ES2214049T3

ES2214049T3 - Uso de una cepa de lactococcus productora de citoquinas para tratar colitis.

Info

Publication number: ES2214049T3
Application number: ES99950738T
Authority: ES
Inventors: Lothar Steidler; Erik Rene Remaut; Walter Fiers
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1998-10-20
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2019-10-06
Also published as: WO2000023471A3; US20020019043A1; EP1123314B1; JP2010222364A; DE69914932T2; ATE259829T1; AU6340199A; JP4598954B2; AU770726B2; EP1123314A2; DE69914932D1; JP2002528392A; US6746671B2; WO2000023471A2; CA2343840A1; CA2343840C

Abstract

El uso de una cepa bacteriana gram-positiva productora de citoquina o una cepa bacteriana gram-positiva productora de antagonista de citoquina para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad intestinal inflamatoria, en el que dicho tratamiento reduce la inflamación en al menos el 50% y/o previene el inicio de dicha inflamación.

Description

Uso de una cepa de lactococcus productora de citoquinas para tratar colitis.

Sumario de la invención

La invención se refiere en general a una estrategia de administración para la entrega en la mucosa intestinal de citoquinas, preferiblemente de agentes anti-inflamatorios sensibles a ácidos, tales como IL-10 y/o un receptor de TNF soluble por vía oral. El aspecto preferido según la invención es la inoculación con una suspensión de células de Lactococcus lactis recombinante vivas, que se han proyectado para producir las proteínas respectivas. Como ejemplo, se usaron ratones en los que se había inducido una inflamación crónica del colon distal por administración con sulfato de dextrano sodio (DSS). El tratamiento registrado por evaluación histológica produjo claramente una regresión de la inflamación y síntomas de enfermedad. El hallazgo es altamente inesperado porque, con el fin de ejercer actividad en el colon tras la administración oral, el sistema de entrega necesita pasar el ambiente ácido del estómago y la parte superior del intestino delgado, respectivamente.

Fundamento de la invención

El sistema inmune en un mamífero es diverso y complejo e incluye mecanismos y reacciones naturales e inmunes adaptables. El sistema inmune se describe a menudo en términos de respuestas inmunes humorales o celulares. La inmunidad humoral se refiere en términos generales a producción de anticuerpos y acciones por células B; la inmunidad celular es mediada por células que incluyen células T, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos. Las células T y las células B son dos categorías de linfocitos.

Uno de los mecanismos por los que el sistema inmune actúa normalmente y se autorregula incluye la producción de las denominadas citoquinas. Es sabido que las citoquinas median en varias respuestas inmunes positivas y negativas. Las citoquinas actúan normalmente uniéndose a un receptor en una célula objetivo. Puede interferirse con la actividad de las citoquinas de varias maneras, por ejemplo, por administración de receptores solubles (dominios extracelulares del receptor) o por análogos o derivados de citoquinas.

La IL-10 es una citoquina capaz de mediar en un cierto número de acciones o efectos. Se sabe que la IL-10 está implicada en el control de las respuestas inmunes de diferentes clases o subgrupos de células Th (células auxiliares T).

Enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) se refiere a un grupo de trastornos gastrointestinales caracterizados por una inflamación no específica crónica de porciones del tracto gastrointestinal. La colitis ulcerativa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son los ejemplos más prominentes de IBD en seres humanos. Están asociadas con muchos síntomas y complicaciones, incluyendo retraso del crecimiento en niños, prolapso rectal, sangre en deyecciones (por ejemplo, melena y/o hematoquecia), agotamiento, deficiencia de hierro y anemia, por ejemplo, anemia por deficiencia de hierro y anemia de enfermedad crónica o de inflamación crónica. La etiología o etiologías de IBD no están claras. Se hace referencia a ellas en Wyngaarden y Smith (reds.) Cecil's Textbook of Medicine (W.B. Saunders Co. 1985), Berkow (red.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1982) y Harrison's Principles of Internal Medicine, 12ª Ed., McGraw-Hill, Inc. (1991).

La incidencia de IBD varía grandemente con la localización geográfica. Un estudio en colaboración en Europa muestra una incidencia por 100.000 de 10,4 para UC y 5,6 para CD con una incidencia superior 40% y 80% respectivamente para UC y CD en centros del norte en comparación con los del sur. Como UC y CD son afecciones a largo plazo, corresponden a trastornos reales en la calidad de vida. La enfermedad de Crohn tiene una distribución de inicio con la edad bimodal, mostrando picos de incidencia notables a los 20 y 50 años de edad. Un perfil de incidencia más alto y más penoso está asociado con el pico en edad más joven. Esto hace a la CD especialmente aguda porque los adolescentes y adultos jóvenes afligidos están virtualmente privados de las altas expectativas de vida tan particularmente asociadas con este grupo social.

Colitis ulcerativa se refiere a una enfermedad inflamatoria y ulcerativa no específica, crónica, que tiene manifestaciones principalmente en la mucosa colónica. Se caracteriza frecuentemente por diarrea sanguinolenta, calambres abdominales, sangre y mucosidad en las deyecciones, malestar, fiebre, anemia, anorexia, pérdida de peso, leucocitosis, hipoalbuminemia y una elevada velocidad de sedimentación de eritrocitos (ESR).

Las complicaciones pueden incluir hemorragia, colitis tóxica, megacolon tóxico, fístulas rectovaginales ocasionales y un riesgo acrecentado de desarrollo de cáncer de colon.

La colitis ulcerativa también está asociada con complicaciones distantes del colon, tales como artritis, espondilitis anquilosante, sacroileitis, uveitis posterior, eritema nodoso, pioderma gangrenoso y episcieritis.

El tratamiento varía considerablemente con la gravedad y duración de la enfermedad. Por ejemplo, la terapia con fluidos para prevenir la deshidratación y el desequilibrio de electrólitos está indicada frecuentemente en un ataque grave. Adicionalmente, son útiles a veces medidas dietéticas especiales. Las medicaciones incluyen diversos corticosteroides, sulfasalazina y algunos de sus derivados, y posiblemente fármacos inmunosupresores.

La enfermedad de Crohn comparte muchas características en común con la colitis ulcerativa. La enfermedad de Crohn es distinguible porque las lesiones tienden a delimitarse mucho del intestino normal adyacente, en contraste con las lesiones de la colitis ulcerativa que son bastante difusas. Adicionalmente, la enfermedad de Crohn aflige principalmente al íleo (ileitis) y al íleo y el colon (ileocolitis). En algunos casos, está enfermo el colon solo (colitis granulomatosa) y algunas veces está implicado el intestino delgado completo (yeyunoileitis). En casos raros, están implicados el estómago, el duodeno o el esófago. Las lesiones incluyen un granuloma epitelioide de tipo sarcoide en aproximadamente la mitad de los casos clínicos. Las lesiones de la enfermedad de Crohn pueden ser transmurales, incluyendo ulceración profunda, edema y fibrosis, que pueden llevar a obstrucción y formación de fístula así como formación de abcesos. Esto contrasta con la colitis ulcerativa, que produce habitualmente lesiones mucho más superficiales, aunque ocasionalmente se ven también en la colitis ulcerativa las complicaciones de fibrosis, obstrucción, formación de fístulas y abcesos.

El tratamiento es similar para ambas enfermedades e incluye esteroides, sulfasalazina y sus derivados, y fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, mercaptopurina y azatioprina. Tratamientos desarrollados más recientemente, algunos aún en pruebas clínicas, implican la administración sistémica (por inyección) de compuestos de bloqueo de TNF tales como anticuerpos de TNF o receptor soluble de TNF.

La IBD representa un problema genuino en la salud pública por la ausencia de tratamiento etiológico. Aunque muchos pacientes se atienden con éxito con terapia médica convencional, tal como tratamiento con corticosteroides anti-inflamatorio, muchos tendrán actividad de la enfermedad recurrente y dos tercios necesitarán cirugía.

La causa de las enfermedades intestinales inflamatorias es desconocida. La patogénesis de CD y UC implica probablemente la interacción entre factores genéticos y ambientales, tales como agentes bacterianos, aunque no se ha identificado hasta ahora un agente etiológico definido. La principal teoría es que una respuesta inmune anormal, impulsada posiblemente por microflora intestinal, tiene lugar en la IBD. Sin embargo, lo que está bien establecido es que las células T juegan un papel importante en la patogénesis. Las células T activadas pueden producir citoquinas anti-inflamatorias y pro-inflamatorias. Con este conocimiento entre manos, puede contrarrestarse la IBD de manera racional. Nuevas terapias anti-inflamatorias, que hacen uso de anticuerpos monoclonales neutralizantes o citoquinas anti-inflamatorias, muestran la posibilidad de modular las desregulaciones inmunes causantes de IBD. Una nueva terapia altamente prominente y eficaz es el tratamiento sistémico con anticuerpos monoclonales anti-TNF como se ha mencionado antes. Dosis intravenosas simples, variables de 5 a 20 mg.kg^{-1}, del anticuerpo infliximab cA2 produjeron una mejora clínica drástica en la enfermedad de Crohn activa. El uso de IL-10 recombinante administrada sistémicamente en un régimen de tratamiento de 7 días por día usando dosis variables de 0,5 a 25 \mug.kg^{-1} mostró registros de actividad de la enfermedad de Crohn reducidos y remisión acrecentada. Está emergiendo actualmente de modelos experimentales un cierto número de terapias muy prometedoras, enredando citoquinas pro-inflamatorias o el establecimiento de infiltrados de células T. Sin embargo, todas estas estrategias requieren administración sistémica. Las complicaciones graves de IBD pueden ser seriamente debilitantes, y pueden conducir eventualmente a la muerte.

Descripción detallada de la invención

En la Patente de los EE.UU. 5.368.854, cedida a Schering Corp., se describe un método usando IL-10 para tratar enfermedades intestinales inflamatorias en mamíferos. En este método, se administra la citoquina a un mamífero que tiene una IBD (enfermedad intestinal inflamatoria). La administración de IL-10 como se describe en esta referencia es parenteral, tal como intravascular y preferiblemente intravenosa.

Es evidente no obstante que tal vía de administración para un paciente (humano) que padece IBD no es sin inconvenientes. Un modo mucho más fácil y más conveniente es una administración oral de un medicamento que comprenda una citoquina tal como IL-10 o un antagonista de citoquina que tenga una actividad terapéutica similar. De manera más importante, la liberación localizada del agente terapéutico permite mayor eficacia y menos efectos secundarios indeseados debido a actividades sistémicas.

En el documento WO 97/14806, cedido a Cambridge University Technical Services Ltd., se describe un método para entregar polipéptidos y/o antígenos biológicamente activos, usando bacterias no invasivas, tales como Lactococcus, por administración intranasal de dichos polipéptidos en el cuerpo, especialmente en la mucosa.

En el documento WO 96/11277, cedido a DOMPE' S.P.A., se describe un método general para entregar compuestos terapéuticos a un animal por administración de una bacteria recombinante, en particular por administración intraperironeal o intracolónica.

Sin embargo, tratar una enfermedad intestinal inflamatoria tal como colitis crónica o enfermedad de Crohn con una citoquina como IL-10, que es sensible a los ácidos, es una tarea muy delicada y difícil de conseguir. Por tanto, se necesita desarrollar un sistema en el que el compuesto activo (por ejemplo, una citoquina o un receptor soluble) se entregue directamente en el lugar en el que se espera que el compuesto ejerza su actividad teniendo en cuenta el problema de la sensibilidad a los ácidos de muchas citoquinas, en particular IL-10, y el requisito de que, tras administración oral, el vehículo de entrega necesita pasar el ambiente ácido del estómago. Además, diversas enzimas digestivas degradan polipéptidos a medida que pasan por el estómago y el intestino. Por último, pero no menos importante, la administración in situ del agente puede permitir alcanzar concentraciones eficaces terapéuticamente que son difíciles de conseguir por vías de administración más sistémicas debido a la toxicidad sistémica u otras limitaciones.

Con el fin de conseguir la recuperación de un paciente que padezca una IBD, es necesario restablecer las células dañadas y el órgano que comprende dichas células dañadas, por ejemplo, el colon.

La solución al problema técnico descrito antes se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención es usar una cepa bacteriana gram-positiva productora de citoquina o una cepa bacteriana gram-positiva productora de antagonista de citoquina para la preparación de un medicamento para tratar enfermedad intestinal inflamatoria.

Dicha citoquina o antagonista de citoquina a producir por la cepa hospedante bacteriana es, por ejemplo, IL-10, un receptor de TNF soluble o un análogo de citoquina tal como el homodímero p40 derivado de IL-12 (un antagonista de IL-12), un antagonista de interferón-\gamma, un antagonista de IL-1 o un análogo de citoquina codificado por virus tal como EBV BCRF1 (Baer et al., 1984), mientras que la cepa bacteriana gram-positiva es preferiblemente una Lactococcus species y más preferiblemente una Lactococcus lactis. Otras cepas bacterianas gram-positivas a usar para el propósito de la presente invención son Bacillus subtilis, Streptococcus gordonii, Staphylococcus xylosus, o una Lactobacillus spec. tal como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus caseï, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii o Lactobacillus plantarum.

Las enfermedades intestinales inflamatorias, tales como una colitis crónica, enfermedad de Crohn o una colitis ulcerativa, pueden tratarse según la invención con una dosificación apropiada del compuesto citoquina activo, preferiblemente IL-10 o un receptor de TNF soluble, y proporciona inesperadamente un restablecimiento del colon enfermo hasta un estado aparentemente normal y sano.

La IL-10 puede administrarse sola o en combinación con al menos un agente terapéutico adicional. Los ejemplos de tales agentes incluyen corticosteroides, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, mercaptopurina, azatioprina y otra citoquina. La coadministración puede ser secuencial o simultánea. Coadministración significa generalmente que los agentes terapéuticos múltiples (dos o más) están presentes en el receptor durante un intervalo de tiempo especificado. Típicamente, si se administra un segundo agente dentro de la vida media del primer agente, los dos agentes se consideran coadministrados.

La invención descrita aquí se refiere así a una entrega localizada de IL-10 mediante síntesis in situ por L. Lactis recombinante. Como resultado de la misma se reduce la inflamación en un 50% en colitis crónica inducida con DSS y previene el comienzo de colitis en ratones 129 Sv/Ev IL-10 -/-. Así, el método es igualmente eficaz en comparación con las terapias enérgicas bien establecidas y aceptadas que cuentan con la administración sistémica de proteínas anti-inflamatorias. El vector usado aquí, L. Lactis, es un organismo de calidad alimentaria gram-positivo que es totalmente inocuo. Es un microorganismo no colonizante. La dosificación y temporización precisas durante el tratamiento, que han mostrado aquí ser de gran importancia, pueden obtenerse así fácilmente.

El requisito crítico para la viabilidad del vector se muestra en la presente invención. Esto indica la necesidad de la síntesis in situ de IL-10. El vector es capaz realmente de conseguir esto mostrando la síntesis de novo de IL-10 en el colon. Se describe con ello un nuevo concepto eficaz para el tratamiento basado en proteína en el tracto intestinal. El tratamiento puede darse por vía oral, que es con mucho deseable para formulaciones farmacológicas. Puede ejercer efectos hasta el colon distal usando un compuesto con sensibilidad intrínseca para la vía usada. Este método evita la necesidad de administración sistémica. Abre la posibilidad de entrega localizada de sustancias, que son inestables o difíciles de producir en altas cantidades. Es intrínsecamente de coste muy eficaz.

Este método puede responder a la cuestión de una presencia sostenida y localizada de IL-10 en terapia con una concentración más alta que la deseable o incluso conseguible mediante entrega sistémica, con respecto a efectos secundarios latentes.

Se explican seguidamente algunas expresiones usadas en la presente descripción, por motivos de claridad.

Generalmente, la expresión "síntoma" se refiere a cualquier evidencia subjetiva de enfermedad o de una condición del paciente. Esto incluye la evidencia como se percibe por el paciente. Los ejemplos de síntomas de IBD incluyen diarrea, dolor abdominal, fiebre, melena, hematoquecia y pérdida de peso.

La expresión "signos" se refiere en general a cualquier evidencia objetivo de una enfermedad o condición, habitualmente como se percibe por un médico que lo examina o aspectos que se revelarían por sí mismos en una evaluación de laboratorio u otros ensayos tales como un estudio ultrasónico o un ensayo radiográfico. Algunos ejemplos de signos de IBD incluyen masa abdominal, glositis, úlcera aftosa, fisura anal, fístula perianal, anemia, malabsorción y deficiencia de hierro. Ocasionalmente, signos y síntomas se superponen. Por ejemplo, el paciente se queja de deyecciones con sangre (un síntoma), y un ensayo de laboratorio de una muestra de deyección es positivo en sangre (un signo).

La frase "dosificación apropiada" o "cantidad eficaz" significa una cantidad o dosificación suficiente para mejorar un síntoma o signo de una condición autoinmune o de una respuesta inflamatoria o inmune indeseable o inapropiada. Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición a tratar, la salud general del paciente, la vía y dosis de administración del método y la gravedad de los efectos secundarios.

Con "citoquina" se entiende un factor de polipéptido producido transitoriamente por un intervalo de tipos de células, que actúan usualmente localmente, y que activan la expresión de genes específicos uniéndose a receptores de la superficie celular.

Con "antagonista" se entiende un compuesto que se une a, pero no activa, receptores, por lo que inhibe la acción de un agonista competitivamente. "Agonistas" son compuestos que se unen a, y activan, receptores (por ejemplo, ligandos endógenos tales como hormonas y neurotransmisores, compuestos sintetizados químicamente y productos naturales como alcaloides).

Descripción detallada de los métodos usados en la presente invención Medios de cultivo

GM17 es M17 (Difco, St. Louis) suplementado con 0,5% p/v de glucosa. GM17E es GM17 suplementado con 5 \mug/ml de eritromicina. BM9 contiene por litro 6 g de Na_{2}HPO_{4}, 3 g de KH_{2}PO_{4}, 1 g de NH_{4}Cl, 0,5 g de NaCl, 2 mmoles de MgSO_{4}, 25 mmoles de NaHCO_{3}, 25 mmoles de Na_{2}CO_{3}, 0,1 mmoles de CaCl_{2}, 5 g de glucosa y 5 g de casitona (Difco). BM9E es BM9 suplementado con 5 \mug/ml de eritromicina.

Técnicas de ADN recombinante

Se realizó multiplicación PCR de ADN con polimerasa VENT y usando condiciones recomendadas por el fabricante. Se usaron enzimas que modifican ADN y endonucleasas de restricción en condiciones estándares y en los tampones recomendados por los fabricantes. Las técnicas de clonación molecular generales y la electroforesis de ADN y proteínas se realizaron esencialmente como se describe (Sambrock et al., 1990). Se transformó L. Lactis por electroporación de células desarrolladas en presencia de glicina (Wells et al., 1993).

Construcción de los plásmidos de expresión

El plásmido pT1MIL 10 (figura 1) se construyó subclonando un fragmento de PCR, obtenido con los cebadores (CAGTACAGCCGGGAAGACAAT y GCACTAGTTAGCTTTTCATTTTGAT) y se realizó en un clon de cADN que contenía secuencia de codificación de mIL 10. Para el diseño de esta estrategia, se hizo uso de la secuencia de cADN de mIL 10 como se da en EMBL nº de cuenta M37897. Mediante utilización de los cebadores mencionados antes, el fragmento de mIL 10 podía subclonarse como un fragmento de SpeI romo, después de tratamiento con quinasa y SpeI, edn el plásmido pT1NX abierto por NaeI-SpeI (figura 1), que es un derivado de pTREX1 (Wells y Schofield en: Lactic Acid Bacteria; current advances in metabolism, genetics and applications. F. Bozoglu & R. Bibek, Reds., Nato ASI Series H, Vol. 98, pág. 37. Springer Verlag, 1996).

El plásmido pT1TR5AH (figura 1) se construyó subclonando un fragmento de PCR, obtenido con los cebadores (CTGGTCCCTTCTCTTGGTGAC y CCACTAGTCTATTAATGATGATGATGATGATGCGCAGTACCTGAGTCCT
GGGG) y se realizó en un clon de cADN que contenía secuencia de codificación de sTNFr55. Para el diseño de esta estrategia, se hizo uso de la secuencia de cADN de TNFr55 como se da en EMBL nº de cuenta L26349. Utilizando los cebadores mencionados antes, se proporcionó el fragmento de sTNFr55 con un 6his tag en el extremo 3' y podía subclonarse como un fragmento de SpeI romo, después de tratamiento con quinasa y SpeI, en el plásmido pT1NX abierto por NaeI-SpeI.

Ambos plásmidos codifican, aguas abajo del promotor P1 de lactococo, genes de fusión entre la líder de secreción de Usp45 (Van Asseldonk et al., Gene, 95, 155-160, 1990) y mIL 10 y sTNFr55, respectivamente. Por secreción, se escinde la secuencia líder.

Identificación de proteínas recombinantes

Podían observarse miL 10 y msTNFr55 recombinantes en el sobrenadante de cultivos de MG1363[pT1MIL 10] y MG1363[pT1TR5AH], respectivamente (figura 2). Para este ensayo, se extrajeron partes alícuotas de 5 ml de los cultivos con 2 ml de fenol y se prepararon las proteínas a continuación a partir de la fase orgánica por precipitación con 10 ml de etanol. Una parte del precipitado, equivalente a 1 ml de sobrenadante de cultivo, se sometió a SDS-15% de PAGE e inmunomanchado. Se tomaron muestras de cultivo en momentos relevantes en la fase de crecimiento de las bacterias, como se describe después.

El sobrenadante de cultivo de MG1363[pT1MIL 10] contenía, como media, 1 \mug.ml^{-1} de IL-10 de ratón. La actividad de IL-10 de ratón del sobrenadante se midió usando un linaje de células cebada de ratón MC/9 (Thompson-Snipes, L. et al., J. Exp. Med. 173, 507, 1991). La IL-10 humana se une a IL-10R de ratón como se demostró por experimentos de transfección (Ho, A.S.Y et al., PNAS 90, 11267, 1993; Liu, Y. et al., J. Immunol. 152, 1821, 1994). 1 U.ml^{-1} de IL-10 se define como la cantidad de IL-10 que es capaz de inhibir el 50% del nivel de producción de IFN-gamma de esplenocitos activados con conA (Florentino, D.F. et al., J. Exp. Med. 170, 2081, 1989). La DE50 para este efecto es típicamente 0,3-0,6 ng.ml^{-1}. Cuando se midió junto con un patrón de actividad conocida (Biosource International, CA), el sobrenadante de cultivo de MG1363[pT1MIL 10] reveló una actividad de aproximadamente 8000 U.ml^{-1}. Berg et al. (J. Clin. Invest. 98, 1010-1020) informan de una actividad específica de aproximadamente 1,0 x 10^{7} U.mg^{-1} para mIL10 recombinante. De estas consideraciones y teniendo en cuenta las variaciones en el método usado, se ha concluido que el mIL10 recombinante, presente en el sobrenadante de cultivo de MG1363[pT1MIL 10], mostraba una actividad biológica total. No podía detectarse actividad de IL10 en el sobrenadante de los cultivos testigo, MG1353 o MG1363[pTREX1].

El sobrenadante de cultivo de la cepa MG1363[pT1TR5AH] contenía, como media, 200 ng.ml^{-1} de msTNFr 55. Loetscher et al. (1991) mostraron que la inhibición completa de la actividad citotóxica de TNF por sTNFr 55 sólo se obtenía a partir de una relación en moles de 1000:1 de sTNFr 55 a TNF y superiores. El TNFr 55 recombinante soluble que se había recuperado del sobrenadante de cultivo de MG1363[pT1TR5AH] mostró un efecto inhibidor igual sobre TNF como se había informado para el producto innato. Esto se demostró mezclando y compitiendo así una serie de titulaciones de TNF con una serie de titulaciones de sTNFr recombinante y midiendo la actividad de TNF en un ensayo de citotoxicidad como se ha descrito (Espevik, T y Nissen-Meyer, 1986).

Pretratamiento de los ratones

Para la inducción de colitis crónica, se pretrataron ratones como se describe por Kojouharoff et al. Clin Exp Immunol 107, 353, 1997. Ratones Balb/c hembras de seis a ocho semanas de edad recibieron cuatro ciclos de tratamiento con DSS. Cada ciclo consistía en 5% de DSS en el agua de beber durante 7 días, seguido por un intervalo de 10 días durante el cual recibieron agua de beber normal. Entre cuatro y seis semanas después de completarse el último ciclo de DSS, se trataron los ratones con las cepas de L. Lactis como se indica.

Leyendas de las figuras Figura 1

Resumen de los plásmidos usados.

Figura 1 a

Mapas esquemáticos de los plásmidos usados. P1 es el promotor P1 de lactococo como en Waterfield et al., (1995), usp45S es un fragmento de ADN que codifica el péptido señal de secreción del Usp45 de lactococo (van Asseldonck et al., 1990), ml 10 es un fragmento de ADN que codifica la parte madura de interleuquina 10 de ratón, tr55 es un fragmento de ADN que codifica la parte soluble de receptor de TNF de tipo 1, H6 es un fragmento que codifica 6 residuos de histidina, Em' es el marcador de selección de eritromicina.

Figura 1 b

Secuencias de ADN de pTREX1 y pT1NX.

Figura 1 c

Secuencias de ADN de pT1MIL 10 y pT1TR5AH.

Figura 2

Perfil de proteínas tras SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo de las cepas indicadas después de inmunomanchas, revelado con antisueros interleuquina 10 anti-ratón (panel A) o receptor de TNF de tipo 1 anti-ratón y anti-6 His (panel B).

Figura 3

Media de longitud de colon de grupos de ratones en los que: a) se había inducido colitis crónica con DSS, b) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pTREX1, c) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1TR5AH y d) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1MIL 10.

Figura 4

Media de registro de daño epitelial en el colon distal de grupos de ratones en los que: a) se había inducido colitis crónica con DSS, b) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pTREX1, c) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1TR5AH y d) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1MIL 10.

Figura 5

Media de registro de infiltrado inflamatorio en el colon distal de grupos de ratones en los que: a) se había inducido colitis crónica con DSS, b) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pTREX1, c) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1TR5AH y d) se había inducido colitis crónica con DSS y a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1MIL 10.

Figura 6

Secciones representativas de colon distal de ratones coloreadas con hematoxilina y eosina.

Tejido normal: animales no tratados.

Colitis con DSS: animales pretratados con DSS para adquirir colitis crónica.

Colitis con DSS, tratamiento con MG1363pT1MIL 10: animales pretratados con DSS para adquirir colitis crónica a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pT1MIL 10. Colitis con DSS, tratamiento con MG1363pTREX1: animales pretratados con DSS para adquirir colitis crónica a los que se administró oralmente a continuación cepa de L. Lactis MG1363pTREX1.

Figura 7

Evaluación estadística de la histología. Las secciones de colon se numeraron aleatoriamente y se interpretaron a ciegas. Se descodificaron a continuación registros de ratones individuales y se analizaron estadísticamente los números reagrupados. El panel de colitis con DSS muestra registros suma histológicos para el colon distal de ratones en blanco y de ratones inducidos con DSS para adquirir colitis crónica, no tratados o tratados con cultivos de L. Lactis. El registro es una suma de registros para daño epitelial e infiltrado linfoide, variando ambos entre 0 y 4. Se trataron alternativamente grupos de ratones (n = 10) con MG1363, MG1363(pTREX1) o MG1363(pT1MIL10) (= IL-10) durante dos (= 2w) o cuatro (= 4w) semanas. Algunos de los cultivos se irradiaron con uv (= + uv) antes de la inoculación, lo que redujo la viabilidad de cálulas más de 10^{6} veces. El panel de IL-10-/-colitis muestra registros suma histológicos de grupos (n = 5) de 7 semanas de edad sin tratar, ratones 129 Sv/Ev IL-10-/- hembras trados con TREX y tratados con IL-10. El registro histológico es una suma del grado de inflamación en el colon próximo, medio y distal, variando todos entre 0 y 4. Las barras de error representan error típico de la media.

Figura 8

Representación de la viabilidad bacteriana tras irradiación medida con OD_{600}.

Con el fin de describir adicionalmente y clarificar así la presente invención, se dan seguidamente algunos ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento de los ratones con L. Lactis vivo Almacenamiento de cepas de expresión

Se inocularon cultivos recién listados de las cepas de expresión de L. Lactis en 10 ml de GM17 o GM17E dependiendo de la ausencia o presencia de un plásmido de expresión y se desarrollaron durante la noche a 30ºC. Los cultivos de la neche se diluyeron 1/100 en GM17 o GM17E recientes y se predesarrollaron durante 3 horas a 30ºC. Se cosecharon las células por centrifugación y se resuspendieron en BGM9 o BGM9E, dependiendo de la presencia de plásmidos. Estos cultivos se desarrollaron durante 5 horas a 30ºC. Se analizó el perfil de proteínas de estos cultivos realizando inmunomanchas de Western en un equivalente de 1 ml de sobrenadante de cultivo usando antisuero dirigido hacia sTNFr55 o IL 10 respectivamente. El perfil de proteínas mostró la presencia de sTNFr55 e IL 10 en las pistas apropiadas (figura 2). Se suplementaron 5 ml de los cultivos de la noche de GM17 o GM17E con 5 ml de glicerol y se guardaron a -20ºC. Estas materias primas se usaron como material de partida para varios experimentos. El análisis de proteínas por toda una serie de experimentos individuales mostró que podía obtenerse por este procedimiento un alto grado de reproducibilidad en la producción de las proteínas recombinantes.

Semanas 1 y 2

Se diluyeron soluciones materia prima de cepas de L. Lactis 1/200 en 10 ml de GM17 o GM17E y se desarrollaron durante la noche a 30ºC. Se cosecharon las células por centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de BM9 o BM9E. Se inocularon ratones sanos testigo y ratones con colitis inducida en base diaria con partes alícuotas de 100 \mul de estas suspensiones de células.

Semanas 3 y 4

Se diluyeron soluciones materia prima de cepas de L. Lactis 1/200 en 10 ml de GM17 o GM17E y se desarrollaron durante la noche a 30ºC. Estos cultivos se diluyeron 1/25 en 10 ml de BM9 o BM9E y se desarrollaron durante 3 horas a 30ºC. Se administraron intragástricamente (peroral) partes alícuotas de 200 \mul a ratones en base diaria.

Ejemplo 2 Determinación del registro histológico

El registro histológico se determinó esencialmente como se describe por Kojouharoff et al. Clin Exp Immunol 107, 353, 1997.

Se sacrificaron ratones por dislocación cervical. Se retiró el colon y se lavó con PBS. Se cortó longitudinalmente el tercio distal del colon, se colocó en papel de filtro y se fijó con formalina al 10% en PBS durante la noche. Se hicieron longitudinalmente secciones del material embebido en parafina. Se cortaron tres secciones de 3 \mum con una distancia intermedia de 200 \mum. Se colorearon las secciones con hematoxilina-eosina. El análisis histológico se realizó de manera a ciegas. Se registraron individualmente los ratones, y cada registro representaba la media de tres secciones.

Se registró la histología como sigue:

Infiltración: 0, sin infiltración; 1, infiltrado alrededor de bases de criptas; 2, infiltrado que alcanza mucosas de L. Muscularis; 3, infiltración extensiva que alcanza mucosas de L. Muscularis y espesamiento de la mucosa con edema abundante; 4, infiltración de la L. Submocosa.

Daño epitelial: 0, morfología normal; 1, desaparición de células con apariencia de copa; 2, desaparición de células copa en grandes zonas; 3, desaparición de criptas; 4, desaparición de criptas en grandes zonas y/o focos de regeneración poliploide.

La longitud colónica se midió inmediatamente después de la disección y colocación en una toalla de papel

La patología de la colitis crónica se caracteriza, entre otros parámetros, por una disminución de la longitud del colon y por daño epitelial e infiltración de linfocitos en una extensión más o menos sustancial.

La figura 3 muestra claramente un aumento de la longitud del colon después de tratar los ratones inflamados con MG1363[pT1MIL10] y, aunque en menor extensión, después de tratar los ratones con MG1363[pT1TR5AH].

Las figuras 4 y 5 muestran el comienzo de la recuperación de colitis crónica, en las que los ratones tratados con MG1363[pT1MIL10] parecen mejorar más extensamente que los ratones que se han tratado con MG1363
[pT1TR5AH].

La figura 4 muestra el registro histológico de daño epitelial mientras que la figura 5 muestra el infiltrado inflamatorio, ambos determinados como se ha descrito previamente.

La figura 6 muestra la histología de tejido normal, en comparación con tejido inflamado y tratado.

En la histología normal, se puede observar una disposición continua de criptas de igual longitud. En las criptas, pueden observarse numerosas células copa. Está presente en la mucosa un bajo número de linfocitos. No hay linfocitos presentes en la submucosa. En el tejido inflamado, puede verse la desaparación de estructuras de cripta organizadas, variando entre diferencias de longitud y ausencia completa de estructura. Así mismo, en los relictos de las criptas, no están presentes células copa. Se puede observar un gran aumento del espesor de la mucosa debido a una infiltración masiva de linfocitos. Los linfocitos tienden a formar ulceraciones. En casos graves, puede observarse también la infiltración de linfocitos en la submucosa. No obstante, el epitelio permanece intacto. El testigo negativo del tratamiento con MG1363(pTREX1) muestra una patología reminiscente de la de tejido fuertemente inflamado. Los ratones tratados con MG1363 (pT1MIL10) muestran una restitución casi completa de la histología normal, revelando sólo ligeros restos de linfocitos infiltrantes en la mucosa. Los ratones tratados con MG1363[pT1TR5AH] muestran un grado intermedio de patología.

La Figura 7 muestra la evaluación estadística de registros histológicos obtenidos de ratones individuales tras el tratamiento con las cepas de L. Lactis indicadas (tamaño del grupo = 10). El registro se anotó después de interpretar a ciegas platinas del colon distal como se ha descrito (Kojouharoff et al., 1997). Cada ratón se interpretó según 3 platinas longitudinales, espaciadas igualmente sobre la circunferencia del colon. Se valoraron de 0 a 4 puntos el infiltrado de linfoides y el daño epitelial y se sumaron para cada ratón los valores para ambos parámetros. Los ratones en blanco normales mostraban un registro histológico de 1 punto. Los ratones en los que se indujo colitis estaban ligeramente por encima de 5 puntos. Todos los grupos testigo para tratamiento con L. Lactis fluctúan alrededor de este número, con posiblemente una tendencia ligeramente más alta en algunos grupos. Los ratones tratados durante 14 días con L. Lactis productor de mIL-10, seguido por 14 días de recuperación muestran sin embargo una media de aproximadamente 3 puntos. Esto es una disminución de casi el 50% de la patología cuando se mide frente a la diferencia entre grupos testigo no tratados y en blanco. La reducción es significativa (p = 0,0151).

Ejemplo 3

Debido a las condiciones de cultivo usadas, una pequeña cantidad (40 ng) de mIL-10 está presente en el sobrenadante de la suspensión de inoculación. Para investigar si este IL-10 realiza la reducción observada del registro histológico, se incluyó el tratamiento con cepas productoras de IL-10 matadas con UV. Estos cultivos se irradiaron con UV inmediatamente antes de la inoculación. La figura 8 muestra que la irradiación redujo la viabilidad bacteriana a menos de 1 en 10^{6} ufc, de modo que no se observó una acumulación adicional de IL-10. Esto no estaba asociado con lisis de células porque no se observó caída de OD_{600} y no podía detectarse precursor de IL-10 en el sobrenadante de cultivo. La irradiación no afecta a la bioactividad de IL-10. Los ratones enfermos tratados durante 2 a 4 semanas con los cultivos matados con UV no muestran diferencia en la histología del colon en comparación con cualquiera de los grupos testigo de enterocolitis positiva. La suerte del IL-10 residual en el medio de inoculación es más probablemente desnaturalización y descomposición en el estómago y el duodeno. La acidez del estómago, antes en pH 1,5, se eleva a pH 6 inmediatamente después de la inoculación. Después de 5 minutos, se alcanza un pH 4, con caídas adicionales de 3,5 a 2,5 en el intervalo entre 30 y 60 minutos después de la inoculación. La IL-10 detectada en el estómago 5 minutos después de la inoculación disminuyó de concentración rápidamente y se encontró sólo en cantidades de trazas en el duodeno a los 30 minutos tras la inoculación. En puntos de tiempo posteriores, no se detectó IL-10 aquí ni en el yeyuno o el íleo.

Ejemplo 4

Se dieron siete inoculaciones en serie de 3,4.10^{9} ufc de MG1363(pT1MIL10) a ratones 129 Sv/Ev IL-10-/-, respetando para ello intervalos de 1 hora. Se preparó el intestino 30 minutos después de la última inoculación y se dividió en los compartimentos morfológicos. Inmediatamente, se homogeneizaron los tejidos en PBS con 1% de BSA y 0,05% de NaN_{3}. Las ufc de MG1363(pT1MIL10) se determinaron como 7.10^{6} en el estómago, 2,6.10^{8} en el duodeno, 2,8.10^{7} en el yeyuno, 4.10^{8} en el íleo, 8,4.10^{8} en el ciego y 7.10^{8} en el colon. Se han detectado 70 ng de IL-10 soluble en el homogenado del colon. Ninguno de los compartimentos aguas arriba mostró ningún contenido de IL-10. Se concluye de esto que L. Lactis recombinante puede producir activamente IL-10 en el colon.

Ejemplo 5 Prevención de enterocolitis en ratones IL-10-/-

Se ensayó la capacidad del método descrito antes para prevenir el inicio de colitis en ratones 129 Sv/Ev IL-10-/-. Estos ratones desarrollaron espontáneamente una enterocolitis generalizada en el marco entre tres y ocho semanas de edad (Kuhn et al., Cell, 1993; 75:263-274). Aparecen primero cambios inflamatorios en el ciego, colon ascendente y transverso de mutantes de 3 semanas de edad. La enfermedad progresiva en ratones IL-10-/- que crecían se caracterizó por un número incrementado de infiltrados de células inflamatorias multifocales compuestos por células mononucleares y neutrófilos acompañados por hiperplasia epitelial moderada y ligero agotamiento de mucina de células copa. Estaban presentes ocasionalmente pequeñas erosiones epiteliales y abcesos de cripta y la inflamación raramente implicaba a la submucosa. Los ratones IL-10-/- usados en estos estudios mostraban una inflamación menos grave de la descrita debido a las condiciones de la instalación de animales de los inventores "limpia" en lugar de "convencional".

Cuando estos ratones se trataron desde la semana 3 durante 6 a 8 semanas con anti IFN-\gamma o anti IL-2, puede prevenirse la colitis (Rennick et al., J-Leukoc-Biol., Abril de 1997, 61(4):389-396). Se trataron ratones de 3 semanas de edad por inoculación intragástrica diaria con L. Lactis productor de IL-10. Los ratones se trataron durante 4 semanas con cultivos exponencial medio o exponencial final, mientras que un grupo sin tratar se mantuvo en condiciones idénticas. La figura 7 muestra los registros histológicos obtenidos como se ha descrito (Berg et al., J-Clin-Invest; 15 de Agosto de 1996; 98(4):1010-1020), con la excepción de que no se examinó el ciego. Los ratones no tratados muestran un registro histológico medio de aproximadamente 4,5 puntos. Esto concuerda bien con los datos informados, siempre que se tenga en cuenta la contribución de los registros cecales en estos valores y la ligera diferencia de edad. El grupo de ratones tratados con MG1363(pT1MIL10) muestra un registro histológico medio de 1,5 puntos, que está sólo ligeramente por encima de los valores informados para ratones de 3 semanas de edad (Berg et al., J-Clin-Invest; 15 de Agosto de 1996; 98(4):1010-102). Como es la suma de 3 valores variables de 0 a 4 puntos, esto se considera un registro muy bajo. De estos datos está claro que puede prevenirse por este tratamiento el desarrollo de colitis.

Referencias

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Kojouharoff, G., Hans, W., Obermeier, F., Mannel, D.N., Andus, T., Scholmerich, J., Gross, V. & Falk, W. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin. Exp. Immunol. 107, 353-358, 1997.

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Baer, R. Et al., DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome. Nature, 130, 207-211 (1984).

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<110> VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOL

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<120> USO DE CEPA DE LACTOCOCCUS PRODUCTORA DE CITOKINA PARA TRATAR COLITIS

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<130>V1/002-V023

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<140>

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<141>

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<150> 98203529.7

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<151> 1998-10-20

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<160> 8

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<170> Patentin Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador usado para obtener el plásmido pT1MIL10

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<400> 1

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cagtacagcc gggaagacaa t

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21

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<210> 2

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 2

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gcactagtta gcttttcatt ttgat

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25

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador usado para obtener el plásmido pT1TR5AH

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<400> 3

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ctggtcctt ctcttggtga c

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21

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<210> 4

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

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ccactagtct attaatgatg atgatgatga tgcgcagtac ctgagtcctg ggg

\hfill

53

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<210> 5

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<211> 5230

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial : plásmido pTREX1

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<400> 5

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1

2

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<210> 6

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<211> 5906

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido pT1NX

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<400> 6

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4

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<210> 7

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<211> 5770

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido pT1MIL10

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<400> 7

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6

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<210> 8

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<211> 5870

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido pT1TR5AH

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<400> 8

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8

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Claims

1. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva productora de citoquina o una cepa bacteriana gram-positiva productora de antagonista de citoquina para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad intestinal inflamatoria, en el que dicho tratamiento reduce la inflamación en al menos el 50% y/o previene el inicio de dicha inflamación.

2. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva según la reivindicación 1ª, en el que la citoquina o el antagonista de citoquina es IL-10, un receptor de TNF soluble u otro antagonista de TNF, un antagonista de IL-12, un antagonista de interferón-\gamma, un antagonista de IL-1 o un análogo de citoquina codificado por virus tal como EBV BCRF1.

3. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva según las reivindicaciones 1ª o 2ª, en el que la cepa bacteriana gram-positiva es una Lactococcus species.

4. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva según la reivindicación 3ª, en el que la Lactococcus species es Lactococcus lactis.

5. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva según las reivindicaciones 1ª o 2ª, en el que la cepa bacteriana gram-positiva es Bacillus subtilis, Streptococcus gordonii, Staphylococcus xylosus o una Lactobacillus spec.

6. El uso de una cepa bacteriana gram-positiva según alguna de las reivindicaciones precedentes, en el que la enfermedad intestinal es una colitis crónica, enfermedad de Crohn o una colitis ulcerativa.