DE60319822T2

DE60319822T2 - Verfahren und mittel zur erhöhung der darmabsorption

Info

Publication number: DE60319822T2
Application number: DE60319822T
Authority: DE
Inventors: Lothar Bandon STEIDLER
Original assignee: Actogenix NV
Current assignee: Intrexon Actobiotics NV
Priority date: 2002-06-19
Filing date: 2003-06-19
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2023-06-20
Also published as: WO2004001020A3; ATE389415T1; US20050158282A1; DE60319822D1; EP1513545A2; US7601799B2; ES2302945T3; AU2003250250B2; CA2489930A1; WO2004001020A2; AU2003250250A1; JP2005529622A; EP1513545B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) bildende Milchsäurebakterien und deren Benutzung zur Vergrößerung der Darmzottenhöhe und zur Begünstigung der Darmresorption. Insbesondere betrifft die Erfindung EGF-bildende Lactococcus lactis und Lactobacillus casei. Diese Organismen können besonders nützlich zur Behandlung des Kurzdarmsyndroms sein.
Die Effizienz der Darmresorption ist für eine gute Lebensmittelumwandlung wesentlich. Die Darmresorption wird in hohem Maße von der Darmoberfläche bestimmt, die u. a. von der Länge des Darms und der Höhe der Zotten abhängt. In Fällen, in denen ein operatives Entfernen eines Teils des Darmes erforderlich ist, wie in dem Fall von Krebs oder Morbus Crohn, kann dies zu einer verringerten Darmresorption führen, die zu einer ungenügenden Lebensmittelumwandlung und einem Mangel an Nährstoffen, zu Dehydratation und sogar möglicherweise tödlichen Stoffwechselveränderungen führt. Diese Syndrome, die durch die umfangreiche Resektion des Dünndarms verursacht werden, sind als Kurzdarmsyndrom bekannt. Mehrere Verfahren wurden vorgeschlagen, um bei Patienten mit Kurzdarmsyndrom die postoperative Anpassung zu verbessern und die Darmresorption zu erhöhen. US 5,288,703 offenbart, daß sowohl Wachstumshormon als auch insulinartiger Wachstumsfaktor eine positive Wirkung auf die Darmresorption bei Säugern aufweisen. Diese positive Wirkung kann durch die Verabreichung von Glutamin oder Glutaminäquivalent erhöht werden. Die Verabreichung von Glutamin und Wachstumshormon führt zu einer Vergrößerung der Zottenlänge (Gu et al., 2001; Zhou et al., 2001). US 5,972,887 zeigte eine Umkehr der verringerten Schleimhautmasse des Darms und der resorptiven Funktion bei Patienten durch die Verabreichung niedriger Dosen von exogenem Hepatozytenwachstumsfaktor auf. Auch die glucagonartigen Peptide GLP-1 und GLP-2 sind mit positiven Ergebnissen benutzt worden. Studien an Labortieren (Scott et al., 1998) sowie an Menschen (Jeppesen et al., 2001) zeigten eine positive Korrelation zwischen einer Vergrößerung der Konzentration von GLP-2 und einer Verbesserung der Darmanpassung. Kurzdarmpatienten, deren Ileum entfernt wurde, zeigen eine Verringerung der durch Lebensmittel bewirkten Sekretion von GLP-2 (Jeppesen et al., 1999). Besonders diese Patienten können erfolgreich mit GLP-2 behandelt werden. Es ist gezeigt worden, daß auch Leptin eine positive Wirkung auf die Darmanpassung in einem Rattenmodell aufweist (Pearson et al., 2001).
Viel Interesse ist der Wirkung von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, Urogastron) entgegengebracht worden. EGF ist ein verhältnismäßig säurestabiles Hormon, das in den Speichel- und den Brunnerschen Drüsen gebildet wird. Es findet sich in einer breiten Vielfalt von externen Sekretionen ebenso wie im Blut und Fruchtwasser (Marti et al., 1989). Das Molekulargewicht von reifem humanem EGF beträgt 6,2 kDa (Carpenter et al., 1991). EGF ist phylogenetisch stark konserviert und zwischen unterschiedlichen Spezies in hohem Maße kreuzreaktiv.
Es ist bekannt, daß EGF die Resorption von H₂O, Na⁺, Cl^– und Glucose in einem Kaninchenmodell erhöht (Opleta-Madsen et al. 1991). Zudem stimuliert EGF die Verlängerung der Zotten. Dies führt zu einer Vergrößerung der apikalen Oberfläche und einer allgemeinen Erhöhung der Resorption von Nährstoffen (Hardin et al., 1999). Die Resorption von Kohlenhydraten wird durch die EGF-stimulierte Sekretion von pankreatischer Amylase weiter erleichtert (Piiper et al., 1994).
Mehrere Studien haben eine positive Wirkung der Anwendung von EGF in experimentellen Tiermodellen bei Kurzdarmsyndrom gezeigt (Helmrath et al., 1988; Chaet et al., 1994; O'Loughlin et al., 1994; Swaniker et al., 1996; Lukish et al., 1997; Dunn et al., 1997).
Durch EGF vermittelte Wirkungen nach Darmresektion sind in hohem Maße dosisabhängig: Bis zu einer bestimmten Grenze nimmt die Anpassung mit zunehmenden Dosen zu. In Darmstudien liegt die normale Dosis zwischen 30 und 300 μg/kg Körpergewicht/Tag. Systemische ebenso wie enterale Anwendung scheinen wirkungsvoll zu sein. Die systemische Anwendung kann jedoch wegen möglicher Nebenwirkungen unerwünscht sein: Mehrere Neoplasmen weisen EGF-Rezeptoren auf, und eine allgemeine Erhöhung der EGF-Konzentration im Blut könnte die Bildung von Tumoren anregen. Die enterale Anwendung von EGF ist jedoch weniger effizient, da Pepsin reifes EGF zu einer verkürzten Form verarbeiten kann, die nur 25 der ursprünglichen biologischen Aktivität aufweist (Playford et al., 1995).
Überraschenderweise waren wir in der Lage zu zeigen, daß EGF durch rekombinante Milchsäurebakterien, die EGF bilden, in situ abgegeben werden kann. Eine wirksame Bildung und Sekretion von EGF durch Milchsäurebakterien ist nicht augenscheinlich und benötigt die Optimierung der Kodierungssequenz. Zudem kann nicht vorhergesagt werden, daß die Milchsäurebakterien den Durchgang durch den Magen hinreichend überleben, um die geeignete Menge EGF zu bilden, um das Wachstum der Zotten zu stimulieren, die Nährstoffresorption zu begünstigen und das Kurzdarmsyndrom zu behandeln.
Es ist ein erster Gesichtspunkt der Erfindung, ein EGF-bildendes Milchsäurebakterium bereitzustellen. Vorzugsweise sondert das Milchsäurebakterium das gebildete EGF in die Wachstumsumgebung ab. Vorzugsweise ist das Milchsäurebakterium ein Lactococcus lactis oder ein Lactobacillus casei. Noch stärker bevorzugt umfaßt das Milchsäurebakterium SEQ ID NO 1 und/oder SEQ ID NO 3. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein EGF-bildendes Lactococcus lactis, umfassend SEQ ID NO 3. Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist ein EGF-bildendes Lactobacillus casei, umfassend SEQ ID NO 3.
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Benutzung eines erfindungsgemäßen EGF-bildenden Milchsäurebakteriums zur Begünstigung der Darmresorption. Verfahren zum Messen der Darmresorption sind dem Fachmann bekannt. Ein noch anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Benutzung eines erfindungsgemäßen EGF-bildenden Milchsäurebakteriums zur Behandlung des Kurzdarmsyndroms. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Milchsäurebakterium oral angewendet; es kann mittels jeder beliebigen dem Fachmann bekannten Behandlung behandelt werden, um sein Überleben beim Durchgang durch das Darmsystem zu verbessern. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann es gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet und/oder in einem geeigneten Behälter eingekapselt sein, derart, daß die Bakterien erst in dem Dünndarm freigesetzt werden. Die Einkapselung und Behandlungen zur Abgabe in den Dünndarm sind u. a. in US 5,972,685 , WO 0 018 377 und WO 0 022 909 beschrieben worden.
Das erfindungsgemäße Milchsäurebakterium kann mit anderen Verbindungen kombiniert werden, die eine positive Wirkung auf die Darmresorption aufweisen und/oder die positive Wirkung von EGF vergrößern. Als ein unbeschränktes Beispiel kann Glutamin in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Milchsäurebakterium benutzt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Skizze der Konstruktion von pT1hEGF. Die Konstruktion von pT1mEGF wird in einer ähnlichen Weise durchgeführt.
2: Expression von mEGF (A) und hEGF (B) in L. lactis und L. casei. Der Überstand der Kulturen wird wie angegeben auf einem 20%igen Polyacrylamid-Gel getrennt, und die Proteine werden unter Benutzung eines Western-Blot detektiert.
3: Durchschnittliche Zottenlänge der Mäuse, behandelt entweder mit Lactococcus lactis oder mit Lactobacillus casei, transformiert mit dem leeren Vektor pT1NX (pT1NX), mit dem Vektor pT1mEGF, Mäuse-EGF (mEGF) exprimierend, oder mit dem Vektor pT1hEGF, Human-EGF (hEGF) exprimierend. Mit Medium BM9 behandelte Mäuse werden als zusätzliche Negativkontrolle (BM9) benutzt.
BEISPIELE
Medien und Stämme
M17:

– 5 g Bacto-Trypton
– 5 g Bacto-Sogton
– 5 g Fleischextrakt
– 2,5 g Hefeextrakt
– 0,5 g Ascorbinsäure
– 0,25 g MgSO₄
– 19 g Dinatrium-β-glycerinphosphat in 1 l entionisiertem H₂O GM17: M17 mit 0,5% Glucose

Rückgewinnungsmedium:

– 1 ml 2 × M17
– 0,5 ml 2 M Sucrose
– 50 μl 20% Glucose
– 40 μl 1 M MgCl₂
– 4 μl 1 M CaCl₂
– 406 μl H₂O

Agarmedium wird durch Zugeben von 1,2% Agar erhalten.
BM9 Expressionsmedium:

– 60 g Na₂HPO₄
– 30 g KH₂PO₄
– 10 g NH₄Cl
– 5 g NaCl
– 50 mM CO₃-Puffer
– 2 mM MgSO₄
– 0,1 mM CaCl₂
– 0,5% Casiton (Difco)
– 0,5% Glucose in 1 Liter H₂O

L. lactis MG1363 ist ein plasmid- und prophagenfreier Abkömmling des L.-lactis-Stammes NCDO 712 (Gasson, 1983).
Beispiel 1: Optimieren der EGF-Kodierungssequenz für die Expression in Lactococcus
Sowohl diejenige von Mäusen als auch diejenige vom Menschen sind in den öffentlichen Datenbanken erhältlich (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Zugangsnummer X04571 für hEGF und NM 010113 für mEGF). Die Kodierungssequenzen wurden angepaßt, um die Expression in Lactococcus zu optimieren. Auf Grundlage dieser Sequenzen wurden Primersätze entworfen, um die optimierten Kodierungssequenzen von sowohl hEGF als auch mEGF zu assemblieren. Am 3'-Ende der Kodierungssequenz wurde eine SpeI-Restriktionsstelle eingeführt. Die Primer sind in Tabelle 1 (hEGF) und Tabelle 2 (mEGF) gezeigt. Tabelle 1: Oligonukleotide, die zum Assemblieren von hEGF benutzt wurden, und die verfügbare Menge
Tabelle 2: Oligonukleotide, die zum Assemblieren von mEGF benutzt wurden, und die verfügbare Menge
Die Oligonukleotide wurden zu einer Konzentration von 100 μM in Wasser gelöst und in einer 10fach verdünnten Konzentration benutzt.
1 μl jedes Oligonukleotids wird zu 10 μl Taq-Puffer, 8 μl 2 mM Mg² ⁺, 2 μl 0,5 mM XTP, 5 U Taq-DNA-Polymerase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) und 1 U Pfu-DNA-Polymerase (Promega, Madison, USA) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser auf 100 μl aufgefüllt. Die PCR-Reaktion wird 300 s lang bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30mal dem Zyklus von 45 s bei 94°C, 30 s bei 48°C und 30 s bei 72°C, mit einem Endschritt von 10 s bei 15°C. Nach dem Assemblieren werden hEGF und mEGF in einem PCR-Gemisch amplifiziert, das 1 μl Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs; Beverly, USA), 10 μl Taq-Puffer, 4 μl 0,5 mM XTP, 5 μl 0,5 μM jedes Primers, 1 μl Template-DNA, 1 μl 2 mM Mg₂SO₄ und 74 μl H₂O enthält.
Im Fall von hEGF wurden HEGF01 und HEGF06 als Primer benutzt, für mEGF wurden MEGF01 und MEGF06 benutzt. Für hEGF wurde dasselbe Temperaturschema wie für den ersten Schritt benutzt. Im Falle von mEGF wurde der Hybridisierungsschritt bei 52°C anstatt bei 48°C durchgeführt.
Nach dem Assemblieren wurde die Größe der optimierten Genfragmente auf einem 2%igen Agarose-Gel bestätigt.
Beispiel 2: Konstruktion von pT1hEGF und pT1mEGF und Transformation in Lactococcus lactis
SpeI-geschnittenes, assembliertes EGF (sowohl für hEGF als auch für mEGF) wird in ein Nae-I- und SpeI-verdautes pT1NX ligiert (Steidler et al., 1995), was pT1hEGF und pT1mEGF ergibt. Ein schematischer Überblick über die Konstruktion von pT1hEGF ist in 1 gezeigt. Plasmide werden durch Elektroporation in kompetente Zellen von L. lactis transformiert. 50 μl Zellen werden in einer vorgekühlten Küvette von 2 mm bei 25 μF, 2,5 kV und 400 Ω elektroporiert (BioRad-Elektroporator). L. lactis wird durch Züchten einer Verdünnung von 1:100 einer gesättigten Kultur in 200 ml GM17 mit 2,5 Glycin bis zu einem OD₆₀₀ von 0,5 kompetent gemacht (Wells et al., 1993). Nach der Elektroporation wird 1 ml Rückgewinnungsmedium zugegeben, und die Zellen werden bei 28°C 1,5 Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden auf festes Medium GM17, umfassend 5 μg/ml Erythromycin, ausplattiert.
Zur Transformation von L. casei wird Plasmid von L. lactis mittels einer Qiagen-tip 100 gemäß den Herstelleranweisungen isoliert. Die DNA wird in kompetente L.-casei-Zellen transformiert. L.-casei-Zellen werden durch Züchten einer Verdünnung von 1:50 einer Übernachtkultur in 50 ml MRS (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) mit 1 Glycin bei 37°C bis zu einem OD₆₀₀ von 0,6 kompetent gemacht. Die Zellen werden geerntet und zweimal mit 10 ml 5 mM Na₃PO₄ pH 7,4, 1 mM MgCl₂ gewaschen und in 500 μl Elektroporationspuffer (0,3 M Sucrose, 5 mM Na₃PO₄ pH 7,4, 1 mM MgCl₂) wieder suspendiert. 10 μl DNA werden zu 50 μl kompetente Zellen gegeben, und die Elektroporation wird in einem BioRad-Elektroporator durchgeführt. Nach der Elektroporation werden 450 μl MRS zugegeben, und die Zellen werden 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden auf MRS-Agar mit 5 μg/ml Erythromycin ausplattiert. Die Gegenwart des Plasmids wird unter Benutzung von PCR bestätigt.
Beispiel 3: Expression von EGF in L. lactis und L. casei
Die transformierten L.-lactis-Stämme MG1363 [pT1NX], MG1363 [pT1mEGF] und MG1363 [pT1hEGF] werden zu 5 ml GM17, umfassend 5 μg/ml Erythromycin, gegeben und über Nacht bei 30°C gezüchtet. Diese Vorkultur wird 1:100 in 5 ml GM17 mit Erythromycin verdünnt und 3 Stunden lang bei 28°C inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und in Expressionsmedium BM9 wieder suspendiert und über Nacht bei 28°C inkubiert. Die transformierten L.-casei-Stämme werden unter ähnlichen Bedingungen, jedoch unter Benutzung von MRS als Vorkultur und BM9 als Expressionsmedium, gezüchtet.
Zu dem Überstand der Kultur wird ein Volumen von 1:10 von Natriumdesoxycholat zugegeben, und das Gemisch wird 10 Minuten lang auf Eis aufbewahrt. Ein Volumen von 1:10 von 100%igem TCA wird zugegeben, und das Gemisch wird auf Eis 15 Minuten lang inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wird das Pellet in 50 μl H₂O und 50 μl 1 M Tris-HCl pH 9,5 gelöst. Die Proteine werden auf einem 20%igen Laemmli-Proteingel analysiert. Die Detektion wird unter Benutzung eines Western-Blot mit polyklonalem Anti-hEGF aus der Maus und Anti-mEGF aus Kaninchen als primäre Antikörper durchgeführt. Mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper waren von Southern Biotechnology (Birmingham, USA). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Beispiel 4: In-vivo-Prüfung von Mäusen unter Benutzung der transformierten Milchsäurebakterienstämme
Um die Wirkung der transformierten Milchsäurebakterien und das Wachstum der Zotten und die Darmresorption zu beurteilen, wurden sieben Gruppen von Balb/c-Mäusen (IFFA CREDO CR Broekman/Sulzfield) entweder mit einem mEGF- oder einem hEGF-exprimierenden Milchsäurebakterienstamm behandelt. L. lactis und L. casei, transformiert mit einem leeren Vektor pT1NX oder mit BM9-Medium, wurden Mäusen als eine Negativkontrolle gegeben.
600 μl L. casei werden in 15 ml MRS mit 10 μg/ml Erythromycin gezüchtet. Im dem Fall von L. lactis wird GM17 anstelle von MRS benutzt, und nur 5 μg/ml Erythromycin werden zur Selektion benutzt. L. casei wird über Nacht bei 37°C inkubiert; bei L. lactis werden 30°C angewendet. Die Übernachtkultur wird durch Zentrifugieren geerntet, und das Pellet wird in 1,5 ml BM9-Expressionsmedium wieder suspendiert. 100 μl dieser Lösung werden täglich zugeführt, für einen Zeitraum von vier Wochen. Am Ende des Experiments werden die Mäuse geopfert und der Darm isoliert. Das Gewebe wird in gepuffertem Formaldehyd fixiert, und dünne Abschnitte werden unter Benutzung von Hämatoxylin und Eosin G zur mikroskopischen Analyse der Zotten gefärbt. Die Länge der Zotten wird an mehreren Stellen gemessen, um einen repräsentativen Durchschnitt zu erhalten. Alle Abschnitte wurden von dem terminalen Ileum genommen.
Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefaßt. Besonders L. casei [pT1hEGF] weist eine positive Wirkung auf das Zottenwachstum auf und sollte die Darmresorption begünstigen.
LITERATURHINWEISE

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

EGF-bildendes Milchsäurebakterium, umfassend SEQ ID NO: 1.
EGF-bildendes Milchsäurebakterium, umfassend SEQ ID NO: 3.
EGF-bildendes Milchsäurebakterium nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Milchsäurebakterium um Lactococcus lactis handelt.
EGF-bildendes Milchsäurebakterium nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Milchsäurebakterium um Lactobacillus casei handelt.
Benutzung eines EGF-bildenden Milchsäurebakteriums zur Begünstigung der Darmresorption.
Benutzung eines EGF-bildenden Milchsäurebakteriums zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung des Kurzdarmsyndroms.
Benutzung nach einem von Anspruch 5 oder 6, wobei das EGF-bildende Milchsäurebakterium SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Benutzung nach einem von Anspruch 5 oder 6, wobei das EGF-bildende Milchsäurebakterium SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Benutzung nach einem von Anspruch 5 bis 8, wobei es sich bei dem Milchsäurebakterium um Lactococcus lactis handelt.
Benutzung nach einem von Anspruch 5 bis 8, wobei es sich bei dem Milchsäurebakterium um Lactobacillus casei handelt.