CN114480455B

CN114480455B - 一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用

Info

Publication number: CN114480455B
Application number: CN202210039938.9A
Authority: CN
Inventors: 胡杨波; 何丽娜; 陈士云; 唐薇
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2042-01-13
Also published as: CN114480455A

Abstract

本发明公开了一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用，该基因片段是由FtsP信号肽序列及位于其后的尿酸氧化酶编码基因组成。它能有效增强尿酸氧化酶活性，使其显示出高效降解功能。以上述功能基因为基础，将其引入大肠杆菌EcN基因组表达，构建并获得稳定表达尿酸氧化酶的工程菌株EcN C6，在体内和体外模型中均验证了其具备高效降尿酸的能力，从肠道微生态角度为治疗高尿酸血症提供新思路，拓宽了益生性大肠杆菌EcN在代谢疾病中的应用价值。

Description

一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用

技术领域

本发明涉及微生物合成生物学领域，具体地指一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用。

背景技术

尿酸是嘌呤代谢途径中的关键产物，嘌呤降解到尿酸生成的途径在生物界中高度保守。大多数哺乳动物在肝脏表达尿酸氧化酶，可将尿酸进一步水解为可溶性较高，更易排泄的尿囊素。而高等灵长类动物体内编码尿酸氧化酶的基因则在长期进化过程中失活，因此高等灵长类动物体内尿酸浓度远高于其他哺乳动物水平。

高尿酸血症是机体嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或肾脏排泄功能障碍，导致尿酸在血液中积累的代谢性疾病，当血尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度，则诱发尿酸盐晶体沉积在局部关节处引起风湿性关节炎，即痛风。根据2021年中国高尿酸及痛风趋势白皮书统计，中国高尿酸血症整体发病率达到13.3％，约1.77亿人，痛风患者约1.1％，类似的，痛风病比例在美国达到3.9％，在欧洲达到4.75％，澳大利亚达部分地区达到3.8％，且痛风病的流行率和发生率在世界范围内正在升高，发达国家高于发展中国家，已成为继高血糖、高血压、高血脂之后的“第四高”代谢性疾病，且诸多证据表明高尿酸血症与高血压，糖尿病，代谢综合症密切相关，甚至会加速肾脏疾病及心血管疾病的发生。

肾脏和肠道主要负责尿酸的排泄，尿酸排泄的减少是造成高尿酸血症发展成痛风病的主要原因。人体内大约2/3的尿酸由肾脏负责代谢，其余1/3由肠道微生物清除，又称作尿酸降解过程。一些肠道有机体可将嘌呤作为氮源使用，如酵母，枯草芽孢杆菌，肺炎克雷伯等菌，都有依赖氧的尿酸分解代谢途径，可以将尿酸降解为氨。近年来随着高尿酸血症致病机理的深入研究，揭示了肠道微生物在高尿酸高血症发生发展中起到关键作用，肠道不仅是尿酸的重要合成池，更尿酸的降解池。研究表明，血清中尿酸水平与肠道中尿酸水平呈现明显正相关，降低肠道中尿酸水平可有效缓解高尿酸血症。

目前针对痛风的治疗药物主要还是靶向肾脏和肝脏，通过抑制黄嘌呤氧化酶减少体内尿酸的生成，例如别嘌呤醇和非布索坦；或促进尿酸随尿液排泄，减少肾小管重吸收，例如丙磺舒等；但这些药物还存在较大的副作用，且仅限于少部分痛风患者使用，对于占据大比例的无症状高尿酸血症人群依然无法周顾，因此目前依旧缺乏一套安全的另辟蹊径的降尿酸方式。在此背景下，针对高尿酸血症的生物疗法应运而生，外源引入有活性的尿酸氧化酶，成为了治疗高尿酸血症的新思路。临床数据表明，培戈洛酶，拉布立酶，普瑞凯希等改造后的尿酸氧化酶，以注射的方式在治疗顽固性痛风疾病方面表现卓越，但是蛋白所造成的严重过敏反应和注射反应是限制其使用的根本因素，被FDA给与黑框警告，因此，针对尿酸氧化酶生物疗法的递送方式还存在较大的挑战。近年来，随着肠道微生物在尿酸降解过程中发挥作用的深入研究，有研究发现通过口服尿酸氧化酶的方式就可降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸值(SUA)，且此类递送方式较注射更为安全，但如此治疗方式需要大量的尿酸氧化酶蛋白，成本较高，且尿酸氧化酶在肠道复杂微生态中发挥功能并未达到最大化，因此如何在肠道环境递送尿酸氧化酶依旧有待解决。

肠道益生菌，以大肠杆菌Nissle 1917(EcN)为代表，可作为生物大分子的“活工厂”，作为药用菌株已具备上百年应用历史，安全性较高且在肠道中具备良好定殖特性，使用益生菌递呈尿酸氧化酶可达利用活体治疗达到更好效果并降低治疗成本。前期有专利指出EcN本身存在尿酸氧化酶同源基因ygfT和aegA,具备尿酸降解活性，动物实验表明口服野生型EcN可轻微缓解高尿酸血症(中国专利CN 111778224)，其自身来源的同源酶降解尿酸效果甚微。目前，还未见关于改造肠道益生菌应用于降低尿酸水平的报道，已有专利(CN108103080)构建了一种重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列和表达载体，主要实现了大肠杆菌中高水平表达纯化尿酸氧化酶，而不能实现重组菌直接应用于降低血液尿酸水平。因此关于有效表达尿酸氧化酶实现降低血液尿酸水平的重组肠道益生菌还有待进一步研发。

发明内容

本发明的目的在于提高尿酸氧化酶在细菌中的表达效率，提供一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用，实现重组菌株体外和体内降解尿酸的能力，开发高尿酸血症新型治疗方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述基因片段是由FtsP信号肽序列及位于其后的尿酸氧化酶编码基因组成。

上述方案中，所述FtsP信号肽的氨基酸序列优选如SEQ.ID.NO:001所示。

上述方案中的酶为尿酸氧化酶(又名尿酸盐羟化酶、尿酸盐-NADH氧化酶)或其同源酶，且这些酶可以来源于不同物种，主要具有将尿酸代谢为更容易排泄的其他代谢产物的功能。本发明提供了三种不同来源的尿酸氧化酶：UA(SEQ.ID.NO:002)、UaZ(SEQ.ID.NO:003)、Uox(SEQ.ID.NO:004)，并提供其氨基酸序列。优选为假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA。

本发明还提供了一种整合有上述功能基因片段的重组菌株。

重组菌株在本发明中是肠道益生菌的改造，肠道益生菌的选择依据受试者种群中肠道益生菌定殖情况而定。常用的肠道益生菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等。本发明中，优选肠道益生性大肠杆菌Nissle 1917(EcN)。

优选地，重组大肠杆菌是通过将上述功能基因片段整合至大肠杆菌EcN基因组HIS-1位点(SEQ.ID.NO:005)获得。

具体地，本发明提供了一种降低血液尿酸水平的重组大肠杆菌，命名为肠道益生菌EcN C6，于2021年11月30日在中国典型培养物保藏中心(中国、武汉)保藏，其保藏编号为CCTCC NO.M 20211517。该重组大肠杆菌是在EcN基因组上绝缘位点HIS-1(SEQ.ID.NO:005)处整合了分泌信号肽FtsP融合的假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA,并使用人工优化启动子P6(SEQ.ID.NO:006)及强终止子rrnBT(SEQ.ID.NO:007)分别起始和终止转录。

上述重组大肠杆菌EcN C6在降低血液尿酸水平药物制备中的应用，其制剂的有效剂量为3×10¹⁰CFU菌数/天，或1×10¹⁰CFU菌数/3天。

制剂的剂型为口服或口部施与剂。

本发明的有益效果：

本发明通过分子生物学技术改造技术，提供了一种新的功能基因，能有效增强尿酸氧化酶活性，使其显示出高效降解功能。以上述功能基因为基础，将其引入大肠杆菌EcN基因组表达，构建并获得稳定表达尿酸氧化酶的工程菌株EcN C6，在体内和体外模型中均验证了其具备高效降尿酸的能力，从肠道微生态角度为治疗高尿酸血症提供新思路，拓宽了益生性大肠杆菌EcN在代谢疾病中的应用价值。

附图说明

图1为不同定位下质粒表达尿酸氧化酶的活性测试结果。

图2为FtsP信号肽定位下质粒表达不同尿酸氧化酶结果。

图3为EcN C6体外降解尿酸的酶活性测试结果。

图4为EcN C6在高尿酸血症大鼠体内降尿酸结果。

图5为EcN C6治疗高尿酸血症最小剂量测试结果。

图6为EcN C6在高尿酸大鼠体内定殖能力测试结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明实施例中所列尿酸代谢酶可以是尿酸氧化酶(又名尿酸盐羟化酶、尿酸盐-NADH氧化酶)。所述尿酸代谢酶可以来自动物、植物、微生物等不同来源，如：食蟹猴(Macacafascicularis)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、非洲爪蟾(Xenopustropicalis)、果蝇(Drosophila melanogaster)、绿藻(Chlamydomonasreinhardtii)、酵母菌(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、黏菌(Cavenderiafasciculata)、根瘤菌属(Neorhizobium)、游动放线菌(Actinoplanes)、芽孢杆菌(Bacillus beveridgei)、肺炎克雷伯(Klebsiellapneumoniae)、嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus)、链霉菌(Streptomyces davaonensis)等。在一些实施例中，优选假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA(SEQ.ID.NO:002)，黑曲霉来源的尿酸氧化酶UaZ(SEQ.ID.NO:003)，球形节杆菌来源的Uox(SEQ.ID.NO:004)。

本发明在肠道益生菌中表达尿酸代谢酶。在一些实施方式中，可以通过质粒将尿酸代谢酶编码基因导入到肠道益生菌，也可以通过基因工程技术(包括同源重组、基因编辑等)将尿酸代谢酶编码基因整合到肠道益生菌基因组中，为了实现外源基因在基因组上稳定表达，本发明优选在EcN基因组HIS-1位点(SEQ.ID.NO:005)插入外源基因元件。

本发明采用不同定位信号肽带动尿酸氧化酶分泌表达，在一些实施例中，包括大肠杆菌Sec系统识别信号肽，TAT系统识别信号肽以及表面展示信号肽等，优选TAT分泌系统识别的FtsP信号肽(SEQ.ID.NO:001)。

本发明在肠道益生菌中表达尿酸代谢酶。在一些实施方式中，尿酸代谢酶基因前可由组成型启动子起始基因转录，启动子序列可以从肠道益生菌中进行随机筛选也可人工合成，优选人工合成强转录启动子P6，并提供其序列SEQ.ID.NO:006。也可由环境诱导型启动子起始基因转录，例如乳糖诱导型、阿拉伯糖诱导型、色氨酸诱导型等，优选tac启动子并提供其序列SEQ.ID.NO:005。

本发明用改造的肠道益生菌EcN C6降低尿酸水平，在一些实施方式中，改造肠道益生菌通过灌胃的方式进入受试者肠道。

实施例1：不同定位下质粒表达尿酸氧化酶的活性测试

本实施例中，我们克隆并优化了三种不同来源的尿酸氧化酶，并提供其序列特征，假丝酵母来源的UA(SEQ.ID.NO:002)，黑曲霉来源的UaZ(SEQ.ID.NO:003)，球形节杆菌来源的Uox(SEQ.ID.NO:004)。

首先在肠道益生菌大肠杆菌EcN中引入质粒表达假丝酵母来源UA进行体外尿酸降解测试，发现菌株胞内表达尿酸氧化酶并未展现出较强的酶活性(图1)，这一现象可能受尿酸进入菌体的量所限制，因此我们尝试给予UA不同分泌信号肽，试图分泌表达尿酸氧化酶以提高其酶活性。

本实施例中，UA表达质粒构建，以pKT100(Hu,Y.,et al.(2011)."Cra negativelyregulates acid survival in Yersinia pseudotuberculosis."FEMS MicrobiolLett317(2):190-195.)作为出发质粒，将Cm启动子替换为tac诱导型的启动子(SEQ.ID.NO:008)，将尿酸氧化酶UA编码基因前通过引入不同类型的分泌信号肽，并插入到tac诱导型启动子后，重组质粒转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆，获得重组质粒后通过电转仪(EppendorfElectroporator 2510)电转至EcN中，获得表达不同定位尿酸氧化酶的重组菌株。将不同重组菌株于37℃，LB卡那抗性液体(50μg/ml)中培养过夜，1:100比例转接至3ml新鲜LB抗性培养基，37℃培养到OD600～0.6，加入0.3mM IPTG，诱导表达3小时。5000rpm室温离心3min，收集菌体，用6ml MU培养基重悬菌体，每1小时取样，通过测定溶液中尿酸特异性吸收峰A293值的变化监测溶液中尿酸水平变化(Rouf,M.A.and R.F.Lomprey,Jr.(1968)."Degradation of uric acid by certain aerobic bacteria."J Bacteriol 96(3):617-622.)。最终从7种不同定位信号肽中，我们筛选出信号肽FtsP可以有效增强尿酸氧化酶UA活性，并提供其序列SEQ.ID.NO:001，体外实验表明FtsP-UA菌株可在1h内降解培养基种全部尿酸(图1)。

实施例中所使用的培养基和试剂：

基因合成及密码子优化(生工生物工程(上海)股份有限公司)

LB培养基：

在1L的蒸馏水中加入

蛋白胨：10g(OXOID货号LP0042)；

NaCl：10g(国药货号7647-14-5)；

酵母粉：5g(OXOID货号LP0021)；

121度高压灭菌20分钟。

卡那霉素Kan(安耐吉化学，货号25389-94-0)

IPTG(生工货号367-93-1)

One step recombination kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)

实施例2：FtsP信号肽定位下质粒表达不同尿酸氧化酶活性测试

本实施例中，为了测试信号肽FtsP增强尿酸氧化酶功能是否具备普适性，我们又将黑曲霉来源的UaZ，球形节杆菌来源的Uox序列引入该信号肽后，并使用一步重组法克隆至改造后的pKT100质粒，筛选阳性质粒转化至EcN，获得重组菌株。将不同重组菌株于37℃，LB卡那抗性液体(50μg/ml)中培养过夜，1：100比例转接至3ml新鲜LB抗性培养基，37℃培养到OD600～0.6，加入0.3mM IPTG,诱导表达3小时。5000rpm室温离心3min，收集菌体，用6mlMU培养基重悬菌体，每1小时取样，通过测定溶液中尿酸特异性吸收峰A293值的变化监测溶液中尿酸水平变化。结果显示FtsP融合的尿酸氧化酶显示出高效降解效果(图2)，说明信号肽FtsP对尿酸氧化酶所展现出的增强功效具备普适性。

实施例中所使用的培养基和试剂：

LB培养基与实施例1相同；

卡那霉素Kan(安耐吉化学，货号25389-94-0)

IPTG(生工货号367-93-1)

One step recombination kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)

MU尿酸缓冲液:

MgSO₄-7H₂O 0.2g(国药货号10034-99-8)

FeSO₄-7H₂O 0.0005g(国药货号7782-63-0)

MnSO₄ 0.02g(国药货号7785-87-7)

CaCl₂ 0.05g(国药货号10043-52-4)

K₂HPO₄ 2.5g(国药货号7758-11-4)

KH₂PO₄ 5g(国药货号7778-77-0)

溶于900ml蒸馏水，121度高压灭菌20分钟，加入过滤除菌的1％葡萄糖(国药货号50-99-7)和20mg/dL的尿酸(生工货号69-93-2)，10％KH₂PO₄(国药货号7778-77-0)调节尿酸PH至中性，最后加蒸馏水定容至1L。

实施例3：EcN C6体外降解尿酸的酶活性测试

本实施例中，通过将假丝酵母来源的UA编码基因整合至大肠杆菌EcN基因组HIS-1位点获得重组菌株EcN C6(保藏号：CCTCC NO.M20211517)。

具体操作过程如下：

1.构建携带温敏型pKD46质粒(Amp)的EcN菌株。将pKD46质粒(Datsenko,K.A.andB.L.Wanner(2000)."One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12 using PCR products."ProcNatlAcadSci U S A 97(12):6640-6645.)通过电转仪电转到EcN中，30℃培养，得到携带Amp抗性的EcN菌株。

2.pDM4-UAm构建。以pDM4自杀质粒(Milton,D.L.,R.O'Toole,P.Horstedt andH.Wolf-Watz(1996)."Flagellin A is essential for the virulence of Vibrioanguillarum."J Bacteriol 178(5):1310-1319.)出发载体，构建重组质粒pDM4-UAm质粒。(构建重组质粒的具体操作为本领域技术人员所熟识，不再赘述)。

3.EcN C6菌株构建。将pDM4-UAm质粒通过接合转移的方法导入到转化有pKD46质粒的EcN菌，涂布到Amp+Cm双抗LB平板，30℃培养过夜获得单交换菌株。单交换克隆通过划线至无盐LB+10％蔗糖平板，获得双交换突变体，42℃培养去除温敏型抗性质粒，命名为EcNC6。

获得重组菌株EcN C6后，将重组菌株与尿酸溶液共孵育，通过测定溶液中尿酸特异性吸收峰A293值的变化检测溶液中尿酸水平变化。EcN和EcN C6接种到LB培养基37℃培养5h，5000rpm室温离心3min，收集菌体，用6ml MU培养基重悬菌体，每1小时取样，测定A293值(Rouf and Lomprey 1968,Price and James 1988,Zhao,Yang et al.2008)。结果显示，改造菌株EcN C6可高效稳定的表达尿酸氧化酶，在1h内显著降低培养基中尿酸水平，体外证实重组肠道益生菌EcN C6具备高效的尿酸降解能力(图3)。

实施例中所使用的培养基和试剂：

LB培养基与实施例1相同；

MU尿酸缓冲液与实施例2相同；

氨苄Amp(上海源叶生物技术有限公司货号69-52-3)

氯霉素Cm(BIOBASICINC货号56-75-7)

蔗糖(国药货号57-50-1)

实施例4：EcN C6在高尿酸血症大鼠模型体内降尿酸测试

本实施例中，通过高嘌呤食物诱导SD大鼠高尿酸血症模型(Zhu,Y.,X.Peng andG.Ling(2017)."An update on the animal models in hyperuricaemia research."ClinExpRheumatol35(5):860-864.)将EcN C6通过灌胃的方式给菌，分别在不同时间点收集血样，通过监测血清中尿酸变化情况，评价EcN C6在大鼠模型中降低尿酸水平的能力。

大鼠高尿酸模型诱导。离乳后两周(约100g)的SPF级野生型SD(Sprague Dawley)大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0006】，室温维持25℃，动物自由饮水摄食适应一周，所有操作均通过中国科学院武汉病毒研究所实验动物伦理委员会审核(伦理号WIVA14201901)。实验组分三组，每组10只，通过喂食高嘌呤食物(大小鼠维持粉料+10％酵母粉+0.1％腺嘌呤)诱导三周,控制酵母粉和腺嘌呤每日进食量为10g/kg和100mg/kg，诱导形成稳定的大鼠高尿酸血症模型(Zhu,Y.,X.Peng and G.Ling(2017)."Anupdate on the animal models in hyperuricaemia research."ClinExpRheumatol35(5):860-864.)。对照组(Ctrl)10只饲喂正常饲料，自由饮水。三周后眼眶采血，采血前10h内撤销其食物供给，但不撤销水。3000rpm,10min，离心分离血清，尿酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，C012-2-1)检测血清尿酸值。数据显示，利用高嘌呤食物诱导SD大鼠三周可以形成稳定的高尿酸血症动物模型(图4)。

EcN C6给菌，监测大鼠尿酸水平。将培养到稳定期前期的EcN和EcN C6菌收集菌体，重悬在菌种制备buffer(Kurtz,C.B.,et al.(2019)."An engineered E.coli Nissleimproves hyperammonemia and survival in mice and shows dose-dependentexposure in healthy humans."SciTransl Med 11(475).)，1ml/管分装，直接冻于-80℃保存，待用时取出。实验组分别灌胃给予同等剂量的buffer(PBS组)、EcN(3×10¹⁰CFU/天/只)(EcN WT组)、EcN C6(3×10¹⁰CFU/天/只)(EcN C6组)；对照组不做任何处理。在给菌后的三天、七天、十四天、二十一天分别进行眼眶采血，用尿酸(UA)检测试剂盒测定各组大鼠血清尿酸值发现，相比于PBS组及EcN组，EcN C6组自给菌后三天开始,大鼠血清尿酸值呈现显著下降，并稳定在正常水平，表明EcN C6在高尿酸血症动物模型体内也同样具备高效降尿酸效果(图4)。

实施例中所使用的培养基和试剂：

LB培养基与实施例1相同；

高嘌呤食物成分：

大小鼠维持粉料(中粮粮油工业有限公司，210002145)

酵母粉10％(OXOID LP0021)

腺嘌呤1％(BioFROXX 73-24-5)

121度高压灭菌20分钟。

菌种制备buffer:Mops 10mM(生工71119-22-7)，海藻糖二水5％(生工6138-23-4)，甘油15％(国药56-81-5)。

尿酸(UA)测试盒(南京建成生物工程研究所，C012-2-1)

实施例5：EcN C6治疗高尿酸血症最小剂量测试

本实施例中，采用实施例4中的方式诱导了高尿酸血症的大鼠模型，为了探索EcNC6发挥功效的最小剂量，我们将诱导成功的大鼠分成了如下三组进行测试：高剂量(10¹¹CFU)只给一次菌，低剂量(10¹⁰CFU)一周一次给菌，低剂量(10¹⁰CFU)一周二次给菌，在不同时间点取血检测血清尿酸值变化。结果显示无论是高剂量给菌还是低剂量给菌，在治疗三天后，血清中尿酸值都有明显的下降，说明治疗后的短时间内，EcN C6可以快速缓解高尿酸血症；给菌七天后比较各组的尿酸水平，发现未及时补充EcN C6会导致血清尿酸值回升，而一周两次给菌组则稳定在正常水平，给菌后十四天及二十一天的结果类似(图5)，说明EcN C6的剂量保证在一周两次施用10¹⁰CFU菌量可稳定发挥功能。

实施例中所使用的培养基和试剂与实施例4相同。

实施例6：EcN C6在高尿酸血症大鼠体内定殖能力测试

本实施例中，为了量化EcN C6在高尿酸血症大鼠体内的定殖水平，在实施例6中EcN C6治疗的基础上，连续收集了大鼠给菌后一周的粪便，提取了粪便中的宏基因组，使用EcN特异性基因fimA作为检测对象，qPCR方法检测10ng DNA中fimA的拷贝数，拷贝数计算是基于定量的EcN C6基因组拷贝数10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰制作的标准曲线。结果证明，高剂量给菌组比低剂量给菌组确实多检测出一个数量级的差异，且无论高剂量还是低剂量给菌，在2天后均检测低于10²拷贝数，说明EcN C6在高尿酸血症大鼠体内的高剂量定殖不超过两天(图6)，这一结果也与实施例6中EcN C6发挥功效的剂量结果对应。

实施例中所使用的培养基和试剂：

粪便提取试剂盒(OMEGA stool kit试剂盒货号D4015-02)

AceQqPCR SYBR Green Master Mix(诺唯赞货号Q111-02)

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用

<130> N2022-0001

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Leu Ser Arg Arg Gln Phe Ile Gln Ala Ser Gly Ile Ala Leu

1 5 10 15

Cys Ala Gly Ala Val Pro Leu Lys Ala Ser Ala Ala Gly Gln

20 25 30

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> 假丝酵母(Candida)

<400> 2

Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val

20 25 30

Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser

35 40 45

Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys

50 55 60

Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu

65 70 75 80

Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His

85 90 95

Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr

100 105 110

Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly

115 120 125

Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys

130 135 140

Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser

145 150 155 160

Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr

165 170 175

Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp

180 185 190

Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys

195 200 205

Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr

210 215 220

Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn

225 230 235 240

Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser

245 250 255

Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys

260 265 270

Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn

275 280 285

Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu

290 295 300

<210> 3

<211> 309

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

Met Gly His His His His His His Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr

1 5 10 15

Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr

20 25 30

Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly

35 40 45

Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala

50 55 60

Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro

65 70 75 80

Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile

85 90 95

Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His

100 105 110

Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe

115 120 125

Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu

130 135 140

Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr

165 170 175

Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala

180 185 190

Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His

195 200 205

Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu

210 215 220

Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr

225 230 235 240

Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val

245 250 255

Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp

260 265 270

His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro

275 280 285

Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser

290 295 300

Met Lys Ser Lys Leu

305

<210> 4

<211> 302

<212> PRT

<213> 球形节杆菌(Arthrobacter)

<400> 4

Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg

20 25 30

Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu

35 40 45

Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val

50 55 60

Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp

65 70 75 80

Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe

85 90 95

Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln

100 105 110

Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn

115 120 125

Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln

130 135 140

Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly

145 150 155 160

Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu

165 170 175

Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr

180 185 190

Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly

195 200 205

Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln

210 215 220

Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp

245 250 255

Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala

260 265 270

Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser

275 280 285

Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys

290 295 300

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

ttgccagaat aagtctcccg ccctgcccgg agccatccct gcagggcttt ttaatgcaat 60

aaaaaagccg ccaggtttga ccccggcggc taagcaatta caggtgaatc ttacttcttc 120

<210> 6

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttga caattaatca tcggctccta 60

gcatgtgtgc aatttcacac aagaaggaga tcacat 96

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttat 47

<210> 8

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttga caattaatca tcggctcgta 60

taatgtgtgt aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag aaggagatca gct 113

Claims

1.一种降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述基因片段是由FtsP信号肽序列及位于其后的尿酸氧化酶编码基因组成；所述信号肽FtsP的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述尿酸氧化酶选自假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA，黑曲霉来源的尿酸氧化酶UaZ或球形节杆菌来源的尿酸氧化酶Uox。

2.根据权利要求1所述的降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种整合有权利要求1所述功能基因片段的重组菌株。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌或嗜热链球菌。

5.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，通过将权利要求1所述功能基因片段整合至大肠杆菌EcN基因组HIS-1位点获得。

6.一种降低血液尿酸水平的重组大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC NO. M 20211517。

7.权利要求6所述重组大肠杆菌在制备降低血液尿酸水平的药物中的应用，其制剂的有效剂量为3×10¹⁰CFU菌数/天，或1×10¹⁰CFU菌数/3天。