DE69914932T2

DE69914932T2 - Verwendung eines zytokine-produzierenden lactococcus stammes zur behandlung von kolitis

Info

Publication number: DE69914932T2
Application number: DE69914932T
Authority: DE
Inventors: Lothar Steidler; Rene Erik REMAUT; Walter Fiers
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1998-10-20
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2019-10-07
Also published as: US20020019043A1; CA2343840A1; EP1123314B1; AU6340199A; ES2214049T3; AU770726B2; WO2000023471A3; ATE259829T1; JP2002528392A; DE69914932D1; JP4598954B2; EP1123314A2; JP2010222364A; US6746671B2; CA2343840C; WO2000023471A2

Description

Die Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Handhabungsstrategie für die Applikation von Zytokinen an die Darmschleimhaut, vorzugsweise von säuresensitiven entzündungshemmenden Wirkstoffen wie IL-10 und/oder eines löslichen TNF-Rezeptors auf oralem Weg. Die bevorzugte erfindungsgemäße Eigenschaft besteht in der Inokulation mit einer Suspension lebender rekombinanter Lactococcus lactis-Zellen, die solchermaßen konstruiert wurden, dass sie die entsprechenden Proteine produzieren. Beispielsweise wurden Mäuse verwendet, in denen durch die Verabreichung von Dextrannatriumsulfat (DSS) eine chronische Entzündung des distalen Dickdarms hervorgerufen wurde. Die Behandlung resultierte eindeutig in einem Rückgang der Entzündung und der Krankheitssymptome, wie durch eine histologische Evaluation ermittelt wurde. Dieser Befund ist sehr unerwartet, da das Applikationssystem, nach der oralen Verabreichung, zur Entfaltung seiner Wirksamkeit im Dickdarm, die saure Umgebung des Magens bzw. den oberen Teil des Dünndarms passieren muss.
Das Immunsystem eines Säugertiers ist divers und komplex und beinhaltet natürliche und adaptive Immunmechanismen und -reaktionen. Das Immunsystem wird häufig in Hinblick auf entweder die humoralen oder zellulären Immunantworten beschrieben. Die humorale Immunität betrifft weitestgehend die Antikörperproduktion und Wirkungen der B-Zellen; die zelluläre Immunität wird durch Zellen vermittelt, einschließlich T-Zellen, dendritische Zellen, Neutrophile, Monozyten und Makrophagen. T-Zellen und B-Zellen stellen zwei Kategorien von Lymphozyten dar.
Einer der Mechanismen über die das Immunsystem normalerweise agiert und sich selbst reguliert beinhaltet die Produktion so genannter Zytokine. Es ist bekannt, dass Zytokine etliche positive und negative Immunantworten vermitteln. Zytokine agieren normalerweise durch die Bindung an einen Rezeptor auf einer Zielzelle. Die Aktivität der Zytokine kann auf mehrere Weisen gestört werden, beispielsweise durch die Verabreichung löslicher Rezeptoren (extrazelluläre Domänen des Rezeptors) oder durch Zytokin-Analoga oder -Derivate.
IL-10 ist ein Zytokin, das in der Lage ist, eine Anzahl von Aktionen oder Wirkungen zu vermitteln. Es ist bekannt, dass IL-10 an der Kontrolle der Immunantworten verschiedener Klassen oder Untergruppen von Th-Zellen (T-Helferzellen) beteiligt ist.
Die entzündliche Darmerkrankung (ED) betrifft eine Gruppe gastro-intestinaler Funktionsstörungen, die durch eine chronische, unspezifische Entzündung von Teilen des gastro-intestinalen Trakts gekennzeichnet ist. Die ulzeröse Kolitis (UC) und Morbus Chron (MC) stellen die prominentesten Beispiele von EDs im Menschen dar. Sie sind mit vielen Symptomen und Komplikationen assoziiert, einschließlich Wachstumsverzögerung bei Kindern, Mastdarmprolaps, blutigen Stühlen (z. B. Teerstuhl und/oder Blutstuhl), Auszehrung, Eisenmangel und Blutarmut, z. B. Eisenmangelanämie und Anämie einer chronischen Erkrankung oder einer chronischen Entzündung. Die Ätiologie oder Ätiologien von EDs sind unklar. Einen Literaturhinweis darauf gibt es in Wyngaarden and Smith (Hrsg.) Cecil's Textbook of Medicine (W. B. Saunders Co. 1985), Berkow (Hrsg.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1982) und Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Aufl., McGraw-Hill, Inc. (1991).
Die Häufigkeit von EDs variiert stark mit dem geographischen Ort. Eine Kollaborationsstudie über Europa zeigt pro 100 000 ein Auftreten von 10,4 für UC und von 5,6 für MC mit einer 40% bzw. 80% höheren Häufigkeit von UC und MC in nördlichen Zentren im Vergleich mit den südlichen. Da sowohl UC als auch MC Langzeiterkrankungen sind, stellen sie wirkliche Störungen der Lebensqualität dar. Morbus Chron besitzt eine bimodale Altersverteilung beim Ausbruch, die auffallende Häufigkeitsspitzen im Alter von 20 und 50 Jahren zeigt. Eine höhere Häufigkeit und ein schwererer Verlauf der Erkrankung ist mit der Spitze im jüngeren Alter verbunden. Es macht MC besonders schmerzlich, da die betroffenen Jugendlichen und jungen Erwachsenen praktisch ihrer hohen Erwartungen an das Leben beraubt werden, welche ja besonders in dieser sozialen Gruppe vertreten sind.
Die ulzeröse Kolitis betrifft eine chronische, unspezifische entzündliche und ulzeröse Erkrankung, die sich hauptsächlich in der Dickdarmschleimhaut manifestiert. Sie ist häufig durch blutigen Durchfall, Unterleibskrämpfen, Blut und Schleim im Stuhl, Unwohlsein, Fieber, Anämie, Anorexie, Gewichtsverlust, Leukozytose, Hypoalbuminämie und einer erhöhten Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BSG) gekennzeichnet. Komplikationen können Blutungen, akute Kolitis, akutes Megakolon, gelegentliche Rektovaginalfisteln und ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines Dickdarmkrebses beinhalten.
Die ulzeröse Kolitis geht ebenfalls mit Komplikationen einher, die nicht mit dem Darm zu tun haben wie Arthritis, Morbus Bechterew, Sakrokoxitis, hintere Uveitis, Erythema nodosum, gangrenöse Pyodermie und Episkleritis.
Die Behandlung unterliegt beachtlichen Schwankungen je nach Ernsthaftigkeit und Dauer der Erkrankung. So ist beispielsweise bei einem ernsten Anfall häufig eine Flüssigkeitstherapie indiziert, um eine Dehydrierung und ein Elektrolytungleichgewicht zu verhindern. Zusätzlich sind manchmal besondere diätetische Maßnahmen nützlich. Die medikamentöse Behandlung beinhaltet verschiedene Corticosteroide, Salazosulfapyridin und einige seiner Derivate sowie möglicherweise immunsuppressive Wirkstoffe.
Morbus Chron besitzt viele Gemeinsamkeiten mit der ulzerösen Kolitis. Morbus Chron lässt sich dadurch unterscheiden, dass die Läsionen scharf von dem benachbarten normalen Darm abgegrenzt sind, im Gegensatz zu den Läsionen der ulzerösen Kolitis, welche ziemlich diffus sind. Darüber hinaus befällt Morbus Chron vornehmlich das Ileum (Ileitis) und das Ileum und den Dickdarm (Ileocolitis). In einigen Fällen erkrankt der Dickdarm alleine (granulomatöse Kolitis) und manchmal ist der gesamte Dünndarm betroffen (Jejunoileitis). In seltenen Fällen sind der Magen, der Zwölffingerdarm oder die Speiseröhre betroffen. Die Läsionen beinhalten ein sarcoid-ähnliches epithelioides Granulom in ungefähr der Hälfte der klinischen Fälle. Die Läsionen des Morbus Chron können transmural sein und tiefe Geschwürbildung, Ödeme sowie Fibrose beinhalten, was zu einem Verschluss und einer Fistelbildung sowie zu einer Abszessbildung führen kann. Dies steht im Gegensatz zur ulzerösen Kolitis, welche üblicherweise zu weit flacheren Läsionen führt, obwohl gelegentlich die Komplikationen der Fibrose, des Verschlusses, der Fistelbildung und Abszesse bei der ulzerösen Kolitis ebenfalls beobachtet werden.
Die Behandlung ist für beide Krankheiten ähnlich und beinhaltet Steroide, Salazosulfapyridin und seine Derivate und immunsuppressive Arzneien wie Cyclosporin A, Mercaptopurin und Azathioprin. Behandlungen, die in jüngerer Zeit entwickelt wurden und von denen sich einige immer noch in klinischen Studien befinden, beinhalten die systemische Verabreichung (durch Injektion) von TNF-blockierenden Verbindungen wie TNF-Antikörper oder den löslichen TNF-Rezeptor.
EDs stellen auf Grund des Fehlens einer ursächlichen Behandlung ein wirkliches Problem der Volksgesundheit dar. Obwohl viele Patienten mit einer konventionellen medizinischen Therapie erfolgreich versorgt werden können, beispielsweise mit einer entzündungshemmenden Corticosteroid-Behandlung, werden die meisten ein Wiederauftreten der Krankheit aufweisen und zwei Drittel werden eine Operation benötigen.
Die Ursache entzündlicher Darmerkrankungen ist unbekannt. Bei der Pathogenese von MC und UC ist wahrscheinlich ein Wechselspiel zwischen genetischen und Umweltfaktoren, wie bakteriellen Verursachern, beteiligt, obwohl bislang keine eindeutige Ursache identifiziert wurde. Die Haupttheorie besteht darin, dass es bei EDs zu einer anormalen Immunreaktion kommt, welche möglicherweise durch die Mikroflora des Darms ausgelöst wird. Auf jeden Fall ist eindeutig gezeigt, dass T-Zellen eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielen. Aktivierte T-Zellen können sowohl entzündungshemmende als auch entzündungsfördernde Zytokine produzieren. Anhand dieses Wissens kann EDs in einer rationalen Weise entgegengewirkt werden. Neuartige entzündungshemmende Therapien, welche neutralisierende monoklonale Antikörper oder entzündungshemmende Zytokine nutzen, zeigen die Möglichkeit auf, die immunologischen Fehlregulationen, die EDs zugrunde liegen, zu modulieren. Eine sehr bedeutende und effektive neue Therapie besteht in der systemischen Behandlung mit monoklonalen Anti-TNF-Antikörpern wie oben beschrieben. Einzelne intravenöse Dosen des cA2-Infliximab-Antikörpers, die von 5 bis 20 mg kg^–1 reichen, resultierten in einer drastischen klinischen Verbesserung des aktiven Morbus Chron. Die Verwendung des systemisch verabreichten rekombinanten IL-10 in einer 7-tägigen täglichen Verabreichungsweise, wobei Dosen von 0,5 bis 25 μg kg^–1 verwendet wurden, zeigte reduzierte Werte der Morbus Chron Aktivität und eine erhöhte Remission. Eine Anzahl sehr viel versprechender Therapien, entweder zur Verwirrung entzündungsfördernder Zytokine oder Etablierung von T-Zell-Infiltraten, zeichnen sich zur Zeit in experimentellen Modellen ab. Allerdings bedürfen alle diese Strategien einer systemischen Verabreichung. Die schweren Komplikationen von EDs können zu einer ernsten Entkräftung und letztendlich zum Tod führen.
Im US Patent 5,368,854, das der Schering Corp. zugeteilt wurde, ist eine Methode offen gelegt, IL-10 zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen in Säugern zu verwenden. Bei dieser Methode wird das Zytokin einem Säugetier verabreicht, das eine ED (entzündliche Darmerkrankung) hat. Die Verabreichung von IL-10 erfolgt, wie in dieser Referenz beschrieben, parenteral wie intravaskulär und vorzugsweise intravenös.
Auf jeden Fall ist es offensichtlich, dass ein solcher Weg der Verabreichung für einen (menschlichen) Patienten, der an einer ED leidet, nicht ohne Nachteile ist. Einen viel einfacheren und angenehmeren Weg stellt eine orale Verabreichung eines Medikaments dar, das ein Zytokin wie IL-10 oder einen Zytokinantagonisten enthält, der eine ähnliche therapeutische Wirksamkeit besitzt. Noch bedeutsamer ist die Tatsache, dass die örtlich begrenzte Abgabe des therapeutischen Wirkstoffs eine höhere Wirksamkeit und weniger unerwünschte Nebenwirkungen auf Grund systemischer Aktivitäten gestattet.
In WO 97/14806, das der Cambridge University Technical Services Ltd. gehört, ist eine Methode offen gelegt, biologisch aktive Polypeptide und/oder Antigene durch die Benutzung nicht-invasiver Bakterien, wie Lactococcus, mittels intranasaler Verabreichung dieser Polypeptide in den Körper, insbesondere an die Schleimhaut zu applizieren.
In WO 96/11277, das der DOMPE' S. P. A. gehört, ist eine allgemeine Methode offen gelegt, einem Tier mittels eines rekombinanten Bakteriums, insbesondere durch eine intraperitoneale oder intrakolische Verabreichung, therapeutische Verbindungen zu applizieren.
Auf jeden Fall stellt die Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung, wie der chronischen Kolitis oder des Morbus Chron, mit einem Zytokin wie IL-10, das säureempfindlich ist, eine sehr heikle und schwierige Aufgabe dar, die zu bewältigen ist. Daher ist es notwendig, ein System zu entwickeln, in dem die aktive Verbindung (z. B. ein Zytokin oder ein löslicher Rezeptor) direkt an den Ort gebracht wird, an dem von der Verbindung erwartet wird, dass sie ihre Wirksamkeit entfaltet, wobei das Problem der Säureempfindlichkeit vieler Zytokine, insbesondere des IL-10, und das Erfordernis, dass das Applikationsvehikel nach der oralen Verabreichung das saure Milieu des Magens passieren muss, in Betracht gezogen werden muss. Ferner degradieren verschiedene Verdauungsenzyme Polypeptide, während diese den Magen und Darm passieren. Nicht zuletzt kann es eine in situ Verabreichung des Wirkstoffs ermöglichen, dass therapeutisch wirksame Konzentrationen erreicht werden, die bei systemischeren Wegen der Verabreichung wegen systemischer Toxizität oder anderer Einschränkungen nur schwer erreicht werden.
Um die Genesung eines Patienten, der an einer ED leidet, zu erreichen, ist es notwendig, die beschädigten Zellen und das Organ, welches die beschädigten Zellen aufweist, zum Beispiel den Dickdarm, wiederherzustellen.
Die Lösung des oben beschriebenen technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen beschrieben sind.
Es ist unsere Erfindung, einen Zytokin produzierenden grampositiven Bakterienstamm oder einen Zytokinantagonisten produzierenden grampositiven Bakterienstamm für die Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen zu verwenden. Das Zytokin oder der Zytokinantagonist, das/der von dem bakteriellen Wirtsstamm produziert werden soll, ist zum Beispiel IL-10, ein löslicher TNF-Rezeptor oder ein Zytokinanalog, wie das von IL-12 abgeleitete p40-Homodimer (ein IL-12-Antagonist), ein Interferon-γ-Antagonist, ein IL-1-Antagonist oder ein viruskodiertes Zytokinanalog, wie EBV BCRF1 (Baer et al., 1984), wobei der grampositive Bakterienstamm vorzugsweise eine Lactococcus species und bevorzugterweise Lactococcus lactis ist. Andere grampositive Bakterienstämme, die zum Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Bacillus subtilis, Streptococcus gordonii, Staphylococcus xylosus oder ein Lactobacillus spec. wie Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei; Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii oder Lactobacillus plantarum.
Die entzündlichen Darmerkrankungen wie eine chronische Kolitis, ein Morbus Chron oder eine ulzeröse Kolitis können gemäß der Erfindung mit einer geeigneten Dosis der aktiven Zytokin-Verbindung, vorzugsweise IL-10 oder löslicher TNF-Rezeptor, behandelt werden und sorgt unerwartet für eine Wiederherstellung eines offensichtlich normalen und gesunden Zustands des erkrankten Dickdarms.
IL-10 kann alleine oder in Kombination mit mindestens einem zusätzlichen therapeutischen Wirkstoff verabreicht werden. Beispiele solcher Wirkstoffe beinhalten Corticosteroide, Salazosulfapyridin, Derivate von Salazosulfapyridin, immunsuppressive Wirkstoffe wie Cyclosporin A, Mercaptopurin, Azathioprin und ein weiteres Zytokin. Die gemeinsame Verabreichung kann nacheinander oder gleichzeitig erfolgen. Eine gemeinsame Verabreichung bedeutet im Allgemeinen, dass im Empfänger während eines festgelegten Zeitintervalls mehrere (zwei oder mehr) Therapeutika vorhanden sind. Üblicherweise spricht man von einer gemeinsamen Verabreichung zweier Wirkstoffe, wenn der zweite Wirkstoff innerhalb der Halbwertszeit des ersten Wirkstoffs verabreicht wird.
Daher geht es bei der hier offen gelegten Erfindung um eine örtlich begrenzte Zufuhr von IL-10 mittels einer in situ Synthese durch rekombinanten L. lactis. Als ein Ergebnis davon wird bei der chronischen Kolitis, die mit DSS induziert wurde, die Entzündung um 50% reduziert und der Ausbruch der Kolitis in IL-10 –/– 129 Sv/Ev Mäusen verhindert. Demnach ist die Methode im Vergleich zu starken, gut etablierten und akzeptierten Therapien, die auf der systemischen Verabreichung von entzündungshemmenden Proteinen beruhen, gleichermaßen wirkungsvoll. Der hier verwendete Vektor, L. lactis, ist ein grampositiver, lebensmittelunbedenklicher Organismus, der vollkommen harmlos ist. Es ist ein nicht-kolonisierender Mikroorganismus. Eine akkurate Dosierung und zeitliche Koordinierung während der Behandlung, deren große Bedeutung hier gezeigt wurde, kann daher leicht erreicht werden.
Die entscheidende Anforderung bezüglich der Lebensfähigkeit des Vektors ist in der vorliegenden Erfindung gezeigt. Dies weist auf die Notwendigkeit der in situ Synthese von IL-10 hin. Der Vektor ist tatsächlich in der Lage, dies zu erreichen, was die de novo Synthese von IL-10 im Dickdarm zeigt.
Ein wirkungsvolles neuartiges Konzept für eine proteinbasierte Behandlung im Darmtrakt ist hiermit offen gelegt. Die Behandlung kann auf oralem Weg ausgeführt werden, was für pharmakologische Formulierungen am wünschenswertesten ist. Es kann seine Wirkungen bis zum distalen Dickdarm hin vermitteln, indem eine Verbindung mit intrinsischer Eignung für den verwendeten Verabreichungsweg verwendet wird. Diese Methode umgeht die Notwendigkeit einer systemischen Verabreichung. Sie eröffnet die Möglichkeit einer örtlich begrenzten Applikation von Substanzen, die instabil oder schwierig in großen Mengen herzustellen sind. Sie ist an sich sehr kosteneffektiv.
Diese Methode kann die Frage nach einer nachhaltigen und lokalisierten Präsenz von IL-10 beantworten, die in der Therapie in Konzentrationen vorliegt, die, hinsichtlich latenter Nebenwirkungen, höher als wünschenswert sind oder sogar höher als sie mit systemischer Applikation erreichbar wären.
Einige Begriffe, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, sind im Folgenden um der Klarheit willen erklärt.
Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff „Symptome" auf jeglichen subjektiven Hinweis auf eine Erkrankung oder auf das Befinden eines Patienten. Dies beinhaltet auch Hinweise, die vom Patienten wahrgenommen werden. Beispiele für Symptome von EDs beinhalten Durchfall, Abdominalschmerzen, Fieber, Teerstuhl, Blutstuhl und Gewichtsverlust.
Der Begriff „Zeichen" bezieht sich im Allgemeinen auf jeglichen objektiven Hinweis auf eine Erkrankung oder das Befinden, üblicherweise so wie er vom untersuchenden Arzt wahrgenommen wird oder auf Merkmale, welche in einer Laboruntersuchung oder bei anderen Tests, wie einer Ultraschalluntersuchung oder einer röntgenographischen Untersuchung, zutage treten würden. Einige Beispiele von Zeichen einer ED beinhalten Abdominalmasse, Glossitis, aphthöse Ulzeration, Analfissuren, Perianalfisteln, Anämie, Malabsorbtion und Eisenmangel. Gelegentlich überlappen Zeichen und Symptome. Zum Beispiel wenn sich ein Patient über Blutstühle (ein Symptom) beschwert und eine Laboruntersuchung einer Stuhlprobe positiv für Blut (ein Zeichen) ist.
Der Ausdruck „geeignete Dosierung" oder „wirksame Menge" bedeutet eine Menge oder Dosierung, die ausreicht, um ein Symptom oder Zeichen eines Autoimmunzustands oder einer unerwünschten oder fehlerhaften Entzündungs- oder Immunreaktion zu verbessern. Eine wirksame Menge für einen bestimmten Patienten kann auf Grund von Faktoren wie dem zu behandelnden Zustand, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, der Methode, dem Weg und der Dosis der Verabreichung und der Ernsthaftigkeit der Nebenwirkungen variieren.
Mit „Zytokin" ist ein Polypeptidfaktor gemeint, der von einer Reihe von Zelltypen vorübergehend produziert wird und der üblicherweise örtlich begrenzt wirkt und durch Bindung an Rezeptoren auf der Zelloberfläche die Expression spezifischer Gene aktiviert.
Mit „Antagonist" ist eine Verbindung gemeint, die an Rezeptoren bindet, diese jedoch nicht aktiviert, und daher die Wirkung des Agonisten kompetitiv inhibiert. „Agonisten" sind Verbindungen, die an Rezeptoren binden und sie aktivieren (z. B. endogene Liganden wie Hormone und Neurotransmitter, chemisch synthetisierte Verbindungen, Naturprodukte wie Alkaloide).
Kulturmedien
GM17 ist M17 (Difco, St. Louis), das mit 0,5 w/v% Glukose supplementiert ist. GM17E ist GM17, das mit 5 μg/ml Erythromycin supplementiert ist. BM9 enthält 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 1 g NH₄Cl, 0,5 g NaCI, 2 mmol MgSO₄, 25 mmol NaHCO₃, 25 mmol Na₂CO₃, 0,1 mmol CaCl₂, 5 g Glukose und 5 g Casitone (Difco) pro Liter. BM9E ist BM9, das mit 5 μg/ml Erythromycin supplementiert ist.
Rekombinante DNA-Techniken
Die PCR-Amplifikation von DNA wurde mit der VENT-Polymerase ausgeführt, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet wurden. DNA-modifizierende Enzyme und Restriktionsendonukleasen wurden unter Standardbedingungen und in den von den Herstellern empfohlenen Puffern verwendet. Allgemeine molekulare Klonierungstechniken und die Elektrophorese von DNA und Proteinen wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Sambrook et al., 1990). L. lactis wurde mittels Elektroporation von Zellen transformiert, die in Gegenwart von Glycin angezogen wurden (Wells et al., 1993).
Konstruktion der Expressionsplasmide
Das Plasmid pT1MIL10 (1) wurde durch die Subklonierung eines PCR-Fragments konstruiert, das mit den Primern CAGTACAGCCGGGAAGACAAT und GCACTAGTTAGCTTTTCATTTTGAT gewonnen wurde, wobei die PCR mit einem cDNA-Klon durchgeführt wurde, der die kodierende Sequenz von mIL-10 beinhaltet. Für die Ausarbeitung dieser Strategie benutzten wir die mIL-10 cDNA-Sequenz wie sie unter der EMBL Acc. Nr. M37897 angegeben ist. Unter Verwendung der oben angegebenen Primer konnte das mIL10-Fragment nach einer Behandlung mit Kinase und SpeI als ein blunt-SpeI-Fragment in das mit NaeI-SpeI geöffnete Plasmid pT1NX (1) subkloniert werden, das ein pTREX1-Derivat darstellt (Wells and Schofield in: Lactic Acid Bacteria: current advances in metabolism, genetics and applications. F. Bozoglu & R. Bibek, Hrsg. Nato ASI Series H, Bd. 98, S. 37. Springer Verlag, 1996).
Das Plasmid pT1TR5AH (1) wurde durch die Subklonierung eines PCR-Fragments konstruiert, das mit den Primern CTGGTCCCTTCTCTTGGTGAC und CCACTAGTCTATTAATGATGATGATGATGATGCGCAGTACCTGAGTCCTGGGG gewonnen wurde, wobei die PCR mit einem cDNA-Klon durchgeführt wurde, der die kodierende Sequenz von sTNFr55 beinhaltet. Für die Ausarbeitung dieser Strategie benutzten wir die sTNFr55 cDNA-Sequenz wie sie unter der EMBL Acc. Nr. L26349 angegeben ist. Unter Verwendung der oben angegebenen Primer wurde das sTNFr55-Fragment mit einem 6-HIS-Tag am 3'-Ende versehen und konnte nach einer Behandlung mit Kinase und SpeI als ein blunt-SpeI-Fragment in das mit NaeI-SpeI geöffnete Plasmid pT1NX subkloniert werden.
Beide Plasmide kodieren, dem Lactococcus-P1-Promotor nachgeschaltet, für Fusionsgene zwischen der Sekretions-Leader-Sequenz von Usp45 (Van Asseldonk et al., Gene 95, 155–160, 1990) und mIL-10 bzw. sTNFr55. Nach der Sekretion wird die Leader-Sequenz abgespalten.
Identifizierung rekombinanter Proteine
Rekombinantes mIL-10 und msTNFr55 konnten im Kulturüberstand von MG1363[pT1MIL10] bzw. MG1363[pT1TR5AH] (2) beobachtet werden. Für diese Untersuchung wurden 5 ml Aliquots der Kulturen mit 2 ml Phenol extrahiert, und die Proteine wurden anschließend durch Präzipitation mit 10 ml Ethanol aus der organischen Phase aufbereitet. Ein Teil des Präzipitats, der 1 ml Kulturüberstand entsprach, wurde einer SDS-15% PAGE und einem Immunoblot unterzogen. Proben der Kulturen wurden, wie unten beschrieben, zu relevanten Zeitpunkten während der Wachstumsphase der Bakterien entnommen.
Der Kulturüberstand von MG1363[pT1MIL10] enthielt im Durchschnitt 1 μg ml^–1 Maus-IL-10. Die Aktivität des Maus-IL-10 im Überstand wurde gemessen, indem eine Maus-Mastzelllinie MC/9 verwendet wurde (Thompson-Snipes, L. et al., J. Exp. Med. 173, 507, 1991). Humanes IL-10 bindet an den Maus-IL-10R wie in Transfektionsexperimenten gezeigt wurde (Ho, A. S. Y. et al., PNAS 90, 11267,1993; Liu, Y. et al., J. Immunol. 152, 1821, 1994). 1 U ml^–1 von IL-10 wird als die Menge definiert, die in der Lage ist, 50% der IFN-gamma Produktion conA-aktivierter Milzzellen zu inhibieren (Fiorentino, D. F. et al., J. Exp. Med. 170, 2081, 1989). Die ED50 für diesen Effekt ist üblicherweise 0,3–0,6 ng ml^–1. Bei einer Messung mit einem Standard bekannter Aktivität (Biosource International, CA) wies der MG1363[pT1MIL10]-Kulturüberstand eine Aktivität von etwa 8000 U ml^–1 auf. Berg et al. (J. Clin. Invest. 98, 1010–1020) berichten von einer spezifischen Aktivität von etwa 1,0 × 10⁷ U mg^–1 für rekombinantes mIL-10. Nach diesen Überlegungen und unter Berücksichtigung der Variationen der verwendeten Methode kamen wir zu dem Schluss, dass das rekombinante mIL-10, das im MG1363[pT1MIL10]-Kulturüberstand vorliegt, eine volle biologische Aktivität aufweist. Es konnte keine IL-10-Aktivität in den Überständen der Kontrollkulturen MG1363 oder MG1363[pTREX1] nachgewiesen werden.
Der Kulturüberstand des Stamms MG1363[pT1TR5AH] enthielt im Durchschnitt 200 ng ml^–1 msTNFr55. Loetscher et al. (1991) zeigten, dass eine vollständige Inhibierung der TNF zytotoxischen Aktivität durch sTNFr55 erst ab einem molaren Verhältnis von 1000 : 1 und höher von sTNFr55 zu TNF erzielt wurde. Der lösliche rekombinante TNFr55, der aus dem Kulturüberstand von MG1363[pT1TR5AH] isoliert wurde, zeigte einen gleich großen inhibitorischen Effekt auf TNF wie er auch für das Ursprungsprodukt berichtet wurde. Dies wurde durch eine Mischung und damit eine Kompetitionsverdrängung einer Titrationsserie von TNF mit einer Titrationsserie von rekombinantem sTNFr und der Messung der TNF-Aktivität in einem Zytotoxizitätsassay wie beschrieben gezeigt (Espevik, T and Niessen-Meyer, 1986).
Vorbehandlung der Mäuse
Zur Induktion einer chronischen Kolitis wurden die Mäuse wie von Kojouharoff et al. beschrieben vorbehandelt (Clin. Exp. Immunol 107, 353, 1997). Sechs bis acht Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse erhielten vier Behandlungsrunden mit DSS. Jede Runde bestand aus 5% DSS im Trinkwasser für 7 Tage, gefolgt von einem 10-Tagesintervall, während dessen sie normales Trinkwasser erhielten. Vier bis sechs Wochen nach Beendigung der letzten DSS-Runde wurden die Mäuse wie angegeben mit L. lactis-Stämmen behandelt.
1: Übersicht über die verwendeten Plasmide
1a: Schematische Karten der verwendeten Plasmide. P1 ist der Lactococcus-P1-Promotor wie in Waterfield et al., (1995) beschrieben, usp45S ist ein DNA-Fragment, welches das Sekretionssignalpeptid von Lactocoecus-Usp45 (van Asseldonck et al., 1990) kodiert, mil10 ist ein DNA-Fragment, welches den reifen Teil des Maus-Interleukin-10 kodiert, tr55 ist ein DNA-Fragment, welches den löslichen Teil des Typ 1-TNF-Rezeptors kodiert, H6 ist ein Fragment, das 6 Histidinreste kodiert, Em^R ist der Erythromycin-Selektionsmarker.
1b: DNA-Sequenzen von pTREX1 und pT1NX
1c: DNA-Sequenzen von pT1MIL10 und pT1TR5AH
2:
Proteinprofil nach einer SDS-PAGE der Kulturüberstände der angegebenen Stämme nach Immunoblot, aufgezeigt mit Anti-Maus-Interleukin-10- (Teilabbildung A) oder Anti-Maus-Typ1-TNF-Rezeptor- und anti-6 His-(Teilabbildung B)-Antisera.
3:
Durchschnittliche Dickdarmlänge von Gruppen von Mäusen, in denen

a) mit DSS eine chronische Kolitis induziert wurde,
b) mit DSS eine chronische Kolitis induziert wurde und denen anschließend der L. lactis Stamm MG1363[pTREX1] oral verabreicht wurde,
c) mit DSS eine chronische Kolitis induziert wurde und denen anschließend der L. lactis Stamm MG1363[pT1TR5AH] oral verabreicht wurde und
d) mit DSS eine chronische Kolitis induziert wurde und denen anschließend der L. lactis Stamm MG1363[pT1MIL10] oral verabreicht wurde.

4
Durchschnittliche Schadenswertung des Epithels im distalen Dickdarm in Gruppen von Mäusen, in denen

5:
Durchschnittliche Wertung des entzündlichen Infiltrats im distalen Dickdarm in Gruppen von Mäusen, in denen

6:
Repräsentative, mit Haematoxylin und Eosin gefärbte Schnitte des distalen Dickdarms von Mäusen.
Normales Gewebe: unbehandelte Tiere
DSS-Kolitis: Tiere, die mit DSS vorbehandelt wurden, um eine chronische Kolitis zu entwickeln.
DSS-Kolitis, MG1363[pT1MIL10]-Behandlung: Tiere, die mit DSS vorbehandelt wurden, um eine chronische Kolitis zu entwickeln und denen anschließend der L. lactis Stamm MG1363[pT1MIL10] oral verabreicht wurde.
DSS-Kolitis, MG1363[pTREX1]-Behandlung: Tiere, die mit DSS vorbehandelt wurden, um eine chronische Kolitis zu entwickeln und denen anschließend der L. lactis Stamm MG1363[pTREX1] oral verabreicht wurde.
7:
Statistische Bewertung der Histologie. Die Dickdarmschnitte wurden nach dem Zufallsprinzip nummeriert und im Blindversuch interpretiert. Die Wertungen der einzelnen Mäuse wurden daraufhin dekodiert und die wieder nach Gruppen zusammengefassten Nummern wurden statistisch ausgewertet. Die DSS-Kolitis-Balken zeigen histologische Summenwertungen für den distalen Dickdarm der Kontrollmäuse und der Mäuse, die mit DSS induziert wurden, um eine chronische Kolitis zu entwickeln, entweder unbehandelt oder mit L. lactis-Kulturen behandelt. Die Wertung ist eine Summe der Wertungen des epithelialen Schadens und des lympoiden Infiltrats, wobei sich beide zwischen 0 und 4 bewegen. Gruppen von Mäusen (n = 10) wurden alternativ für zwei (= 2w) oder vier (= 4w) Wochen mit MG1363, MG1363[pTREX1] oder MG1363[pT1MIL10] (= IL-10) behandelt. Einige der Kulturen wurden vor der Inokulation mit UV (= +u.v.) bestrahlt, was die Lebensfähigkeit der Zellen um mehr als 10⁶-fach verringerte. Die IL-10 –/– Kolitis-Balken zeigen histologische Summenwertungen für Gruppen (n = 5) von 7 Wochen alten unbehandelten, TREX-behandelten und IL-10-behandelten weiblichen 129 Sv/Ev IL-10 –/– Mäusen. Die histologische Wertung ist eine Summe des Entzündungsgrades im proximalen, mittleren und distalen Dickdarm, wobei sich alle zwischen 0 und 4 bewegen. Die Fehlerbalken repräsentieren die SEM.
8:
Darstellung der bakteriellen Lebensfähigkeit nach Bestrahlung, gemessen bei OD₆₀₀.
Um die vorliegende Erfindung weiter offen zu legen und sie demnach weiter zu verdeutlichen, sind im Folgenden einige Beispiele angegeben.
Beispiel 1
Behandlung der Mäuse mit lebenden L. lactis
Lagerung der Expressionsstämme
Frisch ausgestrichene Kulturen der L. lactis-Expressionsstämme wurden in Abhängigkeit von der Ab- oder Anwesenheit eines Expressionsplasmids in 10 ml GM17 oder GM17E angeimpft und über Nacht bei 30°C kultiviert. Die Übernachtkulturen wurden 1/100 in frischem GM17 oder GM17E verdünnt und für 3 Stunden bei 30°C vorkultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Abhängigkeit von der Gegenwart von Plasmiden in BGM9 oder BGM9E resuspendiert. Diese Kulturen wurden für 5 Stunden bei 30°C kultiviert. Das Proteinprofil dieser Kulturen wurde anhand eines Western-Immunoblots mit einem Äquivalent von 1 ml Kulturüberstand analysiert, wobei Antisera verwendet wurden, die entweder gegen sTNFr55 oder IL-10 gerichtet waren. Das Proteinprofil zeigte das Vorhandensein von sTNFr55 und IL-10 in den entsprechenden Spuren (2). 5 ml der ursprünglichen GM17 oder GM17E Übernachtkulturen wurden mit 5 ml Glyzerin versehen und bei –20°C gelagert. Diese Dauerkulturen wurden als Startmaterial für mehrere Experimente verwendet. Die Proteinanalyse während einer Reihe von Einzelexperimenten zeigte, dass durch diese Vorgehensweise ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit in der Herstellung der rekombinanten Proteine erzielt werden konnte.
Wochen 1 und 2
Dauerkulturen der L. lactis-Stämme wurden 1/200 in 10 ml GM17 oder GM17E verdünnt und über Nacht bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 1 ml BM9 oder BM9E resuspendiert. Die Kontrollen, gesunde Mäuse und Mäuse mit induzierter Kolitis wurden täglich mit 100 μl-Aliquots dieser Zellsuspensionen inokuliert.
Wochen 3 und 4
Dauerkulturen der L. lactis-Stämme wurden 1/200 in 10 ml GM17 oder GM17E verdünnt und über Nacht bei 30°C kultiviert. Diese Kulturen wurden 1/25 in 10 ml BM9 oder BM9E verdünnt und für 3 Stunden bei 30°C kultiviert. Täglich wurden Mäusen Aliquots von 200 μl intragastral (peroral) verabreicht.
Beispiel 2
Bestimmung der histologischen Wertung
Die histologische Wertung wurde im Wesentlichen wie in Kojouharoff et al. (Clin. Exp. Immunol. 107, 353, 1997) beschrieben bestimmt.
Die Mäuse wurden mittels Genickbruch getötet. Der Dickdarm wurde entfernt und mit PBS gewaschen. Das distale Drittel des Dickdarms wurde der Länge nach aufgeschnitten, auf Filterpapier gelegt und mit 10% Formalin in PBS über Nacht fixiert. Es wurden Längsschnitte durch das in Paraffin eingebettete Material gemacht. Drei 3 μm-Schnitte wurden in einem mittleren Abstand von 200 μm ausgeführt. Die Schnitte wurden mit Haematoxylin-Eosin gefärbt. Die histologische Analyse wurde im Blindversuch ausgeführt. Die Mäuse wurden einzeln gewertet und jede Wertung stellte den Mittelwert dreier Schnitte dar.
Die Histologie wurde wie folgt bewertet:
Infiltration: 0, kein Infiltrat; 1, Infiltrat rings um die Kryptenbasen; 2, Infiltrat reicht bis zur L. muscularis mucosae; 3, ausgedehnte Infiltration, welche die L. muscularis mucosae erreicht und Verdickung der Schleimhaut mit reichlichen Ödemen; 4, Infiltration der L. submucosa.
Epithelialer Schaden: 0, normale Morphologie; 1, Verlust der Becherzellen; 2, großräumiger Verlust der Becherzellen; 3, Verlust der Krypten; 4, großräumiger Verlust der Krypten und/oder konzentrierte Foci polyploider Regeneration.
Die Dickdarmlänge wurde sofort nach der Dissektion und Ausbreitung auf einem Papiertuch gemessen.
Die Pathologie der chronischen Kolitis ist, neben anderen Parametern, durch eine Verkleinerung der Länge des Dickdarms und durch einen epithelialen Schaden und Infiltration von Lymphozyten in einem mehr oder weniger beträchtlichen Ausmaß gekennzeichnet.
Die 3 zeigt deutlich einen Anstieg der Dickdarmlänge nach der Behandlung der Entzündungs-Mäuse mit MG1363[pT1MIL10] und, wenn auch in einem geringeren Ausmaß, nach der Behandlung der Mäuse mit MG1363[pT1TR5AH].
Die 4 und 5 zeigen den Heilungsbeginn der chronischen Kolitis, der in den Mäusen, die mit MG1363[pT1MIL10] behandelt wurden, zu einem offensichtlich höheren Ausmaß statt findet als in den Mäusen, die mit MG1363[pT1TR5AH] behandelt wurden.
4 zeigt die histologische Wertung des epithelialen Schadens, während die 5 das entzündliche Infiltrat zeigt, wobei beides wie vorhergehend beschrieben bestimmt wurde.
Die 6 zeigt die Histologie von normalem Gewebe im Vergleich zu entzündetem und behandeltem Gewebe.
In der normalen Histologie kann man eine kontinuierliche Anordnung von Krypten gleicher Länge beobachten. In den Krypten können zahlreiche Becherzellen beobachtet werden. In der Schleimhaut ist eine geringe Anzahl von Lymphozyten vorhanden. In der Submucosa sind keine Lymphozyten vorhanden. Im entzündeten Gewebe kann man das Verschwinden der organisierten Kryptenstruktur beobachten, die von Unterschieden in der Länge bis hin zum völligen Fehlen der Strukturen reicht. In den Überbleibseln der Krypten sind auch keine Becherzellen vorhanden. Man kann auf Grund einer massiven Infiltration durch Lymphozyten einen starken Anstieg der Schleimhautdicke beobachten. Die Lymphozyten neigen dazu, Ulzerationen zu verursachen. In ernsten Fällen kann eine Infiltration durch Lymphozyten auch in der Submucosa beobachtet werden. Allerdings bleibt das Epithel intakt. Die Negativkontrolle der Behandlung mit MG1363[pTREX1] weist eine Pathologie auf, die an stark entzündetes Gewebe erinnert. Mäuse, die mit MG1363[pT1MIL10] behandelt wurden, zeigen eine beinahe vollständige Wiederherstellung der normalen Histologie, die nur wenige Überbleibsel der infiltrierenden Lymphozyten in der Schleimhaut aufweist. Mäuse, die mit MG1363[pT1TR5AH] behandelt wurden, zeigen ein intermediäres Ausmaß in der Pathologie.
Die 7 zeigt die statistische Auswertung der histologischen Wertungen, die nach einer Behandlung mit den angegebenen L. lactis-Stämmen von den einzelnen Mäusen erhalten wurden (Gruppengröße = 10). Die Wertung wurde nach einer Auswertung von Schnitten des distalen Dickdarms im Blindversuch, die wie beschrieben ausgeführt wurde (Kojouharoff et al., 1997), protokolliert. Jede Maus wurde anhand von 3 Längsschnitten ausgewertet, die gleichmäßig über den Umfang des Dickdarms verteilt waren. Sowohl das lymphoide Infiltrat als auch der epitheliale Schaden wurden mit 0 bis 4 Punkten bewertet, und die Werte für beide Parameter wurden für jede Maus zusammengezählt. Normale Mäuse der Blindprobe zeigten eine histologische Wertung von 1 Punkt. Die Mäuse, in denen Kolitis induziert wurde, liegen ein wenig über 5 Punkten. Alle Kontrollgruppen der L. lactis-Behandlung schwanken um diese Zahl, mit einer leicht höheren Tendenz in einigen Gruppen. Die Mäuse, die für 14 Tage mit mIL-10-produzierenden L. lactis behandelt wurden, gefolgt von 14 Tagen Erholung, zeigten jedoch einen Durchschnitt von etwa 3 Punkten. Dies ist eine Abnahme von beinahe 50% in der Pathologie, wenn gegen den Unterschied zwischen den unbehandelten und den Blindproben-Gruppen gemessen wird. Die Reduktion ist signifikant (p = 0,0151).
Beispiel 3
Auf Grund der verwendeten Kulturbedingungen ist in der Inokulationssuspension nur eine geringe Menge (40 ng) mIL-10 im Überstand vorhanden. Um herauszufinden, ob dieses IL-10 die beobachtete Reduktion der histologischen Wertung hervorruft, schlossen wir die Behandlung mit UV-abgetöteten IL-10 Produzentenstämmen mit ein. Diese Kulturen wurden kurz vor der Inokulation mit UV bestrahlt. Die 8 zeigt, dass die Bestrahlung die bakterielle Lebensfähigkeit von 10⁶ cfu auf weniger als 1 cfu verringerte, so dass keine weitere Anreicherung von IL-10 beobachtet wurde. Dies stand nicht mit einer Zelllyse im Zusammenhang, da kein Abfall der OD₆₀₀ beobachtet wurde und kein IL-10-Vorläufer im Kulturüberstand nachgewiesen werden konnte. Die Bestrahlung beeinflusst die Bioaktivität des IL-10 nicht. Erkrankte Mäuse, die für 2 oder 4 Wochen mit den UV-behandelten Kulturen behandelt wurden, zeigen keinen Unterschied in der Dickdarmhistologie, wenn sie mit einer der Kontrollgruppen verglichen werden, die positiv sind für eine Enterokolitis. Das Schicksal des restlichen IL-10 im Inokulationsmedium besteht höchstwahrscheinlich in einer Denaturierung und einem Abbau im Magen und Zwölffingerdarm. Der Säuregrad des Magens, zuerst bei pH 1,5, steigt sofort nach der Inokulation auf pH 6. Nach 5 Minuten wird pH 4 erreicht, der im Zeitraum zwischen 30 und 60 Minuten nach der Inokulation weiter von 3,5 bis 2,5 abfällt. IL-10, das 5 Minuten nach der Inokulation im Magen nachgewiesen wird, sinkt schnell in seiner Konzentration und wurde 30 Minuten nach der Inokulation nur in Spuren im Zwölffingerdarm gefunden. Zu späteren Zeitpunkten wurde weder hier noch im Jejunum oder Ileum IL-10 nachgewiesen.
Beispiel 4
Sieben serielle Inokulationen von 3,4 × 10⁹ cfu von MG1363[pT1MIL10] wurden 129 Sv/Ev IL-10 –/– Mäusen verabreicht, wobei 1-stündige Zeitabstände eingehalten wurden. Der Darm wurde 30 Minuten nach der letzten Inokulation herauspräpariert und in seine morphologischen Abschnitte geteilt. Die Gewebe wurden sofort in PBS mit 1% BSA und 0,05% NaN₃ homogenisiert. Die cfu von MG1363[pT1MIL10] wurden als 7 × 10⁶ im Magen, 2,6 × 10⁸ im Zwölffingerdarm, 2,8 × 10⁷ im Jejunum, 4 × 10⁸ im Ileum, 8,4 × 10⁸ im Blinddarm und 7 × 10⁸ im Dickdarm ermittelt. Wir haben 70 ng von löslichem IL-10 im Dickdarmhomogenisat nachgewiesen. Keines der weiter oben liegenden Abschnitte wies einen Gehalt von IL-10 auf. Auf Grund dessen wird geschlossen, dass rekombinante L. lactis aktiv IL-10 im Dickdarm produzieren können.
Beispiel 5
Verhütung von Enterokolitis in IL-10 –/– Mäusen
Die Leistungsfähigkeit des oben beschriebenen Ansatzes, den Beginn der Kolitis in 129 Sv/Ev IL-10 –/– Mäusen zu verhindern, wurde überprüft. Diese Mäuse entwickeln etwa im Alter von drei bis acht Wochen spontan eine allgemeine Enterokolitis (Kuhn et al., Cell, 1993; 75: 263–274). Entzündungsbedingte Veränderungen treten zuerst im Blinddarm auf, steigen auf und durchqueren den Dickdarm von 3 Wochen alten Mutanten. Eine progressive Erkrankung in alternden IL-10 –/– Mäusen wurde durch eine erhöhte Anzahl multifokaler Entzündungszellinfiltrate gekennzeichnet, die aus mononukleären Zellen und Neutrophilen bestehen, in Begleitung mit einer mäßigen epithelialen Hyperplasie und einer leichten Verminderung des Muzins in den Becherzellen. Vereinzelt traten kleine epitheliale Erosionen und Kryptenabszesse auf, und die Entzündung bezog selten die Submucosa mit ein. IL-10 –/– Mäuse, die in unseren Studien verwendet wurden, zeigten auf Grund der eher „sauberen" als „herkömmlichen" Bedingungen in unserem Tierhaus eine weniger schwere Entzündung als beschrieben.
Wenn diese Mäuse ab der Woche 3 für 6 bis 8 Wochen mit entweder Anti-IFN-γ oder Anti-IL-12 behandelt werden, kann eine Kolitis verhindert werden (Rennick et al., J. Leukoc. Biol., 1997 Apr, 61 (4): 389–396). Wir behandelten 3 Wochen alte Mäuse mit einer täglichen intragastralen Inokulation mit IL-10-produzierenden L. lactis. Die Mäuse wurden für 4 Wochen mit Kulturen entweder der mitt- oder endlogarithmischen Phase behandelt, während eine unbehandelte Gruppe unter identischen Bedingungen gehalten wurde. 7 zeigt die histologischen Wertungen, die wie beschrieben ermittelt wurden (Berg et al., J. Clin. Invest.; 1996 Aug. 15; 98 (4): 1010–1020), mit der Ausnahme, dass wir den Blinddarm nicht untersucht haben. Die unbehandelten Mäuse zeigen eine durchschnittliche histologische Wertung von etwa 4,5 Punkten. Dies entspricht gut den berichteten Daten, vorausgesetzt, dass man den Beitrag der Blinddarmwertungen zu diesen Werten und den geringen Alterunterschied berücksichtigt. Die Gruppe von Mäusen, die mit MG1363[pT1MIL10] behandelt wurde, zeigt eine durchschnittliche histologische Wertung von 1,5 Punkten, was nur geringfügig über den Werten liegt, die für 3 Wochen alte Mäuse berichtet werden (Berg et al., J. Clin. Invest.; 1996 Aug. 15; 98 (4): 1010–1020). Da es sich dabei um die Summe von 3 Werten handelt, die von 0 bis 4 Punkten reichen, wird das als eine sehr niedrige Wertung angesehen. Aus diesen Daten wird klar, dass die Entwicklung einer Kolitis mit dieser Behandlung verhindert werden kann.
Referenzen
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Zytokin produzierenden grampositiven Bakterienstammes oder eines Zytokinantagonisten produzierenden grampositiven Bakterienstammes zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlicher Darmerkrankung, wobei die Behandlung die Entzündung um mindestens 50% reduziert und/oder den Beginn der Entzündung verhindert.
Die Verwendung eines grampositiven Bakterienstammes nach Anspruch 1, wobei das Zytokin oder der Zytokinantagonist IL-10, ein löslicher TNF-Rezeptor oder ein anderer TNF-Antagonist, ein IL-12-Antagonist, ein Interferon-γ-Antagonist, ein IL-1-Antagonist oder ein viruscodiertes Zytokinanalog wie EBV BCRF-1 ist.
Die Verwendung eines grampositiven Bakterienstammes nach Anspruch 1 oder 2, wobei der grampositive Bakterienstamm eine Lactococcus species ist.
Die Verwendung eines grampositiven Bakterienstammes nach Anspruch 3, wobei die Lactococcus species Lactococcus lactis ist.
Die Verwendung eines grampositiven Bakterienstammes nach Anspruch 1 oder 2, wobei der grampositive Bakterienstamm Bacillus subtilis, Streptococcus gordonii, Staphylococcus xylosus oder eine Lactobacillus species ist.
Die Verwendung eines grampositiven Bakterienstammes nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Darmerkrankung eine chronische Kolitis, Morbus Crohn oder eine ulzeröse Kolitis ist.