ES2399987T3

ES2399987T3 - Uso de una cepa de levadura recombinante que produce un compuesto antiinflamatorio en la fabricación de un medicamento para tratar colitis

Info

Publication number: ES2399987T3
Application number: ES06806911T
Authority: ES
Inventors: Pieter Rottiers; Klaas Vandenbroucke; Dirk Iserentant
Original assignee: Actogenix NV
Current assignee: Intrexon Actobiotics NV
Priority date: 2005-10-03
Filing date: 2006-10-02
Publication date: 2013-04-04
Anticipated expiration: 2026-10-02
Also published as: EP1931762A1; US20080254014A1; WO2007039586A1; CA2621468A1; JP2009510154A; EP1931762B1

Abstract

Uso de una cepa de levadura recombinante que produce un compuesto antiinflamatorio y/o una cepa delevadura que produce un antagonista de citocinas para la preparación de un medicamento para tratar lainflamación de la mucosa, en el que dicho compuesto antiinflamatorio o antagonista de citocinas se muta paraevitar o limitar la glucosilación.

Description

Uso de una cepa de levadura recombinante que produce un compuesto antiinflamatorio en la fabricación de un medicamento para tratar colitis

En general, la invención se refiere a composiciones para la administración en la mucosa intestinal de compuestos

5 antiinflamatorios, preferentemente de agentes antiinflamatorios sensibles a ácido tales como IL10 y/o un receptor de TNF soluble y/o factor trébol por medio de la vía oral. La característica preferida de acuerdo con la invención es la inoculación con una suspensión de células de levadura recombinantes vivas, preferentemente células de Saccharomyces que se han diseñado para producir las proteínas respectivas. Como ejemplo, se usaron ratones en los que se había inducido una inflamación crónica del colon distal por administración con dextranosulfato de sodio

10 (DSS). El tratamiento tal como se registró por evaluación histológica dio como resultado claramente una regresión de la inflamación y de los síntomas de la enfermedad. El hallazgo es altamente inesperado puesto que se asumió que sólo las bacterias del ácido láctico vivas que pueden interaccionar con la mucosa intestinal eras adecuadas para administrar citocinas y curar la colitis.

El sistema inmunitario en un mamífero es diverso y complejo e incluye reacciones y mecanismos inmunitarios

15 naturales y adaptativos. El sistema inmunitario a menudo se describe en términos de respuestas inmunitarias humorales o bien celulares. La inmunidad humoral se refiere en general a la producción de anticuerpos y acciones por células B; la inmunidad celular está mediada por células incluidas las células T, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos. Las células T y las células B son las categorías de linfocitos.

Uno de los mecanismos por el que el sistema inmunitario normalmente actúa y se regula a sí mismo incluye la

20 producción de las denominadas citocinas. Se sabe que las citocinas median en varias respuestas inmunitarias positivas y negativas. Normalmente, las citocinas actúan uniéndose a un receptor sobre una célula diana. Se puede interferir la actividad de las citocinas de diversas formas, por ejemplo, por la administración de receptores solubles (dominios extracelulares del receptor) o por análogos o derivados de citocinas.

La IL-10 es una citocina que puede mediar en varias acciones o efectos. Se sabe que la IL-10 está implicada en el 25 control de las respuestas inmunitarias de diferentes clases y subconjuntos de células Th (células T auxiliares).

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se refiere a un grupo de trastornos gastrointestinales caracterizado por una inflamación no específica crónica de partes del tubo digestivo. La colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC) son los ejemplos más destacados de EII en seres humanos. Están asociadas con muchos síntomas y complicaciones, incluidas el retraso del crecimiento en niños, prolapso rectal, sangre en heces (por ejemplo, melena

30 y/o hematoquecia), emaciación, deficiencia de hierro, y anemia, por ejemplo, anemia por deficiencia de hierro y anemia de enfermedad crónica o de inflamación crónica. La etiología o etiologías de la EII no están claras. Se hace referencia a esto en Wyngaarden y Smith (eds.) Cecil's Textbook of Medicine (W.B. Saunders Co. 1985), Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1982), y Harrison's Principles of Internal Medicine, 12ª ed., McGraw-Hill, Inc. (1991).

35 La incidencia de la EII varía enormemente con la situación geográfica. Un estudio de colaboración sobre Europa muestra una incidencia por 100.000 de 10,4 para la CU y de 5,6 para la EC con una incidencia mayor de un 40% y un 80% respectivamente para CU y EC en centros del norte en comparación con los del sur. Puesto que tanto la CU como la EC son afecciones duraderas, corresponden a alteraciones reales en la calidad de vida. La enfermedad de Crohn tiene una distribución de aparición por edades bimodal, lo que muestra picos notables en la incidencia a los

40 20 y 50 años de edad. Se asocia una incidencia mayor y un perfil de enfermedad más grave con el pico a la edad más joven. Esto hace que la EC sea especialmente penosa ya que los adolescentes y adultos jóvenes afectados están virtualmente privados de altas expectativas de vida, asociado de manera tan particular con este grupo social.

La colitis ulcerosa se refiere a una enfermedad ulcerosa, inflamatoria, no específica y crónica que tiene manifestaciones principalmente en la mucosa colónica. Se caracteriza con frecuencia por diarrea hemorrágica,

45 calambres abdominales, sangre y moco en las heces, malestar, fiebre, anemia, anorexia, pérdida de peso, leucocitosis, hipoalbuminemia y una tasa de sedimentación de eritrocitos (TSE) elevada.

Las complicaciones pueden incluir hemorragia, colitis tóxica, megacolon tóxico, fístulas rectovaginales ocasionales y un riesgo incrementado de desarrollo de cáncer de colon.

La colitis ulcerosa también está asociada con complicaciones distantes del colon, tales como artritis, espondilitis 50 anquilosante, sacroileítis, uveítis posterior, eritema nodoso, pioderma gangrenoso y episcleritis.

El tratamiento varía considerablemente con la gravedad y duración de la enfermedad. Por ejemplo, en un ataque grave se indica con frecuencia tratamiento fluido para evitar la deshidratación y el desequilibrio electrolítico. Adicionalmente, a veces son útiles medidas dietéticas especiales. Las medicaciones incluyen varios corticosteroides, sulfasalacina y alguno de sus derivados, y posiblemente fármacos inmunosupresores.

55 La enfermedad de Crohn comparte muchas características en común con la colitis ulcerosa. La enfermedad de Crohn se puede distinguir porque las lesiones tienden a estar claramente delimitadas del intestino normal adyacente, en contraste con las lesiones de la colitis ulcerosa que son bastante difusas. Adicionalmente, la enfermedad de Crohn afecta predominantemente al íleon (ileítis) y al íleon y colon (ileocolitis). En algunos casos, se enferma solo el colon (colitis granulomatosa) y a veces está implicado todo el intestino delgado (yeyunoileítis). En casos raros, están implicados el estómago, el duodeno o el esófago. Las lesiones incluyen un granuloma epitelioide de tipo sarcoide en

5 casi la mitad de los casos clínicos. Las lesiones de la enfermedad de Crohn pueden ser transmurales, incluidas ulceración profunda, edema y fibrosis lo que puede dar lugar a obstrucción y formación de fístulas así como a la formación de abscesos. Esto contrasta con la colitis ulcerosa que normalmente produce lesiones mucho menos profundas, aunque ocasionalmente las complicaciones de fibrosis, obstrucción, formación de fístulas y abscesos se observan también en la colitis ulcerosa.

10 El tratamiento es similar para ambas enfermedades e incluye esteroides, sulfasalacina y sus derivados, y fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, mercaptopurina y azatioprina. Los tratamientos desarrollados más recientemente, algunos aún es ensayos clínicos, implican la administración sistémica (por inyección) de compuesto bloqueantes del TNF tales como anticuerpos de TNF. La publicación Digestive Diseases and Sciences, vol. 45, 2000, 1462-4 divulga la capacidad de la levadura Saccharomyces boulardii junto con mesalamina para reducir la

15 incidencia de recidiva clínica en pacientes con la enfermedad de Crohn.

La EII representa un problema serio en la salud pública debido a la ausencia de tratamiento etiológico. Aunque muchos pacientes se controlan con éxito con tratamiento médico convencional, tal como tratamiento con corticosteroides antiinflamatorio, la mayoría tendrá una actividad de la enfermedad recurrente y dos tercios necesitarán cirugía.

20 Se desconoce la causa de las enfermedades intestinales inflamatorias. Probablemente, la patogénesis de la EC y CU implica una interacción entre factores genéticos y medioambientales, tales como agentes bacterianos, aunque hasta el momento no se ha identificado ningún agente etiológico definitivo. La principal teoría es que en la EII se produce una respuesta inmunitaria anormal, posiblemente provocada por la microflora intestinal. Sin embargo, lo que está bien establecido es que las células T desempeñan un papel importante en la patogénesis. Las células T

25 activadas pueden producir citocinas tanto antiinflamatorias como proinflamatorias. Con este conocimiento en mano, se puede contrarrestar la EII de manera racional. Los tratamientos antiinflamatorios novedosos, que hacen uso de anticuerpos monoclonales neutralizantes o citocinas antiinflamatorias, muestran la posibilidad de modular las desregulaciones inmunitarias causantes de la EII. Un tratamiento nuevo altamente prominente y eficaz es el tratamiento sistémico con anticuerpos monoclonales anti-TNF como se menciona anteriormente. Las dosis

30 intravenosas individuales, que varían de 5 a 20 mg·kg-1, del anticuerpo de cA2 infliximab dieron como resultado una mejora clínica drástica en la enfermedad de Crohn activa. El uso de IL-10 recombinante administrada sistémicamente en un régimen de tratamiento diario de 7 días usando dosis que varían de 0,5 a 25 mg·kg-1 mostró una reducción en las puntuaciones de la actividad de la enfermedad de Crohn y un incremento en la remisión. Actualmente, están emergiendo varios tratamientos muy prometedores a partir de modelos experimentales, que

35 implican citocinas proinflamatorias o bien el establecimiento de infiltrados de células T. Sin embargo, todas estas estrategias requieren una administración sistémica. Las complicaciones graves de la EII pueden ser gravemente debilitantes, y finalmente pueden dar lugar a la muerte.

En la técnica son conocidos varios procedimientos para tratar la EII. En la patente de los EE. UU. 5.368.854, asignada a Schering Corp., se divulga un procedimiento que usa la IL-10 para tratar enfermedades intestinales

40 inflamatorias en mamíferos. En este procedimiento, se administra la citocina a un mamífero que tiene una EII (enfermedad intestinal inflamatoria). La administración de IL-10 como se describen en esta referencia es parenteral, tal como intravascular y preferentemente intravenosa.

Sin embargo, es obvio que dicha vía de administración para un paciente (humano) que padece una EII no está carente de inconvenientes. Una forma más fácil y más conveniente es una administración oral de un medicamento

45 que comprende una citocina, tal como IL-10, o un antagonista de citocina que tiene una actividad terapéutica similar. De forma más importante, la liberación localizada del agente terapéutico permite una mayor eficacia y menos efectos secundarios no deseados debido a las actividades sistémicas.

En el documento WO 97/14806, asignado a Cambridge University Technical Services Ltd., se divulga un procedimiento para la administración de antígenos y/o polipéptidos biológicamente activos usando bacterias no

50 invasivas, tales como Lactococcus, por administración intranasal de dichos polipéptidos en el cuerpo, en especial, en la mucosa. El documento WO 00/23471 enseña en detalle cómo se puede tratar la colitis por una cepa de Lactococcus que produce citocinas.

Para lograr la recuperación de un paciente que padece una EII, es necesario restablecer las células dañadas y el órgano que comprende dichas células dañadas, por ejemplo, el colon. Varios estudios indican que el efecto curativo

55 de la Lactococcus que produce el compuesto antiinflamatorio es debido a la combinación de bacterias el ácido láctico vivas y el compuesto antiinflamatorio, y no al compuesto antiinflamatorio solo. De hecho, tanto Steidler et al.(2000), para la IL10, como Vandenbroucke et al. (2004) en el caso de factores trébol, demuestran claramente que no se obtuvo ningún efecto cuando se mata la Lactococcus que produce la IL10 por irradiación UV antes del tratamiento, aunque en estos casos el compuesto activo se debe liberar en el intestino lisando las bacterias.

El tratamiento de colitis con Lactococcus lactis que produce IL-10 ha demostrado que es exitoso. Sin embargo, el principal inconveniente es la rápida disminución de la viabilidad de Lactococcus, y la escasa supervivencia en el intestino, lo que hace que la dosificación y coordinación precisa del tratamiento sea difícil.

Como alternativa para la administración de proteínas o péptidos en el intestino, Blanquet et al. (2004, documento

5 WO 01/98461) describen la posibilidad de administrar proteínas o péptidos en el intestino, usando Saccharomyces cerevisiae recombinante. Aunque este sistema puede ser útil en algunos casos, en general se acepta que esta forma de administración puede que no sea exitosa para enfermedades en las que es necesaria una interacción con la mucosa intestinal. De hecho, ya que los autores usaron un sistema de intestino artificial para probar la administración, ellos mismos indicaron que "este sistema no puede estimular los procesos fisiológicos de la pared

10 del intestino, tal como un transporte activo y facilitado". No están disponibles datos sobre la biodisponibilidad o actividad de las moléculas activas (Blanquet et al. 2004). Está bien documentado que, en especial en el caso de IL10, el microentorno de citocina local producido por los tipos de células que secretan genes es extremadamente importante (Croxford et al., 2001). Varios factores pueden desempeñar un papel, incluidos, pero sin limitación, la composición de la pared celular de la célula que produce citocinas, el tamaño de la célula y la capacidad de la célula

15 para interaccionar con la mucosa. Además, existen datos recientes de que los productos metabólicos de levaduras, los antígenos de levaduras y las levaduras son posibles desencadenantes del síndrome de colon irritable (Santelmann y Howard, 2005). Por lo tanto, los resultados obtenidos con las bacterias del ácido láctico no se pueden extrapolar a levaduras sin la debida experimentación, y en vista de las características inmunomoduladoras especiales de Lactococcus, el experto en la técnica no esperaría un resultado positivo de la levadura, administrando

20 in situ en el intestino un agente antiinflamatorio tal como IL10, para el tratamiento de colitis.

Sorprendentemente, se ha encontrado que se puede usar la levadura recombinante, que produce un compuesto antiinflamatorio tal como IL10, para el tratamiento de la inflamación de la mucosa, tal como EII o mucositis.

Lo siguiente es la invención de los autores:

1. Uso de una cepa de levadura recombinante que produce un compuesto antiinflamatorio y/o una cepa de

25 levadura que produce un antagonista de citocinas para la preparación de un medicamento para tratar la inflamación de la mucosa, en el que dicho compuesto antiinflamatorio o antagonista de citocinas se muta para evitar o limitar la glucosilación.

2. El uso de una levadura recombinante de acuerdo con 1, en el que dicha inflamación de la mucosa es una enfermedad intestinal inflamatoria.

: 30 3. El uso de una cepa de levadura recombinante de acuerdo con 1 o 2, en el que el compuesto antiinflamatorio o antagonista de citocinas se selecciona de la lista que consiste en IL-10, un factor trébol tal como TFF1, TFF2 o TFF3, un antagonista de TNF tal como el receptor de TNF soluble, INCA, ABIN, un antagonista de IL-12, un antagonista de interferón-γ, un antagonista de IL-1 y un análogo de citocina codificado por virus tal como EBV BCRF1.

: 35 4. El uso de una levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho compuesto antiinflamatorio es IL-10 no glucosilada.

5. El uso de una cepa de levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la cepa de levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp. Schizzosaccharomyces sp. Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Monascus sp., Geotrichum sp y Yarrowia sp.

: 40 6. Uso de una cepa de levadura recombinante de acuerdo con 5, en el que la Saccaromyces sp es Saccharomyces cerevisiae.

7. Uso de una cepa de levadura recombinante de acuerdo con 6, en el que la cepa de levadura recombinante es la subespecie de Saccharomyces cerevisiae boulardii.

8. Uso de una cepa de levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la 45 enfermedad intestinal inflamatoria es una colitis crónica, enfermedad de Crohn o una colitis ulcerosa.

El compuesto antiinflamatorio que se va a producir por la cepa huésped de levadura puede ser cualquier compuesto antiinflamatorio conocido por el experto en la técnica. De forma alternativa, la levadura puede producir una enzima modificadora, tal como, como ejemplo no limitante, una cinasa, una fosfatasa, una proteasa o una enzima de acetilación, que puede convertir un sustrato en un compuesto antiinflamatorio. Como ejemplo no limitante, dicho 50 compuesto antiinflamatorio puede ser una citocina, tal como IL-10, un antagonista de citocinas (tal como un antagonista de TNF, un antagonista de IL-12, un antagonista de interferón-γ, o un antagonista de IL-1), un polipéptido antiinflamatorio (tal como proteínas trébol, ABIN o INCA), o un análogo de citocinas codificado por virus tal como EBV BCRF1. Los antagonistas de citocinas son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero sin limitación, el receptor soluble, y anticuerpos anti-citocinas. Preferentemente, dicho compuesto antiinflamatorio es IL

55 10.

En el caso de que el compuesto antiinflamatorio comprenda sitios de glucosilación, preferentemente uno o más de estos sitios se mutan para evitar o limitar la glucosilación, preferentemente para evitar o limitar la hiperglucosilación en levaduras. Una realización preferida es una levadura recombinante, que produce IL-10 no glucosilada, preferentemente una IL-10 no glucosilada en la que se han mutado uno o más sitios de glucosilación posibles.

5 Preferentemente, el gen o genes que codifican el compuesto antiinflamatorio son genes heterólogos, situados sobre un plásmido. Los plásmidos adecuados son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero sin limitación, plásmidos episómicos, cromosomas artificiales o plásmidos integradores.

La levadura recombinante puede ser cualquier levadura que pueda sobrevivir en el intestino de un mamífero. Preferentemente, dicha levadura tiene una capacidad probiótica conocida, tal como cepas de levadura 10 seleccionadas de kéfir, Kombucha o productos lácteos. Aún más preferentemente, dicha levadura recombinante se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp. Schizzosaccharomyces sp. Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Monascus sp., Geotrichum sp y Yarrowia sp. Aún más preferentemente, dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae, lo más preferentemente la subespecie de Saccharomyces cerevisiae boulardii. Preferentemente, el sistema vector -huésped de levadura recombinante es un

15 sistema contenido biológicamente. La contención biológica es conocida para el experto en la técnica y se puede realizar por la introducción de una mutación auxotrófica, preferentemente una mutación auxotrófica suicida tal como la mutación Thy A, o sus equivalentes. De forma alternativa, la contención biológica se puede realizar en el nivel del plásmido que porta el gen que codifica el compuesto antiinflamatorio. Esto se puede realizar, como ejemplo no limitante, usado una construcción episómica inestable, que se pierde después de unas pocas generaciones.

20 Se pueden combinar varios niveles de contención, tales como inestabilidad de plásmido y auxotrofía, para garantizar un alto nivel de contención.

Preferentemente, la inflamación de la mucosa es la EII. Las enfermedades intestinales inflamatorias tales como una colitis crónica, la enfermedad de Crohn o una colitis ulcerosa, se pueden tratar de acuerdo con la invención con una dosificación apropiada del compuesto antiinflamatorio activo, preferentemente IL-10, aún más preferentemente IL-10

25 no glucosilada y proporciona inesperadamente un restablecimiento del colon enfermo a un estado aparentemente normal y sano.

De forma alternativa, se puede usar la administración de un compuesto antiinflamatorio tal como IL-10 por levadura recombinante para tratar otras inflamaciones de la mucosa tales como mucositis.

La IL-10 se puede administrar sola o en combinación con al menos un agente terapéutico adicional. Ejemplos de

30 dichos agentes incluyen corticosteroides; sulfasalacina, derivados de sulfasalacina, fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, mercaptopurina, azatioprina y otra citocina. La administración conjunta puede ser secuencial o simultánea. En general, administración conjunta quiere decir que los múltiples (dos o más) productos terapéuticos están presentes en el receptor durante un intervalo de tiempo específico. Típicamente, si se administra un segundo agente dentro de la semivida del primer agente, los dos agentes se consideran administrados

35 conjuntamente. El otro agente terapéutico, como se menciona aquí, puede ser otro sistema de administración microbiano tal como Lactococcus o una cepa de levadura, que administra otro compuesto, preferentemente un compuesto con una acción complementaria tal como, como ejemplo no limitante, un factor trébol.

Por tanto, la invención divulgada en el presente documento se refiere a una administración localizada de IL-10 a través de la síntesis in situ por levadura recombinante. Como resultado de la misma, se reduce la inflamación en al

40 menos un 30%, en colitis crónica inducida con DSS y evita la aparición de colitis en ratones 129 Sv/Ev IL-10 -/-. De este modo, el procedimiento es igualmente eficaz en comparación con los tratamientos potentes, bien establecidos y aceptados que se basan en la administración sistemática de proteínas antiinflamatorias.

El vector de levadura usado en el presente documento se selecciona de alimento, preferentemente alimento con características probióticas, o de probióticos conocidos y es totalmente inocuo para individuos inmunocompetentes.

45 Especialmente en el caso de la subespecie de Saccharomyces cerevisiae boulardii, está disponible experiencia clínica, y se ha estudiado el tiempo en tránsito en el intestino. La dosificación y coordinación precisa durante el tratamiento, que se ha demostrado aquí que es de gran importancia, se puede obtener así fácilmente.

El requisito crítico para la viabilidad del vector se muestra en la presente invención. Esto indica la necesidad de una síntesis in situ de IL-10. De hecho, el vector puede lograr esto mostrando la síntesis de novo de IL-10 en el colon. La

50 levadura, de acuerdo con la invención, tiene en este respecto una clara ventaja sobre Lactococcus lactis como se describe en el documento WO 00/23471, ya que mantiene su viabilidad más fácilmente durante el proceso, y sobrevive mejor en el intestino que Lactococcus.

Este procedimiento puede contestar la cuestión de la presencia sostenida y localizada de IL-10 en tratamiento a concentraciones mayores de lo que se puede desear o incluso lograr a través de la administración sistémica, con

55 respecto a los efectos secundario latentes.

Definiciones

Algunos términos usado en la presente descripción, en aras de la claridad, se explican a continuación en el presente documento. En general, el término "síntomas" se refiere a cualquier evidencia subjetiva de enfermedad o de una afección de un paciente. Esto incluye evidencia como se percibe por el paciente. Ejemplos de síntomas de EII

5 incluyen diarrea, dolor abdominal, fiebre, melena, hematoquecia y pérdida de peso.

El término "signos" se refiere, en general, a cualquier evidencia objetiva de una enfermedad o afección, normalmente como se percibe por el médico que examina o características que se revelan en una evaluación en laboratorio u otras pruebas tales como un estudio de ultrasonidos o una prueba radiográfica. Algunos ejemplos de signos de EII incluyen masa abdominal, glositis, úlcera aftosa, fisura anal, fístula perianal, anemia, malabsorción y deficiencia de

10 hierro. Ocasionalmente, los signos y los síntomas coinciden. Por ejemplo, el paciente se queja de heces con sangre (un síntoma), y una prueba de laboratorio de una muestra de heces es positiva para sangre (un signo).

La expresión "dosificación apropiada" o "cantidad eficaz" quiere decir una cantidad o dosificación suficiente para mejorar un síntoma o signo de una afección autoinmunitaria o de una respuesta inmunitaria o inflamatoria no deseada o inapropiada. Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales

15 como la afección que se trata, la salud general del paciente, la ruta del procedimiento y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios.

Por "citocina" se quiere decir un factor polipeptídico producido de forma transitoria por una variedad de tipos de células, que normalmente actúa localmente y activa la expresión de genes específicos por la unión a los receptores de la superficie celular.

20 Por "antagonista" se quiere decir un compuesto que se une pero que no activa los receptores, por lo tanto inhibe la acción de un agonista de forma competitiva.

Los "agonistas" son compuestos que se unen a y activan receptores (por ejemplo, ligandos endógenos tales como hormonas y neurotransmisores, compuestos sintetizados químicamente, productos naturales como alcaloides).

"Compuesto" quiere decir cualquier compuesto químico o biológico, incluidos moléculas orgánicas e inorgánicas

25 sencillas o complejas, péptidos, péptidos miméticos, proteínas, anticuerpos, carbohidratos, ácidos nucleicos o derivados de los mismos.

Los términos "proteína" y "polipéptido" como se usan en esta solicitud, son intercambiables. "Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Este término también incluye modificaciones postraduccionales del polipéptido, tal como glucosilación, fosforilación y acetilación.

30 Breve descripción de las figuras

Figura 1: Mapa del plásmido de pPIC92MIL10

Figura 2: Mapa del plásmido del vector pYES2

Figura 3: Mapa del plásmido de pYES2-mIL10

Figura 4: Construcción del fragmento TPI-ppMF-mIL10 por PCR de superposición. Los números indican los 35 cebadores usados (véase el texto).

Figura 5: Mapa del plásmido de pYES2T-mIL10

Figura 6: secreción de mIL10 por INV S.c.1 [pYES2] de Saccharomyces cerevisiae y INV S.c.1 [pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae determinado por ELISA sándwich en función del tiempo (después de 0, 8, 12, 24 y 48 horas). Figura 7: Detección de transferencia Western de mIL10. La señal corresponde a la cantidad de proteína

40 presente en 0,5 ml de sobrenadante de cultivo después de 24 horas de crecimiento en YPD.

Figura 8: Detección de transferencia Western de mIL10 y mIL-10 no glucosilado. La señal corresponde a la cantidad de proteína presente en 0,5 ml de sobrenadante de cultivo después de 24 horas de crecimiento en YPD.

Figura 9: Evaluación estadística de la puntuación histológica del colon distal. Todos los datos se expresan como media ± EEM. Los datos se analizaron estadísticamente con un análisis de varianza con 1 factor (ANOVA) seguido

45 de múltiples comparaciones postprueba de la diferencia mínima significativa (DMS) de Fisher. * representa una diferencia estadísticamente significativa en comparación con grupos de control tratados con vector de Saccharomyces cerevisiae y de prueba de P < 0,035 y P < 0,012, respectivamente, +a representa una diferencia estadística en comparación con grupos de control tratados con vector de Lactococcus lactis y de prueba de P < 0,085 y P < 0,152, respectivamente.

50 Figura 10: Sustitución génica de PURA3-URA3 por PTPIppMF-mIL10ng1S en VC5 de Saccharomyces cerevisiae. Los números (1-8) indican los diferentes cebadores usados.

Figura 11: Organización genómica de la región de 108 504 -120 299 pb del cromosoma V de Saccharomyces cerevisiae (Dietrich et al., 1997); YEL023C y YEL020C son genes con una función desconocida; GEA2 codifica el factor de intercambio nucleotídico de guanina 2 del factor de ribosilación de ADP (ARF); URA3 codifica orotidin-5'fosfato (OMP) descarboxilasa; TIM9 codifica la proteína de la membrana interna mitocondrial que es responsable de

5 la importación e inserción de proteínas politópicas de la membrana interna.

Figura 12: Detección de transferencia Western de mIL10. La señal corresponde a la cantidad de proteína presente en 0,5 ml de sobrenadante de cultivo después de 24 horas de crecimiento en YPD.

Ejemplos

Materiales y procedimientos para los ejemplos

10 Cepas y medio de cultivo

Se obtuvo INV Sc1 de Saccharomyces cerevisiae (apareamiento-α, his3Δ1, leu2-3,-112 trp1-289 y ura3-52) de Invitrogen™.

Se aisló la subspecie boulardii de Saccharomyces cerevisiae a partir de una preparación probiótica comercial.

El medio mínimo fue SD+CSM-U, que consistía en base de nitrógeno para levadura al 0,67% sin aminoácidos (Difco,

15 Detroit, MI) dextrosa al 2% (Merck, Darmstadt, Alemania) y CSM-URA al 0,077%(Bio101 Systems, Morgan Irvine, CA).

El medio YPD consiste en extracto de levadura al 1%, Difco; dextrosa al 2%, Merck; peptona al 2%, Difco.

Técnicas de ADN recombinante.

Se realizó la amplificación de PCR del ADN con polimerasa VENT y se usaron las condiciones recomendadas por el

20 fabricante. Se usaron enzimas modificadoras de ADN y endonucleasas de restricción bajo condiciones estándar y en los tampones recomendados por los fabricantes. Se llevaron a cabo técnicas de clonación molecular general y la electroforesis de ADN y proteínas esencialmente como se describe (Sambrook et al., 1990). Se transformó S. cerevisiae por electroporación y se seleccionaron los transformantes sobre el medio selectivo adecuado como se indica.

25 Construcción de los plásmidos de expresión.

Subclonación de mIL10 en el plásmido pPIC92

Se amplificó por PCR la secuencia codificante de ADN de mIL10 maduro (polimerasa Vent®, NEB, Ipswich, MA) con oligo mIL10 S (CAGTACAGCCGGGAAGACAAT) y oligo mIL10 AS (GCACTAGTTAGCTTTTCATTTTGAT) del plásmido pT1mIL10 (Schotte et al., 2000). Esto dio como resultado un fragmento de 474 pb. Se ligó este fragmento

30 de PCR de mIL10 en marco después de la señal de secreción del factor de apareamiento-α de prepro (ppMF) de Saccharomyces cerevisiae presente en el plásmido pPIC92 que se linealizó con la enzima de restricción de Nael (NEB). Se designó la construcción resultante como pPIC92mIL10 (figura 1). Se derivó el plásmido pPIC92 del plásmido pPIC9K (Invitrogen™, Carlsbad, CA). Se transformaron células competentes en calor de MC1061 de Escherischia coli con la mezcla de ligación pPIC92mIL10.

35 Subclonación de ppMF-mIL10 en el plásmido pYES2

pYES2 (figura 2; Invitrogen) es un vector de 5,9 kb diseñado para la expresión inducible de proteínas recombinantes en Saccharomyces cerevisiae. Las características del vector permiten una fácil clonación del gen de interés y la selección de transformantes por prototrofia del uracilo (contiene el marcador URA3). El vector pYES2 se designa para una expresión de alto nivel de proteínas recombinantes en Saccharomyces cerevisiae. Contiene el promotor

40 GAL1 que permite la expresión inducible de galactosa. El vector lleva el origen de replicación 2μ y se mantiene de forma episómica en un alto número de copias (10-40 copias por célula). El vector también contiene el origen de pUC de E. coli y resistencia a ampicilina que permite la fácil clonación y selección en E. coli.

Se digirió el vector pYES2 con una digestión combinada de BamHI (NEB) y XbaI (NEB). Se aisló el fragmento de ADN del vector de 5780 pb. Se digirió el pPIC92mIL10 de plásmido con una digestión combinada de BamHI (NEB) y

45 Spel (NEB). Se aisló el fragmento de ADN de 751 pb. Se ligaron las dos bandas de ADN seleccionadas (5780 y 751 pb) y se transformaron en células competentes en calor de MC1061 de E. coli. Se designó el plásmido construido como pYES2-mIL10 (figura 3).

Construcción del plásmido pYES2T-mIL10

El plásmido construido previamente pYES2-mIL10 tenía la desventaja de que sólo produce secreción de mIL10

50 después de la inducción con galactosa del promotor GAL1. Para el uso in vivo de cepas de Saccharomyces que secretan mIL10, es muy importante que secreten de forma constitutiva mIL10. Para lograr este objetivo, se sustituyó el promotor GAL1 por la triosa fosfato isomerasa constitutiva y muy fuerte (promotor TPI). Se subclonó el casete de expresión ppMF-mIL10 bajo el control del promotor TPI constitutivo y fuerte en un alto número de copias del plásmido de Saccharomyces cerevisiae (origen 2μ).

Se amplificó por PCR el fragmento TPI-ppMF' con oligo Spel-TPI-S (oligo N.º 1 en la figura 4; GCACTAGTATC

5 CGAGATTATATCTAGGAACCCATCAGG) y oligo antisentido ppMF-medio-AS (oligo N.º 2 en la figura 4A; CT-TCTAAATCTGAGTAACCGATGACAGCTTC) a partir del plásmido pSCTPIMF3. Esto dio como resultado la PCR de TPI-ppMF' que tiene una longitud de 500 pb.

Se amplificó el fragmento de PCR ppMF-mIL10 con el oligo ppMF-inicio-S (oligo N.º 3 en la figura 4A; ATGA-GATTTCCTTCAATTTTTACTGCAG) y el oligo mIL10-EcoRI-medio-AS (oligo N.º 4 en la figura 4A; CAGGGAAT

10 TCAAATGCTCCTTGATTTCTGG) a partir del plásmido construido previamente pPIC92mIL10. El fragmento de PCR resultante ppMF-mIL10 tenía una longitud de 525 pb.

Se usaron el fragmento TPI-ppMF' y ppMF-mIL10 como plantilla en una PCR de superposición con los oligos exteriores de las dos reacciones de PCR previas: oligo Spel-TPI-S (oligo N.º 1 en la figura 4B; GCACTAGTATCCGAGATTATATCTAG-GAACCCATCAGG) y oligo mIL10-EcoRI-medio-AS (oligo N.º 4 en la figura

15 4B; CAGGGAATTCAAATGCTCCTT-GATTTCTGG). El fragmento de PCR SpeI-TPI-ppMF-mIL10-EcoRI ensamblado (figura 4B) tenía una longitud de 989 pb y se purificó en un gel de agarosa y se digirió por las enzimas de restricción Spel y EcoRI.

Se digirió el vector construido previamente pYES2-mIL10 por SpeI y EcoRI. Se aisló el fragmento de ADN de 5466 pb y se ligó con el fragmento de PCR Spe/-TPI-ppMF-mIL10-EcoRI. Esto dio como resultado un plásmido que se

20 designó como pYES2T-mIL10 (figura 5). Se transformaron células de E. coli MC1061 competentes en calor con la mezcla de ligación pYES2T-mIL10.

Animales

Se obtuvieron ratones BALB/c hembras de 11 semanas de edad de los laboratorios Charles River Laboratories (Sulzfeld, Alemania). Se alojaron bajo condiciones SPF. Se alimentaron todos los ratones con pienso de laboratorio

25 estándar y agua corriente ad libitum. Se aprobaron los estudios en animales por el Comité ético del Departamento de Investigación biomédica molecular, Ghent University (N. expediente 04/02).

Inducción de colitis crónica por DSS

Se indujo colitis crónica a los ratones que pesaban aproximadamente 21 g por cuatro ciclos de administración de DSS al 5% (p/v) (40 kDa, Applichem, Darmstadt, Alemania) en el agua de bebida, alternando con periodos de 10

30 días de recuperación con agua de bebida normal. (Okayasu et al., 1990; Kojouharoff et al., 1997). Se inició de forma arbitraria el tratamiento el día 21 después del cuarto ciclo de DSS. Se trataron los diferentes grupos durante 14 días. 14 días después del último tratamiento, se mataron los ratones y se analizaron.

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± EEM. Los datos se analizaron estadísticamente con un análisis de

35 varianza con 1 factor (ANOVA) seguido de múltiples comparaciones postprueba de la diferencia mínima significativa (DMS) de Fisher.

Control de Lactococcus

Se llevó a cabo el tratamiento con Lactococcus que secreta IL-10 como se describe por Steidler et al. (2000).

Ejemplo 1: Construcción de cepas de Saccharomyces que secretan mIL10

40 Se sometió a electroporación 1 μg del plásmido pYES2T-mIL10 (preparado por el kit de plásmido midi de Qiagen, Hilden, Alemania; fuera de la cepa de E. coli MC1061[pYES2T-mIL10]) en células INV Sc1 de Saccharomyces cerevisiae electrocompetentes. Se plaquearon las células de levadura transformadas en medio mínimo deficiente de uracilo (selección). El cribado por PCR identificó los transformantes de Saccharomyces cerevisiae en los que estaba presente el plásmido pYES2T-mIL10. Estos se designaron como INV Sc1[pYES2T-mIL10] de Saccharomyces

45 cerevisiae.

Ejemplo 2: Secreción de mIL10 por Saccharomyces cerevisiae.

Se inocularon respectivamente una colonia de cepas de Saccharomyces de INV Sc1[pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae el vector de control INV Sc1 [pYES2] de Saccharomyces cerevisiae en 50 ml de medio deficiente en uracilo mínimo (SD+CSM-U). Después de 24 horas de crecimiento aeróbico a 30ºC, se sedimentaron

50 las células por centrifugación (5 minutos a 2500 tmp) y no se concentró (2x 10E8 CFU/ml) o se concentró 2 x en medio YPD. En diferentes puntos temporales (8, 12, 24 y 48 horas), se tomaron muestras de sobrenadante para la cuantificación y caracterización de mIL10. Durante las 48 horas de crecimiento, el pH del sobrenadante de Saccharomyces cerevisiae permaneció estable a 7.

Se estableció un ELISA tipo sándwich para evaluar la cantidad de IL-10 murina secretada en el sobrenadante de cultivo. Se usó IL-10 anti murina de conejo policlonal (5 μg ml-1; Prepro Tech, Londres, Inglaterra) como anticuerpo de captura. Se aplicó un anticuerpo acoplado a biotina, monoclonal, contra la IL-10 murina (Pharmingen, San Diego, EE. UU.) a una dilución de 1/1000 para detectar la IL-10 capturada. Se hicieron reaccionar los complejos biotinilados

5 con estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano picante (Pharmingen) a una dilución de 1/1000 y se revelaron por reacción con sustrato TMB (Pharmingen). Entre las etapas, se lavaron las placas de microtitulación dos veces con agua y una vez con PBS, que contenía Triton X-100 al 0,05% (Sigma). Para evitar la unión no específica, se incubaron las placas en PBS que contenía caseína al 0,1%.

Después de 12 horas de crecimiento, la cepa de INV Sc1 [pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae había

10 secretado 0,8 ± 0,0 μg/ml de mIL10 cuando las células se concentraron 1 x y 1,6 ± 0,1 μg/ml de mIL10 cuando las células se concentraron 2 x (figura 6). Después de 24 horas de crecimiento, la cepa de INV Sc1 [pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae había secretado 2,8 ± 0,2 μg/ml de mIL10 cuando las células se concentraron 1 x y 6,0 ± 0,2 μg/ml de mIL10 cuando las células se concentraron 2 x (figura 6). Y finalmente, después de 48 horas de crecimiento, la cepa INV Sc1 [pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae había secretado 5,0 ± 0,3 μg/ml de

15 mIL10 cuando las células se concentraron 1 x y 10,2 ± 0,3 μg/ml de mIL10 cuando las células se concentraron 2 x (figura 6). El vector vacío de control de INV Sc1 [pYES2T-mIL10] de Saccharomyces cerevisiae no mostró producción de mIL10 en ningún punto temporal (figura 6).

Se extrajeron proteínas del sobrenadante de cultivo por precipitación de TCA y posteriormente se disolvieron en tampón de muestra de Laemmli (Laemmli, 1970). Se separaron las fracciones de proteína por electroforesis en gel

20 de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (Burnette, 1981).

Se detectó la interleucina-10 murina por inmunotransferencia con IL-10 anti murina de conejo policlonal como anticuerpo principal a una dilución de 1/1000 (Prepro Tech, Londres, Reino Unido). El anticuerpo secundario fue IgG anti ratón de cabra (H+L) acoplado a fosfatasa alcalina (SBA, Birmingham, EE. UU.) y se usó a una dilución de

25 1/1000. Se reveló la actividad enzimática con sustrato NBT/BCIP (Boehringer Mannheim, GmbH, Alemania). La figura 7 muestra la detección de mIL10 en el sobrenadante de INV S.c.1 de Saccharomyces cerevisiae por transferencia Western después de 24 horas de crecimiento. Se concentraron 1 x o 2 x respectivamente las células de Saccharomyces en YPD durante las 24 horas de crecimiento.

Se sometió a prueba la actividad biológica de la IL-10 recombinante, secretada por Saccharomyces, en un ensayo

30 de proliferación con la línea celular de mastocitos de ratón MC/9. Se determinó la titulación biológica de IL-10 a partir de la estimulación de la incorporación de [3H]timidina por las células de mastocitos en proliferación. Se usó un estándar de actividad específica conocida (BioSource International, Camarillo, CA) como control interno.

Ejemplo 3: Producción de IL10 murina no glucosilada

Puesto que la glucosilación puede afectar a la actividad de la IL-10 secretada, que quiso generar una cepa de

35 Saccharomyces cerevisiae que secrete interleucina-10 murina no glucosilada. La mIL10 contiene dos sitios de Nglucosilación de Saccharomyces cerevisiae potenciales (secuencia consenso N-X-S/T, los sitios de glucosilación potenciales se indican en negrita):

El sitio 11-NCT-19 está situado en un bucle que está orientado hacia el disolvente. El sitio no parece estar implicado

40 en la interacción con el receptor IL-10. Este sitio de reconocimiento no está conservado en (h)IL10 humana. En la hIL10, la secuencia de aminoácidos es 11-SCT-13. El sitio de 11-NCT-13 parece que es un sitio de glucosilación ideal para Saccharomyces cerevisiae. Se puede retirar este sitio de glucosilación de mIL10 mutando 11-NCT-13 a 11-SCT-13 como en la hIL10 o a 11-QCT-13 (Q es un aminoácido que se semeja mucho estructuralmente a N; las mutaciones se indican en negrita). Se realizaron ambas mutaciones de mIL10.

45 El sitio 116-NKS-118 parece que es importante para la estabilización y la estructura de mIL10. N así como S están implicados en la formación del enlace de H con el esqueleto de residuos cercanos. La secuencia de aminoácidos de este sitio se conserva estrictamente en seres humanos y en todos los demás homólogos conocidos de IL10. El programa GlyProt no reconoce este sitio como un sitio de glucosilación potencial. En la hIL10 se conserva este sitio y no está glucosilado (Vieira et al., 1991). Esto sugiere que el sitio de 116-NKS-118 tampoco está glucosilado en la

50 IL10 murina. No obstante, se realizó la mutación del sitio 116-NKS-118 en 116-QKS-118 para someter a prueba posibles efectos.

En total, se realizaron cuatro construcciones diferentes de Saccharomyces cerevisiae que secretan 4 formas mutantes (no glucosiladas) diferentes de mIL10. Se mutan dos construcciones en el primer sitio de glucosilación que se muta respectivamente a S y Q. Además, se realizaron 2 construcciones en las que se mutó el primer sitio de glucosilación respectivamente a S y Q y se muta el segundo sitio de glucosilación a Q.

En el mutante mIL10ng 1S sólo se muta el primer sitio de glucosilación potencial. Se muta la secuencia de 11-NCT13 a 11-SCT-13.

En el mutante mIL 10ng1Q sólo se muta el primer sitio de glucosilación potencial. Se muta la secuencia de 11-NCT5 13 a 11-QCT-13.

En el mutante mIL10ng1S2Q se mutan ambos sitios de glucosilación potenciales primero (11-NCT-13) y segundo (116-NKS-118). Se muta el primer sitio de glucosilación potencial 11-NCT-13 a 11-SCT-13. Se muta el segundo sitio de glucosilación potencial 116-NKS-118 a 116-QKS-118.

En el mutante mIL10ng1Q2Q se mutan los sitios de glucosilación potenciales primero (11-NCT-13) y segundo (116

10 QKS-118). Se muta el primer sitio de glucosilación potencial 11-NCT-13 a 11-QCT-13. Se muta el segundo sitio de glucosilación potencial 116-NKS-118 a 116-QKS-118. Se subclonan los mutantes mIL10ng1S, mIL10ng1Q, mIL10ng1S2Q y mIL10ng1Q2Q mIL10 en pYES2T-ppMF para generar respectivamente los plásmidos pYES2TmIL10ng1S, pYES2Tng1Q, pYES2T-mIL10ng1S2Q y pYES2T-mIL101Q2Q. Se introdujeron estos plásmidos en la cepa INV S.c.1 de Saccharomyces cerevisiae.

15 Se inocularon una colonia de todos los transformantes y el vector de control de INV Sc1[pYES2] de Saccharomyces cerevisiae en 50 ml de medio deficiente en uracilo mínimo (SD+CSM-U). Después de 24 horas de crecimiento aeróbico a 30ºC, se sedimentaron las células por centrifugación (5 minutos a 2500 tmp) y se resuspendieron en medio YPD. A las 24 horas, se tomaron muestras del sobrenadante para la cuantificación y caracterización de mIL10. Durante las 48 horas de crecimiento, el pH del sobrenadante de Saccharomyces cerevisiae permaneció

20 estable a pH 7.

Se extrajeron proteínas del sobrenadante de cultivo por precipitación de TCA y posteriormente se disolvieron en tampón de muestra de Laemmli (Laemmli 1970). Se separaron fracciones de proteína por SDS-PAGE y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (Burnette 1981).

Se detectó la interleucina-10 murina con una IL-10 anti murina de conejo policlonal como anticuerpo principal a una

25 dilución de 1/1000 (Prepro Tech, Londres, Reino Unido). El anticuerpo secundario fue IgG anti ratón de cabra (H+L) acoplado a fosfatasa alcalina (SBA, Birmingham, EE. UU.) y se usó a una dilución de 1/1000. Se reveló la actividad enzimática con sustrato NBT/BCIP (Boehringer Mannheim, GmbH, Alemania). La figura 8 muestra la detección de mIL10 en el sobrenadante de diferentes cepas de INV S.c.1 de Saccharomyces cerevisiae por transferencia Western después de 24 horas de crecimiento en YPD. Cambiando el sitio de glucosilación de mIL10 de Saccharomyces 11

30 NCT-13 a 11-SCT-13 (como en hIL10), se pudo eliminar la hiperglucosilación de mIL10 por Saccharomyces. La retirada del primer sitio de glucosilación potencial (11-SCT-13) fue suficiente para evitar la glucosilación de mIL10. La retirada del segundo sitio de glucosilación 116-NKS-118 a 116-QKS-118 no proporcionó ningún beneficio. En experimentos de estudio en animales, se usaron la forma de mIL10 natural y la forma mIL10ng1S donde el primer sitio de glucosilación potencial está humanizado a 11-SCT-13.

35 Ejemplo 4: Tratamiento de colitis de DSS crónica con S. cerevisiae viva que secreta mIL10ng1 S de forma inducida por plásmido

Se evaluó la eficacia terapéutica de cepas de Saccharomyces cerevisiae que secretan mIL10 para el tratamiento de colitis crónica en el modelo de ratón inducido por dextranosulfato de sodio (DSS).

Se indujo colitis crónica a los ratones por DSS como se describe .(Okayasu et al., 1990; Kojouharoff et al., 1997) El

40 tratamiento diario durante 14 días con 2 x 108 CFU de transformantes de INV Sc1 de Saccharomyces cerevisiae que secretan la forma no glucosilada de mIL10 (n = 10; S.c. mIL10ng1S) dio como resultado una puntuación histológica menor significativa del colon distal en comparación con los grupos tratados con vector de control de Saccharomyces cerevisiae (n = 10) y con prueba (n = 10) (figura 9). La eficacia del tratamiento de S.c. mIL10ng1S contra colitis de DSS crónica establecida era comparable con la observada con el tratamiento diario durante 14 días con 2 x 109 CFU

45 de L. lactis que secreta mIL10 (n = 10; LL-mIL10; figura 9). La forma no glucosilada de mIL10 (mIL10ng1S) que se secretó por Saccharomyces cerevisiae obtuvo mejores resultados que la forma glucosilada con respecto a la eficacia terapéutica (figura 9).

Ejemplo 5: Construcción de una cepa de Saccharomyces cerevisiae que secreta mIL10ng1S contenida biológicamente modificada genéticamente (MG)

50 Para lograr una secreción estable de una proteína terapéutica por Saccharomyces cerevisiae, es importante que el casete de expresión de proteína está integrado genómicamente. Bajo circunstancias no selectivas, Saccharomyces cerevisiae perderá rápidamente su plásmido que expresa el gen terapéutico incriminatorio y no esencial y el ADN del gen recombinante se extenderá a la naturaleza, lo que es altamente indeseable. También es importante crear una cepa de Saccharomyces cerevisiae MG que esté contenida biológicamente y, por tanto, que no pueda sobrevivir en

55 el entorno. Por lo tanto, se usó una cepa de laboratorio haploide estéril (ste) que es auxótrofa (Botstein et al., 1979). Las cepas de levadura auxótrofas sólo pueden sobrevivir en medio rico. En medio mínimo o en el entorno, estas cepas de levadura sufren una detención en el crecimiento después de lo cual mueren. Una cepa de levadura auxótrofa, haploide, que también es estéril (ste) no puede transferir el ADN del gen terapéutico a otra cepa de levadura. Se usó la cepa VC5 de Meyen ex E.C. Hansen de Saccharomyces cerevisiae haploide y estéril (MATa, ste) (Mackay et al., 1974a; Mackay et al., 1974b) para secretar mIL10. El gen URA3 esencial y el promotor se

5 intercambiarán por recombinación homóloga por el gen mIL10ng1S, precedido de un promotor TPI fuerte y constitutivo (figura 10).

Se sustituyó el gen orotidin-5'fosfato (OMP) descarboxilasa (URA3) completo (figura 11) que incluye el promotor URA3 por el promotor TPI constitutivo y fuerte, seguido del fragmento de ADN ppMF-mIL10ng1S. En el fragmento de ADN ppMF-mIL10ng1S, el primer sitio de glucosilación está humanizado, lo que elude el problema de

10 hiperglucosilación por Saccharomyces cerevisiae, y se fusiona en marco a la señal de secreción de ppMF

Por la sustitución de PURA3-URA3 por PTPI-ppMF-mIL10ng1S, se creó una cepa auxótrofa ura3. En ausencia de uracilo, esta cepa sufre una detención en el crecimiento y muere. El genoma de Saccharomyces cerevisiae está completamente secuenciado y hecho público (Dietrich et al., 1997). En base a la secuencia de ADN de la región URA3 se desarrollaron oligos (oligo 1 = 5'URA3P-TPI-S,

y oligo 2 = mIL10-3'URA3-AS,

CTAATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTTTAGCTTTTCATTTTG ATCATCATGTATGC en la figura 10A) que permitieron la amplificación del casete de expresión PTPI-ppMF-hIL10 con la adición en el extremo del cebador 5' y 3' del producto de PCR de respectivamente 50 nucleótidos (nt) de las regiones 20 flanqueantes 5' y 3' de PURA3-URA3 (10B). Se introdujo este fragmento de PCR en células de VC5 de Saccharomyces cerevisiae hechas competentes con LiOAc/PEG (Schiestl et al., 1989; Gietz et al., 2001). Las regiones homólogas de 50 nt del fragmento de PCR con la región PURA3-URA3 permiten la recombinación homóloga y la sustitución del fragmento PURA3-URA3 con el casete de expresión PTPI-ppMF-hIL10. Plaqueando las levaduras en medio mínimo que contiene ácido 5-fluoroorótico (5-FO), sólo pueden sobrevivir las levaduras que han sustituido 25 PURA3-URA3 por PTPI-ppMF-mIL10ng1S (URA3 transforma 5-FO a 5-fluorouracilo tóxico). Se investigaron adicionalmente las colonias por cribado de PCR en presencia de PTPI-ppMF-mIL10ng1S (oligo 5-6 y oligo 7-8; figura 10C) y en ausencia de PURA3-URA3 (oligo3-4 op 10B) (Oligo 3 = URA3-S, TGCTGCTACTCATCCTAGTC; oligo 4 = URA3-AS, TCATCTCTTCCACCCATGTC; oligo 5 = 5'URA3 flanqueante-S, ATTGAGGGCGGATTACTACC; oligo 6 = mIL10AS, AG-GAGTCGGTTAGCAGTATG; oligo 7 = mIL10-S, GCAGTGGAGCAGGTGAAGAG; oligo 8= 3'URA3

30 flanqueante-AS, CG-GTTGTTCCGTTTGACTTG).

Se verificó la ausencia de crecimiento de la cepa VC5 ste ura3-mIL 10+ de Saccharomyces cerevisiae construida en medio mínimo sin uracilo usando un turbidímetro automatizado (Bioscreen). El crecimiento fue normal en medio rico.

Se inocularon una colonia de cepas Saccharomyces de VC5 ste ura3-mIL10ng1S+ de Saccharomyces cerevisiae y el vector de control de VC5 ste ura3-de Saccharomyces cerevisiae en 50 ml de YPD. Después de 24 horas de 35 crecimiento aeróbico a 30ºC, se sedimentaron las células por centrifugación (5 minutos a 2500 tmp) y se resuspendieron en medio YPD recién preparado. Después de otras 24 horas, se tomaron muestras del sobrenadante para la cuantificación y caracterización de mIL10. Durante las 48 horas de crecimiento, el pH del sobrenadante de Saccharomyces cerevisiae permaneció estable a pH 7. Se extrajeron proteínas del sobrenadante de cultivo por precipitación de TCA y posteriormente se disolvieron en tampón de muestra de Laemmli (Laemmli 1970). Se 40 separaron fracciones de proteína por SDS-PAGE y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (Burnette 1981). Se detectó la interleucina-10 murina con una IL-10 anti murina de conejo policlonal como anticuerpo principal a una dilución de 1/1000 (Prepro Tech, Londres, Reino Unido). Como anticuerpo secundario se usó IgG anti conejo de cabra (H+L) acoplada a fosfatasa alcalina (SBA, Birmingham, EE. UU.), a una dilución de 1/1000. Se reveló la actividad enzimática con sustrato NBT/BCIP (Boehringer Mannheim, GmbH,

45 Alemania).

La figura 12 muestra la detección de mIL10 en el sobrenadante de los clones VC5 ura3 ste mIL10ng1S de Saccharomyces cerevisiae. Se usó MG1363[pT1mIL10] de L. lactis como control positivo. A partir de la figura se puede concluir que los clones de VC5 ura3 ste mIL10ng1S de Saccharomyces cerevisiae contenidos biológicamente MG construidos secretan eficazmente mIL10 en el sobrenadante y se pueden usar para la producción de IL-10 in

50 vivo y el tratamiento de EII.

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15 <170> Patent In versión 3.3

<210> 1 <211>21

<212> ADN 20 <213> Artificial

<220>

<223> Oligo ml L 10 S

25 <400> 1 cagt acagcc gggaagacaa t 21

<210>2

<211> 25 30 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo ml L10 AS 35

<400> 2 gcact agtt a gcttttcatttt gat 25

5: <210>3 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligo Spel -TPI -S

10: <400> 3 gcact agt at ccgagattat atct aggaac ccat cagg 38

15: <210>4 <211>31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligo ppMF-medio-AS

20: <400> 4 ct t ct aaat ctgagtaaccg atgacagctt c 31

25: <210>5 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> Oligo ppMF-inicio-S <400> 5 atgagatttc cttcaatttt tactgcag 28

35: <210>6 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligo ml L10-EcoRl -medio-AS

5: <400> 6 cagggaat t caaatgctccttgatttctgg 30

10: <210>7 <211> 157 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 7

<210>8

<211> 72

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo 5' URA3P-TPI-S

<400> 8

<210>9

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ml L10-3' URA3-AS

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> URA3-S

<400> 10 tgctgctact catcctagtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> URA3-AS

5: <400> 11 tcatctcttc cacccat gt c 20

10: <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> 5' URA3 flanqueante-S

15: <400> 12 attgagggcg gat t act acc 20

20: <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> ml L10AS <400> 13 aggagt cggt t agcagt at g 20

30: <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> ml L10-S

<400> 14

gcagtggagc aggtgaagag 20

<210> 15

<211> 20 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> 3' URA3 flanqueante-AS 10

<400> 15 cggttgttcc gtttgacttg 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una cepa de levadura recombinante que produce un compuesto antiinflamatorio y/o una cepa de levadura que produce un antagonista de citocinas para la preparación de un medicamento para tratar la inflamación de la mucosa, en el que dicho compuesto antiinflamatorio o antagonista de citocinas se muta para

5 evitar o limitar la glucosilación.
2.

El uso de una levadura recombinante según la reivindicación 1, en el que dicha inflamación de la mucosa es una enfermedad intestinal inflamatoria.
3.

El uso de una cepa de levadura recombinante según la reivindicación 1 o 2, en el que el compuesto antiinflamatorio o antagonista de citocinas se selecciona de la lista que consiste en IL-10, un factor trébol tal

10 como TFF1, TFF2 o TFF3, un antagonista de TNF tal como el receptor de TNF soluble, INCA, ABIN, un antagonista de IL-12, un antagonista de interferón-γ, un antagonista de IL-1 y un análogo de citocina codificado por virus tal como EBV BCRF1.
4. El uso de una levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto antiinflamatorio es IL-10 no glucosilada.

15 5. El uso de una cepa de levadura recombinante de según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa de levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp. Schizzosaccharomyces sp. Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Monascus sp., Geotrichum sp y Yarrowia sp.
6. Uso de una cepa de levadura recombinante según la reivindicación 5, en el que la Saccaromyces sp es 20 Saccharomyces cerevisiae.
7.

Uso de una cepa de levadura recombinante según la reivindicación 6, en el que la cepa de levadura recombinante es la subespecie de Saccharomyces cerevisiae boulardii.
8.

Uso de una cepa de levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad intestinal inflamatoria es una colitis crónica, enfermedad de Crohn o una colitis ulcerosa.