CN116179452A - 一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过基因工程的手段对E.coli Nissle1917(EcN 1917)菌株进行改造，筛选不同启动子条件下精氨酸酶的表达情况，构建出能够有效表达精氨酸酶的大肠杆菌工程益生菌。该益生菌可定殖在肠道中并降解肠道被消化食物中的精氨酸，动物实验证实精氨酸酶缺乏症小鼠口服该菌株后血液中精氨酸浓度显著降低，因此有潜力开发成用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌，具有重要的临床治疗价值和社会效益。

Description

一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
精氨酸酶缺乏症(Argininemia，ARG)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。精氨酸酶1(Arginase-1，ARG1)在肝细胞中表达量最高，能够催化精氨酸水解为鸟氨酸和尿素，后者在血液中被运输到肾脏并在尿液中排出，而鸟氨酸被循环利用以继续进行进一步的尿素生产。ARG1编码基因的位点突变导致ARG1功能的部分或全部丧失，血液及脑脊液中精氨酸及其代谢产物累积。ARG1缺陷患者表现出高精氨酸血症，伴有痉挛性下肢轻瘫、进行性神经和智力障碍、持续性生长迟缓和罕见的高氨血症。
目前针对ARG患者的临床疗法分别为：(1)限制天然蛋白质的摄取，采取低精氨酸的饮食策略；(2)药物治疗包括苯甲酸钠、苯丁酸钠及卡谷氨酸等口服药物，主要作用为促进氨的排泄，控制高氨血症；(3)酶替代疗法，利用聚乙二醇精氨酸酶，促进精氨酸代谢，降低血液中精氨酸的含量；(4)肝移植，即对患者进行肝移植手术治疗，显著提高精氨酸水平。此疗法是目前最具针对性及有效的治疗方法；(5)对症治疗，根据患者的症状针对性的进行物理或药物治疗。
益生菌是定殖在人体内，通过调节肠道内菌群或调节宿主免疫系统功能，从而产生有利于健康作用的活性微生物。大肠杆菌属Escherichia coli Nissle 1917(EcN 1917)是目前广泛应用的一种益生菌，可长期稳定的定殖在人体肠道中。与常规的大肠杆菌相比，EcN可用于治疗炎症性肠病，防止新生儿消化道内病原菌定殖以及免疫调节作用等。目前已有研究将EcN菌株进行基因改造用于小鼠模型中苯丙酮尿症(PKU)、免疫源性疾病等的治疗中。
研究表明人体内存在着氨基酸肠道循环系统，即进入肠道的胰腺及其他腺体分泌物中包含大量的蛋白质、酶和多肽，胰蛋白酶可将上述物质分解成氨基酸后通过肠道重新吸收回体内，这在身体其他部位和肠道之间形成一个大的氨基酸循环系统。根据氨基酸肠道循环理论，可通过减少肠道中的特定氨基酸的含量从而降低体内氨基酸的含量。
发明内容
本发明提供一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用。本发明通过基因工程的手段对E.coli Nissle 1917(EcN 1917)菌株进行改造，筛选不同乏氧启动子条件下精氨酸酶的表达情况，构建出能够有效表达精氨酸酶的大肠杆菌工程益生菌。该益生菌可定殖在肠道中并降解肠道被消化食物中的精氨酸，动物实验证实精氨酸酶缺乏症小鼠口服该菌株后血液中精氨酸浓度显著降低，因此有潜力开发成用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种工程益生菌，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合厌氧启动子和外源精氨酸酶编码基因。
其中，所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌EcN 1917的衍生菌；
其中，所述外源精氨酸酶编码基因具体为argI，来源于Bacillus subtilis168菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述厌氧型启动子，其可以选自如下任意一种：
厌氧型启动子PfnrS，来源于E.coli菌rRNA FnrS编码基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
厌氧型启动子PnirB，来源于E.coli菌亚硝酸还原酶编码基因nirB的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
厌氧型启动子PadhE，来源于E.coli菌乙醇脱氢酶编码基因adhE的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
厌氧型启动子Pvgb，来源于Vitreoscilla菌血红蛋白编码基因vgb的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明经研发意外发现，不同来源启动子对精氨酸酶的表达情况影响甚大，其中厌氧型启动子PfnrS与精氨酸酶编码基因argI配合最终获得的工程益生菌(在本发明中命名为EcN AR11)其具有最佳的降解精氨酸能力。
本发明的第二个方面，提供上述工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：将上述启动子和外源精氨酸酶编码基因导入大肠杆菌中获得。
本发明的第三个方面，提供上述工程益生菌在降解精氨酸中的应用。
经试验证明，本发明的上述工程益生菌在欠氧(如氧气受限的肠道)环境中仍能表现出优异的降解精氨酸性能，因此可作为精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的治疗药物。
因此，本发明的第四个方面，提供一种药物，所述药物其活性成分包括上述工程益生菌。所述药物可用于治疗因精氨酸及其代谢产物累积引发的相关疾病(如高氨血症等)。
其中，所述药物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的第五个方面，提供一种治疗精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的上述工程益生菌和/或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
(1)本发明首次构建在肠道中能够降解精氨酸的工程益生菌，有效降解肠道中的精氨酸，降低患者体内的精氨酸含量，可用于治疗精氨酸酶缺乏症。
(2)本发明提供的工程益生菌，有助于治疗精氨酸酶缺乏症，可通过口服给药，提高患者生活质量，具有重要的临床治疗价值和社会效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中实施例2中不同工程益生菌处理后样品上清中精氨酸浓度分析图；
图2为本发明中实施例3中不同处理条件下Arg KO小鼠血清中精氨酸浓度分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种工程益生菌，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合启动子和外源精氨酸酶编码基因。
其中，所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌EcN 1917的衍生菌；
其中，所述外源精氨酸酶编码基因具体为argI，来源于Bacillus subtilis168菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述启动子为厌氧型启动子，其可以选自如下任意一种：
厌氧型启动子PfnrS，来源于E.coli菌rRNA FnrS编码基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
厌氧型启动子PnirB，来源于E.coli菌亚硝酸还原酶编码基因nirB的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
厌氧型启动子PadhE，来源于E.coli菌乙醇脱氢酶编码基因adhE的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
厌氧型启动子Pvgb，来源于Vitreoscilla菌血红蛋白编码基因vgb的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明经研发意外发现，不同来源启动子对精氨酸酶的表达情况影响甚大，其中厌氧型启动子PfnrS与精氨酸酶编码基因argI配合最终获得的工程益生菌(在本发明中命名为EcN AR11)其具有最佳的降解精氨酸能力。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：将上述启动子和外源精氨酸酶编码基因导入大肠杆菌中获得。
具体的，所述构建方法包括：
S1、将精氨酸酶编码基因argI基因置于厌氧型启动子下游，获得启动子连接的ArgI的表达序列；
S2、EcN 1917为底盘菌，通过Crisper-Cas9的基因编辑手段将步骤S1制得的基因片段整合到基因组上。
更具体的，以EcN AR11为例，所述构建方法包括：
(1)通过序列合成的方式分别获得PfnrS启动子和argI基因的融合片段Arg，连接到载体上，获得质粒pArg；
(2)以EcN 1917基因组为模板，L-F/L-R为引物PCR扩增获得上游同源臂L-arm，R-F/R-R为引物PCR扩增获得下游同源臂R-arm；利用pArg质粒为模板，Arg-F和Arg-R为引物，PCR扩增获得Arg片段；最后以L-F和R-R为引物，利用融合PCR的方法获得L-arm+Arg+R-arm片段；根据插入位点设计sgRNA序列，利用pTargetF为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，PCR扩增获得TargetF-Arg片段，自连后获得质粒pTargetF-Arg；
(3)通过电转化将pCas9质粒转入EcN 1917菌株中，获得转化子；阿拉伯糖诱导后制备上述菌株的感受态细胞；将pTargetF-Arg和L-arm+Arg+R-arm片段同时加入感受态细胞中进行电转，筛选转化子，利用引物L-F/R-R对转化子进行验证，获得Arg片段插入的EcN菌株；随后依次通过IPTG诱导消除pTargretF质粒，加热培养条件下消除pCas9质粒，获得EcN AR11菌株。
其中，所述步骤(1)中，选用载体为pMD-18T；
所述步骤(2)中，选用引物序列如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.13所示。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述工程益生菌在降解精氨酸或制备降解精氨酸产品中的应用。
经试验证明，本发明的上述工程益生菌在欠氧(如氧气受限的肠道)环境中仍能表现出优异的降解精氨酸性能，因此可作为精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的治疗药物。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物，所述药物其活性成分包括上述工程益生菌。所述药物可用于治疗因精氨酸及其代谢产物累积引发的相关疾病(如高氨血症等)。所述EcN工程益生菌在胃肠道可以将被消化食物中精氨酸降解，减少肠循环中的精氨酸含量，进而降低器官及血液中的精氨酸水平。
其中，所述药物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。同时，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。经本发明精氨酸酶缺乏症小鼠小鼠实验证明，采用口服灌胃方式施用，可快速有效地降解小鼠体内精氨酸。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的上述工程益生菌和/或药物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明工程益生菌或药物的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1工程菌株EcN AR11、AR12、AR13以及AR14的构建
本实施例中全基因合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成。分子生物学实验包括感受态细胞制备、转化等参照《分子克隆实验指南》(第三版)进行。
EcN 1917为底盘菌，通过Crisper-Cas9的基因编辑手段将上述片段整合到基因组上，从而获得表达精氨酸酶的工程菌株AR11。包括如下步骤：
(1)通过序列合成的方式分别获得PfnrS启动子和argI基因的融合片段Arg，连接到载体pMD-18T，获得质粒pArg。
(2)以EcN 1917基因组为模板，L-F/L-R为引物PCR扩增获得上游同源臂L-arm，R-F/R-R为引物PCR扩增获得下游同源臂R-arm；利用pArg质粒为模板，Arg-F和Arg-R为引物，PCR扩增获得Arg片段；最后以L-F和R-R为引物，利用融合PCR的方法获得L-arm+Arg+R-arm片段。根据插入位点设计sgRNA序列，利用pTargetF为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，PCR扩增获得TargetF-Arg片段，自连后获得质粒pTargetF-Arg。具体引物序列见表1。
(3)通过电转化将pCas9质粒转入EcN 1917菌株中，获得转化子。阿拉伯糖诱导后制备上述菌株的感受态细胞。将pTargetF-Arg和L-arm+Arg+R-arm片段同时加入感受态细胞中进行电转，卡那霉素/壮观霉素筛选转化子，利用引物L-F/R-R对转化子进行验证，获得Arg片段插入的EcN菌株。随后依次通过IPTG诱导消除pTargretF质粒，42℃培养条件下消除pCas9质粒，最终获得EcN AR11菌株。
(4)通过同样的方法合技术手段获得EcN AR12菌株(插入位点相同，插入片段为PnirB启动子和argI基因的融合片段)；EcN AR13菌株(插入位点相同，插入片段为PadhE启动子和argI基因的融合片段)；EcN AR14菌株(插入位点相同，插入片段为Pvgb启动子和argI基因的融合片段)。
表1引物列表
Figure BDA0003739549990000101
实施例2体外条件下EcN AR11、AR12、AR13以及AR14对精氨酸的降解能力分析
将EcN 1917和EcN AR11、AR12、AR13以及AR14菌株分别接种于Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃、200rpm低氧条件下培养至OD600＝1.0，离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤2次。再定量转接到添加1mM精氨酸的低浓度LB培养基(含1/10LB培养基的营养成分)，37℃、200rpm低氧条件下培养4h，每隔1h取样，离心收集上清，HPLC方法检测上清中精氨酸的浓度。每个处理做3个重复，检测结果如图1所示，AR11菌株处理样品中精氨酸浓度显著低于EcN 1917、AR12、AR13及AR14处理样品，表明AR11菌株在低氧条件下具有较好的降解精氨酸能力。
实施例3工程益生菌EcN AR11有效降低精氨酸酶缺乏症小鼠血清中精氨酸含量
Arg1flox小鼠与UBC-Cre-ERT2小鼠均购自生物技术公司。利用Arg1flox小鼠与UBC-Cre-ERT2小鼠进行交配获得条件性敲除小鼠(Arg1flox UBC-Cre-ERT2)。小鼠长至10周后，通过腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen)诱导体内arg1基因的部分缺失，以获得精氨酸酶缺乏的小鼠(Arg KO)。他莫昔芬注射开始2周后，将小鼠分成3组，每天定时灌胃2次，分别灌胃200μL生理盐水、EcN 1917或EcN AR11菌株，每次菌株服用量约为1*1010cfu/只小鼠，定时采样，检测小鼠血清中的精氨酸浓度。结果如图2显示，口服EcN AR11菌株5天后，Arg KO小鼠血清中的精氨酸浓度较口服生理盐水、EcN 1917的小鼠显著降低，说明EcN AR11菌株能够有效降解小鼠体内的精氨酸。
综上所述，本发明所构建的E.coli Nissle AR11菌株可以显著降低精氨酸的浓度，经口服后有效降解精氨酸酶缺乏症小鼠血清中的精氨酸，有望应用于治疗精氨酸酶缺乏症。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种工程益生菌，其特征在于，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合厌氧启动子和外源精氨酸酶编码基因；
所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌EcN 1917的衍生菌。
2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述外源精氨酸酶编码基因具体为argI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧型启动子，其选自如下任意一种：
厌氧型启动子PfnrS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
厌氧型启动子PnirB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
厌氧型启动子PadhE，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
厌氧型启动子Pvgb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1-3任一项所述工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将启动子和外源精氨酸酶编码基因导入大肠杆菌中获得。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括：
S1、将精氨酸酶编码基因argI基因置于厌氧型启动子下游，获得启动子连接的ArgI的表达序列；
S2、EcN 1917为底盘菌，通过Crisper-Cas9的基因编辑手段将步骤S1制得的基因片段整合到基因组上。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)通过序列合成的方式分别获得PfnrS启动子和argI基因的融合片段Arg，连接到载体上，获得质粒pArg；
(2)以EcN 1917基因组为模板，L-F/L-R为引物PCR扩增获得上游同源臂L-arm，R-F/R-R为引物PCR扩增获得下游同源臂R-arm；利用pArg质粒为模板，Arg-F和Arg-R为引物，PCR扩增获得Arg片段；最后以L-F和R-R为引物，利用融合PCR的方法获得L-arm+Arg+R-arm片段；根据插入位点设计sgRNA序列，利用pTargetF为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，PCR扩增获得TargetF-Arg片段，自连后获得质粒pTargetF-Arg；
(3)通过电转化将pCas9质粒转入EcN 1917菌株中，获得转化子；阿拉伯糖诱导后制备上述菌株的感受态细胞；将pTargetF-Arg和L-arm+Arg+R-arm片段同时加入感受态细胞中进行电转，筛选转化子，利用引物L-F/R-R对转化子进行验证，获得Arg片段插入的EcN菌株；随后依次通过IPTG诱导消除pTargretF质粒，加热培养条件下消除pCas9质粒，获得EcNAR11菌株。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
所述步骤(1)中，选用载体为pMD-18T；
所述步骤(2)中，选用引物序列如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.13所示。
8.权利要求1-3任一项所述工程益生菌在降解精氨酸或制备降解精氨酸产品中的应用。
9.一种药物，其特征在于，所述药物其活性成分包括权利要求1-3任一项所述工程益生菌。
10.如权利要求9所述药物，其特征在于，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
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