CN113493796A - 苯丙酮尿症治疗用益生菌工程菌株的构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了重组表达载体，所述重组表达载体可以在罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)中表达产生苯丙氨酸脱氨酶，该酶可将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。

Description

苯丙酮尿症治疗用益生菌工程菌株的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及苯丙酮尿症治疗用益生菌工程菌株的构建方法与应用。更具体地，本发明涉及重组表达载体、试剂盒、工程菌及其在治疗苯丙酮尿症中的用途。
背景技术
苯丙酮尿症(Phenylketonuria)，简称PKU，是先天性氨基酸代谢障碍中最常见疾病，也是一种常染色体隐性遗传病，因苯丙氨酸羟化酶基因突变，导致酶活性降低，苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积导致的疾病。一般在出生后3-6个月开始出现症状，临床表现有智力、运动发育落后、皮肤毛发色素减少、鼠尿臭味等。目前，对于苯丙酮尿症的治疗仍有待研究。
益生菌，顾名思义是指对生命有益的菌，指可改善宿主(如动物或人类)肠内微生态的平衡，并对宿主有正面效益的活性微生物。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是目前已报道的几乎可存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸杆菌，是一种具有改善过敏体质、预防过敏反复发作以及调节肠道功能的益生菌。罗伊氏乳杆菌可以在胃肠道表面形成生物膜，病原菌竞争结合位点从而可以抑制病原菌的繁殖；同时还可以产生抑菌物质3-羟基丙醛，进一步发挥其对病原菌的抑制作用。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前，治疗苯丙酮尿症的药物大多是化学药物，存在毒副作用相对较高、容易产生耐药性等缺点。有鉴于此，发明人采用毒副作用小且不易产生耐药性的生物疗法，选择以罗伊氏乳杆菌作为表达宿主，向其中导入经构建的具有编码苯丙氨酸脱氨酶基因的表达载体，从而使构建的工程菌能够高表达苯丙氨酸脱氨酶，该酶可将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积。由此，可以有效地起到治疗苯丙酮尿症的目的。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组表达载体。根据本发明的实施例，所述重组表达载体选自含有编码苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列、启动子和终止子的乳酸菌表达载体。根据本发明实施例的重组表达载体可以在罗伊氏乳杆菌中表达产生苯丙氨酸脱氨酶，该酶可将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
根据本发明的实施例，所述重组表达载体还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述苯丙氨酸脱氨酶来源于皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)或胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，优选皮状丝孢酵母。
根据本发明的实施例，所述编码苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列是如SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列，优选如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述启动子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述乳酸菌表达载体选自质粒pslpa8148。
根据本发明的实施例，所述乳酸菌表达载体进一步含有编码信号肽的核苷酸序列和编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述编码信号肽的核苷酸序列是如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种工程菌。根据本发明的实施例，所述工程菌选自含有前面所述重组表达载体的罗伊氏乳杆菌。由此，利用根据本发明实施例的工程菌可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述重组表达载体或工程菌。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述重组表达载体、试剂盒或工程菌在制备食品或药品中的用途。根据本发明的实施例，所述食品或药品用于治疗苯丙酮尿症。如前所述，该重组表达载体所表达的苯丙氨酸脱氨酶可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
根据本发明的实施例，给药方式为口服。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品含有前面所述工程菌。由此，食用根据本发明实施例的工程菌不仅可以起到调理肠道功能的作用，还可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述工程菌；以及药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。如前所述，根据本发明实施例的药物组合物可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的质粒结构示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的工程菌株降解能力分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了重组表达载体、试剂盒、工程菌及其在制备食品或药品中的用途、食品和药物组合物，下面将分别对其进行详细描述。
重组表达载体
在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组表达载体。根据本发明的实施例，该重组表达载体选自含有编码苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列、启动子和终止子的乳酸菌表达载体。
理论上，苯丙氨酸脱氢酶、苯丙氨酸羟化酶和苯丙氨酸脱氨酶均具有降解苯丙氨酸及其代谢产物的作用，因此，发明人最初分别单独地将这三种酶克隆到乳酸菌表达载体，然后转化到罗伊氏乳杆菌中，意外地发现苯丙氨酸脱氢酶和苯丙氨酸羟化酶在罗伊氏乳杆菌中并未检测到明显的酶活，由此，选择了编码苯丙氨酸脱氨酶的基因构建表达载体，其可以在罗伊氏乳杆菌中高效表达，有效地将苯丙氨酸及其代谢产物降解，从而可以起到治疗苯丙酮尿症的目的。
根据本发明的实施例，苯丙氨酸脱氨酶来源于皮状丝孢酵母或胶红酵母。发明人发现，编码不同来源苯丙氨酸脱氨酶的基因在罗伊氏乳杆菌中表达所获得的酶的活力有所差异，进而，对众多不同来源的苯丙氨酸脱氨酶进行深入研究发现，皮状丝孢酵母和胶红酵母，尤其是皮状丝孢酵母，其编码基因在罗伊氏乳杆菌中表达所得到的酶的活力较高，可以高效降解苯丙氨酸及其代谢产物，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
具体地，编码皮状丝孢酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码胶红酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
ATGTTCATCGAAACCAATGTTGCAAAACCGGCAAGCACCAAAGCAATGAATGCAGGTAGCGCAAAAGCAGCACCGGTTGAACCGTTTGCAACCTATGCACATAGCCAGGCAACCAAAACCGTTAGCATTGATGGTCATACCATGAAAGTTGGTGATGTTGTTGCAGTTGCACGTCATGGTGCAAAAGTTGAACTGGCAGCAAGCGTTGCAGGTCCGGTTCGTGCCAGCGTTGATTTTAAAGAAAGCAAAAAACACACCAGCATCTATGGTGTTACCACCGGTTTTGGCGGTAGCGCAGATACCCGTACCAGCGATACCGAAGCACTGCAGATTAGCCTGCTGGAACATCAGCTGTGTGGTTTTCTGCCGACCGATGCCACCTATGAAGGTATGCTGCTGGCAGCCATGCCGATTCCGATTGTTCGTGGTGCAATGGCAGTTCGTGTTAATAGCTGCGTTCGTGGTCATAGCGGTGTTCGTCTGGAAGTTCTGCAGAGCTTTGCCGATTTTATCAATCGTGGTCTGGTTCCGTGTGTTCCGCTGCGTGGCACCATTAGCGCAAGCGGTGATCTGAGTCCGCTGAGCTATATTGCCGGTGCAATTTGTGGTCATCCTGATGTTAAAGTTTTTGATACCGCAGCAAGCCCTCCGACCGTTCTGACCAGTCCGGAAGCAATTGCAAAATATGGTCTGAAAACCGTGAAACTGGCAAGCAAAGAAGGTCTGGGTCTGGTTAATGGCACCGCAGTTAGCGCAGCAGCCGGTGCACTGGCACTGTATGATGCAGAATGTCTGGCAATTATGAGCCAGACCAATACCGTGCTGACCGTTGAAGCACTGGATGGTCATGTTGGTAGCTTTGCACCGTTTATTCAAGAAATTCGTCCGCATGCAGGTCAGATTGAAGCAGCACGTAATATTCGTCATATGCTGGGTGGTAGCAAACTGGCAGTTCATGAAGAAAGCGAACTGCTGGCCGATCAGGATGCAGGTATTCTGCGTCAGGATCGTTATGCACTGCGTACCTCAGCACAGTGGATTGGTCCGCAGCTGGAAGCCCTGGGCCTGGCACGTCAGCAGATTGAAACCGAACTGAATAGCACCACCGATAATCCGCTGATTGATGTTGAAGGTGGTATGTTTCATCATGGTGGTAATTTTCAGGCAATGGCCGTTACCAGCGCAATGGATAGCGCACGTATTGTGCTGCAGAATCTGGGTAAACTGAGCTTTGCGCAGGTTACAGAACTGATTAATTGCGAAATGAATCATGGTCTGCCGAGCAATCTGGCAGGTAGTGAACCGAGCACCAATTATCATTGTAAAGGCCTGGATATTCATTGCGGTGCATATTGTGCCGAACTGGGTTTTCTGGCAAATCCGATGAGCAATCATGTTCAGAGCACCGAAATGCATAATCAGAGCGTTAATAGCATGGCATTTGCAAGCGCACGTCGTACCATGGAAGCAAATGAAGTTCTGAGCCTGCTGCTGGGTAGCCAGATGTATTGTGCAACCCAGGCACTGGATCTGCGTGTTATGGAAGTTAAATTCAAAATGGCGATTGTGAAACTGCTGAATGAAACCCTGACCAAACATTTTGCAGCATTTCTGACACCGGAACAGCTGGCAAAACTGAATACCCATGCAGCAATTACCCTGTATAAACGTCTGAATCAGACCCCGAGCTGGGATAGTGCACCGCGTTTTGAAGATGCAGCAAAACATCTGGTTGGTGTTATTATGGATGCCCTGATGGTGAATGATGATATTACCGATCTGACCAATCTGCCGAAATGGAAAAAAGAATTTGCAAAAGAAGCCGGTAATCTGTATCGTAGCATTCTGGTTGCCACCACCGCAGATGGTCGTAATGATCTGGAACCGGCAGAATATCTGGGTCAGACCCGTGCAGTTTATGAAGCAGTGCGTAGTGAACTGGGTGTTAAAGTGCGTCGCGGTGATGTGGCAGAAGGTAAAAGCGGTAAAAGTATTGGTAGCAGCGTTGCCAAAATTGTTGAAGCAATGCGTGATGGTCGTCTGATGGGTGCAGTTGGTAAAATGTTTTGA(SEQ ID NO：1，简称TcXAL)
ATGGCACCAAGTGTTGATAGTATTGCTACAAGTGTTGCTAATTCATTAAGTAATGGTCTTCATGCTGCTGCTGCTGCAAATGGTGGTGATGTTCATAAGAAAACTGCTGGTGCTGGTAGTTTATTACCAACTACTGAAACAACTCAACTTGATATTGTTGAACGTATTCTTGCTGATGCTGGTGCTACTGATCAAATTAAATTAGATGGATATACTCTTACTCTTGGTGATGTTGTTGGTGCTGCTCGGCGAGGTCGTTCTGTTAAAGTTGCTGATAGTCCACATATTCGTGAAAAAATTGATGCTAGTGTTGAATTTTTACGTACTCAATTAGATAATAGTGTTTATGGTGTTACTACTGGTTTTGGTGGTAGTGCTGATACTCGTACTGAAGATGCTATTAGTTTACAAAAAGCTCTTTTAGAACATCAATTATGTGGTGTTTTACCAACTTCAATGGATGGTTTTGCTTTAGGTCGTGGTTTAGAAAATAGTTTACCATTAGAAGTTGTTCGTGGTGCTATGACTATTCGTGTTAATAGTTTAACTCGTGGTCATAGTGCTGTTCGTATTGTTGTTTTAGAAGCTCTTACTAATTTTTTAAATCATGGTATTACTCCAATTGTTCCATTACGTGGTACTATTAGTGCTAGTGGTGATTTAAGTCCATTAAGTTATATTGCTGCTAGTATTACTGGTCATCCAGATAGTAAAGTTCATGTTGATGGTAAAATTATGAGTGCTCAAGAAGCTATTGCTTTAAAAGGTTTACAACCAGTTGTTTTAGGTCCAAAAGAAGGTTTAGGTTTAGTTAATGGTACTGCTGTTAGTGCTAGTATGGCTACTTTAGCTTTAACTGATGCTCATGTTTTAAGTTTATTAGCTCAAGCTCTTACTGCTTTAACTGTTGAAGCTATGGTTGGTCATGCTGGTAGTTTTCATCCATTTTTACATGATGTTACTCGTCCACATCCAACTCAAATTGAAGTTGCTCGTAATATTCGTACTTTATTAGAAGGTAGTAAATATGCTGTTCATCATGAAACTGAAGTTAAAGTTAAAGATGATGAAGGTATTTTACGTCAAGATCGTTATCCATTACGTTGTAGTCCACAATGGTTAGGTCCATTAGTTAGTGATATGATTCATGCTCATGCTGTTTTAAGTTTAGAAGCTGGTCAAAGTACTACTGATAATCCATTAATTGATTTAGAAAATAAAATGACTCATCATGGTGGTGCTTTTATGGCTAGTAGTGTTGGTAATACTATGGAAAAAACTCGTTTAGCTGTTGCTTTAATGGGTAAAGTTAGTTTTACTCAATTAACTGAAATGTTAAATGCTGGTATGAATCGTGCTTTACCAAGTTGTTTAGCTGCTGAAGATCCAAGTTTAAGTTATCATTGTAAAGGTTTAGATATTGCTGCTGCTGCTTATACTTCAGAATTAGGTCATTTAGCTAATCCAGTTAGTACTCATGTTCAACCAGCTGAAATGGGTAATCAAGCTATTAATAGTTTAGCTTTAATTAGTGCTCGTCGTACTGCTGAAGCTAATGATGTTTTAAGTTTATTATTAGCTACTCATTTATATTGTGTTTTACAAGCTGTTGATTTACGTGCTATGGAATTTGAACATACTAAAGCATTTGAACCAATGGTTACTGAATTATTAAAACAACATTTTGGTGCTTTAGCTACTGCTGAAGTTGAAGATAAAGTTCGTAAAAGTATTTATAAACGTTTACAACAAAATAATAGTTATGATTTAGAACAACGTTGGCATGATACTTTTAGTGTTGCTACTGGTGCTGTTGTTGAAGCTCTTGCTGGTCAAGAAGTTAGTTTAGCTAGTTTAAATGCTTGGAAAGTTGCTTGTGCTGAAAAAGCTATTGCTTTAACTCGTAGTGTTCGTGATAGTTTTTGGGCTGCTCCAAGTAGTAGTAGTCCAGCTTTAAAATATTTAAGTCCACGTACTCGTGTTTTATATAGTTTTGTTCGTGAAGAAGTTGGTGTTAAAGCTCGTCGTGGTGATGTTTATTTAGGTAAACAAGAAGTTACTATTGGTACTAATGTTAGTCGTATTTATGAAGCTATTAAAAGTGGTTGTATTGCTCCAGTTTTAGTTAAAATGATGGCTTAA(SEQ ID NO：2，简称RmXAL)
根据本发明的实施例，启动子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。该启动子为强组合型启动子，可以使下游基因高效表达，由此，以便提高苯丙氨酸脱氨酶的得率和酶活。AATTCGGTCCTCGGGATATGATAAGATTAATAGTTTTAGCTATTAATCTTTTTTTATTTTTATTTAAGAATGGCTTAATAAAGCGGTTACTTTGGATTTTTGTGAGCTTGGACTAGAAAAAAACTTCACAAAATGCTATACTAGGTAGGTAAAAAAATATTCGGAGGAATTTTGAA(SEQ ID NO：3，简称p32)
需要说明的是，由于本发明的重组表达载体需要转化到罗伊氏乳杆菌中表达，因此，采用适用于乳酸菌表达的载体，本发明对于具体的乳酸菌表达载体类型不作严格限定，只要使该载体可以转化到罗伊氏乳杆菌中表达即可，具体可以根据实际情况灵活选择，可以为质粒pslpa8148。采用质粒pslpa8148可以较方便地将其转化到罗伊氏乳杆菌中，并高效表达其上携带的基因。
根据本发明的实施例，乳酸菌表达载体进一步含有编码信号肽的核苷酸序列和编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列。苯丙氨酸脱氨酶主要是在细胞内表达，需要机体摄入的食物中的苯丙氨酸或其代谢产物进入细胞内，才可以发挥降解作用，因此降解效率偏低。为此，发明人在乳酸菌表达载体插入信号肽编码基因和细胞表面展示锚定蛋白基因，两者在罗伊氏乳杆菌中可以表达出信号肽和细胞表面展示锚定蛋白，在信号肽的引导下，苯丙氨酸脱氨酶可以移到细胞外面，并在细胞表面展示锚定蛋白的作用下锚定在细胞壁上。由此，无需苯丙氨酸或其代谢产物进入细胞内即可有效地对其降解，提高降解效率。
根据本发明的实施例，编码信号肽的核苷酸序列是如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。发明人对众多细胞表面展示锚定蛋白进行研究，例如GpmB蛋白(果糖-2,6-二磷酸酶)、LraI蛋白、HisJ蛋白等，发现GpmB蛋白可以在上述信号肽的引导下较好地将苯丙氨酸脱氨酶锚定到细胞壁上，由此，无需苯丙氨酸或其代谢产物进入细胞内即可有效地对其降解，提高降解效率。
ATGAAATTCAAAAAATTAACAGTAATGTGTGCTGTTTTATCAGGTTTACTATTAGGGAACTCTGCGATGACGGCAGTTCCAGCTACTACCTATGCA(SEQ ID NO：4，简称sp)AAATTTTGGAAGAAAGCACTATTAACAATTGCAGCCTTAACAGTCGGCACCTCCGCAGGAATTACAAGCGTTTCTGCCGCTTCATCAGCTGTTAATTCAGAATTAGTTCATAAGGGAGAATTGACAATTGGTCTTGAGGGAACGTACTCTCCGTACTCTTATCGTAAAAATAACAAATTAACTGGCTTTGAAGTAGATCTTGGTAAAGCAGTTGCTAAAAAGATGGGCTTAAAAGCTAACTTTGTACCAACTAAATGGGATTCGCTAATTGCCGGTCTTGGTTCAGGCAAGTTTGATGTAGTAATGAACAACATTACACAGACACCTGAACGGGCCAAGCAATATAATTTCTCTACCCCATATATCAAGTCCCGGTTTGCATTAATTGTTCCTACTGATAGTAACATCAAAAGCTTGAAGGATATTAAAGGCAAGAAGATTATTGCTGGTACGGGAACTAATAATGCGAATGTGGTTAAAAAATATAAGGGTAACCTTACACCAAATGGCGATTTTGCTAGTTCCTTAGATATGATCAAGCAAGGTCGGGCTGCCGGGACAGTTAACTCCCGTGAAGCTTGGTACGCTTACAGCAAGAAGAACAGTACTAAGGGTCTCAAGATGATTGATGTTTCTAGTGAACAAGATCCAGCTAAGATTTCAGCACTTTTTAACAAGAAAGATACTGCTATTCAATCTTCCTACAACAAGGCACTGAAGGAACTTCAACAAGATGGAACAGTCAAGAAGCTATCTGAAAAGTACTTCGGTGCAGATATTACTGAA(SEQ ID NO：5，简称cnb)
工程菌
在本发明的又一方面，本发明提出了一种工程菌。根据本发明的实施例，工程菌选自含有前面所述重组表达载体的罗伊氏乳杆菌。该罗伊氏乳杆菌可以高效表达苯丙氨酸脱氨酶，特别是可以使其在细胞壁上表达，从而可以有效地降解胃肠道内的苯丙氨酸及其代谢产物，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该工程菌，在此不再赘述。
试剂盒
在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有前面所述重组表达载体或工程菌。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以高效表达苯丙氨酸脱氨酶，从而有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
需要说明的是，本发明的试剂盒中还可以含有其他常见的酶试剂盒中的试剂，例如缓冲液、冻干剂等，以及说明书，对此本发明不作严格限定，可以根据实际情况灵活选择。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体和工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述重组表达载体、试剂盒或工程菌在制备食品或药品中的用途。根据本发明的实施例，所述食品或药品用于治疗苯丙酮尿症。如前所述，该重组表达载体可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本发明的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防苯丙酮尿症)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述工程菌的药物或食品给予有需要的个体。
根据本发明的实施例，给药方式为口服。由此，工程菌可以将胃肠内的苯丙氨酸及其代谢产物降解，避免其蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体、试剂盒和工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
食品
在本发明的又一方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，该食品含有前面所述工程菌。由此，食用根据本发明实施例的工程菌不仅可以起到调理肠道功能的作用，还可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该食品，在此不再赘述。
药物组合物
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有：前面所述工程菌；以及药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。如前所述，根据本发明实施例的药物组合物可以有效地将胃肠内摄入的苯丙氨酸及其代谢产物分解，避免其在体内蓄积，从而起到治疗苯丙酮尿症的目的。
本发明所用“药学上可接受的辅料”意指与给药剂型或药物组合物一致性相关的药学上可接受的材料、混合物或溶媒。每种辅料在混合时必须与药物组合物的其它成分相容，以避免对患者给药时会大大降低本发明公开化合物的功效的相互作用和会导致不是药学上可接受的药物组合物的相互作用。此外，每种辅料必须是药学上可接受的，例如，具有足够高的纯度。
合适的药学上可接受的辅料包括以下类型：稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、塑化剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。技术人员可认识到，某些药学上可接受的辅料可提供不止一种功能，并提供可供选择的功能，这取决于制剂中存在多少该辅料和制剂中存在哪些其他辅料。
“药学可接受的载体”在本领域中是公认的，包括适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。所述载体包括参与携带主题物质或将其从一个器官或机体的一部分转移到另一个器官或机体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。各载体在与制剂中的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中所用的其它无毒的可相容的物质。
本发明提供的药物组合物可以压制片、研制片、可咀嚼锭剂、速溶片、复压片、或肠溶片、糖衣或薄膜衣片的形式来提供。肠溶片是用能抗胃酸作用但在肠中可溶解或崩解的物质包衣的压制片，从而防止了活性成分接触胃的酸性环境。肠包衣包括，但不限于，脂肪酸、脂肪、水杨酸苯酯、蜡、虫胶、氨化虫胶和邻苯二甲酸乙酸纤维素酯。糖衣片为糖衣包围的压制片，其可利于掩盖令人不愉快的味道或气味并且能防止片剂氧化。薄膜包衣片为用水溶性物质的薄层或薄膜覆盖的压制片。薄膜包衣包括，但不限于，羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和邻苯二甲酸乙酸纤维素酯。薄膜包衣赋有和糖包衣相同的一般特性。复压片为经过超过一个压缩周期制备的压制片，包括多层片、和压制包衣或干包衣片。
片剂剂型可以由呈粉末、结晶或颗粒状的活性成分单独的或与本发明描述的一种或多种载体或赋形剂组合来制备，所述载体和赋形剂包括粘合剂、崩解剂、控释聚合物、润滑剂、稀释剂和/或着色剂。增香剂和甜味剂在形成咀嚼片和锭剂时特别有用。
本发明提供的药物组合物可以以软弹性胶囊或硬明胶胶囊的形式来提供，其可以由明胶、甲基纤维素、淀粉或海藻酸钙来制备。所述硬明胶胶囊也称为干填充胶囊(DFC)，由两段组成，一段塞入另一段中，因此完全包封了活性成分。软弹性胶囊(SEC)是软的、球形壳，比如明胶壳，其通过加入甘油、山梨醇或类似的多元醇塑化。软明胶壳可以包含防腐剂来预防微生物生长。合适的防腐剂为如本发明所述的那些，包括尼泊金甲酯和尼泊金丙酯，以及山梨酸。本发明提供的液体、半固体和固体剂型可以包囊在胶囊中。合适的液体和半固体剂型包括在碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液和混悬剂。包含这样的溶液的胶囊可以通过如在美国专利U.S.Pat.Nos.4,328,245；4,409,239和4,410,545中描述的方法来制备。所述胶囊也可以采用如本领域技术人员已知的涂层，从而改善或维持活性成分的溶出。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中所涉及的各个参数的测定方法如下：安捷伦C18反相柱(250×4.6mm,5μm)，检测波长：270nm；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；进样量：20μl；运行时间：25min；流动相甲醇：20mM乙酸铵＝30:70。
实施例中MRS培养基：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g/L、葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/L、吐温80 1.0mL/L、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g/L、琼脂18.0g/L、蒸馏水1000mL，pH 6.3，培养温度37℃。
实施例中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)：十二水合磷酸氢二钠：2.2g，二水合磷酸二氢钠：0.6g，补水至100mL。
实施例1苯丙氨酸脱氨酶降解苯丙氨酸能力研究
1.1胞内表达载体构建
分别选择了皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)来源的苯丙氨酸脱氨酶(命名为TcXAL(SEQ ID NO：1))和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)来源的苯丙氨酸脱氨酶(命名为RmXAL(SEQ ID NO：2))，设计引物进行载体构建。以质粒pslpa8148作为表达载体，以组成型启动子p32(SEQ ID NO：3)代替载体中原有启动子，目的基因经过PCR扩增后通过Gibson方法连接至表达载体。
具体如下：质粒pslpa8148使用BglII和XbalI双酶切后按照产物回收试剂盒(Omega，D6492)说明进行纯化回收；使用引物p32-F和p32-R以及pMG36e作为模板PCR扩增得到p32启动子；使用引物RmXAL-F和RmXAL-R以及pUC57-RmXAL作为模板PCR扩增得到RmXAL片段，胶回收纯化(Omega,D2500)；使用引物TcXAL-F1和TcXAL-R以及pUC57-TcXAL作为模板PCR扩增得到TcXAL片段，胶回收纯化；将纯化后的上述片段使用Gibson连接试剂盒(Biomed,CL116-02)进行连接，电转化大肠杆菌EC1000，经过测序验证得到含有RmXAL和TcXAL的表达载体阳性菌株，分别命名为Pp32-RmXAL和Pp32-TcXAL。使用质粒提取试剂盒(Omega，D6943)，提取目的质粒，电转罗伊氏乳杆菌CGMCC 1.3264得到含有上述载体的工程菌株。
表1扩增引物
Figure BDA0002416165040000121
挑取单克隆至MRS培养基中37℃静置培养12-16h，按照2％(v/v)接种量接种至额外添加2.5mg/mL苯丙氨酸的培养基中培养12h，HPLC测定目的产物肉桂酸的生成。可以看出，皮状丝孢酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶和胶红酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶均具有较好的降解苯丙氨酸能力，其中，皮状丝孢酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶降解能力较高。
表2发酵体系中降解能力分析
样品 肉桂酸产量(μmol/L)
Pp32-RmXAL 63.75±1.77
Pp32-TcXAL 87.10±1.13
实施例2TcXAL表面展示型表达载体构建
使用引物TcXAL-F2和TcXAL-R以及pUC57-TcXAL作为模板PCR扩增得到TcXAL2片段，胶回收纯化；使用引物cnb-F和cnb-R以及实验室保存的含有cnb和信号肽sp的质粒作为模板，扩增后获得sp-cnb片段，胶回收纯化；将纯化后的上述片段以及实施例1中酶切质粒p32启动子，使用Gibson连接试剂盒(Biomed,CL116)进行连接，电转化大肠杆菌EC1000，经过测序验证得到含有TcXAL的表达载体阳性菌株，命名为Pp32-cnb-TcXAL。使用质粒提取试剂盒(Omega，D6943)，提取目的质粒，电转罗伊氏乳杆菌CGMCC1.3264得到含有上述载体的工程菌株。其中，质粒结构参见图1。
挑取单克隆至MRS培养基中37℃静置培养12h，按照2％(v/v)接种量接种扩大培养12h，5000×g离心10min收集菌体，0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗2遍去除表面杂质，重悬于含有10mM苯丙氨酸的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，细胞终浓度(1.8±0.7)×108cfu/L，每小时取样测定肉桂酸(CA)浓度。根据图2中数据可以看出表面展示表达菌株对于苯丙氨酸的降解能力更高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京优酶科技发展有限公司
<120> 苯丙酮尿症治疗用益生菌工程菌株的构建方法与应用
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Claims (10)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体选自含有编码苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列、启动子和终止子的乳酸菌表达载体。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述苯丙氨酸脱氨酶来源于皮状丝孢酵母或胶红酵母，优选皮状丝孢酵母；
任选地，所述编码苯丙氨酸脱氨酶的核苷酸序列是如SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列，优选如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述启动子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
任选地，所述乳酸菌表达载体选自质粒pslpa8148。
4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述乳酸菌表达载体进一步含有编码信号肽的核苷酸序列和编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列；
任选地，所述编码信号肽的核苷酸序列是如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，编码细胞表面展示锚定蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
5.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌选自含有权利要求1～4任一项所述重组表达载体的罗伊氏乳杆菌。
6.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～4任一项所述重组表达载体或权利要求5所述工程菌。
7.权利要求1～4任一项所述重组表达载体、权利要求5所述工程菌或权利要求6所述试剂盒在制备食品或药品中的用途，其特征在于，所述食品或药品用于治疗苯丙酮尿症。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，给药方式为口服。
9.一种食品，其特征在于，含有权利要求5所述工程菌。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有：
权利要求5所述工程菌；以及
药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。
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