較する。転移増殖したマウス中のＨ３Ｖ−２を検出するのを欠始すると、感 染が阻止されたことを示す。

本発明の他の別の実施態様は、本発明の上記記載から、容易に明白であり、これ らの実施態様は本発明の範囲内にあると信じられる。

国際調査報告 １ｍｓ＋＋＋ｓｌ＋ｅ−＾ＤＤ’−”””　Ｎ０ＲＴ／ｌｆｆｌ１１０４１１ｍ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）組換えＤＮＡ技術により固有の微生物を形質転換して防御抗原を発現す ること 　ｂ）該微生物を適当な培養メディウム中で生育すること　ｃ）該微生物を該培 養メディウムからそれを分離することにより収集すること を含む病原疾病に対するワクチン又はトキソイドを製造する方法。
2. ２．病原疾病が生殖ヘルペス又は他の性的に伝えられた疾病である請求項１の方 法。
3. ３．微生物が乳酸桿菌又は生殖器官の他の正常非病原定住物である請求項１の方 法。
4. ４．防御抗原が単純性ヘルペスウイルス、単純性ヘルペスウイルスグリコプロテ インＤ又は他の性的に伝えられた微生物の抗原である請求項１の方法。
5. ５．組換えＤＮＡ技術により形質転換され防御抗原が発現した固有の微生物を含 む病原、疾病に対するワクチン又はトキソイド。
6. ６．病原疾病が生殖ヘルペス又は他の性的に伝えられた疾病である請求項５のワ クチン又はトキソイド。
7. ７．微生物が乳酸桿菌又は生殖器官の他の正常な非−病原定住物である請求項５ のワクチン又はトキソイド。
8. ８．防御抗原が単純性ヘルペスウイルス抗原、単純性ヘルペスウイルスグリコプ ロテインＤ、又は他の性的に伝えられた微生物の抗原である請求項５のワクチン 又はトキソイド。
9. ９．請求項１の方法により製造された病原疾病に対するワクチン。
10. １０．病原疾病が生殖ヘルペス又は他の性的に伝えられた疾病である請求項９の ワクチン。
11. １１．ａ）組換えＤＮＡ技術により固有の微生物を形質転換し、防御抗原を発現 すること 　ｂ）該微生物を培養し、収集すること、及び　ｃ）該微生物でホストの体の地 域を転移増殖して発現した防御抗原が病原疾病に対する免疫応答を引き出すこと を含む病原疾病に対するホストを免疫する方法。
12. １２．病原疾病が生殖ヘルペス又は他の性的に伝えられた疾病である請求項１１ の方法。
13. １３．固有の微生物が乳酸桿菌又は生殖器官の他の正常な非−病原定住物である 請求項１１の方法。
14. １４．防御抗原が単純性ヘルペスウイルス抗原、単純性ヘルペスウイルスグリロ プロティンＤ、又は他の性的に伝えられた微生物の抗原である請求項１１の方法 。
15. １５．ａ）組換えＤＮＡ技術により乳酸桿菌を形質転換して単純性ヘルペスウイ ルスグリコプロテインＤを発現すること　ｂ）該乳酸桿菌を適当な培養メディウ ム中に生育すること　ｃ）該乳酸桿菌をそれを該培養メディウムから分離するこ とにより収集すること を含む単純性ヘルペスウイルスに対するワクチンを製造する方法。
16. １６．組換えＤＮＡ技術により形質転換され、単純性ヘルペスウイルスグリコプ ロテインＤが発現する乳酸桿菌を含む単純性ヘルペスウイルスに対するワクチン 。
17. １７．ａ）組換えＤＮＡ技術により乳酸桿菌を形質転換して単純性ヘルペスウイ ルスグリコプロテインＤ（ＨＳＶｇＤ）を発現すること　ｂ）該乳酸桿菌を培養 し、収集すること　ｃ）生殖器官を該乳酸桿菌で転移増殖して発現したＨＳＶｇ Ｄが単純性ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘導することを含む、単純性ヘ ルペスウイルスに対するホストを製造する方法。