JP7318897B2 - ペプチド、組成物、及びグレリン分泌促進剤 - Google Patents
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Description
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち4個以上9個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち4個以上12個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち4個以上9個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち4個以上12個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
本発明のペプチドは、以下の(1)から(3)のいずれかに記載のペプチドである。なお、以下、アミノ酸配列は、N末端を左端に置き、N末端からC末端にかけて記載する。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列(QAFEPIRSV)のうち4個以上9個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列(TNPWHSPRQGSF)のうち4個以上12個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
例えば、「配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち4個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド」としては、「QAFE」からなるペプチド、「AFEP」からなるペプチド、「FEPI」からなるペプチド等が挙げられる。
なお、配列番号1及び2に記載のアミノ酸配列は、いずれも、「ズブチリシン(subtilisin)」(サブチリシン、サチライシンとも呼ばれる。)による、米胚乳タンパク質の酵素消化物である。
配列番号3で表されるアミノ酸配列(QAFE)からなるペプチド
配列番号4で表されるアミノ酸配列(PIRSV)からなるペプチド
配列番号5で表されるアミノ酸配列(TNPW)からなるペプチド
配列番号6で表されるアミノ酸配列(HSPR)からなるペプチド
配列番号7で表されるアミノ酸配列(QGSF)からなるペプチド
本発明の組成物は、少なくとも本発明のペプチドを含む。本発明の組成物は、本発明のペプチドからなるものであってもよく、その他の成分を含んでいてもよい。本発明の組成物に含まれるペプチドは、本発明のペプチドをアミノ酸配列の一部として含むタンパク質であってもよい。
本発明の組成物を対象に投与することで、食欲不振を治療、予防、又は改善することができる。
上記のとおり、本発明のペプチドはグレリン分泌促進効果を有する。したがって、本発明のペプチドは、グレリン分泌促進剤として有効である。
(ペプチドの作製-1)
精製した米胚乳タンパク質、及び各種消化酵素を水に溶解させ、質量比が米胚乳タンパク質:酵素=100:1、かつ、米胚乳タンパク質の終濃度が20mg/mlとなるように混合し、酵素反応を行い、ペプチドを各種酵素消化物として得た。
(1)ズブチリシン(商品名「T1426」、Sigma-Aldrich社製):反応温度37℃、反応時間5時間、反応pH7.5
(2)スミチーム(商品名「スミチームFP」、新日本化学社製):反応温度:50℃、反応時間:5時間、反応pH7.5
(3)サーモリシン(商品名「Thermolysin」、Seikagaku社製):反応温度37℃、反応時間5時間、反応pH7.0~7.5
上記(ペプチドの作製-1)で得られたペプチドを、以下の試験に供し、各ペプチドがグレリン分泌に与える影響を評価した。ペプチド投与によってグレリン分泌が促進されるほど、該ペプチドが高い食欲促進効果を有することを意味する。
特に、ズブチリシン消化物及びスミチーム消化物は、濃度依存的に顕著なグレリン分泌促進効果を有することがわかった。
(ペプチドの作製-2)
上記(グレリン分泌の評価-1)の結果を踏まえ、グレリン分泌促進効果与するズブチリシン消化物中のペプチドをスクリーニングし、以下の2種のペプチドを候補として特定した。そこで、これらのペプチドを、Fmoc法による合成、次いで、逆相HPLCによる精製によって作製した。なお、以下、「配列番号nで表されるアミノ酸配列からなるペプチド」を、単に「配列番号nのペプチド」ともいう。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列(QAFEPIRSV)からなるペプチド
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列(TNPWHSPRQGSF)からなるペプチド
上記2種のペプチドを用いて、上記(グレリン分泌活性の評価-1)と同様の方法で、各ペプチドがグレリン分泌に与える影響を評価した。その結果を図2に示す(n=4)。なお、本例においては、ペプチド濃度が0.01、0.1又は1mMであるペプチド溶液を使用した。
上記(ペプチドの作製-2)で作製した、配列番号1のペプチドを用いて、グレリン分泌促進効果の作用を検証した。具体的には、配列番号1のペプチドの投与が、細胞内外のグレリン濃度に及ぼす影響、及び、グレリン合成関連遺伝子発現に及ぼす影響を検証した。
配列番号1のペプチドを用いて、上記(グレリン分泌活性の評価-1)と同様の方法で、ペプチドがグレリン分泌(細胞内のグレリン濃度)に与える影響を評価した。その結果を図3Aに示す(n=4~5)。
上記(グレリン分泌活性の評価-1)における培養完了後の細胞中の、グレリン合成に関連する3種の遺伝子(Preproghrelin、GOAT、及びPC3)の発現量を、以下の方法で測定した。まず、「RNeasy Mini Kit」(QIA-GEN社製)、及び「Takara PrimeScript RT Master Mix」(タカラバイオ社製)を用いて細胞からmRNAを抽出した。次いで、「LightCycler 96 System」(Roche Diagnostic社製)、及び「THUNDERBIRD qPCR Mix」(東洋紡社製)を用いて、cDNAを増幅させ、mRNA発現量を測定した。その結果を図3B(Preproghrelin)、図3C(GOAT)、図3D(PC3)に示す(それぞれ、n=4~5)。
上記<試験3>の結果を踏まえ、配列番号1のペプチドによるグレリン分泌促進効果の作用を検証した。具体的には、配列番号1のペプチドの投与が、細胞内cAMP濃度及び細胞内カルシウムイオン(Ca2+)濃度に与える影響を検証した。
グレリン分泌細胞(MGN3-1)を0.5mM IBMXを含むKrebs-Ringer-HEPESバッファーに溶解させ、37℃、30分インキュベートした後に、細胞内のcAMPを「HitHunter cAMP Assay for small molecules」(DiscoveRx社製)を用いて定量した。その結果を図4に示す。
「Calcium Kit II-Fluo 4」(同仁化学研究所)を使用し、マルチプレートリーダー(BMG LABTECH GmbH社製、λex=485nm,λem=520nm)を用いて測定した。
配列番号1のペプチドをマウスに投与し、in vivoにおける効果を検証した。具体的には、配列番号1のペプチドの投与がマウスの摂食行動、及び血清中グレリン濃度に及ぼす影響を検証した。
マウス(ddYマウス、11週齢の雄)に、生理食塩水に溶解させた配列番号1のペプチド(1mg/kg)を単回経口投与した。次いで、あらかじめ秤量した飼料(商品名「CE-2」、日本クレア社製)を摂食させ、摂食4時間後に残った飼料重量を測定した。
また、配列番号1のペプチドの代わりに生理食塩水を単回経口投与した点以外は上記同様の試験を対照試験として行った。
マウスに給餌した飼料重量と、摂食4時間後に残った飼料重量との差を摂食量(g/4時間)として特定した。その結果を図5A(n=10~11)に示す。
マウス(ddYマウス、11週齢の雄)に、生理食塩水に溶解させた配列番号1のペプチド(0.3mg/kg)を投与した。次いで、投与1時間後にマウスの眼窩静脈から採血し、1120×g、10分間、4℃で遠心分離し、上清を1N HClで酸性化した後、アシル化グレリン酵素免疫測定キットを用いて血清中グレリン濃度(pg/ml)を測定した。その結果を図5B(n=5~7)に示す。
上記(ペプチドの作製-2)で作製した配列番号1及び2のペプチド、並びにこれらの部分ペプチド(配列番号3~7のペプチド)を、Fmoc法による合成、次いで、逆相HPLCによる精製によって作製した。次いで、これらの各ペプチドをマウスに投与し、in vivoにおける効果を検証した。具体的には、各ペプチドの投与がマウスの摂食行動に及ぼす影響を検証した。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列(QAFEPIRSV)からなるペプチド
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列(TNPWHSPRQGSF)からなるペプチド
(3)配列番号3で表されるアミノ酸配列(QAFE)からなるペプチド
(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列(PIRSV)からなるペプチド
(5)配列番号5で表されるアミノ酸配列(TNPW)からなるペプチド
(6)配列番号6で表されるアミノ酸配列(HSPR)からなるペプチド
(7)配列番号7で表されるアミノ酸配列(QGSF)からなるペプチド
マウス(ddYマウス、7週齢の雄を購入し1週間以上順化して使用)に、生理食塩水に溶解させた各ペプチド(1mg/kg)を単回経口投与した。次いで、あらかじめ秤量した飼料(商品名「CE-2」、日本クレア社製)を摂食させ、摂食2時間後に残った飼料重量を測定した。
また、各ペプチドの代わりに生理食塩水を単回経口投与した点以外は上記同様の試験を対照試験として行った。
マウスに給餌した飼料重量と、摂食2時間後に残った飼料重量との差を摂食量(g/2時間)として特定した。この結果に基づき、各群における摂取量を、対照の摂取量を「100」とした場合の相対値として算出した。その結果を図6(n=7~18、* 対照に対してP<0.05)に示す。
特に、配列番号3、5、6又は7で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、対照と比較して、飼料摂取量が有意に増加した。
Claims (7)
- 配列番号1から7のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
- 配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、ズブチリシン消化物である、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1又は2に記載のペプチドを含み、食欲不振の治療、予防、又は改善に用いられる組成物。
- 前記食欲不振が、グレリン分泌の低下によってもたらされる食欲不振である、請求項3に記載の組成物。
- 医薬品である請求項3又は4に記載の組成物。
- 飲食品である請求項3又は4に記載の組成物。
- 配列番号1から7のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、グレリン分泌促進剤。
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