JP2012507273A - 殺虫剤のスクリーニングアッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、殺虫剤の標的としてのポリペプチド、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの(DmShal)に関する。

Description

本発明は、殺虫剤の標的としての、電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの(DmShal)の活性を有するカリウムチャネルに関する。一実施形態では、電位開口型カリウムチャネルShalを、そのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)、好ましくはその推定アクセサリータンパク質CG5890、ショウジョウバエKChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)オーソログと共発現させる。
本発明は、殺虫剤の標的としての、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの(DmShal)およびそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)、好ましくはその推定アクセサリータンパク質CG5890、ショウジョウバエKChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)オーソログの活性を有するポリペプチドを提供し、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)およびそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドをコードする新規核酸配列および上記核酸配列の機能的等価物を提供する。
本発明は、さらに、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイでの、昆虫電位開口型カリウムチャネルShalおよび/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、上記方法によって同定される殺虫性化合物および殺虫剤としてのこれらの化合物の使用に関する。
別の実施形態では、本発明は、殺虫剤の標的としての、Shakerカリウムチャネル、好ましくはDrosophila melanogaster由来のものの活性を有するカリウムチャネルに関する。一実施形態では、Shakerチャネルを、ハイパーキネティックベータサブユニット(Hyperkinetic beta subunit)、好ましくはH-kvベータサブユニットAまたはCサブタイプ、好ましくはDrosophila melanogaster由来のものと共発現させる。
本発明は、さらに、殺虫剤のスクリーニングアッセイでの、昆虫Shakerチャネル、好ましくはDrosophila melanogaster由来のものおよびハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAまたはCサブタイプの活性を有するポリペプチドを提供し、昆虫Shakerチャネルおよびハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAまたはCサブタイプの活性を有するポリペプチドをコードする新規核酸配列および上記核酸配列の機能的等価物を提供する。
本発明は、さらに、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプの活性を有するポリペプチドのそれぞれの、昆虫Shakerチャネルおよびハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAまたはCサブタイプのそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイでの使用に関する。さらに、本発明は、上記方法によって同定される殺虫性化合物および殺虫剤としてのこれらの化合物の使用に関する。
別の実施形態では、本発明は、殺虫剤の標的としての、好ましくはDrosophila melanogaster由来の、オクトパミン受容体の活性を有するGタンパク質共役受容体(GPCR)に関する。
本発明は、さらに、殺虫剤のスクリーニングアッセイでの、好ましくはDrosophila melanogaster由来の、オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドを提供し、好ましくはDrosophila melanogaster由来の、オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする新規核酸配列および上記核酸配列の機能的等価物を提供する。
本発明は、さらに、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイでの、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、上記方法によって同定される殺虫性化合物および殺虫剤としてのこれらの化合物の使用に関する。
別の実施形態では、本発明は、殺虫剤の標的としてのSK-チャネルに関する。
本発明は、さらに、殺虫剤の標的としての昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドを提供し、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする新規核酸配列および上記核酸配列の機能的等価物を提供する。
本発明は、さらに、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイでの昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、上記方法によって同定される殺虫性化合物および殺虫剤としてのこれらの化合物の使用に関する。
昆虫は多数のヒトおよび動物の疾患を生じさせる。昆虫はまた、経済的損失を生じさせる実質的な農業的および物的損害に関与する。使用または誤用されるすべての殺虫剤の毒にもかかわらず、昆虫は、依然として、毎年、世界の食用作物の30%を超える量を破壊する。
昆虫によって引き起こされる損害を制限するために多数のアプローチが開発されている。
1つのアプローチは、昆虫抑制のための化学物質の使用である。例えばDDTなどの多数の殺虫剤の問題は、それらが、高濃度での塗布を必要とすることおよびそれらが非特異的な広範囲の活性を有することである。化学殺虫剤は、一般に、有益でない種だけでなく有益な種にも影響する。それらの多くは環境中で持続し、したがって、食物連鎖において蓄積する。
別のアプローチは、細菌Bacillus thuringiensis由来のタンパク質毒素などの殺虫性毒素を発現するトランスジェニック作物である。
害虫はすべての種類の殺虫剤に対する耐性を獲得する傾向がある。その理由は、それらが、短い生活環、高い増殖率および長距離を移動する能力などの、昆虫集団での耐性の急速な発生をもたらす機構に起因して、その環境に適応するための例外的能力を有するからである。現在、殺虫剤耐性を示す害虫は増えつつある。
したがって、害虫に対して非常に特異的な効果を有する有効かつ経済的な殺虫剤を見出す必要性が依然として存在する。より有効な殺虫剤ほど、それがもたらす環境上の危険は少ない。
これは、昆虫発生および/または生存を抑制するタンパク質をコードする遺伝子の同定および単離によって達成することができる。
本発明は、殺虫剤の新規標的としての、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)を提供する。本発明は、さらに、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための自在に使える(at disposal)方法およびアッセイを供する。
多数のショウジョウバエ胚性および幼生ニューロンで見出される外向きの電位依存性K+電流は、ShakerファミリーメンバーShaw、ShabおよびShalから生じる電流の混合物に起因する(Tsunoda, S. & L. Salkoll (1995) J Neuroscience. March;15(3):1741-1754)。Shalは前記巨視的K+電流の一過性成分(transient component)(「A型」電流)を生じさせ、例えば特定のニューロンで遅延電流スパイクを生じさせることによって前記電流をモジュレートする(Yu, D., Feng, C. & A. Guo (1999) J Neurobiology. Aug;40(2):158-70)。選択的スプライシング、翻訳後修飾および他のShal関連プロセスは、これらのニューロンで観察される大きいレパートリーのモジュレーションに部分的に関与するものと考えられる(Choi, J. C., Park, D. & L. C. Griffith (2004) J Neurophysiology. 91:2353-2365)。
KChIP、Kv4.x (Shal)アクセサリータンパク質は、おそらく四量体チャネルアセンブリを促進することによって細胞膜へのShalの輸送を劇的に増加させ、かつShalチャネルゲート開閉特性の明らかな変化を引き起こすことが示されている(Kunjilwar, K., Strang, C., DeRubeis, D. & P. J. Pfaffinger (2004) J Biological Chemistry. Dec;279(52): 54542-54551)。
神経伝達(neuronal transmission)でのShalの役割にもかかわらず、この標的の有効事例はまだ確立されていない。発明者らのin situデータは、胚性腹神経索および内臓筋での低レベルの発現を示す。Berkeley Drosophila Genome Projectでのin situデータは、胚性/幼生の内臓筋、縦の内臓筋線維、腹側正中、および胚性中枢神経系、例えば腹神経索での染色を示す。DmShal mRNAは、まれな転写物であり、中期胚形成期(mid-embryonic stages)に発現ピークを有する(社内Lynxデータ)。Harvard Medical School Drosophila Stock Collectionには2つのイントロントランスポゾン挿入系統が存在するが、これらに伴う実行可能性データはなく、入手可能な他のShal突然変異体はない。マイクロアレイまたはノーザンデータはパブリックドメインに存在しない。
Shalカリウムチャネルのモジュレーションをその主な作用様式として有する市場の殺虫剤は同定されていない。主な作用様式として有するとは、ある化合物が「副作用」によって殺虫性活性に寄与するだけでなく、その活性が重要な致死効果であることを意味する。
別の実施形態では、本発明は、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプを、それぞれ、殺虫剤の新規標的として提供する。本発明は、さらに、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための自在に使える方法およびアッセイを供する。
ショウジョウバエハイパーキネティック(Hk)突然変異は、哺乳類K+チャネルPサブユニットのホモログをコードする遺伝子を変化させる。Wang et al. (Biophysical Journal Volume 71, December 1996, 3167-3176)は、Hk Pサブユニットが広範囲のShaker (Sh) K+電流特性をモジュレートすることを示している。また、アフリカツメガエル卵母細胞でのHkとShとの共発現がCHOUINARD et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 6763-6767, July 1995 Neurobiology)から知られている。CHOUINARD et al.は、この共発現が電流振幅を増加させ、かつ活性化および不活性化の電位依存およびキネティクスを変化させることを示した。
驚くべきことに、Shakerチャネルとハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAまたはCサブタイプのそれぞれとの共発現が殺虫剤に関する新規スクリーニングアッセイをもたらすことが見出された。
Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれのモジュレーションをその主な作用様式として有する市場の殺虫剤は同定されておらず、主な作用様式として有するとは、ある化合物が「副作用」によって殺虫性活性に寄与するだけでなく、その活性が重要な致死効果であることを意味する。
別の実施形態では、本発明は、殺虫剤の新規標的としての、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体を提供する。本発明は、さらに、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための自在に使える方法およびアッセイを供する。
ノルアドレナリンに構造的に関連する生体モノアミンであるオクトパミンは、主要な神経伝達物質、神経調節物質および神経ホルモンであり、無脊椎動物の末梢および中枢神経系での多様な生理学的プロセスを媒介する。チラミンとともに、オクトパミンは、その生理学的役割が無脊椎動物に制限される唯一の向神経活性非ペプチド伝達物質である。
オクトパミンの作用は、oa2、Oamb、Oct-ベータ-2RまたはOct-ベータ-3Rなどの種々の受容体クラスによって媒介される。
オクトパミン受容体は無脊椎動物でのみ/主に見出されることから、殺虫剤の重要な標的になる。したがって、オクトパミン受容体を特異的にモジュレートする化合物は低い脊椎動物毒性しか有さないはずである。選択性に加えて、オクトパミン受容体はその神経発現のせいで殺虫剤の良好な標的である。チラミンとともに、オクトパミンは、その生理学的役割が無脊椎動物に制限される唯一の向神経活性非ペプチド伝達物質である。
オクトパミンは昆虫における主要なニューロメディエーター(neuromediator)であるが、その受容体は、クローニングが困難であることがわかっている。今日まで、少数のオクトパミン受容体しかクローニングされていない。
本発明は、オクトパミン受容体をクローニングし、かつそれらを、好ましくは細胞の、膜に導入するための自在に使える方法を供する。好ましくは、さらに連結されたタンパク質を膜に導入する。
オクトパミン受容体は、受容体アイソフォームに応じて、サイクリックAMP生産または細胞内カルシウム放出を介してその作用をモジュレートすることができる。オクトパミン受容体、好ましくはoa2はcAMPを介して(though cAMP)内因的にシグナル伝達する。該受容体の活性の検出は困難である。
したがって、本発明は、その活性化の際にカルシウム放出を生じさせるカルシウムへのカップリングを強制するための自在に使える方法を供する。カルシウム放出は蛍光カルシウム検出色素によって測定可能である。
驚くべきことに、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の発現、およびプロミスキュアス(promiscuous) Gアルファタンパク質の発現が殺虫剤のための新規スクリーニングアッセイをもたらすことが見出されたされた。
GPCRは、GPCRの細胞外部分にリガンドが結合すると、細胞膜を横切るシグナル伝達を媒介する。GPCRの細胞内部分はGタンパク質と相互作用して、細胞の外側から内側へのシグナル伝達をモジュレートする。したがって、GPCRはGタンパク質と「共役」していると言える。Gタンパク質は、3つのポリペプチドサブユニット: GTPと結合して加水分解(hydolyzes)するαサブユニット、および二量体βγサブユニットから構成される。特定のGタンパク質は「プロミスキュアス」Gタンパク質とみなされる。その理由は、そのGサブユニットが、他のファミリーのGタンパク質と通常共役するGPCRと共役することが可能であるからである。
oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体のモジュレーションをその主な作用様式として有する市場の殺虫剤は同定されておらず、主な作用様式として有するとは、ある化合物が「副作用」によって殺虫性活性に寄与するだけでなく、その活性が重要な致死効果であることを意味する。
別の実施形態では、本発明は、殺虫剤の新規標的としての、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルを提供する。本発明は、さらに、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための自在に使える方法およびアッセイを供する。
カルシウム活性化カリウムチャネルは、細胞内カルシウムの増加によって活性化される機能的に多様なイオンチャネル群である。哺乳類では、それらは大多数の神経細胞に見出され、そこで、それらは活動電位の形成に寄与しかつニューロンの興奮性を調節する。より具体的には、その電流は、活動電位に続く後過分極の基礎となる; それらはまた、ニューロンの発射頻度精度(neuronal firing frequency precision)に関与すると考えられる(レビューに関しては、Stocker et al., Nature Reviews Neuroscience 5, 2004を参照のこと)。
このクラスのカリウムチャネルは、単一チャネルコンダクタンスに基づく3つの一般的タイプで存在する。大-、中-および小-コンダクタンスチャネルは、それぞれ、BK、IKおよびSKと称される。ショウジョウバエでは、該遺伝子は、それぞれ、slo、slackおよびSKと称される。
各タイプのカリウムイオンチャネルは別個の薬理学的プロファイルを示す。カリウムイオンチャネルはいくつかの生理学的プロセスと結び付けられていて、該プロセスには、心拍の調節、動脈の拡張、インスリンの放出、神経細胞の興奮性、および腎臓の電解質輸送の調節が含まれる。したがって、カリウムイオンチャネルは、WO 2005 099711およびUS 2005 0239800で開示されるように、いくつかの疾患の治療での治療標的としては、すでに公知である。
具体的に、SKチャネルは独特の薬理学的プロファイルを有することが示されている。WO 2005 100349で開示されるように、パッチクランプ技術を使用して、臨床的に価値がある精神活性を有する種々の化合物が見出された。評価された化合物は三環系抗うつ剤に構造的に関連し、それには、アミトリプチリン、カルバマゼピン、クロルプロマジン、シプロヘプタジン、イミプラミン、タクリンおよびトリフルペラジン(trifluperazine)が含まれる。各試験化合物はマイクロモル親和性でSK2チャネル電流をブロックすることが見出された。SKチャネルに影響するいくつかの神経筋阻害物質が存在し、例えば、アパミン、アトラクリウム、パンクロニウムおよびツボクラリンである(Shah et al., Br J Pharmacol 129: 627-30 (2000))。
疾患の治療のための薬理学的活性化合物の標的としてSKチャネルを使用するアッセイも報告される。
組み換えラット脳SK2チャネルを、クロルゾキサゾンなどの中枢作用筋弛緩剤化合物の効果をパッチクランプ技術によって研究するためにHEK293哺乳類細胞で発現させた(Cao et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296: 683-689, 2001)。形質転換HEK293細胞を用いるパッチクランプ技術によって、組み換えヒトSK4チャネルの活性化に対する金属イオンの効果も研究されている(Cao et al., FEBS, 446: 137-141, 1999)。
カルシウム活性化カリウムSKチャネルを通るカリウムイオン流動を増加または減少させる化合物を同定する方法はWO 98/11139に記載される。
現在まで、昆虫での従来の分子標的は、アセチルコリンエステラーゼ、電位依存性ナトリウムチャネル、イオンチャネル型受容体、例えばニコチン性アセチルコリンおよびGABA受容体であった。Gautier et al. (J. Pharm. Exp. Therapeutics, jpet.107.128694, 2007)は、殺虫剤神経毒性の間接的標的としてのカルシウム活性化カリウムチャネルの関与の証拠を提示した。彼らは、ゴキブリ(Periplaneta americana)由来のDUMニューロンでのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるDUM (背側不対正中(dorsal unpaired median))ニューロンBKチャネルのノックダウンによってDMDS (ジメチルジスルフィド)がカルシウム活性化カリウム電流を阻害することを示した。
Ca2+活性化カリウムチャネル活性を阻害する別の特定の毒素がいくつかの生物から同定されていて、最も有名なものは例えばUS 5,607,843で開示されるハチ毒由来のアパミンである。
それにもかかわらず、現在、Ca2+活性化カリウムチャネル、好ましくはSKチャネルのモジュレーションをその主な作用様式として有する市場の殺虫剤は同定されていない。主な作用様式として有するとは、ある化合物が「副作用」によって殺虫性活性に寄与するだけでなく、その活性が重要な致死効果であることを意味する。
一般に、殺虫剤の新規標的を構成するかもしれないポリペプチドの検出に関する大きい需要が存在する。その理由は、上記耐性問題および、できるだけ広い作用範囲、生態学的および毒物学的認容性および/または低い塗布率によって区別される新規殺虫性活性成分を同定するための進行中の努力である。
本発明は、今や、殺虫剤の標的としての、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)ならびに、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイを提供する。
本発明はまた、殺虫剤の標的としての、Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、ならびにShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイを提供する。
本発明は、さらに、殺虫剤の標的としての、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体ならびに、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイを提供する。
本発明は、さらに、殺虫剤の標的としての昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルならびに、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法およびアッセイを提供する。
実際、新規標的の検出は大きい困難を伴う。その理由は、ポリペプチドの活性の阻害は、昆虫の生存に対する追加の効果を有さないことが多いからである。これは、昆虫が代替活性にスイッチすることができ、ゆえにタンパク質をコードする遺伝子の数が微生物の少なくとも3倍であるせいである。
さらに、SKチャネルの場合、ヒト医学での研究結果、例えば、カリウムイオンチャネルを通るカリウムイオン流動の阻害でさえ疾患の治療に有用であることを教示するWO 2005 100349に関して、本発明のSKチャネルが殺虫剤の標的であり、それらの生存に影響することは驚くべきことであった。
本発明の目的は、昆虫の発生または生存に必須の新規標的を同定すること、および殺虫性活性化合物を同定するために好適な方法を提供することである。
発明者らは、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドの使用によってこの目的が達成されることを見出した。
本発明の一実施形態は、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法に関する。
別の実施形態では、発明者らは、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドの使用によってこの目的が達成されることを見出した。
本発明の一実施形態は、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法に関する。
別の実施形態では、発明者らは、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドの使用によってこの目的が達成されることを見出した。
本発明の一実施形態は、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップ、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しない、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法に関する。
別の実施形態では、発明者らは、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドの使用によってこの目的が達成されることを見出した。
本発明の一実施形態は、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップ、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しない、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法に関する。
主要なShalクローン。構築物の主な特徴を示す主要なShalクローンの、Vector NTIによって作製された地図。 主要なKChIPクローン。構築物の主な特徴を示す主要なKChIPクローンの、Vector NTIによって作製された地図。 ShalおよびKChIP発現構築物。pcDNA3/AcGFP-ShalおよびpcDNA3/AcGFP-ShaldelN2-40aaの地図およびVector NTI pcDNA3_ShalDelNおよびpcDNA3_Zeo_KCHiP_intron1構築物へのリンク。 AmCyanならびにAcGFPタグ付きバージョンと共発現された場合の完全長および末端切断型構築物ShalおよびShal_delNのパッチクランプデータ(上)。GFP-Shal孔突然変異体の概略図ならびに野生型および孔突然変異体のパッチクランプデータ。測定された電流が、上方制御された内因性電流ではなく、過剰発現されたShalに実際に起因することを示す(下)。 KCl脱分極を用いるFLIPRで検査されたShal_DelNクローン。 FLIPRで検査されたKチャネルブロッカー阻害曲線。 FLIPRでのKCl脱分極によるShal_delN Clone10サブクローンのスクリーニング。 クローン10-2、10-3および10-6のパッチクランプデータ。印加電圧と電流との関係を示すIV曲線。 経時的な蛍光の安定性を示す、第12継代の時点でのShal_DelN C10-3細胞。左パネル - 蛍光励起、右パネル - 通常光。 FLIPRでのShalチャネル活性に対するBaCl2の影響。 第20継代の時点でのFLIPRでのShal_delN C10-3機能。 Shal_delNを安定に発現するCHO-K1細胞をモック(mock；偽)トランスフェクトする(赤色トレース, 下側ライン)か、またはKChIPと共トランスフェクトした(青色トレース, 上側ライン)。 アラキドン酸によって阻害されるShal/KChIP。Shal/KChIP 20細胞を浴液中の100uM [最終]のアラキドン酸溶液で潅流した。プレおよびポスト化合物電流を全細胞クランプ条件下で測定した。左パネル: 曲線下面積の積分(総電流)。右パネル: ピーク電流振幅。 クローン18-13-6および18-13-20のI/V曲線。 Shal/KChIPクローンスクリーニングおよびNeo/Zeoコントロール系統。 Shal/KChIP最終サブクローンスクリーニング。最終セルラインを生じさせるサブクローンスクリーニングから得られた換算FLIPRデータ。 Shal/KChIPアッセイFLIPR応答プロファイル。 活性化バッファー中の色素の利用。 BDおよびGreiner 384ウェルアッセイプレートの比較: BDおよびGreiner 384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでShal/KChIP 20細胞をプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。左パネル: 2つのプレートタイプについての[KCl]の関数としてのウインドウサイズ(stat2-stat1として算出)。右パネル: 2つのプレートタイプについての[KCl]の関数として算出されたZ'統計。 細胞密度最適化。指定細胞密度での全プレートの統計を、得られたZ'統計とともに示す換算FLIPRデータ。 色素濃度評価。 Shal/KChIPアッセイウインドウサイズ、標準偏差およびZ'統計。 アッセイ統計への、色素ローディング時間の影響。 色素ローディング前に細胞をあらかじめ室温に冷却することの影響。 群平均の主要FLIPRデータおよび予備的なEC50。上パネル: KCl投与への群平均応答を示す換算FLIPRデータのScreenWorksスクリーンショット。下パネル: 算出HillslopeおよびEC50を示す非線形回帰/S字形用量応答。 MDCとAxygen FLIPR 384チップの比較。左パネル: Molecular Devices FLIPR 384チップ。右パネル: Axygen FLIPR 384チップ。 試薬安定性。 3日間の最小、中間点および最大統計。 3日間のKCl用量応答曲線およびEC50。 3日間のアミロライド用量応答。 ダイレクトプレートアッセイ。 BIOMOL化合物 - 主要スクリーニングデータ。挿入図: 主要データスクリーニングで強調されたコントロールおよび化合物ウェルの群平均のスクリーンショット。 BIOMOL化合物 - 換算スクリーニングデータ。BIOMOL化合物によるShal/KChIP応答の阻害パーセントを示すアッセイプレート図。実験条件は以前の図の説明文に記載される。 BioFocusスクリーニングのための化合物調製プロトコール。 Shal/KChIP FLIPR BioFocus 1スクリーニング - 活性化。Shal/KChIPに関する活性物の分布。 図３５Ａ: 表A1に記載される反応から得られたPCR産物。 最終pExSelect_Shaker構築物のVectorNTi地図。 FLIPR384でのモックI限界希釈プレート選択: 1プレートの例。 FLIPR384でのShaker+Hkvβ AまたはCサブユニットI限界希釈クローン選択。 FLIPR384での計測細胞(counted celss)としてのI限界希釈クローン再試験。 種々の細胞継代の時点でのA-3A10シグナル安定性。 凍結および解凍後のA-3A10シグナル安定性。 A-3A10クローンに対するTEAの影響。 高張液および等張液分析。 FLIPR384でのA-3A10 II限界希釈クローン選択。 FLIPRTETRAで分析されたn゜1およびn゜9 II限界希釈クローン。 細胞密度依存性、KCl用量応答。 DMSO感受性: 10000 c/w-24h DMSO感受性: 7500 c/w-24h DMSO感受性: 5000 c/w-24h 培養物中および凍結/解凍後のクローン安定性。 独立した3日のEC50再現性。 全細胞パッチクランプ試験。a: クローン3a10 サブタイプA、第４継代培養。b: クローン4d1 サブタイプC、第４継代培養。 Dm-Shakerの活性化誘発。 IV曲線標準化。 図５５Ａ: オクトパミン受容体のGFPタグ付けおよびCa2+経路に切り換えられた共役。図５５Ｂ: pcDNA3.1-OctRおよびpcDNA3.1-OctR-GFP。 図５５: G-アルファ-16を安定に発現しかつ増加量のタグなしまたはGFPタグ付きOctR-pcDNA3.1を一時的に発現するCHO細胞でのオクトパミンまたはチラミン刺激に対するカルシウム検出Fluo-4蛍光色素応答。Ａ: OctR-pcDNA3.1 + 100 uMオクトパミン。Ｂ: OctR-GFP + 100 uMオクトパミン。Ｃ: OctR-GFP + 100 nMチラミン。 図５５Ｃ: HTSスクリーニングアッセイ。 細胞選別の直前に完了した実験。 オクトパミンへの応答に関するすべてのGFP陽性モノクローナルセルラインのスクリーニング。 FLIPR Tetraでのクローン#13および#30の応答。 クローン#13 および#30の、オクトパミンに対する単一細胞応答。 OCTRクローン55選択。 OCTRクローン55の均質性。 アンタゴニストおよびアゴニスト用量応答曲線。 1回目および2回目の添加の種々のDMSO濃度でのオクトパミンEC50曲線。 細胞密度最適化。 色素濃度。ウインドウサイズへの色素濃度の影響を示す最大統計。 色素ローディング時間。 チップ洗浄評価。フルプレートに関する最大および最小統計を、得られたCVおよびZ'統計とともに示すFLIPRデータ。 3日のアゴニストおよびアンタゴニスト用量応答曲線。 図６９Ａはプレート#7の散布図であり、スクリーニングのアゴニスト部分のコントロールおよび試験ウェルを示す。図６９Ｂはプレート#7の散布図であり、スクリーニングのアンタゴニスト部分のコントロールおよび試験ウェルを示す。 pCRII-SK2+4D pTriEx3 Neo SK 1uM [最終]イオノマイシン(Ca2+イオノフォア)をアクチベーターとして使用したトランスフェクションプールの機能試験。 外部Ca2+の除去に対する応答。 SK3に対するイオノマイシンのEC50。 色素ローディング時間に関するアッセイウインドウサイズの変動性。 DMSO耐性。 ハーフプレートデータ。 BAY K-8644の試験。 プロパフェノンの試験。 TEA (SK3)試験。 4-AP (SK3-4)試験。 プロパフェノン(SK3)試験。 CHO細胞でのDmSK発現の試験(クローンSK)。 プロパフェノンのSK試験。 卵母細胞内のSK活性化についての公開されている結果。
本発明では、膜は、2つの相または溶液間のバリアーとして機能する半透性シートまたはレイヤーなどの構造であり、それにより、膜は溶媒透過性、好ましくは水透過性である。一実施形態では、膜は、生物学的膜、生体膜または脂質層または脂質二重層である。膜は、好ましくは、流動性脂質二重層から構成される。一実施形態では、膜は、細胞の外面、細胞コンパートメント、小胞、リポソーム(両親媒性分子であるリン脂質からなる小胞)、ポリマー小胞またはシントソーム(synthosomes)である。
ポリマー小胞は、しばしば、「ポリマーソーム(polymersomes)」と称され、詳細に研究されており、進歩がレビュー[Discher et al., Science 2002, 297; 967 973]にまとめられている。ポリマーソームまたはポリマー小胞は、自己組織化ジまたはトリブロックコポリマーからなる。
機能化ナノコンパートメント系であるシントソームは推定の生物工学的適用のために開発された[Nardin et al., Chem. Commun. 2000, 1433 1434]。シントソームは、ブロックコポリマー膜および、選択的ゲートとして機能する操作された膜貫通タンパク質を有する機械的に安定な小胞からなる中空の球である。
本発明の、好ましくは昆虫の、電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)を、膜中で組み立てるかまたはインタカレートするか、包埋するかまたは組み込む。該用語は同意語であり、交換可能である。
本発明の、好ましくは昆虫の、Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれを、膜中で組み立てるかまたは挿入するか、包埋するかまたは組み込む。それら用語は同意語であり、交換可能である。
本発明のoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される、好ましくは昆虫の、オクトパミン受容体を膜中で組み立てるかまたは挿入するか、包埋するかまたは組み込む。それら用語は同意語であり、交換可能である。
昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルを膜中で組み立てるかまたは挿入するか、包埋するかまたは組み込む。それら用語は同意語であり、交換可能である。
本発明の目的のために、一般に複数形は単数形を包含するものとし、逆もまた同様である。
特に指定されない限り、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」はこの関連で交換可能である。特に指定されない限り、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」はこの関連で交換可能である。用語「配列」は、用語「配列」が使用される文脈に応じて、ポリヌクレオチド、核酸、核酸分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する。本明細書中で使用される用語「遺伝子(群)」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸分子(群)」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形式、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを表す。該用語は、分子の一次構造を表すだけである。
ゆえに、本明細書中で使用される用語「遺伝子(群)」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸分子(群)」には、二本鎖および一本鎖DNAおよびRNAが含まれる。また、それらは、公知のタイプの修飾、例えば、メチル化、「キャップ」、1以上の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換を含む。好ましくは、DNAまたはRNA配列は、本明細書中で規定されるポリペプチドをコードするコード配列を含む。
「コード配列」は、RNA、例えばmiRNA、ta-siRNA、コサプレッション分子、RNAi、リボザイム、などの調節RNA、または、適切な調節配列の制御下に配置されるとポリペプチドに翻訳されるmRNAに転写されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、非限定的に、mRNA、cDNA、組み換えヌクレオチド配列またはゲノムDNAが含まれるが、特定の状況下ではイントロンも同様に存在してよい。
この関連で使用される核酸分子は、コード遺伝子領域の3'および5'末端に位置する非翻訳配列を包含してもよく、例えばコード領域の5'末端の上流の少なくとも500、好ましくは200、特に好ましくは100、ヌクレオチドの配列およびコード遺伝子領域の3'末端の下流の少なくとも100、好ましくは50、特に好ましくは20、ヌクレオチドの配列を包含してもよい。例えば、アンチセンス、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、コサプレッション分子、リボザイムなどのテクノロジーが使用されるイベントでは、コード領域ならびに5'-および/または3'領域を好都合に使用することができる。
しかし、クローニングおよび発現目的では、コード領域を選択することのみが有益であることがよくある。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマー(アミノ酸配列)を表し、特定の長さの該分子を表さない。ゆえに、ペプチドおよびオリゴペプチドはポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、また、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを表すか、または含む。例えば、1以上のアミノ酸アナログ(例えば非天然アミノ酸などが含まれる)を含むポリペプチド、代替結合を有するポリペプチド、ならびに当技術分野で公知の他の修飾であって、天然に存在する修飾および非天然に存在する修飾がともに、該定義に含まれる。
用語「含む(comprise)」または「comprising」およびその文法上のバリエーションは、本明細書中で使用される場合、記載される特徴、整数、ステップまたは成分またはそれらの群の存在を指定するが、1以上の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を妨げないと解釈されるものとする。
用語「減少(reduction)」、「抑制(repression)」、「低下(decrease)」または「阻害(inhibition)」は、生物、生物の部分、例えば組織、または細胞中の特性の、対応する変化に関する。「特性の変化」の下に、ある比体積または特定量のタンパク質において、コントロール、リファレンスまたは野生型の、対応する体積または量のタンパク質と比較して、活性が変化することが理解される。
用語「減少」、「抑制」、「低下」または「阻害」は、本発明の対象の部分のみでの該特性の変化を含み、例えば、改変は、細胞小器官などの細胞のコンパートメントまたは組織、羽、脚、体幹などの生物の部分で見出される。好ましくは、「減少」、「抑制」、「低下」または「阻害」は細胞性であると見出され、ゆえに用語「活性の減少、低下または阻害」は、野生型細胞またはコントロール細胞と比較された、細胞性の減少、低下または阻害に関する。
したがって、用語「減少」、「抑制」、「低下」または「阻害」は、遺伝子産物、タンパク質または調節RNAの比活性ならびに化合物または代謝産物、例えばポリペプチド、核酸分子、イオンまたはコードmRNAまたはDNAの量が、ある比体積において、減少、低下または阻害されることを意味する。用語「減少」、「抑制」、「低下」または「阻害」は、該「減少」、「抑制」、「低下」または「阻害」の理由が、生物またはその部分に投与される化学物質であることを含む。
用語「減少」、「抑制」、または「低下」は交換可能である。用語「減少」は、特に指定されない限り、用語「抑制」、「低下」または「阻害」を含むものとする。
また、減少は、活性の改変を意味すると理解される。この関連で、機能または活性、例えば「機能的活性」または「生物学的活性」は、コントロール、リファレンスまたは野生型と比較して、少なくとも10%、好都合には20%、好ましくは30%、特に好ましくは40%、50%または60%、非常に特に好ましくは70%、80%、85%または90%またはそれ以上減少し、非常に特に好ましくは95%であり、より好ましくは99%またはそれ以上である。最も好ましくは、活性の減少、低下または欠失は総計で本質的に100%に達する。ゆえに、特に有益な実施形態は、化合物、例えばポリペプチドまたは核酸分子の機能の不活性化、例えば阻害である。
用語「野生型」、「コントロール」または「リファレンス」は交換可能であり、本明細書中に記載の本発明の方法にしたがって改変または処理されていない、細胞または生物の部分、例えば細胞小器官または組織、または生物、特に昆虫であってよい。したがって、野生型、コントロールまたはリファレンスとして使用される細胞または生物の部分、例えば細胞小器官または組織、または生物、特に昆虫は、できる限り、該細胞、生物またはその部分と一致し、かつ本発明の方法の結果を除く任意の他の特性において、できる限り本発明の主題と同一である。ゆえに、野生型、コントロール、またはリファレンスは等しく処理されるか、またはできる限り同一であり、試験特性の性質に影響しない条件または特性のみが異なると言える。
好ましくは、すべての比較を類似(analogous)条件下で実施する。用語「類似条件」は、すべての条件、例えば、培養または生育条件、アッセイ条件(例えばバッファー組成、温度、基質、病原体系統、濃度など)が、比較される実験間で同一に維持されることを意味する。
「リファレンス」、「コントロール」、または「野生型」は、好ましくは、本明細書中に記載の本発明の方法にしたがって改変または処理されていない対象、例えば細胞小器官、細胞、組織、生物、特に昆虫であり、任意の他の特性において、できる限り本発明の主題と類似である。リファレンス、コントロール、または野生型は、そのゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームまたはメタボローム(metabolome)において、本発明の対象にできる限り類似である。好ましくは、用語「リファレンス-」、「コントロール-」または「野生型-」-細胞小器官、-細胞、-組織または-生物は、本発明の細胞小器官、細胞、組織または生物またはそれらの部分にほぼ遺伝的に同一の細胞小器官、細胞、組織または生物に関し、好ましくは95%、より好ましくは98%であり、さらにより好ましくは99,00%であり、特に99,10%、99,30%、99,50%、99,70%、99,90%、99,99%、99, 999%またはそれ以上である。最も好ましい「リファレンス」、「コントロール」、または「野生型」は、関与するかまたは活性を付与する核酸分子またはそれらによってコードされる遺伝子産物を、本発明の方法にしたがって、改変、操作、交換または導入することを除き、本発明の方法にしたがって使用される生物、細胞または細胞小器官と遺伝的に同一の対象、例えば細胞小器官、細胞、組織、生物である。
好ましくは、リファレンス、コントロールまたは野生型は、本発明のポリペプチドまたは本発明の方法で使用されるポリペプチドの活性においてのみ、本発明の対象と異なる。
「顕著な低下」: 本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性に関して、これは、測定誤差の範囲を超える大きさを有する、コントロールと比較された、例えば試験化合物とインキュベートされていないポリペプチドの活性と比較された、試験化合物で処理されたポリペプチドの活性の低下を意味すると理解される。
イオンチャネルの「機能的活性」への言及は、イオンチャネルが実行するかまたは関与する任意の1以上の機能および/または形質への言及として理解されるべきである。
オクトパミン受容体の「機能的活性」への言及は、オクトパミン受容体が実行するかまたは関与する任意の1以上の機能および/または形質への言及として理解されるべきである。
一実施形態では、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)の活性を有するポリペプチドについての用語「機能的活性」または「生物学的活性」は、膜を横切るカリウムイオンの輸送によって規定される。
別の実施形態では、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドについての用語「機能的活性」または「生物学的活性」は、膜を横切るカリウムイオンの輸送によって規定される。
別の実施形態では、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドについての用語「機能的活性」または「生物学的活性」は、オクトパミン受容体が、選択的に、α-アドレナリン作動性アンタゴニストによってブロックされかつα-アドレナリン作動性アゴニストによって活性化される事実によって規定される。
別の実施形態では、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドについての用語「機能的活性」または「生物学的活性」は、膜を横切るカリウムイオンの輸送によって規定される。この輸送はカルシウムイオンによって活性化され、最大半減活性化またはCa2+感受性K0.5は、間隔200〜1000 nM、300〜900 nM、300〜800 nMおよび400〜800 nMの群から選択される。本発明のSKチャネルは、間隔2〜20 pS、3〜20 pS、4〜15 pS、5〜12 pSおよび5〜10 pSの群から選択される単一チャネルコンダクタンスを有する。本発明のポリペプチドの生物学的活性はアパミン(apamine)非感受性である。
化合物についての用語「活性」とは、生物学的系、例えば細胞、器官または生物での化合物の機能を表す。例えば、化合物についての用語「活性」とは、化合物の酵素機能、調節機能または、結合パートナー、輸送体、調節因子、または担体としてのその機能などを表す。
化合物の殺虫性活性とは、昆虫を殺すかまたは麻痺させるか、または昆虫が低い損害しかもたらさないように昆虫の発生または成長を阻害する該化合物の能力を表す。殺虫性活性を有する化合物は昆虫に有毒であるともみなされる。化合物の殺虫性活性は昆虫の死を誘発するだけでなく、昆虫に対する他の有害な効果、例えば病気、摂食阻害(anti-feedant)活性、成長遅延、生殖能力の減少および繁殖力の減少を含む。
本明細書中で使用される殺虫性活性を有する化合物は「殺虫剤」である。用語「殺虫剤」とは、概して、農作物保護、ヒトおよび動物の健康の分野において、昆虫生存に不都合に影響する、例えば昆虫種を殺すか、麻痺させるか、不妊化する(sterilize)かまたは他の様式で無能にする、化学物質、生物学的物質、および他の化合物を表す。
一実施形態では、本発明の方法は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに記載のコンセンサス配列、または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれに記載の1以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号３、４; ７、８; １１、１２; １５、１６; １９、２０; ２３、２４; ２７、２８および/または３１、３２のそれぞれのプライマーを使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得される、ポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログ、例えば2〜40アミノ酸コード領域のN末端欠失を有するShal_delN突然変異体を含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、配列番号２６および/または３０に記載のそのアクセサリータンパク質KChIPまたはそのホモログの活性を有するポリペプチドに連結されている、配列番号２、６、１０、１４、１８および/または２２に記載の電位開口型カリウムチャネルShalまたはそのホモログおよび/または、2〜40アミノ酸コード領域のN末端欠失を有するShal_delN突然変異体の活性を有するポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログを含む膜を用いて実施される。
別の実施形態では、本発明の方法は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含む核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに記載のコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれに記載の1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブ、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される、Kozak配列(例えばACCATG)を含む、核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログを含む膜を用いて実施され、ここに該核酸分子は、好ましくは正しいKozakとともに、好ましくはShaker ATGコドンを含む、Shakerチャネルの400 bpまたは500 bp 5'断片、および/またはShakerチャネルの1770 bp断片および/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプをコードする配列を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、配列番号７３、７５、７７、７９、８１および８３からなる群から選択される少なくともポリペプチドまたはその機能的等価物もしくはホモログおよび配列番号８５および８７からなる群から選択されるポリペプチドまたはその機能的等価物もしくはホモログの任意の組み合わせを含む膜を用いて実施される。
別の実施形態では、本発明の方法は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子;
遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに記載のコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれに記載の1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６、１５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブ、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログおよび、さらに、マーカータンパク質、例えばGFPを含む膜を用いて実施され、ここに該マーカータンパク質は、好ましくは、例えば上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされる、本発明のポリペプチドと連結されている。
一実施形態では、本発明の方法は、配列番号１７３に記載の核酸分子またはそのホモログによってコードされる配列番号４６に示されるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログおよび、さらに、「プロミスキュアス」Gタンパク質、そのGサブユニットは該Gタンパク質が、他のファミリーのGタンパク質と通常共役するGPCRと共役することを可能にする、を含む膜を用いて実施され、ここに該「プロミスキュアス」Gタンパク質は、好ましくは、例えば上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされる、本発明のポリペプチドと連結されている。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログおよび、さらに、マーカータンパク質、例えばGFP、および/または、さらに、「プロミスキュアス」Gタンパク質を含む膜を用いて実施され、ここにマーカータンパク質および/または該「プロミスキュアス」Gタンパク質は、好ましくは、例えば上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされる、本発明のポリペプチドと連結されている。
一実施形態では、本発明の方法は、配列番号１７３に記載の核酸分子またはそのホモログによってコードされる配列番号４６に示されるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログおよび、さらに、「プロミスキュアス」Gタンパク質を含む膜を用いて実施され、ここに該タンパク質は好ましくは連結されている。
一実施形態では、「プロミスキュアス」Gタンパク質はプロミスキュアスG-アルファ-16-タンパク質またはそのホモログである。
別の実施形態では、本発明の方法は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４、２３５、２３６; および２３７、２３８のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブ、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む膜を用いて実施される。
一実施形態では、本発明の方法は、上で項目(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)または(j)の下に記載される群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも機能的等価物またはホモログを含む膜を用いて実施される。
上記の用語、ポリペプチドの「機能的等価物」は、本質的に、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチドの活性を付与するポリペプチドである。
上記の用語、核酸分子の「機能的等価物」は、本質的に、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に記載の核酸分子の活性を付与するポリヌクレオチドである。
本発明では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチドの活性を、その活性の減少、抑制、低下または阻害が、膜を通るカリウム流動の低下を媒介すれば、有する。
本発明では、核酸分子またはポリヌクレオチドは、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に記載の核酸分子の活性を、その発現の減少、抑制、低下または阻害が、膜を通るカリウム流動の低下を媒介する場合には、有する。
本発明のポリペプチドのホモログ、特に、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子によってコードされるかまたはそれを含んでいるポリペプチドのホモログ、または該ポリペプチド、配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドのホモログは、該ホモログが本明細書中に記載の活性を付与する限り、すなわちそれが該分子の機能的等価物である限り、任意の生物由来であってよい。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、本発明のポリペプチドのホモログ、特に、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子によってコードされるかまたはそれを含んでいるポリペプチド、または該ポリペプチド、配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドのホモログは、該ホモログが本明細書中に記載の活性を付与する限り、すなわちそれが該分子の機能的等価物である限り、任意の生物由来であってよい。
Gタンパク質共役受容体の場合、本発明のポリペプチドのホモログ、特に、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子によってコードされるかまたはそれを含んでいるポリペプチド、または該ポリペプチド、配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドのホモログは、該ホモログが本明細書中に記載の活性を付与する限り、すなわちそれが該分子の機能的等価物である限り、任意の生物由来であってよい。
SKチャネルの場合、本発明のポリペプチドのホモログ、特に、配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子によってコードされるかまたはそれを含んでいるポリペプチド、または該ポリペプチド、配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドのホモログは、該ホモログが本明細書中に記載の活性を付与する限り、すなわちそれが該分子の機能的等価物である限り、任意の生物由来であってよい。
さらに、本発明では、用語「ホモログ」は、生物のすべての発現された配列のうちの本明細書中で記載されるかまたは列挙される配列に対して、好ましくは最も高い、または基本的に最も高い配列相同性を有する生物の配列に関する。
当業者は、推定上のホモログが本明細書中に記載のものと同じ活性を有することを見出し、同定し、および確認する方法を承知している。公知であれば、生物の生物学的機能または活性は、本質的に、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に記載の遺伝子に関して記載される活性または機能に関するかまたは一致する。
したがって、一実施形態では、ホモログまたは機能的等価物は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドの配列または配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列、配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むか、またはそれは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子の発現産物である。
したがって、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、一実施形態では、ホモログまたは機能的等価物は、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に記載の配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドの配列または配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列、配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むか、またはそれは、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子の発現産物である。
したがって、Gタンパク質共役受容体の場合、一実施形態では、ホモログまたは機能的等価物は、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に記載の配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドの配列または配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列、配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むか、またはそれは、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子の発現産物である。
したがって、SKチャネルの場合、一実施形態では、ホモログまたは機能的等価物は、配列番号２２７、２２９、２３１に記載の配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドの配列または配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチド配列、配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むか、またはそれは、配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子の発現産物である。
本明細書中で開示される、配列、活性、コンセンサス配列、ポリペプチドモチーフおよび試験についての情報は、ある生物でのそれぞれの相同的または機能的に等価な発現産物に当業者を導く。
一実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは昆虫由来であり、かつ、少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ好ましくは昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの本質的に同一または類似の活性を有する。
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは昆虫由来であり、かつ少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ好ましくは、Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの本質的に同一または類似の活性を有する。
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは昆虫由来であり、かつ少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ好ましくは、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の本質的に同一または類似の活性を有する。
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは昆虫由来であり、かつ少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ好ましくは、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの本質的に同一または類似の活性を有する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは昆虫由来であり、好ましくは、Pterygota, Neopetra, Hemiptera, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Homoptera, Tenebrionoidea, Tenebrionidae, Tenebrio, Sternorrhyncha, Aphidina, Brachycera, Drosophilidae, DrosophilinaeおよびDrosophilaからなる群から選択される昆虫由来であり、かつ少なくとも50%の配列同一性を有し、かつ好ましくは：
(i) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体、または
(iv) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
の本質的に同一または本質的に類似の活性を有する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドの任意の1つのホモログは、
(i) Drosophila melanogaster、サザンアーミーワーム(southern armyworm)、コクヌストモドキ(tribolium)、トビイロウンカ(brown plant hopper)、または
(ii) Drosophila melanogaster、サザンアーミーワーム、コクヌストモドキ、モモアカアブラムシ(green peach aphid)、ワタアブラムシ(cotton aphid)および/または黒豆アブラムシ(black bean aphid)、または
(iii) Drosophila melanogaster、サザンアーミーワーム(Spodoptera eridania)、コクヌストモドキ(Red Fluor Beetle)(Tribolium castaneum)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、およびシルバーリーフコナジラミ(Silverleaf Whitefly)(Bemisia argentifolii)、または
(iv) 好ましくは、Pterygota, Neopetra, Hemiptera, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Homoptera, Tenebrionoidea, Tenebrionidae, Tenebrio, Sternorrhyncha, Aphidina, Brachycera, Drosophilidae, DrosophilinaeおよびDrosophilaからなる群から選択される昆虫由来の昆虫
由来であり、かつ少なくとも50%の配列同一性を有しかつ好ましくは、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの本質的に同一または本質的に類似の活性を有する。
本発明のポリペプチドの機能的等価物またはホモログは、
(i) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体、または
(iv) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
の活性を有し、
および配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２からなる群から選択される配列に示されるポリペプチドと少なくとも55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%または63%の同一性、好ましくは少なくとも64%、65%、66%、67%、68%または69%、より好ましくは少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%または85%、最も好ましくは86%、87%、88%、89%または90%、特に好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
「機能的等価物」は、この関連で、
(i) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体、または
(iv) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列または
(i) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体、または
(iv) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
の生物学的活性を有するポリペプチドの、細胞または生物での、発現をもたらすことが可能な上記核酸配列の部分と、標準条件下でハイブリダイズする核酸配列を説明する。
ハイブリダイゼーションを実施するために、他の関連遺伝子との比較によって、当業者が精通している方法で決定することができる例えば保存領域または他の領域の、約10〜50 bp、好ましくは15〜40 bpの長さの短いオリゴヌクレオチドを使用することが好都合である。しかし、100〜500 bpの長さの、本発明の核酸の長い断片、または完全配列をハイブリダイゼーションに使用してもよい。使用される核酸/オリゴヌクレオチド、断片の長さまたは完全配列に応じて、またはどのタイプの核酸、すなわちDNAまたはRNAがハイブリダイゼーションに使用されているかに応じて、これらの標準的条件は変動する。ゆえに、例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度より約10℃低い。
標準ハイブリダイゼーション条件は、核酸に応じて、例えば0.1〜5 x SSC (1 X SSC = 0.15 M NaCl, 15 mMクエン酸ナトリウム, pH 7.2)の範囲の濃度の水性バッファー溶液中で、または、さらに、50%ホルムアミドの存在下での、42〜58℃の範囲の温度を意味すると理解されるものとし、例えば5 x SSC、50%ホルムアミド中の42℃である。DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好都合には、0.1 x SSCおよび約20℃〜65℃の範囲、好ましくは約30℃〜45℃の範囲の温度である。DNA:RNAハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、好都合には、0.1 x SSCおよび約30℃〜65℃の範囲、好ましくは約45℃〜55℃の範囲の温度である。指定されているこれらのハイブリダイゼーション温度は、ホルムアミドの不存在下で、長さが約100ヌクレオチドでG + C含量が50%の核酸に関して一例として算出された融解温度値である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は、例えばSambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989などの遺伝学の専門家の教科書に記載され、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプまたはG + C含量の関数として、当業者が精通している公式を使用して算出することができる。当業者は、以下の教科書: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxfordに、ハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を見出す。
機能的等価物は、さらに、特に、本発明の核酸配列および他の生物由来のそれらのホモログによってコードされるタンパク質のそれぞれの核酸配列の天然または人工の突然変異を意味するとも理解される。
ゆえに、本発明はまた、例えば、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１の核酸配列の改変によって取得されるヌクレオチド配列を包含する。例えば、そのような改変は、当業者が精通している技術、例えば「部位特異的突然変異誘発」、「エラープローンPCR」、「DNAシャフリング」(Nature 370, 1994, pp.389-391)または「スタッガー伸長プロセス(Staggered Extension Process)」(Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261)によって作製することができる。そのような改変の目的は、例えば、制限酵素の追加の切断部位の挿入、配列を末端切断するためのDNAの除去、コドンを最適化するためのヌクレオチドの置換、または追加の配列の付加であってよい。改変された核酸配列によってコードされるタンパク質は、逸脱した核酸配列にもかかわらず、所望の機能を保持する必要があり、該所望の機能は、
(i) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体、または
(iv) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
の生物学的活性である。
機能的等価物は、ゆえに、本明細書中に記載の配列の天然に存在する変異体および人工核酸配列、例えば化学合成によって取得されたものおよびコドン使用に合わせて改変されたもの、およびさらに、それらから得られるアミノ酸配列を含む。
本発明の核酸分子などの、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリヌクレオチドを含む核酸分子の天然変異体ホモログに相当する核酸分子（それはcDNAであってもよい）は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準ハイブリダイゼーション技術にしたがって、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子、例えば本発明の核酸分子、またはその断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書中で開示される核酸分子に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。
本発明の方法に好都合な核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして配列またはその部分を使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション技術にしたがって、本明細書中で開示される核酸分子に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。
用語「相同性」は、それぞれの核酸分子またはコード対象のタンパク質が機能的および/または構造的に等価であることを意味する。上記核酸分子に相同でかつ該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、該核酸分子の変異であり、それは、同一の生物学的機能を有し、特に同一または実質的に同一の生物学的機能を有するタンパク質をコードする改変に相当する。それらは、天然に存在する変異、例えば他の植物品種または種由来の配列、または突然変異であってよい。これらの突然変異は天然に存在するかまたは突然変異誘発技術によって取得される。対立遺伝子変異は、天然に存在する対立遺伝子変異体ならびに合成によって製造されたかまたは遺伝子操作された変異体であってよい。構造的等価物は、例えば、該ポリペプチドと抗体との結合を試験することまたはコンピュータに基づく予測によって同定することができる。構造的等価物は類似の免疫学的特性を有し、例えば類似のエピトープを含む。
「ハイブリダイズ(hybridizing)」とは、慣用のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは例えばSambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989))またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されるようなストリンジェントな条件下でそのような核酸分子がハイブリダイズすることを意味する。
本発明では、本発明の核酸のDNAならびにRNA分子をプローブとして使用することができる。さらに、機能的ホモログの同定のための鋳型として、ノーザンブロットアッセイならびにサザンブロットアッセイを実施することができる。ノーザンブロットアッセイは、有益には、発現される遺伝子産物についての追加の情報: 例えば発現パターン、プロセシングステップ、例えばスプライシングおよびキャッピングの存在、などを提供する。サザンブロットアッセイは、本発明の核酸分子をコードする遺伝子の染色体局在化および組織化についての追加の情報を提供する。
ストリンジェントなサザンブロットハイブリダイゼーション(hydridization)条件の好ましい非限定的な例は、6 x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(= SSC)中で約45℃でのハイブリダイゼーションおよびその後の0.2 x SSC、0.1% SDS中で50〜65℃、例えば50℃、55℃または60℃での1回以上の洗浄ステップである。これらのハイブリダイゼーション条件は、核酸のタイプに応じておよび、例えば有機溶媒が存在する場合、バッファーの温度および濃度に関して異なることを当業者は承知している。「標準ハイブリダイゼーション条件」下の温度は、例えば核酸のタイプに応じて、0.1 x 0.5 x、1 x、2x、3x、4xまたは5 x SSCの濃度の水性バッファー(pH 7.2)中で42℃〜58℃の範囲、好ましくは45℃〜50℃の範囲で異なる。上記バッファー中に有機溶媒(群)、例えば50%ホルムアミドが存在するならば、標準条件下の温度は約40℃、42℃または45℃である。DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1 x SSCおよび20℃、25℃、30℃、35℃、40℃または45℃、好ましくは30℃〜45℃の範囲である。DNA:RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは例えば0.1 x SSCおよび30℃、35℃、40℃、45℃、50℃または55℃、好ましくは45℃〜55℃の範囲である。上記ハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミドの不存在下で約100 bp (= 塩基対)の長さでかつ50%のG + C含量の核酸に関して決定される。教科書、例えば上記のもの、または以下の教科書: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxfordを活用して、必要とされるハイブリダイゼーション条件を決定することを当業者は承知している。
そのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の1つの追加の例は、4XSSCで65℃でのハイブリダイゼーションおよびその後の0.1XSSC中で65℃で1時間の洗浄である。あるいは、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は42℃の50 %ホルムアミド、4XSSC中である。さらに、洗浄ステップ中の条件は、低ストリンジェンシー条件(50℃の約2X SSC)および高ストリンジェンシー条件(50℃、好ましくは65℃の約0.2X SSC) (20X SSC: 0.3Mクエン酸ナトリウム、3M NaCl、pH 7.0)によって定められる条件の範囲から選択することができる。さらに、洗浄ステップ中の温度は、室温、約22℃での低ストリンジェンシー条件から、約65℃での高ストリンジェンシー条件に高めることができる。
パラメータ塩濃度および温度の両者は、同時に変動させるか、または2つのパラメータのうちの一方を一定に維持し、他方のみを変動させることができる。変性剤、例えばホルムアミドまたはSDSをハイブリダイゼーション中に用いてもよい。50%ホルムアミドの存在下では、ハイブリダイゼーションは好ましくは42℃で達成される。(i) 処理の長さ、(ii) 塩条件、(iii) 界面活性剤条件、(iv) 競合DNA、(v) 温度および(vi) プローブ選択などの関連因子をケースバイケースで組み合わせることができ、すべての候補が本明細書中に記載されるわけではない。
DNAハイブリダイゼーション(サザンブロットアッセイ)および洗浄ステップの条件の一部の例を以下に示す。
(1) ハイブリダイゼーション条件は、例えば、以下の条件から選択することができる。
(a) 4X SSC, 65℃,
(b) 6X SSC, 45℃,
(c) 6X SSC, 100 mg/ml変性断片化魚精子DNA, 68℃,
(d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml変性サケ精子DNA, 68℃,
(e) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 mg/ml変性断片化サケ精子DNA, 50%ホルムアミド, 42℃,
(f) 50%ホルムアミド, 4X SSC, 42℃,
(g) 50% (vol/vol)ホルムアミド, 0.1%ウシ血清アルブミン, 0.1%フィコール, 0.1%ポリビニルピロリドン, 50 mMリン酸ナトリウムバッファーpH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mMクエン酸ナトリウム, 42℃,
(h) 2Xまたは4X SSC, 50℃(低ストリンジェンシー条件), または
(i) 30〜40%ホルムアミド, 2Xまたは4X SSC, 42℃(低ストリンジェンシー条件)。
(2) 洗浄ステップは、例えば、以下の条件から選択することができる。
(a) 0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1% SDS, 50℃.
(b) 0.1X SSC, 65℃.
(c) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 68℃.
(d) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50%ホルムアミド, 42℃.
(e) 0.2X SSC, 0.1% SDS, 42℃.
(f) 2X SSC, 65℃(低ストリンジェンシー条件).
(g) 0,2XSSC, 0,1%S DS, 60℃(中〜高ストリンジェンシー条件), または
(h) 0,1XSSC, 0,1%S DS, 60℃(中〜高ストリンジェンシー条件), または
(i) 0,2XSSC, 0,1%S DS, 65℃(高ストリンジェンシー条件), または
(h) 0,1XSSC, 0,1%S DS, 65℃(高いストリンジェンシー条件)。
一実施形態では、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」は、互いに少なくとも30 %、40 %、50 %または65%同一のヌクレオチド配列が、典型的に、互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するものとする。好ましくは、該条件は、互いに少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約75%または80%、およびさらにより好ましくは少なくとも約85%、90%または95%またはそれ以上同一の配列が、典型的に、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。
一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に示される配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する(例えば天然タンパク質をコードする)ヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を表す。
集団中に存在する核酸またはタンパク質配列の天然に存在する変異体に加えて、ポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列に、突然変異によって変化を導入し、それによってコード対象のポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらし、かつそれによって該ポリペプチドの機能的能力を変化させることができ、該機能的能力は好ましくは該活性を減少、低下または欠失させることを意味することを当業者はさらに認識する。例えば、「必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、例えば、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に示される、対応する核酸分子を含む、本発明の方法で減少させようとする核酸分子の配列において施すことができる。「必須」アミノ酸残基は、1つのポリペプチドの野生型配列から変更されると、該ポリペプチドの改変された活性をもたらす残基であり、一方、「非必須」アミノ酸残基は、タンパク質の活性、例えば酵素またはチャネルとしての活性に必要とされない。「必須」残基の改変は、ポリペプチドの活性の減少、低下または欠失をもたらすことがよくある。好ましくはポリペプチドのアミノ酸は、活性が減少、低下または欠失するように変更され、それは、好ましくは必須アミノ酸残基および/またはより多くの非必須残基が変更され、それによって、該ポリペプチドの発現または活性が低下した後に、活性が減少することを意味する。しかし、活性に必須ではなく、ゆえに、該活性を変化させることなく変化させやすい可能性が高い他のアミノ酸残基(例えば、該活性を有するドメインで保存されていないかまたは半保存しかされていない)はあまり好ましくない。
好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示される配列に対して、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約60%、70%または80%同一であり、より好ましくは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示される配列の1つに対して、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約85%同一であり、さらにより好ましくは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示される配列に対して、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%相同であり、最も好ましくは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示される配列に対して、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約96%、97%、98%、または99%同一である。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示される配列に対して、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約60%、70%または80%同一であり、より好ましくは、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示される配列の1つに対して、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約85%同一であり、さらにより好ましくは、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示される配列に対して、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%相同であり、最も好ましくは、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示される配列に対して、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約96%、97%、98%、または99%同一である。
Gタンパク質共役受容体の場合、好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示される配列に対して、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約60%、70%または80%同一であり、より好ましくは、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示される配列の1つに対して、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約85%同一であり、さらにより好ましくは、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示される配列に対して、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%相同であり、最も好ましくは、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示される配列に対して、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約96%、97%、98%、または99%同一である。
SKチャネルの場合、好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２２８、２３０、２３２に示される配列に対して、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約60%、70%または80%同一であり、より好ましくは、配列番号２２８、２３０、２３２に示される配列の1つに対して、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約85%同一であり、さらにより好ましくは、配列番号２２８、２３０、２３２に示される配列に対して、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%相同であり、最も好ましくは、配列番号２２８、２３０、２３２に示される配列に対して、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含む配列に対して少なくとも約96%、97%、98%、または99%同一である。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸分子の相同性(= 同一性)のパーセンテージを決定するために、最適な比較用に他方の下に一方の配列を書く。タンパク質または核酸分子の配列にギャップを挿入して、他方のタンパク質または他方の核酸との最適なアライメントを得ることができる。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを両ポリマー間で比較する。一方の配列中の位置が他方の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基または同一のヌクレオチドで占められていれば、該分子はこの位置で同一である。この関連で使用されるアミノ酸またはヌクレオチド「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と一致する。一般に、2配列間の相同性のパーセンテージは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である(すなわち相同性%= (同一の位置の数)/(位置の総数) x 100)。ゆえに、用語「相同性」および「同一性」は、この説明では、同義語とみなされるものとする。
2以上のアミノ酸または2以上のヌクレオチド配列の相同性(=同一性)のパーセンテージの決定のために、いくつかのコンピュータソフトウェアプログラムが開発されている。2以上の配列の相同性は、例えばソフトウェアfastaを用いて算出することができ、fastaは、現在、fasta 3のバージョンで使用されている(W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63-98; W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1990); Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTAMethods in Enzymology 183:63-98)。異なる配列の相同性の計算のための別の有用なプログラムは標準blastプログラムであり、それはBiomax pedantソフトウェアに含まれる(Biomax, Munich, Federal Republic of Germany)。これは、残念ながら時々、最適以下の結果をもたらす。その理由は、blastが常に対象およびクエリの完全配列を含むわけではないからである。それにもかかわらず、このプログラムは非常に効率的であるため、多数の配列の比較に使用することができる。そのような配列の比較には、以下の設定が典型的に使用される: -p Program Name [String]; -d Database [String]; default = nr; -i Query File [File In]; default = stdin; -e Expectation value (E) [Real]; default = 10.0; -m alignment view options: 0 = pairwise; 1 = query-anchored showing identities; 2 = query-anchored no identities; 3 = flat query-anchored, show identities; 4 = flat query-anchored, no identities; 5 = query-anchored no identities and blunt ends; 6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends; 7 = XML Blast output; 8 = tabular; 9 tabular with comment lines [Integer]; default = 0; -o BLAST report Output File [File Out] Optional; default = stdout; -F Filter query sequence (DUST with blastn, SEG with others) [String]; default = T; -G Cost to open a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -E Cost to extend a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -X X dropoff value for gapped alignment (in bits) (zero invokes default behavior); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]; default = 0; -I Show GI's in deflines [T/F]; default = F; -q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn only) [Integer]; default = -3; -r Reward for a nucleotide match (blastn only) [Integer]; default = 1; -v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V) [Integer]; default = 500; -b Number of database sequence to show alignments for (B) [Integer]; default = 250; -f Threshold for extending hits, default if zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; default = 0; -g Perfom gapped alignment (not available with tblastx) [T/F]; default = T; -Q Query Genetic code to use [Integer]; default = 1; -D DB Genetic code (for tblast[nx] only) [Integer]; default = 1; -a Number of processors to use [Integer]; default = 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Believe the query defline [T/F]; default = F; -M Matrix [String]; default = BLOSUM62; -W Word size, default if zero (blastn 11, megablast 28, all others 3) [Integer]; default = 0; -z Effective length of the database (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -K Number of best hits from a region to keep (off by default, if used a value of 100 is recommended) [Integer]; default = 0; -P 0 for multiple hit, 1 for single hit [Integer]; default = 0; -Y Effective length of the search space (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -S Query strands to search against database (for blast[nx], and tblastx); 3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]; default = 3; -T Produce HTML output [T/F]; default = F; -l Restrict search of database to list of GI's [String] Optional; -U Use lower case filtering of FASTA sequence [T/F] Optional; default = F; -y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 invokes default behavior); blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real]; default = 0.0; -Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 invokes default behavior); blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]; default = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional; -n MegaBlast search [T/F]; default = F; -L Location on query sequence [String] Optional; -A Multiple Hits window size, default if zero (blastn/megablast 0, all others 40 [Integer]; default = 0; -w Frame shift penalty (OOF algorithm for blastx) [Integer]; default = 0; -t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0 disables linking) [Integer]; default = 0。
Needleman and WunschまたはSmith and Watermanのアルゴリズムを使用することによって高品質の結果に達する。したがって、該アルゴリズムに基づくプログラムが好ましい。好都合には、プログラムPileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)、または好ましくはプログラムGapおよびBestFitを用いて配列の比較を実施することができ、該プログラムは、それぞれ、Needleman and Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)]およびSmith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]のアルゴリズムに基づく。両プログラムはGCGソフトウェア-パッケージの部分である[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et seq.]。したがって、好ましくは、配列相同性のパーセンテージ(perentages)を決定するための計算は、配列の全範囲にわたってプログラムGapを用いて実施される。核酸配列の比較に以下の標準調整を使用した: ギャップウェイト: 50, レングスウェイト: 3, 平均適合: 10.000, 平均ミスマッチ: 0.000。
例えば、核酸レベルで配列番号１に示される配列と80%の相同性を有する配列は、上記パラメータセットでの上記Gapプログラムアルゴリズムによって配列番号１の配列と比較されると、80%の相同性を有する配列を意味すると理解される。
2ポリペプチド間の相同性は、各事例で配列の全長にわたるアミノ酸配列の同一性を意味すると理解され、それは、プログラムアルゴリズムGap (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)を、以下のパラメータ: ギャップウェイト: 8; レングスウェイト: 2; 平均適合: 2.912; 平均ミスマッチ: -2.003にセットして活用する比較によって算出される。
例えば、タンパク質レベルで配列番号２の配列と80%の相同性を有する配列は、上記パラメータセットでの上記Gapプログラムアルゴリズムによって配列番号２の配列と比較されると、80%の相同性を有する配列を意味すると理解される。
置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチド、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つ由来の機能的等価物は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドの1つと、または配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性によって識別される。
置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸配列由来の機能的等価物は、本発明に記載の、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸の1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードする。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチド、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つ由来の機能的等価物は、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドの1つと、または配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性によって識別される。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸配列由来の機能的等価物は、本発明に記載の、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸の1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードする。
Gタンパク質共役受容体の場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチド、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つ由来の機能的等価物は、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドの1つと、または配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列もしくは配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性によって識別される。
Gタンパク質共役受容体の場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸配列由来の機能的等価物は、本発明に記載の、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸の1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードする。
SKチャネルの場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチド、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つ由来の機能的等価物は、配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドの1つと、または配列番号２３９に示されるコンセンサス配列もしくは配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドの1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性によって識別される。
SKチャネルの場合、置換、挿入または欠失による本発明に記載の、配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸配列由来の機能的等価物は、本発明に記載の、配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸の1つと少なくとも30%、35%、40%、45%または50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%または70% 好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも85%または90%、91%、92%、93%または94%、非常に特に好ましくは少なくとも95%、97%、98%または99%の相同性を有し、かつ配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドと本質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードする。
一実施形態では、2核酸配列またはポリペプチド配列間の「相同性」または「同一性」は、各事例で配列の全長にわたる核酸配列/ポリペプチド配列の同一性によって定義され、該同一性は、プログラムアルゴリズムGAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)を以下のパラメータにセットして活用するアライメントによって算出される:
ギャップウェイト: 8 レングスウェイト: 2
平均適合: 2,912 平均ミスマッチ:-2,003。
以下の本文では、同一性という用語はまた、用語「相同的」または「相同性」の代わりに、同義語として使用される。
「突然変異」は、1以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位(inversions)または挿入を含み、それは、1以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失による標的タンパク質の、対応するアミノ酸配列の変化をもたらしてもよい。
一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号７、８; ９、１０; １１、１２; のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される、単離された核酸分子に関する。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含む核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される、単離された核酸分子に関する。
Gタンパク質共役受容体の場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６、１５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される、単離された核酸分子に関する。
SKチャネルの場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４、２３５、２３６; および２３７、２３８;のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される、単離された核酸分子に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の単離された核酸分子を含む核酸構築物に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明の核酸構築物または単離された核酸分子を含むベクターに関する。
一実施形態では、本発明は、トランスフェクション/形質転換によって、本発明のベクター、核酸構築物または単離された核酸分子を含むトランスジェニック宿主細胞に関する。
「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、該核酸分子の天然供給源中に存在する他のポリヌクレオチドまたは核酸分子から分離されている。単離された核酸分子は、数kbの染色体断片であるか、または好ましくは、該遺伝子のコード領域のみを含む分子である。したがって、単離された核酸分子は、5'および3'に隣接する染色体領域またはさらに隣接する染色体領域を含んでよいが、好ましくは、天然に、該核酸分子の起源である生物でのゲノムまたは染色体の状況で該核酸分子配列に隣接するそのような配列(例えば、該核酸分子の5'-および3'-UTRをコードする領域に隣接する配列)を含まない。種々の実施形態では、本発明の方法で使用される単離された核酸分子は、例えば、天然に、該核酸分子の起源である細胞のゲノムDNAで該核酸分子に隣接する約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kbまたは0.1 kb未満のヌクレオチド配列しか含まない。
本方法で使用される核酸分子またはその部分は、分子生物学の標準的技術および本明細書中で提供される配列情報を使用して単離することができる。また、比較アルゴリズムを活用して、例えばDNAまたはアミノ酸レベルでの相同配列または相同的保存配列領域を同定することができる。前者は、本方法で有用なさらなる核酸配列を単離するための標準ハイブリダイゼーション技術(例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の技術)の下でのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
本発明の方法でその活性を減少させようとする分子の完全配列を包含する核酸分子またはその部分を、ポリメラーゼ連鎖反応によって、さらに単離することができ、この配列またはその部分に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。例えば、完全配列またはその部分を含む核酸分子は、このすべての配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。例えば、Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299のグアニジニウムチオシアネート抽出法(guanidinium thiocyanate extraction method)を例えば用いて細胞からmRNAを単離することができ、逆転写酵素(例えばMoloney MLV逆転写酵素, Gibco/BRL, Bethesda, MDから入手可能, またはAMV逆転写酵素, Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FLから入手可能)を用いてcDNAを作製することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に示される配列に基づいて作製することができる。そのようなプライマーを使用して、例えばcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから核酸配列を増幅し、かつ本発明の方法で有用な核酸分子を同定することができる。
さらに、本発明の方法にしたがって減少させようとする核酸分子によってコードされるポリペプチドとの、特に、保存領域、ひいては、縮重プライマーを導き出す元となる、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合は配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子によってコードされる配列との、タンパク質配列アライメントを実施することによって種々の生物から保存領域を同定することが可能である。
保存領域は、異なる起源由来のいくつかのホモログのある特定の位置のアミノ酸において非常に少ない変異を示す領域である。本明細書中に示されるコンセンサス配列およびポリペプチドモチーフは該アライメントから導かれる。さらに、本発明の方法にしたがって減少させようとする核酸分子によってコードされるポリペプチドとの、特に、保存領域が由来する、およびひいては、縮重プライマーが由来する、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチド分子によってコードされる配列との、タンパク質配列アライメントを実施することによって、種々の生物から保存領域を同定することが可能である。
保存領域は、異なる起源由来のいくつかのホモログのある特定の位置のアミノ酸において非常に少ない変異を示す領域である。本明細書中に示されるコンセンサス配列およびポリペプチドモチーフは該アライメントから導かれる。有益な一実施形態では、本発明の方法で、配列番号３３および/または３４、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号１０２および/または１０３、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１７７、１７８および/または１７９、およびSKチャネルの場合は配列番号２３９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６、およびSKチャネルの場合は配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むかまたはそれからなるポリペプチドの活性が低下し、また別の一実施形態では、本発明は、配列番号３３および/または３４、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号１０２および/または１０３、Gタンパク質共役受容体の場合、配列番号１７７、１７８および/または１７９、およびSKチャネルの場合は配列番号２３９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６、およびSKチャネルの場合は配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むかまたはそれからなるポリペプチドに関し、ここに、20以下、好ましくは15または10、好ましくは9、8、7、または6、より好ましくは5または4、さらにより好ましくは3、さらにより好ましくは2、さらにより好ましくは1、最も好ましくは0個の指定のアミノ酸位置を任意のアミノ酸によって置換することができる。一実施形態では、一文字で指定されるアミノ酸位置の、多くとも15%、好ましくは10%、さらにより好ましくは5%、4%、3%、または2%、最も好ましくは1%または0%を別のアミノ酸に置換する。一実施形態では、20以下、好ましくは15または10、好ましくは9、8、7、または6、より好ましくは5または4、さらにより好ましくは3、さらにより好ましくは2、さらにより好ましくは1、最も好ましくは0個のアミノ酸をコンセンサス配列またはタンパク質モチーフに挿入する。
配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に示される配列のマルチプルアライメントからコンセンサス配列を導き出した。文字は一文字アミノ酸コードであり、アミノ酸が、アライメントされたすべてのタンパク質で保存されていることを示す。文字Xはすべての配列で保存されているわけではないアミノ酸を意味する。
すべての配列から、保存ドメインを同定した。そして、標準Prosite表記のサブセットを使用して記載する。例えば、パターンY-x(21,23)-[FW]は、保存されているチロシンが、フェニルアラニンまたはトリプトファン(tryptophane)のいずれかから最小21および最大23アミノ酸残基だけ分離されていることを意味する。
保存されているパターンをソフトウェアツールMEMEバージョン3.5.1を用いるかまたは手動で同定した。MEMEはTimothy L. Bailey and Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of California, San Diego, USAによって開発された。そしてTimothy L. Bailey and Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994]によって報告されている。スタンドアローンプログラムのソースコードはSan Diego Supercomputerセンター(http://meme.sdsc.edu)から公的に入手可能である。
ソフトウェアツールMEMEを用いてすべての配列中の共通モチーフを同定するために、以下の設定を使用した: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites number of sequences used for the analysis。MEMEの入力配列はFastaフォーマットのアライメントされていない配列であった。他のパラメータはこのソフトウェアバージョンのデフォルト設定で使用した。
ソフトウェアツールPrattバージョン2.1を用いるかまたは手動で、保存されているドメインのPrositeパターンを作製した。PrattはInge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norwayによって開発された。そしてJonassen et al. [I.Jonassen, J.F.Collins and D.G.Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science 4 (1995), pp. 1587-1595; I.Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, Submitted to CABIOS Febr. 1997]によって報告されている。スタンドアローンプログラムのソースコード(ANSI C)は、例えば、EBI (European Bioinformatics Institute)などの確立されているBioinformaticセンターで公的に入手可能である。
ソフトウェアツールPrattでパターンを作製するために、以下の設定を使用した: PL (max Pattern Length): 100, PN (max Nr of Pattern Symbols): 100, PX (max Nr of consecutive x's): 30, FN (max Nr of flexible spacers): 5, FL (max Flexibility): 30, FP (max Flex.Product): 10, ON (max number patterns): 50。Prattの入力配列は、ソフトウェアツールMEMEから同定される高い類似性を示すタンパク質配列の別個の領域であった。作製されたパターンと適合する必要がある最小数の配列(CM, min Nr of Seqs to Match)を供給配列の少なくとも80%にセットした。ここに記載されないパラメータはそれらのデフォルト設定で使用した。
保存ドメインのPrositeパターンを使用して、このパターンに適合するタンパク質配列を検索することができる。種々の確立されているBioinformaticセンターは、該パターンをデータベース検索で使用するための公的インターネットポータルサイトを提供している(例えばPIR [Protein Information Resource, located at Georgetown University Medical Center]またはExPASy [Expert Protein Analysis System])。あるいは、EMBOSSソフトウェアパッケージの部分であるプログラムFuzzproなどのスタンドアローンソフトウェアが利用可能である。例えば、プログラムFuzzproは、正確なパターン-タンパク質適合を検索することを可能にするだけでなく、実施される検索において種々の多義性を設定することができる。
ソフトウェアClustalW (バージョン1.83)でアライメントを実施した。それは、Thompson et al. [Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680]によって報告されている。該スタンドアローンプログラムのソースコードはEuropean Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Germanyから公的に入手可能である。ClustalW v1.83のデフォルトパラメータ(gap open penalty: 10.0; gap extension penalty: 0.2; protein matrix: Gonnet; pprotein/DNA endgap: -1; protein/DNA gapdist: 4)を使用して分析を実施した。
そして、上記のように設計された縮重プライマーを、PCRによって、上記活性を有するタンパク質をコードする新規コード領域の断片の増幅に利用することができる。
そして、これらの断片を、完全遺伝子配列を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして利用することができる。代替法として、RACE-PCRを用いて、欠けている5'および3'配列を単離することができる。本発明の核酸分子は、標準PCR増幅技術にしたがって、cDNAまたは、代替法では、ゲノムDNAを鋳型として使用し、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができる。こうして増幅された核酸分子を好適なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴付けることができる。標準合成方法によって、例えば自動DNAシンセサイザーを使用して、本方法で使用される核酸分子の1つに対応するオリゴヌクレオチドを作製することができる。
本発明の方法に好都合な核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして配列またはその部分を使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション技術にしたがって、本明細書中で開示される核酸分子に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。
一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号７、８; ９、１０; １１、１２; のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
Gタンパク質共役受容体の場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子
遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６、１５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
SKチャネルの場合、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４、２３５、２３６; および２３７、２３８;のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む膜であって、本発明のポリペプチドの内因性活性を示していなかった膜に関する。
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む宿主細胞であって、該宿主の膜が本発明のポリペプチドの内因性活性を示していなかった、宿主細胞に関する。
表現「膜がもともとは本発明のポリペプチドの活性を示していない」は、本発明のポリペプチドが、天然に存在する膜の部分ではなく、本発明の方法にしたがって膜に組み込まれたことを意味する。
一実施形態では、本発明の方法は、以下の活性:
(i) 宿主細胞の膜中の昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
(ii) 宿主細胞の膜中の昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
(iii) 宿主細胞の膜中のoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体、または
(iv) 宿主細胞の膜中の昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル
を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現ステップを含む。
一実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、そのネイティブ状態では、低いかまたは興味をそそらない電気活性しか有さない細胞である。対照的に、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞は、間隔2〜20 pS、3〜20 pS、4〜15 pS、5〜12 pSおよび5〜10 pSの群から選択される伝導率を示す。
一実施形態では、宿主細胞は、CHO細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞; Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OSからなる群から選択される。
以下のヌクレオチド配列:
(i) イオンチャネルおよび/またはそのアクセサリータンパク質の活性を有する本発明のポリペプチドを含む本発明の宿主細胞の製造では、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(ii) イオンチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプの活性を有する本発明のポリペプチドを含む本発明の宿主細胞の製造では、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii) オクトパミン受容体および好ましくはさらに、マーカータンパク質、例えばGFP、および/またはさらに、「プロミスキュアス」Gタンパク質の活性を有する本発明のポリペプチドを含む本発明の宿主細胞の製造では、該ポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、または
(iv) イオンチャネルの活性を有する本発明のポリペプチドを含む本発明の宿主細胞の製造では、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、それが組み換え生産される場である宿主細胞に導入する。
を、それが組み換え生産される場である宿主細胞に導入する。
一実施形態では、宿主細胞は微生物であり、該微生物に、
(i) 本発明のカリウムイオンチャネルおよび/またはそのアクセサリータンパク質、または
(ii) 本発明のカリウムイオンチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプ、または
(iii) 本発明のオクトパミン受容体および好ましくはさらに、マーカータンパク質、例えばGFP、および/またはさらに、「プロミスキュアス」Gタンパク質、または
(iv) 本発明のチャネル
の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入して、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載の一般的クローニング技術にしたがって該ヌクレオチド配列を複写(manifold)する。
上記核酸分子を、追加の遺伝子とともに組み合わせて本発明の核酸構築物またはベクターにクローニングすることができ、または数種の核酸構築物またはベクター(プラスミドを含む)を宿主細胞に形質導入することによって、異なる遺伝子を導入する。
したがって、本発明はまた、1種以上の調節要素またはシグナルに機能的に連結された本発明の方法で使用される核酸分子または分子群またはその断片を含む核酸構築物、好ましくは発現構築物に関する。さらに、本発明はまた、本発明の方法で使用される核酸分子またはその部分を含む、相同組み換えイベントを生じさせるための核酸構築物に関する。
該核酸構築物は追加の遺伝子を含むこともでき、それは宿主細胞に導入しようとする遺伝子である。
本明細書中に記載される、調節配列または調節因子は、好ましくは導入された構築物の発現に関して、正の効果を有することができ、ゆえにそれを増加させる。ゆえに、強力な転写シグナル、例えばプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することによって、調節要素の増強を転写レベルで好都合に生じさせることができる。しかし、さらに、例えばRNAの安定性を増加させることによって、翻訳の増強も可能である。
ゆえに、本発明の核酸構築物を発現カセットとして使用することができ、そして宿主細胞への導入に直接使用することができ、あるいはそれらをベクターに導入してよい。したがって一実施形態では、該核酸構築物は、微生物プロモーターまたは微生物ターミネーターまたは両者を含む発現カセットである。別の実施形態では、該発現カセットは真核生物プロモーターまたは真核生物ターミネーターまたは両者を包含する。
数種の構築物またはベクターで宿主細胞を形質転換することが意図される場合、先の形質転換のマーカーを除去するか、または次の形質転換で追加のマーカーを用いる必要がある。当業者が精通している方法によって、その技術水準で報告されているようにして、宿主細胞からマーカーを除去することができる。
一実施形態では、本発明の方法で使用される核酸配列は、好都合には、遺伝子発現を増加させるために、1種以上の調節シグナルに作動可能に連結することができる。
これらの調節配列は、核酸分子、例えば遺伝子または遺伝子断片または遺伝子産物または、本発明の方法で使用される核酸の特異的発現を可能にするためのものである。宿主生物、例えば真核細胞または微生物に応じて、これは、例えば、遺伝子または遺伝子構築物が、誘導後にのみ、発現および/または過剰発現されること、またはそれが構成的に発現および/または過剰発現されることを意味する。これらの調節配列は、例えば、誘導物質(inductors)またはリプレッサーが結合する対象の配列であり、ゆえに核酸の発現を調節する配列である。さらに、該遺伝子構築物は、好都合には、プロモーターと作動可能に連結された1種以上のエンハンサー配列として知られる配列を含むこともでき、これらは核酸配列の発現増加を可能にする。また、DNA配列の3'末端に追加の有益な配列、例えば追加の調節要素またはターミネーターを挿入することが可能である。
本明細書中で使用される用語「増加した発現(発現増加)」または「過剰発現」は、元の野生型発現レベルに追加される任意の形式の発現を意味する。
遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させる方法は当技術分野で十分に文書化されており、それには、例えば、適切なプロモーターによって駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が含まれる。プロモーターまたはエンハンサー要素として働く、単離された核酸を、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するために、非異種形態のポリヌクレオチドの適切な位置(典型的に上流)に導入することができる。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、本発明の一実施形態では、Kozak配列を使用する。
本発明のタンパク質をコードする核酸分子および他のポリペプチドをコードする核酸分子を1つの核酸構築物またはベクターに存在させるか、またはいくつかの核酸構築物またはベクターに存在させてよい。一実施形態では、本発明の方法での使用のための核酸分子またはそのコード遺伝子の1コピーのみを核酸構築物またはベクター中に存在させる。いくつかのベクターまたは核酸構築物またはベクターを宿主細胞中で一緒に発現させることができる。本発明の核酸分子または核酸構築物をベクターに挿入して、遊離型で細胞中に存在させることができる。安定な形質転換が好ましい場合、ベクターを使用し、それは数世代にわたって安定に複製されるか、さもなければ、該ベクターまたはその部分はゲノムに挿入される。哺乳類細胞の場合、核のゲノムへの組み込みが生じていてよい。宿主ゲノムでの2種以上の構築物の挿入では、発現対象の構築物は、1ベクター、例えば複数の構築物を保持する上記ベクター中で一緒に存在させてよい。
通例、構築物の発現率に関する調節配列は、調節しようとする核酸分子の配列に対して上流(5')、配列内、および/または下流(3')に位置する。それらは、特に転写および/または翻訳および/または転写物の安定性をコントロールする。発現レベルは、さらなる細胞調節系、例えば細胞のタンパク質生合成および分解系の関連に依存する。
調節配列には、転写および翻訳調節配列またはシグナル、例えば、プロモーターまたは開始コドンなどの特に転写または翻訳開始の調節に関係する、上流(5')に位置する配列、および、ポリアデニル化シグナルまたは終止コドンなどの特に転写または翻訳終結および転写物の安定性の調節に関係する、下流(3')に位置する配列が含まれる。
特に有益なプロモーターは、構成的、組織またはコンパートメント特異的および誘導性プロモーターである。一般に、「プロモーター」は、この関連で、核酸分子のコード配列セグメントの発現を媒介する、核酸分子中の調節配列を意味すると理解される。原理的に、天然プロモーターをそれらの調節配列とともに使用することが可能である。哺乳類細胞用のプロモーターには、例えばCMV、SV40、TK、ベータ-アクチンがある。
核酸構築物は、好都合には、プロモーターの後ろに、好都合にはポリリンカー中に、発現対象の核酸の挿入に好適な切断部位が続き、適切であれば、ポリリンカーの後ろに位置するターミネーターが続くように構築される。適切であれば、この順序を数回繰り返し、いくつかの遺伝子を1構築物中で組み合わせて、そしてトランスジェニック植物に導入して発現させることができるようにする。該配列を、例えば、3回まで繰り返す。発現のために、例えばプロモーターの後ろのポリリンカー中の、好適な切断部位を介して該核酸配列を挿入する。上記のように、各核酸配列がそれ自身のプロモーターおよび、適切であれば、それ自身のターミネーターを有するのが好都合である。しかし、特に宿主または標的細胞中でポリシストロニック転写が可能であれば、プロモーターの後ろでかつ、適切であれば、ターミネーターの前に、いくつかの核酸配列を挿入することも可能である。この関連で、核酸構築物中の挿入部位、または挿入される核酸分子の配列は決定的ではなく、すなわち、カセットの最初または最後の位置に、これが発現に対する実質的影響を有することなく、核酸分子を挿入することができる。しかし、1プロモータータイプのみを構築物中で使用することも可能である。
本発明の一実施形態は、また、ベクターへの、本明細書中で特徴付けられる核酸分子、本発明の核酸分子または本発明の発現カセットの挿入ステップを含む、ベクターの作製方法に関する。例えば、核酸構築物に関して本明細書中で記載されるか、または以下で形質転換またはトランスフェクションの下に記載されるか、または実施例に示されるように、ベクターを細胞、例えば微生物または哺乳類細胞に導入することができる。宿主または標的細胞の一時的または安定な形質転換が可能であるが、安定な形質転換が好ましい。
本発明のベクターは、好ましくは、細胞、好ましくは哺乳類細胞での本発明のポリペプチドの発現に好適なベクターである。該方法は、ゆえに、調節シグナル、特に生物、例えば微生物または哺乳類細胞での発現を媒介するシグナルをベクターに組み込むための1以上のステップを包含することもできる。
したがって、本発明はまた、植物発現に好適な核酸構築物の部分として本明細書中で特徴付けられる核酸分子または本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の方法で使用される有益なベクター、例えば本発明のベクターは、本発明の方法で使用される核酸分子をコードする核酸分子、または上記のように本発明の方法で使用可能な核酸分子を含む細胞での発現に好適な核酸構築物を、単独で、またはさらなる遺伝子、例えばマーカーまたは選択遺伝子と組み合わせて、含む。
したがって、本発明の方法で好都合に使用される組み換え発現ベクターは、本発明の方法で使用される核酸分子または、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合は配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合は配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合は配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリヌクレオチド、またはそれらのホモログを含む核酸分子の発現および/または同時に、宿主細胞中での、本発明の核酸分子に付随するかまたは本明細書中に記載される追加の遺伝子の発現に好適な形式の本発明の核酸構築物を含む。したがって、組み換え発現ベクターは、発現対象の核酸配列と作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される1種以上の調節シグナルを含む。
本発明では、用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を表す。ベクターの1タイプは「プラスミド」であり、それは、追加のDNAセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖DNAループを意味する。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることが可能である。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製可能である(例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター)。他の好ましいベクターは、それらが宿主細胞に導入されると、好都合には完全にまたは部分的に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、ゆえに宿主ゲノムとともに複製する。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現をコントロール可能である。この関連で、これらのベクターを「発現ベクター」と称する。上記のように、それらは自律複製可能であるか、または部分的にもしくは完全に宿主ゲノムに組み込まれる。通常、DNA組み換え技術に好適な発現ベクターはプラスミドの形式をとる。この説明では、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用できる。その理由は、プラスミドが最も頻繁に使用されるベクターの形式であるからである。しかし、本発明はまた、類似の機能を発揮する、ウイルスベクターなどのこれらの他の形式の発現ベクターを包含するものとする。ベクターという用語は、さらにまた、当業者に公知の他のベクター、例えばファージ、ウイルス、例えばSV40、CMV、TMV、トランスポゾン、IS要素、ファスミド、ファージミド、コスミド、および線状または環状DNAを包含するものとする。
組み換え発現ベクターでは、「作動可能な連結」は、目的の核酸分子が、該遺伝子の発現が可能であるように調節シグナルに連結されていることを意味し、それらは、2つの配列が、(例えばin vitro転写/翻訳系で、またはベクターが宿主細胞に導入されるならば、宿主細胞で)該配列に割り当てられた予測される機能を果たすように互いに連結されていることを意味する。
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素(例えばポリアデニル化シグナル)を含むものとする。これらの調節配列は、例えば、Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載され、または: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick and Thompson, chapter 7, 89-108, 該文献中で引用される参考文献を含む、を参照のこと。調節配列は、多数のタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現をコントロールする調節配列および特定の宿主細胞でのみ、および特定の条件下でヌクレオチド配列の直接発現をコントロールする調節配列を包含する。発現ベクターの設計が、形質転換対象の宿主細胞の選択、タンパク質量の減少の程度、などの要因に依存することを当業者は承知している。調節配列の好ましい選択は上に記載され、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどである。調節配列という用語は、調節シグナルという用語によって包含されるとみなされるものとする。いくつかの好都合な調節配列、特にプロモーターおよびターミネーターが上に記載される。一般に、発現に好適な核酸構築物に好都合であると説明される調節配列はベクターに適用可能でもある。
代替法として、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞で核酸配列を発現させることができる。培養昆虫細胞(例えばSf9細胞)でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAc系列(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)およびpVL系列(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)を包含する。上記ベクターは、潜在的に好適なベクターのほんの小さい概略でしかない。さらなるプラスミドが当業者に公知であり、例えば、Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に記載されている。原核細胞および真核細胞に好適なさらなる発現系について、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989のチャプター16および17を参照のこと。
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の方法での使用のための核酸分子または本発明の方法での使用のための核酸構築物、例えば本発明の核酸分子または核酸構築物を含むベクターに関する。該ベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するための宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に有用である。好都合には、該核酸分子は、原核生物または真核生物、または原核生物および真核生物宿主での発現のための調節配列と作動可能に連結されている。さらに、相同組み換えに好適なベクターも本発明の範囲内である。
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の方法で使用可能なベクター、特に本発明のベクターまたは本発明の核酸分子または本発明の核酸構築物で安定にまたは一時的に形質転換された宿主細胞であって、ここに該宿主の膜は、内因的に、本発明のポリペプチドの活性を示していない、宿主細胞に関する。
本発明のさらなる実施形態はまた、トランスジェニック宿主細胞、例えば真核生物または原核生物の宿主または宿主細胞、好ましくはトランスジェニック哺乳類細胞の作製方法であって、本発明の核酸構築物、本発明のベクター、または本発明の核酸分子を宿主細胞に導入するステップを含み、ここに該宿主の膜は、内因的に、本発明のポリペプチドの活性を示していない、方法に関する。
慣用の形質転換またはトランスフェクション技術によってベクターDNAを原核細胞または真核細胞に導入することができる。用語「形質転換」および「トランスフェクション」には、コンジュゲーションおよび形質導入が含まれ、かつ、この関連で使用される場合、外来核酸分子(例えばDNA)を宿主細胞に導入するための、非常に多数の先行技術の方法を包含するものとし、該方法には、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、PEG媒介トランスフェクション、リポフェクション、天然の能力、化学媒介導入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が含まれる。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに好適な方法は、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および他の実験室ハンドブック、例えばMethods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jerseyに見出せる。
宿主生物への核酸分子、ベクターまたは核酸構築物の良好な導入を選択するために、上で詳細にすでに記載されているマーカー遺伝子を使用することが好都合である。植物細胞への核酸の安定なまたは一時的組み込みについて、使用される発現ベクターおよび使用されるトランスフェクション技術に応じて、少数の細胞のみが外来DNAを摂取し、所望であれば、それをそのゲノムに組み込むことが知られている。これらのインテグラント(integrants)を同定および選択するために、選択マーカー(上記、例えば抗生物質耐性)をコードする遺伝子を、通常、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、例えば、耐性に関与する遺伝子、好ましくは抗生物質耐性に関する遺伝子、または、例えば糖またはアミノ酸の生合成の経路での遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ura3またはilv2をコードするマーカーである。遺伝子、例えばルシフェラーゼ、gfpまたは他の蛍光遺伝子をコードするマーカーも同様に好適である。これらのマーカーおよび上記マーカーは、これらの遺伝子が、例えば慣用の方法によって欠失されたために、機能的でない突然変異体で使用することができる。さらに、選択マーカーをコードする核酸分子を、本方法で使用されるヌクレオチド酸分子をコードする核酸分子と同一のベクター上で、あるいは別々のベクター中で宿主細胞に導入することができる。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされている細胞を例えば選択によって同定することができる(例えば、選択マーカーを組み込んでいる細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)。
「レポーター遺伝子」は、上記マーカー遺伝子のように、容易に定量化可能なタンパク質をコードする。これらの遺伝子を用いて、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイもしくは耐性アッセイによって、または光度測定(内色素)もしくは酵素活性によって、形質転換効力または発現部位またはタイミングを評価することができる。この関連で非常に特に好ましいのは、レポータータンパク質(Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44)、例えば「緑色蛍光タンパク質」(GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1):44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5):912-8, 1997)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ(Giacomin, Plant Sci 1996, 116:59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414)、およびルシフェラーゼ遺伝子全般、ベータ-ガラクトシダーゼまたはベータ-グルクロニダーゼ(Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907)またはUra3遺伝子である。
「選択マーカー」は、抗生物質または他の毒性化合物に対する耐性を付与し: この関連で記載される例は、アミノグリコシド抗生物質ネオマイシン(G 418)、カナマイシン、パロマイシン(paromycin)に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737)、突然変異型ジヒドロプテロイル酸シンターゼ(a mutated dihydropteroate synthase)をコードするsul遺伝子(Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1):127-136)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Gen Bank Accession NO: K 01193)およびブレオマイシン抗生物質、例えばゼオシン(zeocin)に対する耐性を付与するshe ble耐性遺伝子である。選択マーカー遺伝子のさらなる例は、2-デオキシグルコース-6-リン酸(WO 98/45456)またはフォスフィノスリシンなどに対する耐性を付与する遺伝子、または代謝拮抗剤に対する耐性を付与する遺伝子、例えばdhfr遺伝子である(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149)。好適な他の遺伝子の例はtrpBまたはhisDである(Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1988) 8047-8051)。別の好適な遺伝子はマンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子(WO 94/20627)、ODC (オルニチンデカルボキシラーゼ)遺伝子(McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.)またはAspergillus terreusデアミナーゼ(Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338)である。
一実施形態では、本発明のベクターまたは核酸構築物は、親和性タグをコードする核酸配列を含む。「親和性タグ」: これは、慣例的なクローニング技術を使用して、直接またはリンカーを用いて、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列にそのコード核酸配列を融合することができるペプチドまたはポリペプチドを表す。親和性タグは、トータル細胞抽出物からのアフィニティークロマトグラフィーを用いる、組み換え標的タンパク質の単離、濃縮および/または特異的精製に役立つ。上記リンカーは、好都合には、プロテアーゼ切断部位(例えばトロンビンまたは因子Xaの切断部位)を含んでよく、それにより、必要な時に標的タンパク質から親和性タグを切断することができる。通常の親和性タグの例は、例えばQuiagen, Hilden製の「Hisタグ」、「Strepタグ」、「Mycタグ」(Invitrogen, Carlsberg)、キチン結合ドメインおよびインテインからなるNew England Biolabs製のタグ、New England Biolabs製のマルトース結合タンパク質(pMal)、およびNovagen製のCBDタグとして知られるタグである。この関連で、親和性タグは、標的タンパク質をコードする配列を有するコード核酸配列の5'または3'末端に取り付けることができる。
本発明の核酸分子は、それによって本発明の核酸配列の機能的等価物を単離することができる、ハイブリダイゼーションプローブの作製に使用することができる。これらのプローブの作製および実験手順は公知である。例えば、これは、PCRを用いる放射性または非放射性プローブの個別の作製および好適に標識されたオリゴヌクレオチドの使用およびその後のハイブリダイゼーション実験を含む。この目的で必要とされる技術は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載される。目的のプローブを、さらに、別の目的で、例えば、他の生物の対応する配列を分析するために、mRNAおよび対応するコード配列と特異的にハイブリダイズするプローブとして、それらを用いることができるように標準的技術(Lit. SDMまたはランダム突然変異誘発)によって改変することができる。該プローブを、例えば目的の昆虫のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーのスクリーニングに、または電子データベース中の類似配列のコンピュータ検索で、使用することができる。
「遺伝子制御配列」: 用語「遺伝子制御配列」は、用語「調節配列」と等価であるとみなされ、原核生物または真核生物での本発明の核酸の転写および、適切であれば、翻訳に対する影響を有する配列を説明する。その例は、プロモーター、ターミネーターまたは「エンハンサー」配列として知られるものである。これらの制御配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、これらの配列の天然の調節は実際の構造遺伝子の前に依然として存在してよく、かつ、適切であれば、該天然の調節のスイッチをオフにし、かつ標的遺伝子の発現が改変され、すなわち増加または減少するように遺伝子改変されていてよい。制御配列の選択は宿主生物または出発生物に依存する。遺伝子制御配列は、さらにまた、遺伝子の5'-非翻訳領域、イントロンまたは非翻訳3'領域を含む。制御配列は、さらに、宿主生物のゲノムへの相同組み換えまたは挿入を可能にするかまたはゲノムからの除去を可能にする配列を意味すると理解される。
「ノックアウト形質転換体」とは、特定の遺伝子が不活性化され、それぞれ特定の遺伝子の活性が、形質転換によって標的化された様式で、低下し、下方制御され(doew regulated)、減少し、または欠失している個々のトランスジェニック生物を表す。
「天然遺伝子環境」とは、元の生物の天然染色体の遺伝子座を表す。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然遺伝子環境は、好ましくは、少なくとも部分的に保持される。該環境は核酸配列の少なくとも5'または3'に隣接し、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも100 bp、特に好ましくは少なくとも500 bp、非常に特に好ましくは少なくとも1 000 bp、および最も好ましくは少なくとも5 000 bpの配列の長さを有する。
「反応時間」とは、活性に関する顕著な知見が得られるまで活性アッセイを実施するために必要な時間を表し; それは、アッセイに用いられるタンパク質の比活性および使用される方法および使用される装置の感度のすべてに依存する。当業者は反応時間の測定に精通している。測光法に基づく殺真菌性活性化合物を同定する方法の場合、反応時間は、概して、> 0〜360分の範囲である。
「組み換えDNA」は、組み換えDNAテクノロジーによって作製できるDNA配列の組み合わせ物を記載する。
「組み換えDNAテクノロジー」: DNA配列を融合するための一般に公知の技術(例えばSambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される技術)である。
「複製起点」は、微生物および酵母での本発明の発現カセットまたはベクターの増殖を確保し、例えばE. coliのpBR322 ori、ColE1またはP15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および酵母のARS1 ori (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068)である。
「標的/標的タンパク質」:
(i) カリウムイオンチャネルおよび/またはそのアクセサリータンパク質のそれぞれ、または
(ii) カリウムイオンチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプ、または
(iii) オクトパミン受容体の活性を有するタンパク質、または
(iv) カリウムイオンチャネル
の活性を有する本発明のポリペプチド、タンパク質である。
すべての作用標的または作用部位は、標的タンパク質の機能的存在が昆虫の生存に必須であるという特徴を共有する。
「形質転換」は、異種DNAを原核細胞または真核細胞に導入するためのプロセスを説明する。形質転換された細胞は、形質転換プロセス自体の産物だけでなく、形質転換プロセスによって作製されたトランスジェニック生物のすべてのトランスジェニック子孫も説明する。
「トランスジェニック」: これは、本発明の核酸配列を含む核酸配列、発現カセットまたはベクターを表すか、または本発明の核酸配列、発現カセットまたはベクターで形質転換された生物を表し、トランスジェニックという用語は、遺伝子工学による方法によって作製されたすべての該構築物を説明し、該構築物では、標的タンパク質の核酸配列または標的タンパク質の核酸配列に作動可能に連結された遺伝子制御配列または上記候補の組み合わせがそれらの天然遺伝子環境ではないか、または組み換えによる方法によって改変されている。この関連で、改変は、例えば、目的の核酸配列の1以上のヌクレオチド残基を突然変異させることによって達成することができる。
一実施形態では、本発明は、殺虫剤標的としての、本発明のポリペプチド、膜または宿主細胞の使用に関する。
Drosophila melanogasterでの昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれをコードする遺伝子の欠失、または電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性の阻害は、Drosophila melanogasterに致死的である。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号７、８; ９、１０; １１、１２; のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはそのホモログの殺虫剤標的としての使用に関する。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、Drosophila melanogasterでの昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれをコードする遺伝子の欠失、またはShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性の阻害は、Drosophila melanogasterに致死的である。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含む核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはそのホモログの殺虫剤標的としての使用に関する。
Gタンパク質共役受容体の場合、Drosophila melanogasteror他の昆虫でのoa2(好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの)、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択される昆虫オクトパミン受容体をコードする遺伝子の欠失、またはoa2(好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの)、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性の阻害は、それぞれ、Drosophila melanogasterまたは他の昆虫に致死的である。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６、１５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはそのホモログの殺虫剤標的としての使用に関する。
SKチャネルの場合、Drosophila melanogasterでの昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルをコードする遺伝子の欠失、または昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性の阻害は、Drosophila melanogasterに致死的である。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる、核酸分子;
(d) 配列番号２２８、２３０、２３２に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４、２３５、２３６; および２３７、２３８;のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはそのホモログの殺虫剤標的としての使用に関する。
本発明は、さらに、以下のもの:
(a) 以下の核酸配列:
(i) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合、配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸配列を有する核酸配列; または
(ii) 遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７、Gタンパク質共役受容体の場合、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４、およびSKチャネルの場合、配列番号２２８、２３０、２３２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳(back translation)によって誘導することができる核酸配列; または
(iii) 核酸配列配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６、Gタンパク質共役受容体の場合、配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３、およびSKチャネルの場合、配列番号２２７、２２９、２３１の機能的等価物
を含む核酸配列と作動可能に連結された遺伝子制御配列
および
(b) 追加の機能的要素; または
(c) (a)および(b)の組み合わせ
を含む核酸構築物または発現カセット
および以下:
(a) 本発明の核酸配列と作動可能に連結されている遺伝子制御配列;
(b) 追加の機能的要素; または
(c) 「in vitro」または「in vivo」アッセイ系での(a)および(b)の組み合わせ
を含む核酸構築物または発現カセットの使用に関する。
本発明は、さらに、in vitroまたはin vivoアッセイ系のための、本発明のポリペプチドを発現するための核酸構築物または発現カセットについての上記実施形態の使用に関する。
一実施形態では、本発明は、殺虫性活性を有する化合物を同定するための、本発明のポリペプチド、膜または宿主細胞の使用に関する。
本発明は、さらに、殺虫性化合物を同定する方法での本発明のポリペプチドの使用に関する。
本発明の方法の好ましい実施形態は、以下のステップ:
i. 試験化合物(群)が本発明のポリペプチドに結合することを可能にする条件下で本発明のポリペプチドを1種以上の試験化合物と接触させるステップ;
ii. 試験化合物が、(i)に記載の本発明のポリペプチドと結合するかどうかを検出するステップ; または
iii. 試験化合物が、(i)に記載の本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出するステップ; または
iv. 試験化合物が、
1. (I)に記載の電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれ、または
2. (i)に記載のShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれ、または
3. (i)に記載のoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体、または
4. (i)に記載の昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネル、
の活性を有するポリペプチドの転写、翻訳または発現を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出するステップ
を含む。
本発明のポリペプチドの活性に関する上記方法のステップiiまたはiiiの検出は、種々のin vitroおよびin vivoアッセイを使用して、例えば電流の測定、膜電位の測定、イオン流動、例えばカリウムまたはルビジウムの測定、カリウム濃度の測定、二次メッセンジャーおよび転写レベルの測定、カリウム依存的酵母増殖アッセイの使用、および例えば電位感受性色素、放射性トレーサー、およびパッチクランプ電気生理学の使用によって評価することができる。
Gタンパク質共役受容体の場合、本発明のポリペプチドの活性に関する上記方法のステップiiまたはiiiの検出は、種々のin vitroおよびin vivoアッセイを使用して、例えば電流の測定、膜電位の測定、イオン流動、例えばカルシウムの測定、好ましくはカルシウム濃度の測定、二次メッセンジャーおよび転写レベルの測定、カリウム依存的酵母増殖アッセイの使用、および例えばカルシウム濃度感受性色素または放射性トレーサーの使用によって評価することができる。
上記方法のステップiiまたはiiiの検出は、タンパク質とリガンドとの間の相互作用を同定する技術を使用して達成することができる。この関連で、試験化合物またはポリペプチドのいずれかは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性同位体、化学発光標識または膜または電位差測定標識を含むことができる。標識の例は、Molecular Devices製の青色膜電位色素、ANEP (アミノナフチルエテニルピリジニウム(AminoNaphthylEthenylPyridinium))色素、例えばジ-4-ANEPPS、ジ-8-ANEPPS、ジ-2-ANEPEQ+、ジ-8-ANEPPQ、ジ-12-ANEPPQ; RH色素(Rina Hildesheimによって最初に合成された)、例えばMolecular Probes製のジアルキルアミノフェニルポリエニルピリジニウム色素のシリーズ、例えばRH 414 (T-1111)、RH 795 (R-649)およびRH 237 (S-1109)からなる群から選択される。RH 421 (S-1108)、またはCarbocyanineおよびOxonolに基づくMolecular Probes製の他の色素は、Seventh Edition of Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals published in 1999に記載される。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、
好ましくは配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６からなる群から選択される昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれで安定にトランスフェクトされたCHO細胞を付するステップ、
少なくとも1種の上記色素、好ましくはMolecular Devices製の青色膜電位色素を0.1〜3時間、好ましくは0.5〜1時間、好ましくは0.45時間ローディングするステップ、
EC50値1〜120 mM、好ましくは10〜60 mM、より好ましくは50 mM KClの濃度でKClの細胞外(extrcellular)レベルの増加させることによってShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれを活性化するステップ、
チャネルの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を、好ましくは1μM〜100 mM、10〜10000μM、好ましくは100〜1000μMの濃度で加えるステップ、
発光、蛍光を測定するステップ、
色素の発光/蛍光のデータをコントロールと比較するステップ
および試験化合物がチャネルの活性を阻害する能力を有するかどうかを判定するステップ
を含む。
Gタンパク質共役受容体の場合、上記方法のステップiiまたはiiiの検出は、タンパク質とリガンドとの間の相互作用を同定する技術を使用して達成することができる。この関連で、試験化合物またはポリペプチドのいずれかは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性同位体、化学発光標識または膜または電位差測定標識を含むことができる。標識の例は、カルシウム濃度感受性色素、例えばFluo-4 Calcium CrimsonTM、Calcium GreenTM、Calcium OrangeTM、Calcium YellowTM、Fura RedTM、Oregon Green(登録商標)、Rhod-3、X-rhod-5F、Fura-2、ビス-fura-2、fluo-5F、fluo-5N、furaデキストラン、fura-4F、fura-5F、fura-6F、fura-FF、fura-FF、quin-2、rhodデキストラン、rhod-2、rhod-5Nまたはrhod-FFまたはSeventh Edition of Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals published in 1999に記載のCarbocyanineおよびOxonolに基づくMolecular Probes製の他の色素の群から選択される。
SKチャネルの場合、本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、
好ましくは配列番号２２７、２２９、２３１からなる群から選択される、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞を付するステップ
少なくとも1種の上記色素、好ましくはMolecular Devices製の青色膜電位色素を2〜6時間、好ましくは〜5時間、好ましくは4時間ローディングするステップ、
100〜500 nM、より好ましくは200 nMのEC50値の濃度のイオノフォア、好ましくはイオノマイシンで小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルを活性化し、それは1〜5μMの濃度で細胞をインキュベートすることを意味する、ステップ、
5〜50μM、5〜20μM、好ましくは10μMの濃度でチャネル(channell)の活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を加えるステップ
発光、蛍光を測定するステップ、
色素の発光/蛍光データをコントロールと比較するステップ
および試験化合物がチャネルの活性を阻害する能力を有するかどうかを判定するステップ
を含む。
本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、好ましくは配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９からなる群から選択される、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれで安定にトランスフェクトされたCHO細胞を付するステップ
少なくとも1種の上記色素、好ましくはMolecular Devices製の青色膜電位色素を0.5〜3時間、好ましくは1.5時間、好ましくは2〜2.5時間ローディングするステップ、
KClの細胞外レベルをEC50値10〜120 mM、好ましくは10〜60 mM、より好ましくは30 mM KClの濃度に増加させることによって、電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれを活性化するステップ、
1〜200μM、5〜100μM、好ましくは25〜30μMの濃度で、チャネルの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を加えるステップ、
発光、蛍光を測定するステップ、
色素の発光/蛍光データをコントロールと比較するステップ
および試験化合物がチャネルの活性を阻害する能力を有するかどうかを判定するステップ
を含む。
本発明のポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物は浴液に直接加えられる。
あるいは、上記方法のステップiiまたはiiiの検出は、パッチクランプ技術を使用して達成することができる。
インサイドアウト、アウトサイドアウト、細胞接着型(cell-attached)、両切取りパッチ(both excised patch)、全細胞パッチおよび穿孔パッチ技術からなる群から選択される基本技術のいくつかのバリエーションを適用することができる。
後の検出は標識に依存し、それは当業者に公知である。
本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、好ましくは配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０からなる群から選択される、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれで安定にトランスフェクトされたCHO-細胞を、室温(22〜25℃)での全細胞構成のパッチクランプ技術に付するステップを含み、ここに、ピペット液で満たされかつ浴液中で測定された場合に2〜3 MOhmの抵抗を有するホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用し、好ましくは浴液とピペット液との間の液間電位差を相殺し、全細胞クランプ条件下で膜電流を測定し、2 kHzでサンプリングしかつ1 kHzでフィルタリングし、細胞を-70mVで保持し、かつ-100から出発して2秒毎に10mV増分で+130mVまでの一群の400ms試験電位パルスを適用し、電流電圧関係に関して測定される振幅を測定し、かつ所定の脱分極電位での最大外向き電流として定義する。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、好ましくは配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７からなる群から選択される昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれで安定にトランスフェクトされたCHO-細胞を、室温(22〜25℃)での全細胞構成のパッチクランプ技術に付するステップを含む。本発明の全細胞電位固定法は、データ収集およびさらなる分析に関して、EPC10デジタル制御増幅器をPATCHMASTERソフトウェアと組み合わせて使用することを含む(HEKA Electronics, Lambrect, Germany)。EPC10はプレパルスを用いて電気容量および漏洩電流の自動減算を提供する。データを66.7 KHzでフィルタリング(-3dB、8ポールBesselローパス)し、5μs/ポイントでデジタル化する。パッチピペットの入力抵抗は2.0〜4.0 MΩである。細胞の電気容量は15.3±2.1 pF (n=45)であった; 残りのシリーズの抵抗(80%相殺までの後)は4.2±0.4 MΩである。液間電位差の補正を通常通り適用した。膜電位を- 100 mVでクランプし、-60 mVから+100 mV (または+60 mV)までの50 ms脱分極パルス(0.1 Hz)によって電流を誘発する。
本発明のポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物は浴液に直接加えられる。
一実施形態では、pClampによるオンラインP/4プロトコールを用いて残留電気容量およびリーク電流の減算を実施する。
Gタンパク質共役受容体の場合、本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、G-アルファ-16プロミスキュアスGタンパク質を安定に発現しかつ、好ましくは配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３からなる群から選択される、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体を安定にまたは一時的に発現するCHO細胞を付するステップ、
少なくとも1種の上記色素、好ましくはFluo-4を0.1〜3時間、好ましくは0.5〜2時間、好ましくは1時間ローディングするステップ、
FLIPRに入れ、2回添加(two-additon)プロトコールを使用して実行し、ここに、試験化合物、オクトパミン受容体をブロックまたは活性化する能力を有すると疑われる化合物を1回目の添加において加えるものとし、3分間インキュベートしておくステップ、
そしてアクチベーターオクトパミンを2回目の添加においてEC80濃度で導入するものとし、蛍光を2分間読み取るステップを含む。コントロールは両添加に関して実行されるものとする。1回目の添加でのベースラインを超える蛍光の増加はアクチベーター候補を示し、かつ2回目の添加において応答が減少するかまたは増加がなければ、インヒビター候補を示す。
後の検出は標識に依存し、それは当業者に公知である。
SKチャネルの場合、本発明の一実施形態では、試験化合物が本発明のポリペプチドの活性を減少させるかまたは阻害するかまたはブロックするかどうかを検出する方法は、好ましくは配列番号２２８、２３０、２３２からなる群から選択される、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルで安定にトランスフェクトされたCHO-細胞を、室温(22〜25℃)で全細胞構成のパッチクランプ技術に付するステップを含み、ここに、ピペット液で満たされかつ浴液中で測定された場合に2〜3 MOhmの抵抗を有するホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用し、好ましくは浴液とピペット液との間の液間電位差を相殺し、全細胞クランプ条件下で膜電流を測定し、2 kHzでサンプリングしかつ1 kHzでフィルタリングし、細胞を-70mVで保持し、かつ-100から出発して2秒毎に10mV増分で+130mVまでの一群の400ms試験電位パルスをアプライし、電流電圧関係に関して測定される振幅を測定し、かつ所定の脱分極電位での最大外向き電流として定義する。
本発明の方法で複数の試験化合物を用いることも本発明の方法において可能である。一群の試験化合物が標的に影響するならば、個々の試験化合物を直接単離するか、または、例えばそれが非常に多数の異なる成分からなる場合、本発明の方法において異なる試験化合物の数を減少させるために試験化合物の群を種々の亜群に分けることのいずれかが可能である。そして個々の試験化合物または、試験化合物の、適切な亜群を用いて本発明の方法を繰り返す。サンプルの複雑さに応じて、好ましくは本発明の方法にしたがって同定された亜群が少数の試験化合物、または実際に1試験化合物のみしか含まなくなるまで、上記ステップを繰り返し実施することができる。
本発明の方法は、好都合には、HTS手順として実施することができる。
HTSは、非常に多数の異なる化合物の同時試験を可能にする。
ハイスループットスクリーニングの質は2つの因子、アッセイウインドウの相対的サイズおよび対照実験から対照実験までのこのアッセイウインドウの安定性(すなわちコントロールの約20アッセイスクリーニングプレートを横断するアッセイシグナルの安定性)によって決定される。これはスクリーニングのz'因子として、式:
Z' = 1-((3σmax + 3σmin) /( Iμmax - μminI))
として表される。
SKチャネルの場合、ハイスループットスクリーニングの質は2つの因子によって決定され、それはアッセイウインドウの相対的サイズであり、この場合、(完全に活性化されたチャネルからのシグナル) - (活性化されていないチャネルからのシグナル)である(通常、任意単位で表記される)。第2の因子は、対照実験から対照実験までのこのアッセイウインドウの安定性(すなわちコントロールの約20アッセイスクリーニングプレートを横切るアッセイシグナルの安定性)である。これはスクリーニングのz'因子として、式:
Z'=1-[3*( σmax + σmin)/Abs(Ave(MAX)-Ave(MIN))]
として表される。
算出されたZ' > 0.5は優れたアッセイとみなされる。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、別法では、Z'因子の計算に以下の式を使用する:
Z' = 1 - ((3*(ST.DEVアゴニスト + ST.DEV Tyrode)/(平均アゴニスト - 平均Tyrode))。
この関連で、本発明に関連するハイスループットスクリーニング法(HTS)に同様に好適である好ましい実施形態を具体的に記載する必要がある:
1. 好ましい実施形態では、本発明の方法のステップii (SKチャネルの場合、変形3)の検出は、以下のステップを包含する: 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、好適な条件下での2つの空間的に隣接する蛍光分子の間の放射線フリーのエネルギー移動に基づく。必須条件は、ドナー分子の発光スペクトルがアクセプター分子の励起スペクトルとオーバーラップすることである。UGPおよび試験化合物を蛍光標識することによって、FRETによって結合を測定することができる(Cytometry 34, 1998, pp. 159-179)。代替法として、本発明の方法は、1の下に記載される「置換アッセイ」の形式をとってもよい。FRETテクノロジーの特に好適な実施形態は、Packard BioScienceから入手できる「ホモジニアス時間分解蛍光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)」(HTRF)である。この様式で同定される化合物はインヒビターとして好適である。
2. 好ましい実施形態では、本発明の方法のステップii (SKチャネルの場合、変形3)の検出は以下のステップを含む: 表面プラズモン共鳴の測定は、表面に固定されたタンパク質に化学物質が結合した時の表面での屈折率の変化に基づく。屈折率の変化は、表面での質量濃度の規定の変化に関して実質的にすべてのタンパク質およびポリペプチドで同一であるから、この方法は原理的に任意のタンパク質に適用することができる(Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187)。例えばBiacore (Freiburg)から入手可能な表面プラズモン共鳴に基づく自動分析器で、現在384サンプル/日までの処理量で測定を実施することができる。本発明の方法は、試験化合物とUGPとの結合を直接測定するように設計することができる。代替法として、本発明の方法は、1の下に記載する「置換アッセイ」の形式をとってもよい。この様式で同定される化合物はインヒビターとして好適である。
3. 好ましい実施形態では、本発明の方法のステップiiの検出は、実施例で開示されるように、Molecular Devices製のFLIPR膜電位アッセイキットの使用を含む。該方法は、マニュアルパッチクランプデータと良好な相関を示す、FLIPR蛍光イメージングプレートリーダー(Fluorometric Imaging Plate Reader)系での電位感受性色素の適用に基づく。
4. 好ましい実施形態では、本発明の方法のステップiiの検出は、BIOMOL化合物スクリーニングまたはBioFocus化合物スクリーニングの使用を含み、2液添加法を使用して、1回の実験でアクチベーターおよびアンタゴニストの検出を可能にするか、または実施例で開示されるように後のBIOMOLおよびBioFocus検証スクリーニングを使用する。
shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットの場合、本発明の方法は、安定な純粋クローン選択、および、好ましくはFLIPR384および/またはFLIPRTETRAまたは両実験に関するFLIPRでの膜電位感受性色素を用いる機能的特徴付け、および電気生理学的技術によって好ましくはCHO-K1細胞で開発された、自在に使えるDrosophila melanogasterのShakerチャネルに関する機能的な細胞に基づくアッセイを示す。
作製されたアッセイはHTS要件を完全に満たし、非常に高いシグナル品質および再現性を示す。
ハイスループットスクリーニングの目的のために、以下のパラメータを記載することができる:
・ アクチベーターKCl濃度: 活性化バッファー中50mM (約EC80)
・ リファレンスZ': 0.60
・ 単一アッセイプレートの最小許容Z': 0.45
・ Hitに関する阻害%閾値: 40%。
本発明の方法の別の実施形態では、上記方法によって同定されるすべての物質を、それらの殺虫性作用に関して後に検査することができる。
さらに、X線構造解析による本発明のポリペプチドの三次元構造の解明を経て、分子モデリングによって殺虫性活性成分に関するさらなる候補を検出する可能性が存在する。X線構造解析に必要なタンパク質結晶の調製、および関連する測定およびこれらの測定の後の評価、タンパク質中の結合部位の検出、および潜在的インヒビター構造の予測は当業者に公知である。原理的に、上記方法によって同定される活性化合物の最適化もまた、分子モデリングによって可能である。
一実施形態では、試験化合物とインキュベートされた本発明のポリペプチドの活性を、コントロール野生型細胞またはステップiiiで試験化合物とインキュベートされていない本発明のポリペプチドの活性と比較する。
この関連で、本発明のポリペプチドの活性の顕著な低下を生じさせる化合物をステップ(iii)で選択し、少なくとも10%の減少、好都合には少なくとも20%、25%、29% 好ましくは少なくとも30%、特に好ましくは少なくとも50%および非常に特に好ましくは少なくとも70%、80%、90%、95% 96%、97%、98%、995、または100%の減少(阻害)が達成される。
本発明は、さらに、本発明の方法によって同定される化合物に関する。これらの化合物は、以下、「選択化合物」と称される。それらは1 000 g/mol未満、好都合には500 g/mol未満、好ましくは400 g/mol未満、特に好ましくは300 g/mol未満の分子量を有する。殺虫性活性化合物は、1μM未満、好ましくは1μM未満、特に好ましくは0.1μM未満、非常に特に好ましくは0.01μM未満のKi値を有する。
上記方法によって同定されかつ/または実施例に示される物質を下記表Iに示す：
Figure 2012507273
Figure 2012507273
Figure 2012507273
Figure 2012507273
Figure 2012507273
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選択化合物は、上で記載される化合物のように、害虫の抑制に好適である。それらの昆虫の例は、Pterygota, Neopetra, Hemiptera, Coleoptera, Diptera, Homoptera, Tenebrionoidea, Tenebrionidae, Tenebrio, Sternorrhyncha, Aphidina, Brachycera, Drosophilidae, DrosophilinaeおよびDrosophilaからなる群から選択され、好ましくは、SKチャネルの場合、モモアカアブラムシ(Myzus persica )および/またはレッドフラワービートル(Red Flower Beetle)(Tribolium castaneum)である。
選択化合物は、農業での害虫の抑制(control)、作物、森林、都市の木、放牧場、ポストハーベスト系(例えば貯蔵穀物)および自然地域の、害虫からの保護、ならびに穀物および/または食物の保存に好適である。
選択化合物は、蔓延(Infestation)の防止に好適であり、非常に大きくなって有害または不快になる害虫集団の成長を妨害しようとする。
本発明では、害虫は、望ましくないかまたは、人、所有物または環境に害を引き起こす任意の昆虫である。ある生物は1つの場所では害虫であるが、別の場所ではそうではない; 例えば、家のシロアリと対比した、森林で枯れ木をリサイクルするシロアリである。
選択化合物は、それらの有用な塩の形式で存在することもできる。好適な有用な塩は、主に、そのカチオンの塩、またはその酸の酸付加塩であり、そのカチオン、またはアニオンは、本発明の方法によって同定される殺虫性活性化合物の殺虫性作用に有害に影響しない。
上記方法によって同定されるすべての化合物は、それらが不斉中心を含めば、純粋なエナンチオマーまたはジアステレオマーの形式またはそれらの混合物の形式およびラセミ化合物としての、本発明の対象である。
選択化合物は、化学合成された物質または微生物によって生産された物質であってよく、例えば植物、動物または微生物の例えば細胞抽出物中に見出せる。反応混合物は無細胞抽出物であるかまたは細胞または細胞培養物を含んでよい。好適な方法は当業者に公知であり、概して、例えばAlberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), 例えばチャプター17に記載されている。
試験化合物候補は、発現ライブラリー、例えば、cDNA発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さい有機物質、ホルモン、PNAなどであってよい(Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198および該文献で引用される参考文献)。
本発明の殺虫性活性を有する化合物は、TMB-8、ニフェジピン、ニトルンジピン(Nitrndipine)、テトランドリン(Tetrandrine)、ベラパミル、メトキシベラパミル、YS035、プロパフェノン、キニジン、スルホンアミド、チアゾリジノン(Thiazolidinones)、インドロン(Indolones)、イソオキサゾリルアミド(Isoxazolylamides)からなる群から選択される。
本発明の方法での使用のために、化合物を通常の製剤、例えば溶液、エマルジョン、懸濁液、粉剤、粉末、ペースト、顆粒および直接スプレー可能な溶液に変換することができる。使用形式は具体的目的および適用方法に依存する。製剤および適用方法は、各事例で本発明の式Iの化合物の微細かつ均一な分布を確保するように選択される。
製剤は、例えば、農芸化学物質の製剤化に好適な補助剤、例えば溶媒および/または担体、所望であれば、乳化剤、界面活性剤および分散剤、保存剤、消泡剤、凍結防止剤、種子処理製剤では、さらにオプションとして着色剤および/または結合剤および/またはゲル化剤で活性化合物を拡張することによって、公知の様式で調製される(例えばレビューに関してはUS 3,060,084, EP-A 707 445 (液体濃縮物に関して), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 and et seq. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8)を参照のこと。
好適な溶媒/担体は例えば以下のものである。
- 溶媒、例えば水、芳香族溶媒(例えばSolvesso製品、キシレンなど)、パラフィン(例えばミネラルフラクション)、アルコール(例えばメタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール)、ケトン(例えばシクロヘキサノン、ガンマ-ブチロラクトン)、ピロリドン(N-メチル-ピロリドン(NMP)、N-オクチルピロリドンNOP)、アセテート(グリコールジアセテート)、乳酸アルキル、ラクトン、例えばg-ブチロラクトン、グリコール、脂肪酸ジメチルアミド、脂肪酸および脂肪酸エステル、トリグリセリド、植物または動物起源の油および変性油、例えばアルキル化植物油。原則的に、溶媒混合物を使用してもよい。
- 担体、例えば挽いて粉にした天然ミネラルおよび挽いて粉にした合成ミネラル、例えばシリカゲル、微粉化されたケイ酸、ケイ酸塩(エステル)、タルク、カオリン、アタクレイ(attaclay)、石灰石、石灰、白亜、ボール(bole)、レス、クレイ、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウムおよび硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、挽いて粉にした合成物質、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素および植物起源の産物、例えば穀類粉、樹皮粉、木粉および堅果殻粉、セルロース粉末および他の固体担体。
好適な乳化剤は、非イオン性およびアニオン性乳化剤(例えばポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホナートおよびアリールスルホナート)である。
分散剤の例はリグニン-亜硫酸パルプ廃液(lignin-sulfite waste liquors)およびメチルセルロースである。
好適な界面活性剤は、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、アルキルアリールスルホナート、硫酸アルキル、アルキルスルホナート、脂肪アルコール硫酸塩、脂肪酸および硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテルのアルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩、さらにスルホン化ナフタレンおよびナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレンまたはナフタレンスルホン酸とフェノールおよびホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコールおよび脂肪アルコール/エチレンオキシド縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステルである。
また、凍結防止剤、例えばグリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールおよび殺菌剤などを製剤に加えることができる。
好適な消泡剤は、例えば、ケイ素またはステアリン酸マグネシウムに基づく消泡剤である。
好適な保存剤は、例えば、ジクロロフェンおよび(und)ベンジルアルコールヘミホルマール(hemiformal)である。
好適な増粘剤は、製剤に擬似塑性流動挙動、すなわち静止時の高い粘性および攪拌段階での低い粘性を付与する化合物である。この関連で、例えば、市販の、多糖に基づく増粘剤、例えばXanthan Gum(登録商標)(Kelco製のKelzan(登録商標))、Rhodopol(登録商標)23 (Rhone Poulenc)またはVeegum(登録商標)(R.T. Vanderbilt製)、または有機フィロシリケート、例えばAttaclay(登録商標)(Engelhardt製)に言及することができる。本発明の分散物に好適な消泡剤は、例えば、シリコーンエマルジョン(例えばSilikon(登録商標) SRE, Wacker or Rhodorsil(登録商標) Rhodia製)、長鎖アルコール、脂肪酸、有機フッ素化合物およびそれらの混合物である。微生物による攻撃に対して本発明の組成物を安定化するために殺生物剤を加えることができる。好適な殺生物剤は、例えば、イソチアゾロンに基づき、例えばAvecia (またはArch)製の商標Proxel(登録商標)またはThor Chemie製のActicide(登録商標) RSおよびRohm & Haas製のKathon(登録商標) MKの下に市販されている化合物である。好適な凍結防止剤は、有機ポリオール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセロールである。これらは、通常、活性化合物組成物の総重量に基づいて、多くとも10重量%の量で用いられる。適切であれば、本発明の活性化合物組成物は、pHを制御するために、調製される製剤の総量に基づいて1〜5重量%のバッファーを含んでよく、使用されるバッファーの量およびタイプは活性化合物または活性化合物群の化学的性質に依存する。バッファーの例は、弱い無機または有機酸、例えば、リン酸、ボロン酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸およびコハク酸のアルカリ金属塩である。
直接スプレー可能な溶液、エマルジョン、ペーストまたは油分散物の調製に好適な物質は、中〜高沸点の鉱油フラクション、例えば灯油またはディーゼル油、さらにコールタール油および植物または動物起源の油、脂肪族、環状および芳香族の炭化水素、例えばトルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレンまたはそれらの誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、強い極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、N-メチルピロリドンおよび水である。
粉末、拡散用の物質および粉剤は、活性物質を固体担体と混合するかまたは同時に挽くことによって調製することができる。
顆粒、例えば被覆顆粒、含浸顆粒(impregnated granules)および均質顆粒(homogeneous granules)は、活性成分を固体担体と結合させることによって調製することができる。固体担体の例は、ミネラルアース(mineral earths)、例えばシリカゲル、ケイ酸塩(エステル)、タルク、カオリン、アタクレイ、石灰石、石灰、白亜、ボール、レス、クレイ、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、挽いて粉にした合成物質、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素および植物起源の産物、例えば穀類粉、樹皮粉、木粉および堅果殻粉(nutshell meal)、セルロース粉末および他の固体担体である。
一般に、製剤は、0.01〜95重量%、好ましくは0.1〜90重量%の活性成分を含む。90%〜100%、好ましくは95%〜100% (NMRスペクトルによる)の純度の活性成分を用いる。
種子処理目的では、それぞれの製剤を2〜10倍希釈して、すぐに使用できる調製物での、重量単位で0,01〜60重量%の活性化合物、好ましくは0,1〜40重量%の濃度にすることができる。
本発明の方法にしたがって同定した化合物は、そのようなものとして、それらの製剤の形式またはそれらから調製された使用形式、例えば、スプレー、噴霧、飛散、拡散または注入(pouring)による、直接スプレー可能な溶液、粉末、懸濁液または分散物、エマルジョン、油分散物、ペースト、飛散性製品(dustable products)、拡散用物質、または顆粒の形式で使用することができる。使用形式は、もっぱら、意図される目的に依存する; それらは、各事例で、本発明の活性化合物のできるだけ細かい分配を確保するよう意図される。
以下に製剤の例を挙げる:
1. 水で希釈される製品。種子処理目的で、希釈されているかまたは希釈されていない種子にそのような製品を適用することができる。
(A) 水溶性濃縮物(SL, LS)
10重量部(parts by weight)の活性化合物を90重量部の水または水溶性溶媒に溶解する。別法として、湿潤剤または他の補助剤を加える。活性化合物は水での希釈で溶解し、それによって10 % (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(B) 分散性濃縮物(DC)
20重量部の活性化合物を70重量部のシクロヘキサノンに溶解し、10重量部の分散剤、例えばポリビニルピロリドンを加える。水での希釈により分散物が得られ、それによって20% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(C) 乳剤(Emulsifiable concentrates)(EC)
15重量部の活性化合物を7重量部のキシレンに溶解し、カルシウムドデシルベンゼンスルホナートおよびヒマシ油エトキシラート(いずれの場合も5重量部)を加える。水での希釈によりエマルジョンが得られ、それによって15% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(D) エマルジョン(EW, EO, ES)
25重量部の活性化合物を35重量部のキシレンに溶解し、カルシウムドデシルベンゼンスルホナートおよびヒマシ油エトキシラート(いずれの場合も5重量部)を加える。乳化装置(例えばUltraturrax)を用いてこの混合物を30重量部の水に導入し、均質なエマルジョンにする。水での希釈によりエマルジョンが得られ、それによって25% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(E) 懸濁液(SC, OD, FS)
攪拌ボールミル中で、20重量部の活性化合物を細かく砕き、10重量部の分散剤、湿潤剤および70重量部の水または有機溶媒を加えて、微細な活性化合物懸濁液を得る。水での希釈により活性化合物の安定な懸濁液が得られ、それによって20% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(F) 水分散性顆粒および水溶性顆粒(WG, SG)
50重量部の活性化合物を細かく挽き、50重量部の分散剤および湿潤剤を加え、技術的装置(例えば射出、噴霧塔、流動床)を用いて水分散性または水溶性顆粒として作製する。水での希釈により活性化合物の安定な分散物または溶液が得られ、それによって50% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(G) 水分散性粉末および水溶性粉末(WP, SP, SS, WS)
75重量部の活性化合物をローター-ステーターミルで挽き、25重量部の分散剤、湿潤剤およびシリカゲルを加える。水での希釈により活性化合物の安定な分散物または溶液が得られ、それによって75% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
(H) ゲル製剤(GF)
攪拌ボールミル中で、20重量部の活性化合物を細かく砕き、10重量部の分散剤、1重量部のゲル化剤 湿潤剤および70重量部の水または有機溶媒を加えて、微細な活性化合物懸濁液を得る。水での希釈により活性化合物の安定な懸濁液が得られ、それによって20% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。
2. 葉面処理に無希釈で適用される製品。種子処理目的で、希釈されているかまたは希釈されていない種子にそのような製品を適用することができる。
(I) 飛散性粉末(DP, DS)
5重量部の活性化合物を細かく挽き、95重量部の微粉化されたカオリンと念入りに混合する。これにより、5% (w/w)の活性化合物を有する飛散性製品が得られる。
(J) 顆粒(GR, FG, GG, MG)
0.5重量部の活性化合物を細かく挽き、95.5重量部の担体と混合し、それによって0.5% (w/w)の活性化合物を有する製剤が得られる。現在の方法は、射出、スプレー乾燥または流動床である。これにより、葉での用途に無希釈で適用される顆粒が得られる。
(K) ULV溶液(UL)
10重量部の活性化合物を90重量部の有機溶媒、例えばキシレンに溶解する。これにより、10% (w/w)の活性化合物を有する製品が得られ、それを、葉での用途に無希釈で適用する。
水性使用形態は、エマルジョン濃縮物、ペーストまたは水和剤(wettable powders)(スプレー可能粉末、油分散物)から、水を加えることによって調製することができる。エマルジョン、ペーストまたは油分散物を調製するために、物質をそのまままたは油もしくは溶媒に溶解して、湿潤剤、粘着剤、分散剤または乳化剤を用いて水中で均質化することができる。あるいは、活性物質、湿潤剤、粘着剤、分散剤または乳化剤および、適切であれば、溶媒または油からなる濃縮物を調製することが可能であり、そのような濃縮物は水での希釈に好適である。
調製済み製品中の活性成分濃度は比較的広い範囲内で変動しうる。一般に、それらは、0.0001〜10%、好ましくは0.01〜1%である。
活性成分を高濃度微量処理(ultra-low-volume process)(ULV)で良好に使用してもよく、95重量%を超える活性成分を含む製剤を適用することが可能であるか、または添加物なしで活性成分を適用することさえ可能である。
本発明の方法では、本発明の方法にしたがって同定された化合物を、他の活性成分とともに、例えば他の農薬(pesticides)、殺虫剤(insecticides)、除草剤、肥料、例えば硝酸アンモニウム、尿素、カリ(potash)、および過リン酸、植物に有害な物質(phytotoxicants)および植物成長調節物質、セーフナー(safeners)および殺線虫剤とともに適用することができる。これらの追加の成分は、上記組成物と逐次でまたは組み合わせて使用することができ、適切であれば、使用直前にのみ加えることもできる(タンク混合)。例えば、他の活性成分での処理の前または後に本発明の組成物を植物(群)にスプレーすることができる。
本発明の化合物とともに使用できかつ潜在的相乗効果が得られるかもしれない以下の農薬リストMは、組み合わせの候補を例示するためのものであり、いかなる限定を課すものでもない。
M.1. 有機(チオ)リン酸: アセフェート(acephate)、アザメチホス(azamethiphos)、アジンホス-エチル(azinphos-ethyl)、アジンホス-メチル(azinphos-methyl)、クロルエトキシホス(chlorethoxyfos)、クロルフェンビンホス(chlorfenvinphos)、クロルメホス(chlormephos)、クロルピリホス(chlorpyrifos)、クロルピリホス-メチル(chlorpyrifos-methyl)、クマホス(coumaphos)、シアノホス(cyanophos)、デメトン-S-メチル(demeton-S-methyl)、ジアジノン(diazinon)、ジクロルボス/ DDVP (dichlorvos/ DDVP)、ジクロトホス(dicrotophos)、ジメトアート(dimethoate)、ジメチルビンホス(dimethylvinphos)、ジスルホトン(disulfoton)、EPN、エチオン(ethion)、エトプロホス(ethoprophos)、ファムフール(famphur)、フェナミホス(fenamiphos)、フェニトロチオン(fenitrothion)、フェンチオン(fenthion)、フルピラゾホス(flupyrazophos)、フォスチアゼート(fosthiazate)、ヘプテノホス(heptenophos)、イソキサチオン(isoxathion)、マラチオン(malathion)、メカルバム(mecarbam)、メタミドホス(methamidophos)、メチダチオン(methidathion)、メビンホス(mevinphos)、モノクロトホス(monocrotophos)、ナレド(naled)、オメトアート(omethoate)、オキシデメトン-メチル(oxydemeton-methyl)、パラチオン(parathion)、パラチオン-メチル(parathion-methyl)、フェントアート(phenthoate)、ホレート(phorate)、ホサロン(phosalone)、ホスメット(phosmet)、ホスファミドン(phosphamidon)、ホキシム(phoxim)、ピリミホス-メチル(pirimiphos-methyl)、プロフェノホス(profenofos)、プロペタンホス(propetamphos)、プロチオホス(prothiofos)、ピラクロホス(pyraclofos)、ピリダフェンチオン(pyridaphenthion)、キナルホス(quinalphos)、スルホテップ(sulfotep)、テブピリムホス(tebupirimfos)、テメホス(temephos)、テルブホス(terbufos)、テトラクロルビンホス(tetrachlorvinphos)、チオメトン(thiometon)、トリアゾホス(triazophos)、トリクロルホン(trichlorfon)、バミドチオン(vamidothion);
M.2. カルバメート: アルジカルブ(aldicarb)、アラニカルブ(alanycarb)、ベンジオカルブ(bendiocarb)、ベンフラカルブ(benfuracarb)、ブトカルボキシム(butocarboxim)、ブトキシカルボキシム(butoxycarboxim)、カルバリル(carbaryl)、カルボフラン(carbofuran)、カルボスルファン(carbosulfan)、エチオフェンカルブ(ethiofencarb)、フェノブカルブ(fenobucarb)、ホルメタネート(formetanate)、フラチオカルブ(furathiocarb)、イソプロカルブ(isoprocarb)、メチオカルブ(methiocarb)、メトミル(methomyl)、メトルカルブ(metolcarb)、オキサミル(oxamyl)、ピリミカルブ(pirimicarb)、プロポキスル(propoxur)、チオジカルブ(thiodicarb)、チオファノクス(thiofanox)、トリメタカルブ(trimethacarb)、XMC、キシリルカルブ(xylylcarb)、トリアザマート(triazamate);
M.3. ピレスロイド: アクリナトリン(acrinathrin)、アレトリン(allethrin)、d-シス-トランスアレトリン(d-cis-trans allethrin)、d-トランスアレトリン(d-trans allethrin)、ビフェントリン(bifenthrin)、ビオアレトリン(bioallethrin)、ビオアレトリンS-シクロペンテニル(bioallethrin S-cylclopentenyl)、ビオレスメトリン(bioresmethrin)、シクロプロトリン(cycloprothrin)、シフルトリン(cyfluthrin)、ベータ-, イフルトリン(beta-, yfluthrin)、シハロトリン(cyhalothrin)、ラムダ-シハロトリン(lambda-cyhalothrin)、ガンマ-シハロトリン(gamma-cyhalothrin)、シペルメトリン(cypermethrin)、アルファ-シペルメトリン(alpha-cypermethrin)、ベータ-シペルメトリン(beta-cypermethrin)、シータ-シペルメトリン(theta-cypermethrin)、ゼータ-シペルメトリン(zeta-cypermethrin)、シフェノトリン(cyphenothrin)、デルタメトリン(deltamethrin)、エンペントリン(empenthrin)、エスフェンバレレート(esfenvalerate)、エトフェンプロックス(etofenprox)、フェンプロパトリン(fenpropathrin)、フェンバレレート(fenvalerate)、フルシトリネート(flucythrinate)、フルメトリン(flumethrin)、タウ-フルバリネート(tau-fluvalinate)、ハルフェンプロックス(halfenprox)、イミプロトリン(imiprothrin)、ペルメトリン(permethrin)、フェノトリン(phenothrin)、プラレトリン(prallethrin)、レスメトリン(resmethrin)、RU 15525、シラフルオフェン(silafluofen)、テフルトリン(tefluthrin)、テトラメトリン(tetramethrin)、トラロメトリン(tralomethrin)、トランスフルトリン(transfluthrin)、ZXI 8901;
M.4. 幼若ホルモン模倣物: ヒドロプレン(hydroprene)、キノプレン(kinoprene)、メトプレン(methoprene)、フェノキシカルブ(fenoxycarb)、ピリプロキシフェン(pyriproxyfen);
M.5. ニコチン受容体アゴニスト/アンタゴニスト化合物: アセタミプリド(acetamiprid)、ベンスルタップ(bensultap)、カルタップ塩酸塩(cartap hydrochloride)、クロチアニジン(clothianidin)、ジノテフラン(dinotefuran)、イミダクロプリド(imidacloprid)、チアメトキサム(thiamethoxam)、ニテンピラム(nitenpyram)、ニコチン、スピノサド(spinosad)(アロステリックアゴニスト)、チアクロプリド(thiacloprid)、チオシクラム(thiocyclam)、チオスルタップ-ナトリウム(thiosultap-sodium)およびAKD1022。
M.6. GABA作動性クロライドチャネルアンタゴニスト化合物: クロルダン(chlordane)、エンドスルファン(endosulfan)、ガンマ-HCH(リンダン(lindane)); アセトプロール(acetoprole)、エチプロール(ethiprole)、フェプロニル(fipronil)、ピラフルプロール(pyrafluprole)、ピリプロール(pyriprole)、バニリプロール(vaniliprole)、以下の式M6.1のフェニルピラゾール化合物
Figure 2012507273
 ;
M.7. クロライドチャネルアクチベーター: アバメクチン(abamectin)、エマメクチン安息香酸塩(emamectin benzoate)、ミルベメクチン(milbemectin)、レピメクチン(lepimectin);
M.8. METI I化合物: フェナザキン(fenazaquin)、フェンピロキシメート(fenpyroximate)、ピリミジフェン(pyrimidifen)、ピリダベン(pyridaben)、テブフェンピラド(tebufenpyrad)、トルフェンピラド(tolfenpyrad)、フルフェネリム(flufenerim)、ロテノン(rotenone);
M.9. METI IIおよびIII化合物: アセキノシル(acequinocyl)、フルアシプリム(fluacyprim)、ヒドラメチルノン(hydramethylnon);
M.10. 酸化的リン酸化の脱共役剤: クロルフェナピル(chlorfenapyr)、DNOC;
M.11. 酸化的リン酸化のインヒビター: アゾシクロチン(azocyclotin)、シヘキサチン(cyhexatin)、ジアフェンチウロン(diafenthiuron)、フェンブタチンオキシド(fenbutatin oxide)、プロパルギット(propargite)、テトラジホン(tetradifon);
M.12. 脱皮かく乱剤(Moulting disruptors): シロマジン(cyromazine)、クロマフェノジド(chromafenozide)、ハロフェノジド(halofenozide)、メトキシフェノジド(methoxyfenozide)、テブフェノジド(tebufenozide);
M.13. 協力剤(Synergists): ピペロニルブトキシド(piperonyl butoxide)、トリブホス(tribufos);
M.14. ナトリウムチャネルブロッカー化合物: インドキサカルブ(indoxacarb)、メタフルミゾン(metaflumizone);
M.15. 燻蒸剤: 臭化メチル、クロロピカリンスルフリルフルオライド(chloropicrin sulfuryl fluoride);
M.16. 選択的摂食ブロッカー: クリロチエ(crylotie)、ピメトロジン(pymetrozine)、フロニカミド(flonicamid);
M.17. ダニ成長抑制物質: クロフェンテジン(clofentezine)、ヘキシチアゾクス(hexythiazox)、エトキサゾール(etoxazole);
M.18. キチン合成インヒビター: ブプロフェジン(buprofezin)、ビストリフルロン(bistrifluron)、クロルフルアズロン(chlorfluazuron)、ジフルベンズロン(diflubenzuron)、フルシクロクスロン(flucycloxuron)、フルフェノクスロン(flufenoxuron)、ヘキサフルムロン(hexaflumuron)、ルフェヌロン(lufenuron)、ノバルロン(novaluron)、ノビフルムロン(noviflumuron)、テフルベンズロン(teflubenzuron)、トリフルムロン(triflumuron);
M.19. 脂質生合成インヒビター: スピロジクロフェン(spirodiclofen)、スピロメシフェン(spiromesifen)、スピロテトラマト(spirotetramat);
M.20. オクトパミン作動性アゴニスト(octapaminergic agonsits): アミトラズ(amitraz);
M.21. リアノジン受容体モジュレーター: フルベンジアミド(flubendiamide);
M.22. 種々の物質: リン化アルミニウム、アミドフルメト(amidoflumet)、ベンクロチアズ(benclothiaz)、ベンゾキシマート(benzoximate)、ビフェナゼート(bifenazate)、ホウ砂(borax)、ブロモプロピレート(bromopropylate)、シアニド、シエノピラフェン(cyenopyrafen)、シフルメトフェン(cyflumetofen)、キノメチオネート(chinomethionate)、ジコホル(dicofol)、フルオロアセテート、ホスフィン、ピリダリル、ピリフルキナゾン(pyrifluquinazon)、硫黄、吐酒石(tartar emetic); 以下のピリミジニルアルキニルエーテル化合物M22.1またはチアジアゾリルアルキニルエーテル化合物M22.2:
Figure 2012507273
 式中、RM-22はメチルまたはエチルであり、かつHet*は、3,3-ジメチルピロリジン-1-イル、3-メチルピペリジン-1-イル、3,5-ジメチルピペリジン-1-イル、3-トリフルオロメチルピペリジン-1-イル(3-trifluormethylpiperidin-1-yl)、ヘキサヒドロアゼピン-1-イル、2,6-ジメチルヘキサヒドロアゼピン-1-イルまたは2,6-ジメチルモルホリン-4-イルである。
M.23. N-R'-2,2-ジハロ-1-R''シクロ-プロパンカルボキサミド-2-(2,6-ジクロロ- アルファ, アルファ, アルファ-トリ-フルオロ-p-トリル)ヒドラゾンまたはN-R'-2,2-ジ(R''')プロピオンアミド-2-(2,6-ジクロロ- アルファ, アルファ, アルファ-トリフルオロ-p-トリル)-ヒドラゾン[式中、R'はメチルまたはエチルであり、ハロはクロロまたはブロモであり、R''は水素またはメチルであり、かつR'''はメチルまたはエチルである];
M.24. アントラニルアミド(Anthranilamides): クロルアントラニリプロール(chloranthraniliprole), 以下の式M24 1の化合物
Figure 2012507273
 ;
M.25. マロノニトリル化合物: CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)5CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2C(CF3)2F, CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2(CF2)3CF3, CF2H(CF2)3CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF3, CF3(CF2)2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3CF2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, 2-(2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル)-2-(3,3,4,4,4-ペンタフルオロブチル)-マロノジニトリル, およびCF2HCF2CF2CF2CH2C(CN) 2CH2CH2CF2CF3;
M.26. 微生物かく乱物質: Bacillus thuringiensis亜種Israelensi, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis亜種Aizawai, Bacillus thuringiensis亜種Kurstaki, Bacillus thuringiensis亜種Tenebrionis。
群Aの市販されている化合物は、他の刊行物のうちでとりわけ、The Pesticide Manual, 13th Edition, British Crop Protection Council (2003)に見出せる。
式M6.1のチオアミドおよびその製造はWO 98/28279に記載されている。レピメクチン(Lepimectin)はAgro Project, PJB Publications Ltd, November 2004から公知である。ベンクロチアズ(Benclothiaz)およびその製造はEP-A1 454621に記載されている。メチダチオン(Methidathion)およびパラオキソン(Paraoxon)およびそれらの製造はFarm Chemicals Handbook, Volume 88, Meister Publishing Company, 2001に記載されている。アセトプロール(Acetoprole)およびその製造はWO 98/28277に記載されている。メタフルミゾン(Metaflumizone)およびその製造はEP-A1 462 456に記載されている。フルピラゾホス(Flupyrazofos)はPesticide Science 54, 1988, p.237-243およびUS 4822779に記載されている。ピラフルプロール(Pyrafluprole)およびその製造はJP 2002193709およびWO 01/00614に記載されている。ピリプロール(Pyriprole)およびその製造はWO 98/45274およびUS 6335357に記載されている。アミドフルメト(Amidoflumet)およびその製造はUS 6221890およびJP 21010907に記載されている。フルフェネリム(Flufenerim)およびその製造はWO 03/007717およびWO 03/007718に記載されている。AKD 1022およびその製造はUS 6300348に記載されている。クロラントラニリプロール(Chloranthraniliprole)はWO 01/70671、WO 03/015519およびWO 05/118552に記載されている。式M24.1のアントラニルアミド(Anthranilamide)誘導体はWO 01/70671、WO 04/067528およびWO 05/118552に記載されている。シフルメトフェン(Cyflumetofen)およびその製造はWO 04/080180に記載されている。アミノキナゾリノン(aminoquinazolinone)化合物ピリフルキナゾン(pyrifluquinazon)はEP A 109 7932に記載されている。アルキニルエーテル化合物M22.1およびM22.2は例えばJP 2006131529に記載されている。マロノニトリル(malononitrile)化合物CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)5CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2C(CF3)2F, CF3(CH2)2C(CN)2(CH2)2(CF2)3CF3, CF2H(CF2)3CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3(CH2)2C(CN)2CH2(CF2)3CF3, CF3(CF2)2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, CF3CF2CH2C(CN)2CH2(CF2)3CF2H, 2-(2,2,3,3,4,4,5,5-オクタフルオロペンチル)-2-(3,3,4,4,4-ペンタフルオロブチル)-マロノジニトリル, およびCF2HCF2CF2CF2CH2C(CN) 2CH2CH2CF2CF3はWO 05/63694に記載されている。
殺真菌性混合パートナーは、以下の化合物からなる群Fから選択されるものである。
F.1 アシルアラニン、例えばベナラキシル(benalaxyl)、メタラキシル(metalaxyl)、オフレース(ofurace)、オキサジキシル(oxadixyl);
F.2 アミン誘導体、例えばアルジモルフ(aldimorph)、ドダイン(dodine)、ドデモルフ(dodemorph)、フェンプロピモルフ(fenpropimorph)、フェンプロピジン(fenpropidin)、グアザチン(guazatine)、イミノクタジン(iminoctadine)、スピロキサミン(spiroxamin)、トリデモルフ(tridemorph);
F.3 アニリノピリミジン(anilinopyrimidines)、例えばピリメタニル(pyrimethanil)、メパニピリム(mepanipyrim)またはシロジニル(cyrodinyl);
F.4 抗生物質、例えばシクロヘキシミド(cycloheximid)、グリセオフルビン(griseofulvin)、カスガマイシン(kasugamycin)、ナタマイシン(natamycin)、ポリオキシン(polyoxin)またはストレプトマイシン;
F.5 アゾール、例えばビテルタノール(bitertanol)、ブロモコナゾール(bromoconazole)、シプロコナゾール(cyproconazole)、ジフェノコナゾール(difenoconazole)、ジニトロコナゾール(dinitroconazole)、エポキシコナゾール(epoxiconazole)、フェンブコナゾール(fenbuconazole)、フルキコナゾール(fluquiconazole)、フルシラゾール(flusilazole)、ヘキサコナゾール(hexaconazole)、イマザリル(imazalil)、メトコナゾール(metconazole)、ミクロブタニル(myclobutanil)、ペンコナゾール(penconazole)、プロピコナゾール(propiconazole)、プロクロラズ(prochloraz)、プロチオコナゾール(prothioconazole)、テブコナゾール(tebuconazole)、トリアジメホン(triadimefon)、トリアジメノール(triadimenol)、トリフルミゾール(triflumizol)、トリチコナゾール(triticonazole)、フルトリアホル(flutriafol);
F.6 ジカルボキシイミド、例えばイプロジオン(iprodion)、ミクロゾリン(myclozolin)、プロシミドン(procymidon)、ビンクロゾリン(vinclozolin);
F.7 ジチオカルバメート、例えばフェルバム(ferbam)、ナバム(nabam)、マネブ(maneb)、マンコゼブ(mancozeb)、メタム(metam)、メチラム(metiram)、プロピネブ(propineb)、ポリカルバメート(polycarbamate)、チラム(thiram)、ジラム(ziram)、ジネブ(zineb);
F.8 複素環式化合物、例えばアニラジン(anilazine)、ベノミル(benomyl)、ボスカリド(boscalid)、カルベンダジム(carbendazim)、カルボキシン(carboxin)、オキシカルボキシン(oxycarboxin)、シアゾファミド(cyazofamid)、ダゾメット(dazomet)、ジチアノン(dithianon)、ファモキサドン(famoxadon)、フェナミドン(fenamidon)、フェナリモル(fenarimol)、フベリダゾール(fuberidazole)、フルトラニル(flutolanil)、フラメトピル(furametpyr)、イソプロチオラン(isoprothiolane)、メプロニル(mepronil)、ヌアリモル(nuarimol)、プロベナゾール(probenazole)、プロキナジド(proquinazid)、ピリフェノクス(pyrifenox)、ピロキロン(pyroquilon)、キノキシフェン(quinoxyfen)、シルチオファム(silthiofam)、チアベンダゾール(thiabendazole)、チフルザミド(thifluzamid)、チオファネート-メチル(thiophanate-methyl)、チアジニル(tiadinil)、トリシクラゾール(tricyclazole)、トリホリン(triforine);
F.9 銅殺真菌剤、例えばボルドー混合物(Bordeaux mixture)、酢酸銅(copper acetate)、オキシ塩化銅(copper oxychloride)、塩基性硫酸銅(basic copper sulfate);
F.10 ニトロフェニル誘導体、例えばビナパクリル(binapacryl)、ジノカップ(dinocap)、ジノブトン(dinobuton)、ニトロフタルイソプロピル(nitrophthalisopropyl);
F.11 フェニルピロール、例えばフェンピクロニル(fenpiclonil)またはフルジオキソニル(fludioxonil);
F.12 ストロビルリン(strobilurins)、例えばアゾキシストロビン(azoxystrobin)、ジモキシストロビン(dimoxystrobin)、フルオキサストロビン(fluoxastrobin)、クレソキシム-メチル(kresoxim-methyl)、メトミノストロビン(metominostrobin)、オリサストロビン(orysastrobin)、ピコキシストロビン(picoxystrobin)またはトリフロキシストロビン(trifloxystrobin);
F.13 スルフェン酸誘導体、例えばカプタホル(captafol)、カプタン(captan)、ジクロフルアニド(dichlofluanid)、ホルペット(folpet)、トリルフルアニド(tolylfluanid);
F.14 シンネムアミド(cinnemamides)およびアナログ、例えばジメトモルフ(dimethomorph)、フルメトベル(flumetover)またはフルモルフ(flumorph);
F.15 硫黄、および他の殺真菌剤、例えばアシベンゾラル-S-メチル(acibenzolar-S-methyl)、ベンチアバリカルブ(benthiavalicarb)、カルプロパミド(carpropamid)、クロロタロニル(chlorothalonil)、シフルフェナミド(cyflufenamid)、シモキサニル(cymoxanil)、ダゾメット(dazomet)、ジクロメジン(diclomezin)、ジクロシメット(diclocymet)、ジエトフェンカルブ(diethofencarb)、エジフェンホス(edifenphos)、エタボキサム(ethaboxam)、フェンヘキサミド(fenhexamid)、フェンチン-アセテート(fentin-acetate)、フェノキサニル(fenoxanil)、フェリムゾン(ferimzone)、フルアジナム(fluazinam)、ホセチル(fosetyl)、ホセチル-アルミニウム(fosetyl-aluminum)、イプロバリカルブ(iprovalicarb)、ヘキサクロロベンゼン、メトラフェノン(metrafenon)、ペンシクロン(pencycuron)、プロパモカルブ(propamocarb)、フタリド(phthalide)、トロクロホス-メチル(toloclofos-methyl)、キントゼン(quintozene)、ゾキサミド(zoxamid)。
適用
有害動物、すなわち昆虫、植物、植物が成長している土壌または水を、当技術分野で公知の任意の適用方法によって、本発明の方法にしたがって同定した本化合物(群)またはそれらを含む組成物(群)と接触させることができる。そのように、「接触」には、直接接触(有害動物または植物- 典型的に植物の葉、茎または根に化合物/組成物を直接適用する)および間接接触(有害動物または植物の場所に化合物/組成物を適用する)の両者が含まれる。
本発明の方法にしたがって同定された式の化合物またはそれらを含む殺虫性組成物を使用し、本発明の方法にしたがって同定された化合物の殺虫性有効量と植物/作物を接触させることによって、有害動物、特に昆虫、コナダニ科(acaridae)またはクモ形動物(arachnids)による攻撃または横行から成長中の植物および作物を保護することができる。用語「作物」とは、成長中および収穫された作物の両者を表す。
さらに、有害標的、その食物供給、生息地、繁殖地またはその場所を、本発明の方法にしたがって同定した化合物の殺虫性有効量と接触させることによって有害動物を抑制することができる。そのように、場所、成長中の作物、または収穫された作物の、害虫による感染の前または後に適用を実施することができる。
本発明の化合物は、害虫の発生が予測される場所に予防的に適用することもできる。
本発明の方法にしたがって同定した化合物を使用して、本発明の方法にしたがって同定した化合物の殺虫性有効量と植物を接触させることによって、害虫による攻撃または横行から成長中の植物を保護してもよい。そのように、「接触」には、直接接触(害虫および/または植物- 典型的に植物の葉、茎または根に化合物/組成物を直接適用する)および間接接触(害虫および/または植物の場所に化合物/組成物を適用する)の両者が含まれる。
「場所(locus)」は、害虫または寄生虫が成長中であるかまたは成長するかもしれない生息地、繁殖地、植物、種子、土壌、地域、材料または環境を意味する。
一般に、「殺虫性有効量」は、成長、死、遅延、予防、および除去、破壊、または他の様式での標的生物の発生および活性の減少に関する観察可能な効果を達成するために必要な活性成分の量を意味する。殺虫性有効量は、本発明で使用される種々の化合物/組成物ごとに変動しうる。組成物の殺虫性有効量も、支配的条件、例えば所望の殺虫性効果および持続時間、天候、標的種、場所、適用様式、などにしたがって変動する。
土壌処理または害虫が住む場所または巣への適用の場合、活性成分の量は0.0001〜500 g / 100 m2、好ましくは0.001〜20 g / 100 m2の範囲である。
材料の保護での通例の適用率は、例えば、処理される材料1 m2 あたり0.01 g〜1000 gの活性化合物であり、望ましくは0.1 g〜50 g / m2である。
材料の含浸での使用のための殺虫性組成物は、典型的に、0.001〜95重量%、好ましくは0.1〜45重量%、より好ましくは1〜25重量%の少なくとも1種の忌避物質および/または殺虫剤を含む。
作物植物の処理での使用では、本発明の活性成分の適用率は、0.1 g〜4000 g /ヘクタール、望ましくは25 g〜600 g /ヘクタール、より望ましくは50 g〜500 g /ヘクタールの範囲であってよい。
式Iの化合物は接触(土壌、ガラス、壁、蚊帳、カーペット、植物部分または動物部分を介して)、および摂取(餌、または植物部分)の両方によって有効である。
本発明の化合物は、非作物害虫、例えばアリ、シロアリ、スズメバチ、ハエ、蚊、コオロギ、またはゴキブリに対して適用してもよい。該非作物害虫に対する使用では、好ましくは式Iの化合物を餌組成物中で使用する。
該餌は、液体、固体または半固体調製物(例えばゲル)であってよい。固体餌は、それぞれの適用に好適な種々の形状および形式、例えば小粒、ブロック、スティック、ディスクに成形することができる。液体餌は、正しい適用を確保するように種々のデバイスに充填することができ、該デバイスは、例えば、オープンコンテナ、スプレーデバイス、液滴源、または蒸発源である。ゲルは水性または油性マトリックスに基づくものであってよく、粘着性、水分保持または経時特性に関する具体的な必要物に製剤化することができる。
組成物中で用いられる餌は、昆虫、例えばアリ、シロアリ、スズメバチ、ハエ、蚊、コオロギなど、またはゴキブリを刺激してそれを食べさせるために十分に魅力的な産物である。該誘引性は摂食刺激剤または性フェロモンを使用することによって操作することができる。食物刺激剤は、例えば、排他的ではないが、動物および/または植物タンパク質(肉-、魚-または血粉、昆虫部分、卵黄)、動物および/または植物起源の脂肪および油、またはモノ-、オリゴ-もしくはポリ有機サッカライド、特にスクロース、ラクトース、フルクトース、デキストロース、グルコース、デンプン、ペクチンまたは、さらには、糖蜜またはハチミツから選択される。果実、作物、植物、動物、昆虫またはそれらの特定部分の新鮮または崩壊部分も摂食刺激剤として有用でありうる。性フェロモンはさらに昆虫特異的であることが知られている。特定のフェロモンは刊行物に記載され、当業者に公知である。
餌組成物での使用では、典型的な活性成分含量は0.001重量%〜15重量%、望ましくは0.001重量%〜5%重量%の活性化合物である。
エアロゾル(例えばスプレー缶中の)、油スプレーまたはポンプスプレーとしての、本発明の方法にしたがって同定した化合物の製剤は、害虫、例えばハエ、ノミ、マダニ、蚊またはゴキブリの抑制のために、非専門的ユーザーに非常に好適である。エアロゾル処方は、好ましくは、活性化合物、溶媒、例えば低級アルコール(例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール)、ケトン(例えばアセトン、メチルエチルケトン)、約50〜250℃の沸点範囲を有するパラフィン炭化水素(例えば灯油)、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、芳香族炭化水素、例えばトルエン、キシレン、水、さらに補助剤、例えば乳化剤、例えばソルビトールモノオレアート、3〜7モルのエチレンオキシドを有するオレイルエトキシラート、脂肪アルコールエトキシラート、香油、例えばエーテル油、中脂肪酸と低級アルコールのエステル、芳香族カルボニル化合物、適切であれば、安定剤、例えば安息香酸ナトリウム、両性界面活性剤、低級エポキシド、オルトギ酸トリエチルおよび、必要であれば、噴射剤、例えばプロパン、ブタン、窒素、圧縮空気、ジメチルエーテル、二酸化炭素、亜酸化窒素、またはこれらのガスの混合物から構成される。
油スプレー製剤は、噴射剤を使用しない点でエアロゾル処方と異なる。
スプレー組成物での使用では、活性成分の含量は0.001〜80重量%、好ましくは0.01〜50重量%、最も好ましくは0.01〜15重量%である。
本発明の方法にしたがって同定した化合物およびそのそれぞれの組成物は、蚊取渦巻および燻蒸渦巻(mosquito and fumigating coils)、スモークカートリッジ(smoke cartridges)、バポライザープレート(vaporizer plates)または長時間バポライザーおよび、さらに、モスペーパー(moth papers)、モスパッド(moth pads)または他の熱非依存的バポライザー系で使用することもできる。
式Iの化合物およびそのそれぞれの組成物を用いて、昆虫によって伝達される感染症(例えばマラリア、デングおよび黄熱病、リンパ性フィラリア症、およびレーシュマニア症)を抑制するための方法はまた、小屋および家の表面を処理するステップ、カーテン、テント、衣料品、蚊帳、ツェツェバエトラップなどのエアースプレーおよび含浸のステップを含む。線維、織物、ニット、不織布、網用材料またはホイルおよび防水布への適用のための殺虫性組成物は、好ましくは、殺虫剤、オプションの忌避物質および少なくとも1種の結合剤を含む混合物を含む。好適な忌避物質は、例えば、N,N-ジエチル-メタ-トルアミド(DEET)、N,N-ジエチルフェニルアセトアミド(DEPA)、1-(3-シクロヘキサン-1-イル-カルボニル)-2-メチルピペリン、(2-ヒドロキシメチルシクロヘキシル)酢酸ラクトン、2-エチル-1,3-ヘキサンジオール、インダロン(indalone)、メチルネオデカンアミド(MNDA)、昆虫抑制に使用されないピレスロイド、例えば{(+/-)-3-アリル-2-メチル-4-オキソシクロペンタ-2-(+)-エニル-(+)-トランス-クリサンテマート(エスビオスリン(Esbiothrin))、植物抽出物に由来するかまたはそれと同一の忌避物質、例えば、リモネン、オイゲノール、(+)-ユーカマロール(1)((+)-Eucamalol (1))、(-)-1-エピ-ユーカマロールまたは、Eucalyptus maculata、Vitex rotundifolia、Cymbopogan martinii、Cymbopogan citratus (レモングラス)、Cymopogan nartdus (シトロネラ(citronella))などの植物由来の粗製植物抽出物である。好適な結合剤は、例えば、脂肪族酸のビニルエステル(例えば酢酸ビニルおよびベルサチン酸ビニル(vinyl versatate))の、アルコールのアクリルおよびメタクリルエステル、例えばブチルアクリラート、2-エチルヘキシルアクリラート、およびメチルアクリラート、モノ-およびジ-エチレン不飽和炭化水素(mono- and di-ethylenically unsaturated hydrocarbons)、例えばスチレン、および脂肪族ジエン、例えばブタジエンのポリマーおよびコポリマーから選択される。
カーテンおよび蚊帳の含浸は、一般に、殺虫剤のエマルジョンまたは分散物に織物材料に浸すかまたはそれをネットにスプレーすることによって行われる。
本発明の方法にしたがって同定した化合物およびその組成物は、木製材料、例えば木、板塀、根太(sleepers)、など、および建造物、例えば家、離れ家、工場、さらに、建設材料、家具、皮革、線維、ビニル物品、電線およびケーブルなどを、アリおよび/またはシロアリから保護するために、およびアリおよびシロアリが作物またはヒト(例えば害虫が家および公共施設に侵入した場合)に害をおよぼさないように抑制するために使用することができる。本発明の方法にしたがって同定した化合物は、木製材料を保護するために周囲の土壌表面または床下の土壌中に適用されるだけでなく、それは、材木物品(lumbered articles)、例えば床下コンクリート、床柱、梁、ベニヤ板、家具、など、木製物品、例えば削片板、半板(half boards)、など、およびビニル物品、例えば被覆電線、ビニルシート、断熱材、例えばスチレンフォーム、などの表面に適用することもできる。作物またはヒトに害をおよぼすアリに対する適用の場合、本発明のアリ抑制剤(ant controller)を作物または周囲の土壌に適用するか、またはアリの巣などに直接適用する。
種子処理
本発明の方法にしたがって同定した化合物はまた、害虫、特に土壌生存害虫から種子を保護するため、および生じる植物の根および発芽を土壌害虫および葉の昆虫から保護するための種子の処理に好適である。
本発明の方法にしたがって同定した化合物は、土壌害虫からの種子の保護および生じる植物の根および発芽の、土壌害虫および葉の昆虫からの保護に特に有用である。生じる植物の根および発芽の保護は好ましい。より好ましいのは、生じる植物の発芽の、貫通型(piercing)および吸引型(sucking)の昆虫からの保護であり、ここに、アブラムシ、特にモモアカアブラムシ(Myzus persica)および/またはレッドフラワービートル(Tribolium castaneum)からの保護が最も好ましい。
したがって、本発明は、昆虫、特に土壌昆虫からの種子の保護、および昆虫、特に土壌および葉の昆虫からの苗の根および発芽の保護のための方法であって、播種前および/またはプレ発芽(pregermination)後の種子を、本発明の方法にしたがって同定した化合物と接触させるステップを含む方法を含む。特に好ましいのは、植物の根および発芽を保護する方法であり、より好ましくは、貫通型および吸引型の昆虫から植物の発芽を保護する方法であり、最も好ましくは、植物の発芽をアブラムシから保護する方法である。
種子という用語は、すべての種類の種子および植物のムカゴを包含し、それには、非限定的に、真正種子(true seeds)、種子片、吸枝、球茎、球根、果実、塊茎、穀粒、切り枝、刈り桑(cut shoots)などが含まれ、好ましい実施形態では、真正種子を意味する。
種子処理という用語は、当技術分野で公知のすべての好適な種子処理技術を含み、例えば種子粉衣(seed dressing)、種子コーティング(seed coating)、種子散粉(seed dusting)、浸種(seed soaking)および種子ペレット化(seed pelleting)である。
本発明はまた、活性化合物でコーティングされた種子または活性化合物を含む種子を含む。
用語「〜でコーティングされ、かつ/またはそれを含む」は、一般に、活性成分の大部分は、適用の時点で、伝播産物の表面上にあるが、適用方法に応じて、多かれ少なかれ、該成分の部分は伝播産物に浸透することを示す。該伝播産物を(再び)植えると、それは活性成分を吸収する。
好適な種子は、穀類、根菜類、油料作物、野菜、香辛料、観賞用の種子、例えばデュラムおよび他のコムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、トウモロコシ(飼料用トウモロコシおよび糖トウモロコシ/スイートコーンおよび飼料用コーン)、ダイズ、油料作物、アブラナ科(crucifers)、綿、ヒマワリ、バナナ、コメ、アブラナ、カブ(turnip rape)、サトウダイコン、飼料用ビート、ナス、ジャガイモ、草、芝生(lawn)、芝(turf)、飼料用草、トマト、リーキ、カボチャ(pumpkin/squash)、キャベツ、アイスバーグレタス、コショウ、キュウリ、メロン、アブラナ種(Brassica species)、メロン、マメ、エンドウマメ、ニンニク、タマネギ、ニンジン、塊茎状植物、例えばジャガイモ、サトウキビ、タバコ、ブドウ、ペチュニア、ゼラニウム/テンジクアオイ、パンジーおよびインパチエンスの種子である。
さらに、活性化合物は、遺伝子工学による方法を含む品種改良のおかげで、除草剤または殺真菌剤または殺虫剤の作用に耐性がある植物由来の種子の処理に使用してもよい。
例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン(imidazolinones)、グルフォシネート-アンモニウムまたはグリフォセート-イソプロピルアンモニウムおよび類似の活性物質からなる群由来の除草剤に耐性である植物由来の種子の処理(例えば、EP-A-0242236, EP-A-242246) (WO 92/00377) (EP-A-0257993, U.S. Pat. No. 5,013,659を参照のこと)または、特定の害虫に対して植物を耐性にするBacillus thuringiensis毒素(Bt毒素)を生産する能力を有するトランスジェニック作物植物、例えば綿(EP-A-0142924, EP-A-0193259)において、活性化合物を用いることができる。さらに、例えば従来の品種改良法および/または突然変異体の作製、または組み換え手順によって作製できる、既存の植物consistと比較して改変された特性を有する植物由来の種子の処理にも、活性化合物を使用することができる)。例えば、植物で合成されるデンプンを改変する目的での作物植物の組み換え改変について(例えばWO 92/11376, WO 92/14827, WO 91/19806)、または改変された脂肪酸組成を有するトランスジェニック作物植物について(WO 91/13972)のいくつかの事例が報告されている。
活性化合物の種子処理適用は、植物の播種前および植物の発生前に種子にスプレーするかまたは散布することによって実施される。
種子処理に特に有用な組成物は、例えば、以下の組成物である。
A 可溶性濃縮物(SL, LS)
D エマルジョン(EW, EO, ES)
E 懸濁液(SC, OD, FS)
F 水分散性顆粒および水溶性顆粒(WG, SG)
G 水分散性粉末および水溶性粉末(WP, SP, WS)
H ゲル製剤(GF)
I 飛散性粉末(DP, DS)。
慣用の種子処理製剤には、例えば流動性濃縮物FS、溶液LS、乾燥処理用粉末DS、スラリー処理用水分散性粉末WS、水溶性粉末SSおよびエマルジョンESおよびECおよびゲル製剤GFが含まれる。これらの製剤は希釈するかまたは希釈せずに種子に適用することができる。種子への適用は、播種前に、直接、種子に対して実施されるか、または種子をプレ発芽させた後に実施される。
好ましい実施形態では、FS製剤を種子処理に使用する。典型的に(Typcially)、FS製剤は、1〜800 g/lの活性成分、1〜200 g/lの界面活性剤、0〜200 g/lの凍結防止剤、0〜400 g/lの結合剤、0〜200 g/lの色素および1リットルまでの溶媒、好ましくは水を含む。
種子処理用の、本発明の方法にしたがって同定した化合物の特に好ましいFS製剤は、通常、0.1〜80重量% (1〜800 g/l)の活性成分、0.1〜20重量% (1〜200 g/l)の少なくとも1種の界面活性剤、例えば0.05〜5重量%の湿潤剤および0.5〜15重量%の分散剤、20重量%まで、例えば5〜20 %の凍結防止剤、0〜15重量%、例えば1〜15重量%の色素および/または染料、0〜40重量%、例えば1〜40重量%の結合剤(ステッカー(sticker)/接着剤)、オプションの、5重量%まで、例えば0.1〜5重量%の増粘剤、オプションの、0.1〜2 %の消泡剤、および例えば0.01〜1重量%の量のオプションの保存剤、例えば殺生物剤、酸化防止剤など、および100重量%までの充填剤/ビヒクルを含む。
種子処理製剤は、さらに、結合剤およびオプションの着色剤を含んでもよい。
処理後の種子への活性物質の接着を向上させるために結合剤を加えることができる。好適な結合剤は、アルキレンオキシド、例えばエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのホモ-およびコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびそれらのコポリマー、エチレン-酢酸ビニルコポリマー、アクリルホモ-およびコポリマー、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミドおよびポリエチレンイミン、多糖、例えばセルロース、チローゼおよびデンプン、ポリオレフィンホモ-およびコポリマー、例えばオレフィン/無水マレイン酸コポリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリスチレンホモおよびコポリマーである。
随意に、着色剤を製剤に含ませることもできる。種子処理製剤に好適な着色剤または染料は、Rhodamin B, C.I. Pigment Red 112, C.I. Solvent Red 1, pigment blue 15:4, pigment blue 15:3, pigment blue 15:2, pigment blue 15:1, pigment blue 80, pigment yellow 1, pigment yellow 13, pigment red 112, pigment red 48:2, pigment red 48:1, pigment red 57:1, pigment red 53:1, pigment orange 43, pigment orange 34, pigment orange 5, pigment green 36, pigment green 7, pigment white 6, pigment brown 25, basic violet 10, basic violet 49, acid red 51, acid red 52, acid red 14, acid blue 9, acid yellow 23, basic red 10, basic red 108である。
ゲル化剤の例はカラゲーン(Satiagel(登録商標))である。
種子の処理では、化合物Iの適用率は、一般に、種子100 kgあたり0.1 g〜10 kg、好ましくは種子100 kgあたり1 g〜5 kg、より好ましくは種子100 kgあたり1 g〜1000 g、特に種子100 kgあたり1 g〜200 gである。
したがって、本発明はまた、本明細書中で規定されるように、本発明の方法にしたがって同定した化合物、または農業上有用なIの塩を含む種子に関する。本発明の方法にしたがって同定した化合物または農業上有用なその塩の量は、一般に、種子100 kgあたり0.1 g〜10 kg、好ましくは種子100 kgあたり1 g〜5 kg、特に種子100 kgあたり1 g〜1000 gで変動する。特定の作物、例えばレタスでは、適用率は高くなりうる。
一実施形態では、本発明は、以下のようにまとめた発明対象に関する。
項目a1. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法。
項目a2. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞の膜中で発現させる、項目a1に記載の方法。
項目a3. 前記膜が、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号３、４; ７、８; １１、１２; １５、１６、１９、２０; ２３、２４; ２７、２８および/または３１、３２のそれぞれのプライマーを使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得される、ポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む、項目1または2のいずれか一項目の方法。
項目a4. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有する該ポリペプチドの活性を電気生理学的に測定する、項目a1の方法。
項目a5. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有する該ポリペプチドの活性をパッチクランプ法によってまたはHTSアッセイで測定する、項目a4の方法。
項目a6. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳類細胞で発現させる、項目a2の方法。
項目a7. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、CHO細胞およびHEK293からなる群から選択される哺乳類細胞で発現させる、項目a2の方法。
項目a8. 以下のステップ:
(a) (e) 昆虫、昆虫集団または、該昆虫を抑制しようとする場所に、項目aa1 (d)にしたがって同定した化合物の昆虫抑制量を適用するステップおよび
(b) (f) 該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の、および無処理の昆虫、昆虫集団または場所の、増殖または生存度を測定するステップおよび
(c) (g) ステップ(e)の化合物の適用後の、該処理された昆虫もしくは昆虫集団のまたは該場所の昆虫もしくは昆虫集団の増殖または生存度を減少させる化合物を選択するステップ
を含む、項目a1の方法。
項目a9. 項目a3 (a)〜3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子、およびこの核酸分子の発現に基づく、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの生物学的活性を有するポリペプチドが、埋め込まれているか、組み立てられているか、挿入されているか、または組み組み込まれている、宿主生物、組織、細胞またはその細胞消化物または膜を含む、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するためのアッセイ系。
項目a10. 宿主生物が、項目a3 (a)〜3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子を発現する安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞である、項目a9のアッセイ系。
項目a11. 哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12およびU2OSからなる群から選択される、項目a10のアッセイ系。
項目a12. 昆虫を死滅させるかまたは昆虫の増殖もしくは生存度を阻害するための方法であって、項目a1の方法にしたがって同定した化合物を昆虫に適用するステップを含む方法。
項目a13. 以下の核酸分子:
(a) ２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列、または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号３、４; ７、８; １１、１２; １５、１６; １９、２０; ２３、２４; ２７、２８および/または３１、３２のそれぞれのプライマーを使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得される、ポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつカリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子。
項目a14. 項目a13に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
項目a15. 項目a14に記載の核酸構築物または項目a13に記載の核酸分子を含む、ベクター。
項目a16. 項目a15に記載のベクター、項目a14に記載の核酸構築物または項目a13に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック細胞。
項目a17. 項目a13に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
項目a18. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目a19. 項目a3 (a)〜3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目a20. 表Iに記載の少なくとも1種の化合物またはその誘導体を殺虫性活性成分として含む組成物を適用することを含む、殺虫剤害虫抑制方法。
項目b1. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティック(Hyperkinetic)ベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法。
項目b2. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞の膜で発現させる、項目b1に記載の方法。
項目b3. 膜が、以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含む核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む、項目b1またはb2のいずれか一項目の方法。
項目b4. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有する該ポリペプチドの活性を電気生理学的に測定する、項目b1の方法。
項目b5. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有する該ポリペプチドの活性をパッチクランプ法またはFLIPRによって測定する、項目b4の方法。
項目b6. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳類細胞で発現させる、項目b2の方法。
項目b7. 昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、CHO細胞、HEK293からなる群から選択される哺乳類細胞で発現させる、項目b2の方法。
項目b8. 以下のステップ:
(e) 昆虫、昆虫集団または、該昆虫を抑制しようとする場所に、項目b1 (d)にしたがって同定される化合物の昆虫抑制量を適用するステップおよび
(f) 該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の、および無処理の昆虫、昆虫集団または場所の、増殖または生存度を測定するステップおよび
(g) ステップ(e)の化合物の適用後の、該処理された昆虫もしくは昆虫集団のまたは該場所の昆虫もしくは昆虫集団の増殖または生存度を減少させる化合物を選択するステップ
を含む、項目b1の方法。
項目b9. 項目b3 (a)〜b3 (j)に記載の核酸分子からなる群から選択される核酸分子、およびこの核酸分子の発現に基づく、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの生物学的活性を有するポリペプチドが、埋め込まれているか、組み立てられているか、挿入されているか、または組み入れられている、宿主生物、組織、細胞またはその細胞消化物または膜を含む、昆虫Shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するためのアッセイ系。
項目b10. 宿主生物が、項目b3 (a)〜b3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子を発現する、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞である、項目b9のアッセイ系。
項目b11. 哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OSからなる群から選択される、項目b10のアッセイ系。
項目b12. 昆虫を死滅させるかまたは昆虫の増殖もしくは生存度を阻害するための方法であって、項目b1の方法にしたがって同定した化合物を昆虫に適用するステップを含む方法。
項目b13. 以下の核酸分子:
(a) 配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に示されるポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含む核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５および/または８７に記載のポリペプチド配列を含むポリペプチドから誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および/または８６に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつShakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１０２および/または１０３のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４および/または１２５および/または１２６、１２７および/または１２８のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号８８、８９; ９０、９１; ９２、９３; ９４、９５; ９６、９７; ９８、９９および/または１００、１０１のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつShakerチャネルおよびハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子。
項目b14. 項目b13に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
項目b15. 項目b14に記載の核酸構築物または項目b13に記載の核酸分子を含む、ベクター。
項目b16. 項目b15に記載のベクター、項目b14に記載の核酸構築物または項目b13に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック細胞。
項目b17. 項目b13に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
項目b18. 昆虫Shakerチャネルおよびハイパーキネティックベータサブユニット、好ましくはH-kvベータサブユニットAもしくはCサブタイプのそれぞれの活性を有するポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目b19. 項目b3 (a)〜b3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目c1. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法。
項目c2. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞の膜で発現させる、項目c1に記載の方法。
項目c3. 膜が、以下の核酸分子:
(a) 配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子
(d) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６; １５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子;
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む、項目c1またはc2のいずれか一項目の方法。
項目c4. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有する該ポリペプチドの活性を蛍光測定によって測定する、項目c1の方法。
項目c5. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有する該ポリペプチドの活性をカルシウム濃度感受性色素を用いて測定する、項目c2の方法。
項目c6. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳類細胞で発現させる、項目c2の方法。
項目c7. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、CHO細胞、HEK293からなる群から選択される哺乳類細胞で発現させる、項目c2の方法。
項目c8. 以下のステップ:
(e) 昆虫、昆虫集団または、該昆虫を抑制しようとする場所に、項目c1 (d)にしたがって同定される化合物の昆虫抑制量を適用するステップおよび
(f) 該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の、および無処理の昆虫、昆虫集団または場所の、増殖または生存度を測定するステップおよび
(g) ステップ(e)の化合物の適用後の、該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の増殖または生存度を減少させる化合物を選択するステップ
を含む、項目c1の方法。
項目c9. 項目c3 (a)〜c3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子、およびこの核酸分子の発現に基づく、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の生物学的活性を有するポリペプチドが、埋め込まれているか、組み立てられているか、挿入されているか、または組み入れられている、宿主生物、組織、細胞またはその細胞消化物または膜を含む、oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するためのアッセイ系。
項目c10. 宿主生物が、項目c3 (a)〜c3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子を発現する、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞である、項目c9のアッセイ系。
項目c11. 哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OSからなる群から選択される、項目c10のアッセイ系。
項目c12. 昆虫を死滅させるかまたは昆虫の増殖もしくは生存度を阻害するための方法であって、項目c1の方法にしたがって同定した化合物を昆虫に適用するステップを含む方法。
項目c13. 以下の核酸分子:
(a) ２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２および/または４６に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０および/または１７４に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９および/または１７３に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号１７７、１７８および/または１７９のそれぞれに示されるコンセンサス配列または配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および/または１９０、および/または１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７および/または２０８、および/または２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５および/または２２６のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号１３１、１３２; １３５、１３６; １３９、１４０; １４３、１４４; １４７、１４８; １５１、１５２; １５５、１５６; １５９、１６０; １６３、１６４; １６７、１６８; １７１、１７２および/または１７５、１７６のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつoa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子。
項目c14. 項目c13に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
項目c15. 項目c14に記載の核酸構築物または項目c13に記載の核酸分子を含む、ベクター。
項目c16. 項目c15に記載のベクター、項目c14に記載の核酸構築物または項目c13に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック細胞。
項目c17. 項目c13に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
項目c18. oa2、好ましくはDrosophila melanogaster由来のもの、Oamb、Oct-ベータ-2RおよびOct-ベータ-3Rからなる群から選択されるオクトパミン受容体の活性を有するポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目c19. 項目c3 (a)〜c3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目c20. マンセリン(manserin)および/またはシプロヘプタジンの、殺虫性活性成分としての使用。
項目d1. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
(a) 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
(b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
(c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
(d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
を含む方法。
項目d2. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞の膜で発現させる、項目d1に記載の方法。
項目d3. 膜が、以下の核酸分子:
(a) 配列番号２２８、２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２２８、２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２２７、２２９、２３１に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４; ２３５、２３６; ２３７、２３８のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む、項目d1またはd2のいずれか一項目の方法。
項目d4. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有する該ポリペプチドの活性を電気生理学的に測定する、項目d1の方法。
項目d5. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有する該ポリペプチドの活性をパッチクランプ法によって測定する、項目d4の方法。
項目d6. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳類細胞で発現させる、項目d2の方法。
項目d7. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、CHO細胞、HEK293からなる群から選択される哺乳類細胞で発現させる、項目d2の方法。
項目d8. 以下のステップ:
(e) 昆虫、昆虫集団または、該昆虫を抑制しようとする場所に、項目d1 (d)にしたがって同定される化合物の昆虫抑制量を適用するステップおよび
(f) 該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の、および無処理の昆虫、昆虫集団または場所の、増殖または生存度を測定するステップおよび
(g) ステップ(e)の化合物の適用後の、該処理された昆虫もしくは昆虫集団のまたは該場所の昆虫もしくは昆虫集団の増殖または生存度を減少させる化合物を選択するステップ
を含む項目d1の方法。
項目d9. 項目d3 (a)〜d3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子、およびこの核酸分子の発現に基づく、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの生物学的活性を有するポリペプチドが、埋め込まれているか、組み立てられているか、挿入されているか、または組み入れられている、宿主生物、組織、細胞またはその細胞消化物または膜を含む、昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するためのアッセイ系。
項目d10. 宿主生物が、項目d3 (a)〜d3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子を発現する、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞である、項目d9のアッセイ系。
項目d11. 哺乳類細胞が、CHO細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞その他、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12、U2OSからなる群から選択される、項目d10のアッセイ系。
項目d12. 昆虫を死滅させるかまたは昆虫の増殖もしくは生存度を阻害するための方法であって、項目d1の方法にしたがって同定した化合物を昆虫に適用するステップを含む方法。
項目d13. 以下の核酸分子:
(a) 配列番号２３０、２３２に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
(b) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子;
(c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２３０、２３２に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
(d) 配列番号２２９、２３１に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
(e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
(g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
(h) 配列番号２３９に示されるコンセンサス配列または配列番号２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２および２５３からなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
(i) 配列番号２３３、２３４; ２３５、２３６; ２３７、２３８のそれぞれのプライマーを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得されるポリヌクレオチドを含む核酸分子;
および
(j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子
からなる群から選択される核酸分子。
項目d14. 項目d13に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
項目d15. 項目d14に記載の核酸構築物または項目d13に記載の核酸分子を含む、ベクター。
項目d16. 項目d15に記載のベクター、項目d14に記載の核酸構築物または項目d13に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック細胞。
項目d17. 項目d13に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
項目d18. 昆虫小コンダクタンスCa2+活性化カリウムチャネルの活性を有するポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
項目d19. 項目d3 (a)〜d3 (j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用。
実施例
細胞生物学
分子生物学: EcoR1制限部位を使用して、完全長Shal CDS (コード配列)をpcDNA3/Neo(-)発現ベクターにサブクローニングした。Shal_delN突然変異体は2〜40 aa(アミノ酸)コード領域のN末端欠失を有する。Shal_del_2-4aa_fwd (5' gcagaattcgcccttgccaccatggagaagctcctga tcaacgtctccgg-3')およびShal_del_2-4aa_rev (5'- ccggagacgttgatcaggagcttctccatggtggcaagggc gaattctgc-3')プライマーおよびXL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を使用して、pcDNA3_Shal構築物に欠失突然変異を挿入した。部位特異的突然変異誘発によってpcDNA_ShalおよびpcDNA_Shal_delN構築物中でATG開始コドンの前に唯一のAscI制限部位を挿入した。完全長ShalおよびShal_delN挿入物をpcDNA3_AcGFPC1ベクター(AscIおよびHindIII制限部位)にサブクローニングして、AcGFPキメラ(図１)を得た。つまり、これらの両構築物のN末端にAcGFPがタグ付けされている。すべての構築物のShalコード領域の二本鎖双方をシークエンシングして、配列の完全性を確認した。孔領域(pore region)の362位のトリプトファン(W)をフェニルアラニン(F)に変化させることによって、ドミナントネガティブShal_DelNW362F突然変異体を作製した。Shalアクセサリータンパク質であるKChIPをショウジョウバエからクローニングし、pcDNA3.1/Zeoベクターにサブクローニングした。
図１: 主要なShalクローン。構築物の主な特徴を示す主要なShalクローンの、Vector NTIによって作製された地図。Shalコード領域の長さは1473 bpである。
図２: 主要なKChIPクローン。構築物の主な特徴を示す主要なKChIPクローンの、Vector NTIによって作製された地図。KChIPコード領域の長さは621 bpである。発現構築物、pcDNA3.1-Zeo-KChIP-intron1 (データは示していない, ノート1049294 #5)は、クローニングを支援するための約700bpイントロンを含み、CMVプロモーターの下流にKChIP ORFを配置する。
図３: ShalおよびKChIP発現構築物。pcDNA3/AcGFP-ShalおよびpcDNA3/AcGFP-ShaldelN2-40aaの地図およびVector NTI pcDNA3_ShalDelNおよびpcDNA3_Zeo_KCHiP_intron1構築物へのリンク。
図４: AmCyanならびにAcGFPタグ付きバージョンと共発現された場合の完全長および末端切断型構築物ShalおよびShal_delNのパッチクランプデータ(上)。GFP-Shal孔突然変異体の概略図ならびに野生型および孔突然変異体のパッチクランプデータ。測定された電流が、上方制御された内因性電流ではなく、過剰発現されたShalに実際に起因することを示す(下)。
哺乳類細胞での発現: 野生型および突然変異体ShalチャネルをCHO細胞で一時的に発現させ、全細胞電位固定記録によって48時間の時点での機能を検査した。タグ付けされていないShal構築物をpcDNA3_AmCyanと共トランスフェクトした。完全長ShalおよびShal_delN突然変異体は機能的チャネル活性を媒介した。アミノ末端のGFPタグはチャネル機能を変化させなかった。Shal_delN-W362F突然変異体は機能的チャネルを構成しなかった。
安定なセルライン作製: FuGene Transfection Reagent (Roche)を使用して、AcGFP-ShalおよびAcGFP-Shal_delN DNAで野生型CHO細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後にG418 (900ug/ml)で細胞を選択することによって安定なクローン系統を作製した。各構築物ごとに25コロニーを選び、蛍光顕微鏡を使用してGFP発現を評価した。クローン系統の70〜75%は、非常に弱いGFP発現しか有さないか、またはGFP発現を有さなかった。蛍光評価に基づいて、一部の高および中程度GFP発現クローン系統のShal活性をパッチクランプ法によって検査した(表1)。Shal_delNクローン(クローン10 & 15)は完全長Shalクローンより高い電流密度を有した。ゆえに、これらの2クローンを用いてアッセイの開発を進めた。
Figure 2012507273
Molecular Devices青色膜電位色素を使用したFLIPRでShal_DelN C10およびC15の機能を検査した。96ウェルCostarプレートの完全培地中に60K細胞/ウェルで細胞をまき、24時間の時点で機能をアッセイした。15〜60 mM KClでの脱分極は、該クローン系統で、pcDNAコントロールセルラインより2〜2.8倍高い活性を生じさせた(図５)。クローン10はクローン15よりわずかに高い活性を有した。
図５: KCl脱分極を用いるFLIPRで検査されたShal_DelNクローン。
発明者らはまた、FLIPRでチャネル活性に関するいくつかの既知のKチャネルブロッカーを検査した(図６)。Bay K8644、ニカルジピン、キニジンおよびニフルム酸は、Shal_delNクローン系統およびコントロールpcDNA3セルラインの両方でKCl脱分極の用量依存的阻害を示した。フレカイニドは、検査された濃度で、クローンおよびコントロールセルラインに関するいかなる阻害も示さなかった。Shal_delNクローンセルラインは細胞継代とともにそのGFP発現およびアッセイウインドウを失った。第12継代の時点で、細胞集団の10〜15%しか、GFP陽性でなかった。
図６: FLIPRで検査されたKチャネルブロッカー阻害曲線。
流動選別(flow-sorting)によってShal_delN C10細胞をサブクローニングした。細胞を96ウェル組織培養プレートへ流動選別して、GFP陽性単一細胞を得た。いくつかのクローン系統を増殖させ、FLIPRでKCl脱分極を使用して機能を検査した(図７)。
図７: FLIPRでのKCl脱分極によるShal_delN Clone10サブクローンのスクリーニング。
FLIPRデータに基づいて、クローン10-2、10-3および10-6をパッチクランプ法によってさらに検査した(図８)。クローン10-3および10-6は全細胞パッチクランプ研究で高い電流を示した。
図８: クローン10-2、10-3および10-6のパッチクランプデータ。印加電圧と電流との関係を示すIV曲線。
Shal-delNクローン10-3サブクローンは、数代の細胞継代にわたってGFP発現を維持した。第12継代の時点で、細胞集団の約80〜85%がGFP陽性であった(図９)。
図９: 経時的な蛍光の安定性を示す、第12継代の時点でのShal_DelN C10-3細胞。左パネル - 蛍光励起、右パネル - 通常光。
アッセイウインドウの増加:
Shal_delN機能に関するバリウム(Ba2+)の影響を検査した。バリウムは、いくらかのオープン整流(open rectifier)および内向き整流Kチャネル活性を阻害することが知られている。BaCl2の存在下でRTで1時間、細胞に色素を負荷し、KCl脱分極を使用してFLIPRでチャネル活性化をアッセイした。4〜5mMの濃度でのBa2+はCHO_pcDNA3コントロール細胞での蛍光応答を顕著に減少させたが、KCl脱分極に伴うShal_delNチャネル活性のいかなる顕著な減少もなかった(図１０)。
図１０: FLIPRでのShalチャネル活性に対するBaCl2の影響。
クローン10-3は、Ba2+の存在下でのFLIPRで、クローン10-6より高いアッセイウインドウを有した。電気生理学によって示されるようにShal外向き電流はBa2+によって阻害されなかった。考えは、pcDNA3細胞で、Ba2+が内因性外向きK+電流を阻害して、細胞内カリウムの蓄積をもたらし、したがって細胞の脱分極をもたらすことである。すなわち、外液中の0.5mM KCl、漸増Ba2+濃度の場合、膜電位は増加し、野生型細胞アッセイウインドウは5mM BaCl2で完全に崩壊する。対照的に、Shal_delNクローン10-3セルラインは、5mM Ba2+で、依然として、顕著なShal外向きK+電流活性を有し、アッセイウインドウを生じさせる。Shal_delNクローン10-3細胞の機能を第20継代までFLIPRで検査した(P20, 図１１)。該細胞は、P20での継代ウインドウで、依然として、顕著なアッセイウインドウを有した。しかし、細胞継代の増加に伴ってウインドウのサイズは減少する。
図１１: 第20継代の時点でのFLIPRでのShal_delN C10-3機能。
アクセサリータンパク質の共発現による増加電流: 一部のイオンチャネルでは、図１２に示されるように、アクセサリータンパク質の共発現によって電流を増加させることができる。
図１２: Shal_delNを安定に発現するCHO-K1細胞をモック(mock；偽)トランスフェクトする(赤色トレース, 下側ライン)か、またはKChIPと共トランスフェクトした(青色トレース, 上側ライン)。
追加の電気生理学
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を(a) ショウジョウバエShal遺伝子(b) ショウジョウバエShal孔突然変異体遺伝子および(c) ショウジョウバエShal + KChIP遺伝子でトランスフェクトし、すべての測定に使用した。実験の2〜6時間前に細胞を35 mmペトリ皿に入れた。
データを取得し、pClampソフトウェア(バージョン9.0.1.16)を使用して解析した。室温(22〜25℃)で電位固定細胞に対して全細胞構成のパッチクランプ技術を使用した。DMZ Universal Puller (Zeitz, Munich, Germany)を使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー(#8250, Garner Glass, Claremont, CA)からピペットを引き出し、それはピペット液で充填されて浴液中で測定された場合に1〜2 MOhmの抵抗を有した。ギガオームシールの形成前に浴液とピペット液との間の液間電位差を常に相殺した。
全細胞クランプ条件下で膜電流を測定し、Axoclamp 200B (Axon Instruments)によって2 kHzでサンプリングし、1 kHzでフィルタリングした。各実験の開始時に電気容量電流を電子的に相殺した。P/4リーク補正を適用した。
CHO細胞上のShal電流を研究するために、細胞を-70mVの状態にしておき、-70で出発し10mV増分で+70mV、または+100mVまでの一群の500ms試験電位パルスをかけた。電流−電圧関係に関して測定される振幅を、所定の膜電位での最大電流として定義した。
浴液: NaCl (160 mM), KCl (2.5mM), MgCl2 (1mM), CaCl2 (2mM), HEPES (10mM) pH 7.4 (NaOHで)。
ピペット液: KCl (160 mM), MgCl2 (5mM), EGTA (1mM), CaCl2 (0.1mM), NaGTP (0.1mM), K2ATP (3mM), HEPES (5mM) pH 7.4 (NaOHで)。
追加の電気生理学
さらなるアッセイ検証のために、推定上のShalブロッカーであるアラキドン酸( J. Neurosci. 1996, 16:2522)をShal/KChIP 20細胞で試験した(図１３)。
図１３: アラキドン酸によって阻害されるShal/KChIP。Shal/KChIP 20細胞を浴液中の100uM [最終]のアラキドン酸溶液で潅流した。プレおよびポスト化合物電流を全細胞クランプ条件下で測定した。左パネル: 曲線下面積の積分(総電流)。右パネル: ピーク電流振幅。
結果および結論: アラキドン酸との5分間のインキュベーション後に総Shal/KChIP電流の完全阻害が達成された。ゆえに、これは、このチャネルの重要な指標であることを確認する。
図１４に示される、CHOセルラインでのShIP_GFP安定クローン。
図１４: クローン18-13-6および18-13-20のI/V曲線。
バッファー: KCNQ Int/Ext溶液
プロトコール:
Figure 2012507273
クローン作製および選択
トランスフェクション: Shal _delN 10-3細胞を35mm 6ウェルプレートに2.5x105細胞/ウェルで入れ、6時間後に、FuGENEトランスフェクション試薬(Roche)および製造元の推奨を使用して、1ug pcDNA3.1/Zeo(+)KChIP DNAで各ウェルをトランスフェクトした。抗生物質選択をモニターするためにKChIP DNAなしのモックトランスフォーメーションを同様に実施した。「Neo/Zeo」コントロールセルラインでは、第44継代の時点でのpcDNA3.1/Neo CHO細胞を1 ug pcDNA3.1/Zeo DNAでトランスフェクトした。24時間後に175cm2フラスコに750K細胞/フラスコで細胞を継代し、抗生物質選択条件(900ug/ml G418; 1mg/ml Zeocin)に置いた。Shal/KChIPトランスフェクションでは、いったん選択が完了したら(4日)、完全培養培地中で12細胞/mlに細胞を希釈し、4つの96ウェル培養プレートの各ウェルに250ulを分配した。1週間の培養後に単一コロニーを含むウェルを同定し、増殖およびさらに1週間後の試験のためにコロニー採取した。Neo/Zeoコントロール細胞をポリクローナルプールとして増殖させた。
クローンスクリーニング: 19個の別個のShal/KChIPクローンを機能についてスクリーニングした(図１５)。KClでの脱分極に応答する振幅および動力学的プロファイルを使用して、さらなる評価のためにクローンを選択した。
図１５: Shal/KChIPクローンスクリーニングおよびNeo/Zeoコントロール系統。一次FLIPRデータを示すScreenWorksスクリーンショットおよび19クローンおよびNeo/Zeoプールの換算データ表(中央パネル, ウェルH4-6)。96ウェルアッセイプレート(TC処理, BD Biosciences)に約5x104細胞/ウェルで細胞を入れ、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を除去し、アッセイバッファー中の1x 青色膜電位色素で置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間記録し、等積置換(isometrically-substituted)されたKCl (60mM [最終], カラム1, 2, 4 & 5)での活性化後にさらに180秒を記録することによって、FLIPR Tetraでアッセイを読み取った。カラム3 & 6は、通常のアッセイバッファー(0.5mM KCl [最終])に対する応答を示す。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。データ表では、サブトラクトバイアスは1であり、ネガティブコントロール補正(カラム3 & 6由来)はオンであった。
結果および結論: さらなる試験のために7つのShal/KChIPクローンを同定した(データ表の青色の行)。2ラウンドのサブクローニングのためにクローン18 (左パネル, C行)を最終的に選択し、応答を安定化しかつ不均質性を減少させた。重要なことに、Neo/Zeoセルラインは、使用された活性化方法に本質的に応答しないことがわかったので(中央パネル, ウェルH4 & 5)、コントロール系統としてのそれに関する必要条件は事実上排除された。
中間サブクローン作製: 以前に記載されるようにサブクローニングのためにShal/KChIPクローン17 & 18をプレーティングした。総計66サブクローンをスクリーニングし、最終サブクローン作製のソースとしてナンバー18-13を選択した(データは示していない, ノート1050115 #8)。
最終サブクローンスクリーニングおよび選択: 以前に記載されるように最終サブクローニングのためにShal/KChIPサブクローン18-13をプレーティングした。34サブクローンのKCl脱分極に対する応答を評価した(図１６)。
図１６: Shal/KChIP最終サブクローンスクリーニング。最終セルラインを生じさせるサブクローンスクリーニングから得られた換算FLIPRデータ。96ウェルアッセイプレート(TC処理, BD Biosciences)におよそ5x104細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を吸引し、アッセイバッファー中の1x 青色膜電位色素で置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間記録し、等積置換したKCl (60mM [最終])での活性化後にさらに60秒を記録することによって、FLIPR Tetraでこのアッセイを読み取った。データエクスポート時にデータ換算を使用しなかった。生応答(RFU, 相対蛍光単位, 青色バー)およびレシオ化応答(ratioed responses) (ひし形)の両者を示す。レシオ化応答は、シグナル試験値(すなわちベースライン蛍光)によって生応答値を除算した値に等しく、これは、各クローンに関してプレーティングされた細胞数の変動を相殺するために実施された。「レシオ(比)」カラムの緑色セルは生/ベースライン比率(ration) >1のクローンを示す。一方および/または両方の減少を考慮することによってさらなる評価のためのクローンを選択した(マーキングした線によって示される)。
結果および結論: FLIPR (データは示していない)および電気生理学(例えば「追加の電気生理学」を参照のこと)でのさらなる評価のために7つのセルラインを選択した(図１５でマークされている)。慣用のパッチクランプ法によってクローンを検査した後、Shal/KChIP 18-13-20を用いて進めることを決定した。特に指定しない限り、すべての以後のHTSアッセイおよびスクリーニング開発で、Shal/KChIP 20 (またはShIP 20)として知られるこのセルラインを使用した。
アッセイ&スクリーニング開発
HTSスクリーニングストラテジー
このアッセイは2液添加を使用して、1回の実験でアクチベーターおよびアンタゴニストの検出を可能にする(図１７)。スクリーニングでは、試験化合物を1回目の添加で加え、3分間インキュベートしておく。そして、2回目の添加で活性化用量のKClを導入し、次の3分間、蛍光を読み取る。両方の添加についてコントロール実験を実施する。1回目の添加でのバッファー/ DMSOから得られる応答より顕著に大きい応答(蛍光の上昇)は、該化合物がアクチベーターでありうることを示す(緑色トレース)。2回目の添加後の応答の減少は、化合物がアンタゴニストでありうることを示す(青色トレース)。
図１７: Shal/KChIPアッセイFLIPR応答プロファイル。1回目および2回目の添加アッセイウインドウならびに潜在的アクチベーターおよびアンタゴニストプロファイルを示す、BioFocus化合物スクリーニングから得られたサンプル対照群平均。
基本的試験プロトコール
Multidrop 384ディスペンサーを使用して384ウェルTC透明/黒色アッセイプレート(Greiner 781091)に7,500細胞を含む50μl容量に細胞を分配し、周囲温度で1時間インキュベートし(周縁効果を減少させるため)、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。接種の18〜24時間後に細胞をアッセイした。この時点で、それらはウェル中で集密にちょうど近づいていた。プレートから外へ弾き飛ばして抜き取ることによって培養培地を除去し、アッセイバッファー中の20ul/ウェルの1x青色膜電位色素を25℃で30分間、細胞にローディングした。30分後、アッセイプレートをFLIPRに入れ、2回添加プロトコールを使用して実施した。1回目の添加(5x, 5ul)はアッセイバッファー中の2.5% DMSOを含んだ。ピペッティングの高さ(pipetting height)を15にセットし、スピードを20にセットした。この添加後3分間、プレートを読み取った。2回目の添加(2x, 25ul)はアッセイバッファーまたは120mM等積置換KCl (すなわち1:1モルベースでNaClの代わりに用いられるKCl)のいずれかであった。高さは20であり、スピードは25であった。吸引スピードを最低値にセットし、保持または排出容量(hold or expel volumes)を適用しなかった。2回目の添加後さらに3分間、プレートを読み取った。エクスポートされる統計値を、stat1 = 190-200の平均(1回目の添加の直前の間隔)およびstat2 = 260-許容される最大の最大値として、典型的に構成した。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。以下の式を使用してZ'統計(「スクリーニング可能性(screenability)」の指標, Z' > 0.5 = シングル-パススクリーニング(single-pass screen))を算出した:
Z' = 1-((3σmax + 3σmin) /( Iμmax - μminI))。
アッセイでの膜電位色素の使用
Shalセルラインアッセイは、アッセイウインドウのサイズを増加させるために活性化バッファー中の膜電位色素の添加を使用した(データは示していない)。KChIPをShalセルラインに加えた後、発明者らは、プロトコールを単純にし、かつ開発およびHTSの両方に関するアッセイのコストを減少させるために、この色素の必要性を削除することができるかどうかを調査した(図１８)。
図１８: 活性化バッファー中の色素の利用。Shal/KChIP (ShIP)、ShalおよびNeo (Shalコントロール)セルラインを96ウェルアッセイプレート(TC処理, BD Biosciences)に5x104細胞/ウェルでプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を吸引し、アッセイバッファー中の1x青色膜電位色素50ulで置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間記録し、膜電位色素ありとなしで等積置換KCl (60mM [最終]) 50ulの添加後にさらに60秒を記録することによって、FLIPR Tetraでアッセイを読み取った。データエクスポートでは、サブトラクトバイアスを1にセットした。エラーバーは+/- 1 SDである。
結果および結論: 活性化バッファーから膜電位色素を除去したところと、3種すべてのセルラインでKCl活性化時に傾向の顕著に減少する変化が生じた。Shal/KChIPのZ'統計は0.77から0.59に低下した。それは、依然として、シングル-パススクリーニングカットオフ0.5を十分に上回る(データは示していない)。活性化バッファーへの色素の添加はHTSプロトコールを複雑にし、かつ開発およびスクリーニング過程にわたる推定上の潜在的コスト節約を考慮すべきであったので、活性化バッファー中で色素を使用せずに進めることを決定した。後の開発中にZ'統計の減少の大部分を回復した。
アッセイプレート選択
発明者らの標準BD Falcon 353962プレートと安価なGreiner 781091 384ウェル組織培養処理アッセイプレートとの間でのアッセイ性能を比較するための実験に取り組んだ(図１９)。注: GreinerはBD Falconプレートの製造業者である。
図１９: BDおよびGreiner 384ウェルアッセイプレートの比較: BDおよびGreiner 384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでShal/KChIP 20細胞をプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を弾き飛ばして除き、アッセイバッファー中の1x青色膜電位色素20ulで置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。FLIPR Tetraでアッセイを読み取った。1回目の添加(5x, 5ul)はアッセイバッファー中の2.5% DMSOを含み、それを3分間読み取った。2回目の添加(2x, 25ul)は一用量の(at dose)等積置換KClから構成され、それをやはり3分間読み取った。Z'の算出を可能にするために各条件を2 x 48の複製物から測定した。エクスポートされる統計は、stat1 = 190-200の平均およびstat2 = 260-許容される最大の最大値として構成した。サブトラクトバイアスを1にセットした。左パネル: 2つのプレートタイプについての[KCl]の関数としてのウインドウサイズ(stat2-stat1として算出)。右パネル: 2つのプレートタイプについての[KCl]の関数として算出されたZ'統計。
結果および結論: この試験でGreinerアッセイプレートを使用した場合にアッセイウインドウサイズの小さいが一貫した低下(約200 RFU)が存在した。しかし、Greinerプレート上のわずかに低いCVのせいでZ'統計はほぼ同一であった。開発およびスクリーニング過程にわたる推定の潜在的コスト節約が十分であるため、Greinerプレートを使用して開発を継続することを決定し、すべての以後の仕事はそれらを用いて実施した。
アッセイバッファー調製方法の試験
早期のアッセイ開発中の実験結果は、あらたに調製されたアッセバッファーの使用を示したが、この必要条件はスクリーニング開発中に最終的に削除された(データは示していない)。しかし、調製方法(KCl、NaClおよびDMSOの原液を基本バッファーに添加する)は依然として使用中であり、容量相殺バッファー調製計算表(volume-compensated buffer preparation calculator)がこの文書に含まれる。
細胞密度最適化
5,000〜15,000細胞/ウェルのプレート密度の平均応答および標準偏差を調査し、Z'統計を算出した(図２０)。
図２０: 細胞密度最適化。指定細胞密度での全プレートの統計を、得られたZ'統計とともに示す換算FLIPRデータ。5000細胞/ウェル未満のプレートでは、翌日、単層が生じず、試験されなかった。Shal/KChIP細胞を指定密度でプレーティングし、37℃/ 5% CO2でインキュベートし、次の日にアッセイした。細胞に20ul 1x色素/ウェルを25℃で0.5時間ローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の等積置換KCl (60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値190-200の平均(最小応答)および読み取り値260-最後(最大応答)の最大値を使用して統計を算出した。空間的均一性(Spatial uniformity)補正はオンであった。バーは活性化への応答を示し、ラインはZ'統計の傾向を示す。
結果および結論: このアッセイは、低い細胞密度ほど良好に機能する傾向があった。細胞カウントおよびプレーティングの変動に起因する潜在的問題を回避するために、7500細胞/ウェル(望ましいと思われる5000細胞/ウェルではなく)を用いて開発を進めることを決定した。
色素濃度
可能なコスト節約手段として0.4x膜電位色素(vs. 1x)を使用してShal/KChIP中間サブクローン18-13および18-28の性能を調査した(図２１)。
図２１: 色素濃度評価。Shal/KChIPクローン18-13および18-28を96ウェルアッセイプレート(TC処理, BD Biosciences)に5x104細胞/ウェルでプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を除去し、アッセイバッファー中の1xまたは0.4x青色膜電位色素50ulで置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間記録し、等積置換KCl (60mM [最終]) 50ulの添加後にさらに60秒を記録することによって、FLIPR Tetraでアッセイを読み取った。最大RFU値を示す。データエクスポートでは、サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正はオンであった。エラーバーは+/- 1 SDである。
結果および結論: 0.4xで使用された色素は、両試験クローンに関してフル(1x)色素を用いて得られたアッセイウインドウの70%サイズに減少したアッセイウインドウを生じさせた。完全アッセイウインドウを保存するために、1x色素を使用してすべての以後の開発を実施することを決定した。
DMSO耐性
細胞ベースのアッセイの、1回目の添加のDMSOに対する感受性は、特定のDMSO保存濃縮物から所望のレベルの化合物をスクリーニングする能力について施される計算の要素に入る。1回目の添加のDMSOの、アッセイウインドウサイズおよび変動性への影響、および得られるZ'統計を調査した(図２２)。
図２２: Shal/KChIPアッセイウインドウサイズ、標準偏差およびZ'統計。Shal/KChIP18-13細胞をGreiner 384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を弾き飛ばして除き、アッセイバッファー中の1x青色膜電位色素20ulで置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。以下の条件を使用して、FLIPR Tetraでアッセイを実施した。1回目の添加(5x, 5ul)はアッセイバッファー中の5x [最終] DMSOを含み、それを3分間読み取った。2回目の添加(2x, 25ul)は等積置換KCl (120mM)から構成され、それをさらに3分間読み取った。Z'の算出を可能にするために各条件を64の複製物から測定した。エクスポートされる統計は、stat1 = 180-200の平均およびstat2 = 260-380の最大値として構成した。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。青色バー(stat2-stat1)は活性化への応答を示し、赤色ラインはZ'統計の傾向を示す。エラーバーは+/- 1 SDである。
結果および結論: 1% DMSO [最終]を除き、標準偏差は比較的一定のままであったが、ウインドウサイズはDMSOの増加とともに低下し、必然的に、Z'統計の、対応する低下が生じた。実際問題として、発明者らに入手可能な化合物DMSOストックの濃度(通常2または10mM)を考慮すれば、発明者らは、細胞の曝露を0.5% DMSO [最終]に制限することができる。この実験では、該条件は、アッセイウインドウ>2000 RFUおよびZ'統計0.73を生じさせた。
色素ローディング時間
徐々に長くなる色素ローディング時間の、アッセイウインドウサイズ、標準偏差および得られるZ'統計への影響を調査した(図２３)。
図２３: アッセイ統計への、色素ローディング時間の影響。ウインドウサイズ、標準偏差およびZ'統計への、0.5〜3時間の範囲の色素ローディング時間の影響を示すフィルタリングされたフルプレート統計。Shal/KChIP18-13細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートを弾くことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5〜3時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の120mM等積置換KCl (60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値190-200の平均(最小応答)および読み取り値260-最後の最大(最大応答)を使用して統計を算出した。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。緑色バー(stat2-stat1)は活性化への応答を示し、青色ラインはZ'統計の傾向を示す。エラーバーは+/- 1 SDである。システム的なアーティファクトに関してデータを最小限補正した。
結果および結論: 0.5〜3時間の範囲の色素ローディング時間はすべて、0.7を上回るZ'統計を生じさせた。1.5時間でアッセイウインドウの最大が存在し、2〜2.5時間でZ'の最大が存在した。3時間の時点での細胞の目視検査では、それらが良好な状態であることが示された。0.5〜3時間のすべての色素ローディング時間で、うまく機能するアッセイがもたらされることを結論付けた。
色素ローディングに関する細胞温度
室温(25℃)に1時間冷やしておいた細胞プレートと、37℃でのインキュベーションから直接色素ローディングされたプレートとの間での色素ローディング温度に関する比較を行った(図２４)。
図２４: 色素ローディング前に細胞をあらかじめ室温に冷却することの影響。Shal/KChIP (ShIP)、ShalおよびNeo (Shalコントロール)セルラインを96ウェルアッセイプレート(TC処理, BD Biosciences)に5x104細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験するために37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。培養培地を除去し、アッセイバッファー中の1x青色膜電位色素50ulで置換し、25℃で0.5時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間記録し、等積置換120mM KCl (60mM [最終]) 50ulの添加後にさらに60秒を記録することによって、FLIPR Tetraでアッセイを読み取った。データエクスポートでは、サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正はオンであった。エラーバーは+/- 1 SDである。
結果および結論: Shal/KChIPでは、冷たい細胞と温かい細胞との間に統計学的に無視できる差異しか存在せず、Shalでは差異は存在せず、あらかじめ冷却されたNeoコントロール系統の応答には有意な減少が存在した。バックグラウンド応答の減少(コントロール系統で観察される)が望ましい結果であるので、室温で1時間平衡化された色素ローディングアッセイプレートによって以後の開発を行うことを決定した。アッセイプレートをあらかじめ冷却する必要条件は、HTSプロトコールにわずかな負担しかかけない。
アクチベーターEC50
等積KCl活性化によってShal/KChIP 18-13に関する用量応答を確立した(図２５)。
図２５: 群平均の主要FLIPRデータおよび予備的なEC50。Shal/KChIP18-13細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の服用量の等積置換KCl (0〜60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大を使用して統計を算出した。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。上パネル: KCl投与への群平均応答を示す換算FLIPRデータのScreenWorksスクリーンショット。下パネル: 算出HillslopeおよびEC50を示す非線形回帰/S字形用量応答。
結果および結論: Shal/KChIPセルラインは進行的に応答し、漸増レベルの等積置換KClによる活性化に低い変動性しか有さなかった。この方法を使用して達成されるKClの最高濃度は60mM [最終]である。この実験で、固定最高応答(a fixed top response)を使用するEC50が30mM KClであることを算出した。
MDC vs Axygen FLIPR 384チップ
Molecular Devices Corporation (MDC)によって供給されるFLIPR 384チップとAxygen Scientificによって供給されるものとの比較を行った(図２６)。注: Axygenは、MDCへの、FLIPR 384チップの以前の供給者である。AxygenチップのRTPでの発明者らのコストはMDCチップのコストの2/3である。
図２６: MDCとAxygen FLIPR 384チップの比較。得られたShal/KChIPアッセイの統計とともに最大および最小応答を示すGraphPad Prism散布図。Shal/KChIP18-13細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の120mM等積置換KCl (60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。左パネル: Molecular Devices FLIPR 384チップ。右パネル: Axygen FLIPR 384チップ。
結果および結論: MDCまたはAxygenチップを使用するShal/KChIPアッセイの性能は同一であった。アッセイ開発およびHTSの過程にわたるコスト節約を考慮すべきであると判断したため、すべての以後のプロトコールでは、Axygen Scientific FLIPR 384チップを使用した。
アッセイバッファーおよび他の試薬の安定性
Shal/KChIPアッセイで使用される試薬、すなわち、1回目の添加のアッセイバッファー/DMSO、再組成色素および活性化バッファーの安定性の評価を行った(図２７)。
図２７: 試薬安定性。Shal/KChIP 18-13細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の120mM等積置換KCl (60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。Shal/KChIPアッセイのすべての試薬を、作業日の前日(色素を除く)、作業日の早い時間および各実験ごとに新たに調製した。事前に調製された試薬および新たに調製された試薬の両者を用いて、0、4および8時間および一晩(O/N)の時点でアッセイを実施した。
結果および結論: Shal/KChIPアッセイの性能は、その日の経過中にわずかなゆらぎしか示さなかった。試薬は少なくとも丸一日安定であると結論した。次いで、アッセイおよび活性化バッファーは少なくとも1週間にわたって安定であることを見出した(データは示していない)。
FLIPR Tetraピペッティングの最適化
ピペッティングの高さ、スピード、ならびに保持および排出容量の変化の、アッセイ統計への影響を調査するためにいくつかの実験(データは示していない)を実施した(表2)。
結果および結論: 以下の表は、Z'統計によって測定された場合に良好な結果を一貫してもたらす設定を示す。
Figure 2012507273
3日間の最小/中間点/最大応答
Shal/KChIP 20細胞の応答の安定性を5日間にわたって3回調査し、スクリーニング時に予測される変動性を評価した(図２８)。
図２８: 3日間の最小、中間点および最大統計。3日間の重複ハーフプレートアッセイデータを、得られたウインドウ、CVおよびZ'統計とともに示すGraphPad Prism散布図。Shal/KChIP 20細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5+時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(2x)はアッセイバッファー中の60mM (プレートの左半分)または120mM (プレートの右半分)等積置換KCl (それぞれ30および60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。以下のように統計をまとめた: Min-左半分のn001 stat1 & 右半分のn002 stat1; Mid-左半分n001 stat2 & 左半分n002 stat2; Max-右半分n001 stat2 & 右半分n002 stat2。システマティックなアーティファクトに関してデータを最小限補正した。
結果および結論: このアッセイは5日間にわたってうまく機能し、最大Z'統計の範囲は0.73〜0.80であり、平均0.77であり、標準偏差は0.03であった。注: 3日間の単一フルプレート(3プレート/日)実験を同様に行い(データは示していない)、良好な結果を得た。該アッセイは6日間にわたってうまく機能し、最大Z'統計の範囲は0.69〜0.74であり、平均0.72であり、標準偏差は0.03であった。総合すると、このアッセイは、スクリーニングキャンペーンの経過にわたってうまく機能すると予測される。
3日間のアクチベーター用量応答曲線& EC50
等積置換KCl投与に対するShal/KChIP 20の応答の安定性を6日にわたって3回測定した(図２９)。
図２９: 3日間のKCl用量応答曲線およびEC50。Shal/KChIP 20細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目の添加はアッセイバッファー中の服用量の2x等積置換KCl (0〜60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。分析は、非線形回帰、S字形用量応答、トップコンスタント(top constant)である。データは、各用量に関して48複製物を有する単一プレート由来である。
結果および結論: アッセイは、3日間にわたってKCl投与に合理的に一貫して応答し、EC50の範囲は32〜42mM KClであり、平均36mMであり、標準偏差は5mMであった。
3日間のアンタゴニスト用量応答曲線& IC50
25uMでのBIOMOL化合物スクリーニング時に同定された推定Shal/KChIPアンタゴニストであるアミロライドを使用して、連続3日間にわたる重複して用量応答を作製した(図３０)。
図３０: 3日間のアミロライド用量応答。Shal/KChIP 20細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に試験した。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目の添加はアッセイバッファー中の服用量の2x等積置換KCl (0〜60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。分析は、非線形回帰、S字形用量応答である。阻害が100%に近づくと観察される1回目の添加のアーティファクトを相殺するために、データを55mM KClでの外挿されたポイントに固定した。データは、各用量に関して48複製物/プレートを有する1日ごとの重複したプレート由来である。
結果および結論: アッセイは、連続3日間にわたってアミロライドによる阻害に対して一貫して応答し、IC50の範囲は20〜29uMアミロライドであり、平均24uMであり、標準偏差は3uMであった。この化合物は、HTSのための阻害コントロールとしてうまく機能すると合理的に予測されると結論した。
ダイレクトプレートアッセイ(Direct-to-Plate Assay)
いかなる中断する細胞培養も行わずに、アッセイプレートに液体窒素保存から直接細胞をプレートする可能性を決定するための実験に取り組んだ(図３１)。
図３１: ダイレクトプレートアッセイ。凍結Shal/KChIP 20細胞(2ml x 106/ml)を解凍し、82mlの完全培養培地に加え、次の日に試験するために384ウェルプレートの50ul容量(1.2x104細胞/ウェル)にプレーティングした。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(5x)はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終]) 5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目の添加はアッセイバッファー中の60mMまたは120mM等積置換KCl (それぞれ30mMまたは60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。
このストラテジーはリード化合物探索部門(the lead discovery sector)の至るところで広く用いられ、アッセイ変動性の低下、かなりの時間節約、および労働コストの減少を生じさせることがよくある。
結果および結論: 液体窒素保存から直接プレートされた場合にShal/KChIPアッセイは良好に応答した。最大応答から達成されたZ'は0.73であった。このストラテジーは現在のキャンペーンでは用いられないが、将来のスクリーニング開発時に考慮される。
BIOMOL化合物スクリーニング
主要なイオンチャネルタイプをカバーする71種のアクチベーターおよびインヒビターを含むIon Channel Ligand Library (BIOMOL #2805)を384ウェル4ポント(four-pont)モードで25uMでのShal/KChIP 20活性に対して2回測定した(図３２および３３)。
図３２: BIOMOL化合物 - 主要スクリーニングデータ。BIOMOL化合物スクリーニングの主要FLIPRデータを示すScreenWorksスクリーンショット。Shal/KChIP 20細胞を384ウェルアッセイプレートに7500細胞/ウェルでプレーティングし、次の日にスクリーニングした。プレートをはじくことによって培養培地を除去し、細胞にウェルあたり1x膜電位色素20ulを0.5時間25℃でローディングした。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加はアッセイバッファー中の2.5% DMSO (0.5% [最終])中の5xコントロールまたは化合物5ulであり、それを180秒間読み取り、2回目の添加はアッセイバッファー中の2xコントロールまたは120mM等積置換KCl (0〜60mM [最終]) 25ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値180-200の平均および読み取り値260-許容される最大の最大値を使用して統計をエクスポートした。サブトラクトバイアスを1にセットし、ネガティブコントロール補正をオフにした。コントロールカラム1/2および23/24を本文書のpg. 53から説明する。挿入図: 主要データスクリーニングで強調されたコントロールおよび化合物ウェルの群平均のスクリーンショット。
図３３: BIOMOL化合物 - 換算スクリーニングデータ。BIOMOL化合物によるShal/KChIP応答の阻害パーセントを示すアッセイプレート図。実験条件は以前の図の説明文に記載される。
結果および結論: 55%阻害の任意のカットオフを使用して、3種の化合物は、Shal/KChIP応答に対する再現可能な阻害活性を示した。アミロライド(B8)は既知のカルシウムチャネルブロッカーである。NS-1619 (E7)およびフルフェナム酸(F6)はともに、KCa2+チャネル活性を刺激することが知られている。これらの化合物がShalの直接のインヒビターであると判明することはありそうになく、パッチクランプ測定によってこれが裏付けられた(データは示していない)。スクリーニング目的で、アミロライドは、その作用において一貫していることが立証されたので、以後のBIOMOLおよびBioFocus検証スクリーニングに使用した。そしてHTSに推奨される。
BioFocus化合物スクリーニング
図３４: BioFocusスクリーニングのための化合物調製プロトコール。化合物調製をFLIPR Tetraで実施した。2mMのライブラリープレートをアッセイバッファー中で40x希釈し、384ウェルスクリーニングのために四分円に分配した。
複合アクチベーターおよびアンタゴニストスクリーニングにおいて、10uMで、Shal/KChIPに対して、384ウェル4点モードで、BioFocus SoftFocus Ion Channel Libraries #1-4 (#SF101-04)の3222の固有のメンバーをスクリーニングした。BIOMOLスクリーニングに関して、同じFLIPRプロトコールを使用し、連続しない4日間にわたって実施した。以下の化合物調製プロトコールを使用してスクリーニングプレートを調製した。
簡潔に言えば、Shal-KChIP細胞を384ウェルプレートに7500細胞/ウェルで50μl中に接種し、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、20μlの1x FMP色素を加え、細胞プレートを27℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞プレートをTetraに入れ、2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加は5μlの5x化合物(50μM)であり、3分読み取った。化合物が1回目の添加において応答を示せば、それはアクチベーターとしてマークされる。2回目の添加は25μlの2x活性化バッファー(NaClの代わりの120mM等積KCl置換)であり、それをさらに2分間読み取った。KCl応答の抑制は化合物がアンタゴニストであることを示した。すべてのデータを統計ファイルとしてエクスポートした。1回目の添加では、読み取り値190 - 200由来の平均を使用し、2回目の添加では、260 - 許容される最大由来の最大値を使用した。
活性化および阻害パーセンテージを以下の式によって算出し、すべての結果をコントロールに基づいて算出した。
活性化%(1回目の添加の統計) = (試験サンプル - μminA)/( μmaxA - μminA) x 100
式中、μmaxA = 100%活性化の平均であり、μminA = 0%活性化の平均である。
%阻害(2回目の添加の統計) = (μminI - 試験サンプル)/( μminI - μmaxI) x 100
式中、μmaxI = 100%阻害の平均であり、μminI = 0%阻害の平均である。
以下の式を使用して活性化および阻害のZ'統計を算出した。
Z' = 1- ((3σmax + 3σmin) /( Iμmax - μminI))。
BioFocus SoftFocus(登録商標)イオンチャネル集中ライブラリ(Ion Channel Focused Libraries) #1- 4: 1スクリーニングアクチベーターヒット
コントロールと比較した活性パーセントをBioFocusイオンチャネルライブラリーアクチベータースクリーンのヒストグラムとしてプロットした(図３５)。
図３５: Shal/KChIP FLIPR BioFocus 1スクリーニング - 活性化。Shal/KChIPに関する活性物の分布。
活性は化合物セットの平均および標準偏差(マイナスコントロール、および分離化合物、例えば蛍光化合物)に基づいた。平均および標準偏差が非常に低かったので、発明者らは、追跡調査のための化合物の選択に12%活性化の6σカットオフを使用することを選択した。表3に示されるように、12%の6σカットオフを超える活性化を示す化合物は存在しなかった。
Figure 2012507273
BioFocus SoftFocus(登録商標)イオンチャネル集中ライブラリ(Ion Channel Focused Libraries) #1- 4: 1スクリーニングアンタゴニストヒット
コントロールと比較された活性パーセントをBioFocusイオンチャネルライブラリーアンタゴニストスクリーンのヒストグラムとしてプロットした。活性は化合物セットの平均および標準偏差(マイナスコントロール、および分離化合物、例えば蛍光化合物)に基づいて算出した。アンタゴニスト活性の分布は正規分布を示した; しかし、それは10〜15%阻害に中心があり、それは、発明者らがこの化合物セットを用いて以前に観察していた。発明者らは、追跡調査のための化合物の選択に29%阻害の3σカットオフの使用を選択する(表4)。FLIPRスクリーニングで化合物を4重に試験したため、かつ10μMで強い阻害を示さなかったため、かつ利用可能な化合物の量が限られているため、FLIPRでIC50を実施しない。アンタゴニストヒットに関するすべての追跡調査をQPatchで実施した。表Iは、阻害>/= 29%のアンタゴニスト活性物を詳細に示す。
Figure 2012507273
Shal / KChIPセルラインの分子的検証
Shal/KChIP安定セルラインに組み入れられたShalおよびKChIPコード配列の完全性を評価するための実験に取り組んだ(表A1)。用いられたストラテジーは、Shal/KChIP 20およびコントロールセルラインからゲノムDNA (gDNA)を単離し、かつこれらのDNAをインフォマティブPCR (informative PCR)(ポリメラーゼ連鎖反応)の鋳型として使用することであった。ShalおよびKChIPコード領域の5'および3'末端にわたる生成物を得るための増幅プライマーを選択した。各コード領域の全体の長さを検証するための追加のプライマーを選択した。
Figure 2012507273
結果および結論: すべての反応は、約300bpの微量産物を生じた反応#3 (図３５Ａ, レーン3)を除き、正しい予測サイズの単一産物を生じさせた(図３５Ａ)。この生成物は、コントロールセルラインgDNAを増幅した場合にも作製された(データは示していない)。これは、使用された特定のプライマーペアのアーティファクトであると推定される。結論として、この種の分子的検査を使用して、ShalおよびKChIPのコード配列はインタクトであると思われる。
図３５Ａ: 表A1に記載される反応から得られたPCR産物。各レーンは、1%アガロースゲル上で電気泳動され、臭化エチジウムで染色された20ulの各50ul増幅反応物を含む。M1: BenchTop 1kb DNA Ladder (Promega), M2: BenchTop PCR Markers (Promega), 1: Shal 5'末端(180bp), 2: Shal 3'末端(1.1kb), 3: Shal完全長(2.1kb), 4: KChIP 5'末端(1.4kb), 5: KChIP 3'末端(260bp), 6: KChIP完全長(1.3kb)。
以下の実施例は、shakerチャネルおよび/またはハイパーキネティックベータサブユニットに関連するものである。
分子クローニングおよびベクター地図
発明者らが最初に使用したpTriEx/Shakerプラスミドは、追加のN末端アミノ酸(MAISR)の5'上流のKozak配列を含む。Shaker完全長cDNAを種々の発現ベクターにクローニングするために、以下のストラテジーを実施した。
o 500 bp 5'断片増幅: 正しいKozak配列を有し、追加の5' N末端アミノ酸を有さないShaker ATGコドンの増幅のために2つのオリゴを設計した。
オリゴSH-UPP, 5'-CCGGTACCATGGCCGCCGTTGCC-3'
オリゴSH-LOW, 5'-CCGGTCTCCGTAGTCGGCCACC-3'
KpnI制限部位は太字であり; Kozak配列は太字で下線付加されており、Shakerアニーリング配列は下線付加されている。
SH-LOWオリゴはShaker配列上の唯一のSalI制限部位の下流に位置する。
PCR断片をpCR-Bluntベクターにクローニングし、配列を確認した。
pCR-Blunt/5'-PCRクローンをKpnI (SH-UPPオリゴ中)およびSalI (Shaker配列中)で消化し、400 bp 5'-断片を精製した。
o 1770 bp 3'-断片のクローニング: pTriEx/ShakerプラスミドをSalIおよびEcoRI制限酵素で消化し、1770 bp断片を精製した。
o pcDNA3.1(+)ベクター経由のpExSelectおよびpIRES2EGFP発現ベクターへのShaker wtクローニング: 上記のように得られた400 bp KpnI-SalI 5'-断片および1770 bp SalI-EcoRI 3'-断片をpcDNA3.1(+)ベクターにクローニングした。この構築物のNheI-EcoRI Shaker断片を切断し、そして、NheIおよびEcoRIであらかじめ消化されたpExSelectおよびpIRES2EGFPにクローニングした。
最終pExSelect_Shaker構築物のVectorNTi地図を図３６に示す。
細胞培養条件およびトランスフェクション
1.6 mMピルビン酸ナトリウム、(100 mM溶液, Euroclone cat.#ECM0542D)、13 mM Hepes (1M溶液, Euroclone cat.#ECM0180D)、0.2%炭酸水素ナトリウム(7,5%溶液, Euroclone cat.#ECM0980D)、2 mM Ultraglutamine (BioWhittaker cat.#BE17-605E/U1)、10% FBS (ウシ胎児血清, Euroclone cat.#ECS0180L)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100x溶液Euroclone cat.#B3001D)を補充したダルベッコのMEM/Nutrient Mix F12 (1:1) (DME-F12 Euroclone cat.#ECM0090L)中でCHO-K1細胞を維持した。
増殖条件は週2回の約6X105細胞/T75フラスコの接種からなる。約10〜13x106細胞/T75フラスコの回収。
10μgのDNAの存在下で300 mVおよび950μFでの1.0x106細胞のエレクトロポレーションによってトランスフェクションを実施した。次いで2 mg/ml G418または1 mg/ml Zeocinを含む培地で10〜15日間、細胞を選択した。抗生物質での選択後、耐性クローンを1mg/ml G418 (Calbiochem cat.#345812)または0.5 mg/ml Zeocin (InvivoGen cat.# ant-zn-5)培地中で維持した。
FLIPR実験のために抗生物質を含まない完全培地中にすべてのセルラインをプレーティングする。
FLIPRによる細胞膜電位測定
KCl注入によって誘発される膜脱分極を検出するために、FLIPR384およびFLIPRTETRA実験の両方で膜電位感受性色素を使用した。実験の24時間前に384透明底黒色MPT (MATRIX cat.# 4324)に5000、7500、10000細胞/ウェルを接種することによって細胞を分析した。プレートを40μl/wの0.625x膜電位色素と45〜60分間37℃または室温でインキュベートし、10μl/wの5xアンタゴニストを注入し(指定のように0.5% DMSOの存在下で)、次いで3〜5分間蛍光を読み取ることによってFLIPR装置で測定し; そして2回目の、標準Tyrode液中の) 25μl/wの3x KClの注入を実施し、さらに3〜4分間、蛍光を測定した。単回注入(アゴニスト)での実験では、プレートを20μl/wの1x色素とインキュベートし、標準Tyrode液中の20μl/wの2x KClを注入した。
異なるウェル複製物から得られた動力学的(kinetic)データを、FLIPR、ExcelおよびSpotfireソフトウェアを使用して、注入後の積分または最大-最小RFU値を算出することによって分析し; 得られた平均および標準偏差を利用して、GraphPad PRISM(登録商標)またはSpotfireソフトウェアによってS字形用量応答フィッティングを作製し、EC50 -IC50値およびZ'因子を算出した。
以下の式にしたがってEC80値を算出した。
ECx= (x/100-x)1/Hill Slope * EC50
Z'因子の算出では、以下の式を使用した。
Z' = 1 - (3*(ST.DEVアゴニスト + ST.DEV Tyrode)/(平均アゴニスト - 平均Tyrode))
パッチクランプ法による電流検出
電気生理学記録
標準全細胞電位固定実験を室温で実施した。データ収集およびさらなる分析のために、発明者らはEPC10デジタル制御増幅器をPATCHMASTERソフトウェアとともに使用した(HEKA Electronics, Lambrect, Germany)。EPC10はプレパルスを用いて電気容量および漏洩電流の自動減算を提供する。データを66.7 KHzでフィルタリング(-3dB、8ポールBesselローパス)し、5μs/ポイントでデジタル化した。パッチピペットの入力抵抗は2.0〜4.0 MΩであり、細胞の電気容量は15.3±2.1 pF (n=45)であった; 残りのシリーズの抵抗(80%相殺までの後)は4.2±0.4 MΩであった。
液間電位差の補正を通常通り適用した。膜電位を- 100 mVで固定し、-60 mVから+100 mV (または+60 mV)までの50 ms脱分極パルス(0.1 Hz)によって電流を誘発した。
細胞培養
電気生理学実験では、上記標準プロトコールを用いてCHO-K1 / DmShaker細胞を処理し、培養物中で維持した。実験の24時間(または2回目の限界希釈試験の4〜6時間)前に、CHO-K1 / DmShaker細胞をポリ-D-リシンコーティングガラス上に播種(各200000細胞)し、抗生物質を含まない培地中で6ウェルプレートに入れた。実験直前に、細胞が播種されているコーティングガラスをパッチクランプ細胞外液で5回洗浄し、そして記録チャンバに入れた。
溶液
ピペット液は、(mM): KMeSO3 128, HEPES 10, EGTA 12, MgCl2 3, CaCl2 0,7, K2ATP 5, KOHでpH 7.2を含んだ。
浴液は、(mM): NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 2, HEPES 10, Glucose 10, NaOHでpH 7.4を含んだ。
リガンド保存
・ DMSO (ジメチルスルホキシドSIGMA cat.#D-5879)をSIGMA(登録商標)から購入した。
・ KClをSIGMA(登録商標)から購入し、水中の3 M原液を調製した。
・ TEAをSIGMA(登録商標)から購入し、水中の1M原液を調製した。
標準Tyrodeバッファー(pH 7.4): NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl2-2H2O 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 5 mM, HEPES 20 mM中で作業液を調製する。
ソフトウェア
Excel、GraphPad Prism 4、FLIPR384 Control Software、ScreenWorks 1.2.0を使用してデータを解析した。
安定なセルラインの作製
CHO-K1細胞をpExSelect_ShakerまたはpExSelectベクター単独(モックコントロールとして)で安定にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、2 mg/ml G418を補充された完全培地中で細胞を培養し、耐性プールを選択した。
抗生物質耐性DmShakerトランスフェクト細胞(FACSortされていない)を、BASFから受け取ったH-kvβサブユニットAまたはCサブタイプベクターでさらにトランスフェクトし、48時間後に、細胞を1 mg/ml Zeocinでの選択に付した。
1回目の限界希釈クローン選択
純粋なShakerおよびH-kvβクローンを得るために、安定なモックまたはShakerトランスフェクトプールを96 wp中で1細胞/ウェルの細胞密度で希釈することによって1回目の限界希釈ステップを実施した(5x96 wpモックおよび5x96 wp Shakerプラス各サブユニットごとのH-kvβ)。集密クローンを透明底384 wpに複製し、24時間後に100 mM KClを注入することによってFLIPR384で分析した。図３７に示されるように、モッククローンはKCl注入時に過分極を示したが、ShakerおよびHkvβの両AおよびCクローンの一部は、図３８に示されるように、持続する脱分極として記録されるKCl応答を示した。
図３７. FLIPR384でのモックI限界希釈プレート選択: 1プレートの例。
図３８. FLIPR384でのShaker+Hkvβ AまたはCサブユニットI限界希釈クローン選択。
アクチベーター注入後の全積分RFU値を使用してデータを解析した。このデータ解析に基づいて、計測された細胞の実験での再試験のために、2種のモッククローン、およびそれぞれ両ShakerプラスAまたはCサブタイプ由来の6種のクローンを選択した: 10000 c/wをプレーティングし、24時間後、FLIPR384でのKCl用量応答を実施した。得られた最良のクローンを図３９に示す。
図３９. FLIPR384での計測細胞(counted celss)としてのI限界希釈クローン再試験。
プロトコール: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; FLIPR384での20μl/w KCl注入(3x Tyrode液)。
培養物中の種々の継代の時点での、および凍結/解凍後のクローン安定性
最良の応答クローンとしてA-3A10を選択し、2か月以上、培養物中で維持した。図４０および４１に示されるように、FLIPR384でA-3A10の、種々の細胞継代時点での、および凍結/解凍後のKCl応答安定性を分析した。
図４０. 種々の細胞継代の時点でのA-3A10シグナル安定性: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; 5xタイロード液としての10μl/w 0.5% DMSO注入; 3'後, FLIPR384での25μl/w KCl注入(3xタイロード液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
図４１. 凍結および解凍後のA-3A10シグナル安定性: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLIPR384での25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
A-3A10クローンに対するTEAの影響
FLIPR 384による30、60または90 mM TEAプレ注入時のKCl刺激によるA-3A10クローンに対するTEAの影響を分析した。図４２に示されるように、TEAブロッキング効果は特に30 mM KCl刺激で明らかである。
図４２. A-3A10クローンに対するTEAの影響: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; 30、60または90 mM TEA 5x Tyrode液の存在下での10μl/w 0.5% DMSO注入(inj.); 3'後, FLIPR384での25μl/w KCl注入(3xタイロード液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
KCl高張液または等張液分析
KCl高張液または等張液の両者をA-3A10クローンで分析した。標準Tyrodeバッファー(135 mM NaCl+KCl)から出発して必要な容量のKCl原液を加えることによって高張液を調製した(標準プロトコール)。「Tyrodeベース」(0 M NaCl+KCl)から出発し、NaCl+KCl塩濃度を135 mMで維持して、等張液を調製した。図４３に示されるように2種の溶液を使用した場合に、RFUおよび動力学的形状の両者として試験クローンの応答に差異は観察されなかった。したがって、すべての検証実験を標準Tyrode中で実施した。
図４３. 高張液および等張液分析: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション(inc.); 10μl/w 0.5% DMSO注入 5xタイロード液; 3'後, FLIPR384での25μl/w KCl注入(3xタイロード液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
2回目の限界希釈クローン選択
Shaker/H-kvβAサブユニットの最良のクローンであるA-3A10を3x96 wp中の1細胞/ウェルの細胞密度での2回目の限界希釈に付した。30クローンを採取し、試験のために培養した。標準ローディングおよび実験プロトコールを使用して、10クローンを、考慮される細胞として最初に試験した。最良のクローンのKCl応答を図４４に示す。
図４４. FLIPR384でのA-3A10 II限界希釈クローン選択。
最良のクローンの例: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLIPR384での25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
2つのクローン、n゜1およびn゜9を最良の応答クローンとしてFLIPRTETRAでのさらなる分析のために選択した。実験の24時間前に、10000、7500、5000および2500 c/wをプレーティングし、KCl用量応答分析を実施した。得られたデータを図４５に示す。
図４５. FLIPRTETRAで分析されたn゜1およびn゜9 II限界希釈クローン: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLIPRTETRAでの25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
最終クローン最適化
さらなる特徴付けおよび最終クローン最適化のためにShaker n゜1クローンを選択した。
細胞密度依存性
最適細胞密度を決定するために、実験の24時間前に10000、7500および5000 c/wでShaker n゜1クローンを播種した。実験日に、KCl用量応答をFLIPRTETRAで注入し、EC50を算出した。結果を図４６に示す。
図４６. 細胞密度依存性、KCl用量応答: 10000, 7500, 5000 c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との室温での45'インキュベーション; 10μl/w Tyrode注入; 3'後, FLIPRTETRAでの25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
曲線を描写するために、KCl注入後のMax-Min値を考慮した。
DMSO感受性
DMSOがアクチベーター応答に対して何らかの影響を生じさせるかどうかを決定するために、クローンn゜1を10000、7500または5000 c/wの細胞密度でプレーティングし、24時間後にFLIPRTETRAで、0.5-1-1.5-3% DMSOの装置プレ注入後にKCl用量応答を注入することによって分析した。
図４７〜４８〜４９に示されるように、1.5%までのDMSO濃度はKCl応答に対して顕著な影響を有さない; 3% DMSOはKCl依存的応答の低下を生じさせる。
図４７ DMSO感受性: 10000 c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との室温での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5, 1, 1.5, 3% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLIPRTETRAでの25μl/w KCl注入(3xタイロード液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
曲線を描写するために、KCl注入後のMax-Min値を考慮した。
図４８ DMSO感受性: 7500 c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との室温での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5, 1, 1.5, 3% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLIPRTETRAでの25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
曲線を描写するために、KCl注入後のMax-Min値を考慮した。
図４９ DMSO感受性: 5000 c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との室温での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5, 1, 1.5, 3% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLPIRTETRAでの25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
曲線を描写するために、KCl注入後のMax-Min値を考慮した。
凍結/解凍後のクローン安定性
クローンn゜1を培養(p 6)および凍結/解凍後に分析した: 10000、7500または5000 c/wの細胞密度で細胞をプレーティングし、24時間後に、0.5% DMSOの存在下でKCl用量応答を注入することによってFLIPRTETRAで分析した。
結果を図５０に示す。
図５０ 培養物中および凍結/解凍後のクローン安定性: 10000, 7500, 5000 c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との室温での45'インキュベーション; 10μl/w 0.5% DMSO注入5x Tyrode液; 3'後, FLPIRTETRAでの25μl/w KCl注入(3x Tyrode液) 1.5, 3.7, 7.5, 15, 30, 60, 90, 120 mM。
曲線を描写するために、KCl注入後のMax-Min値を考慮した。
独立した3日のEC50安定性
種々の実験日にわたるKCl応答安定性を検証するために、独立した3日にFLIPR384で、KCl用量応答を注入することによって最終クローンを試験した。図５１に示される通りである。
図５１. 独立した3日のEC50再現性。
プロトコール: 10000c/w-24h; MEM廃棄; 上記手順にしたがう40μlの青色MP色素との37℃での30'インキュベーション; FLIPR384での10μl/w Tyrode 0.5% DMSO注入; 2'の読み取り; FLIPR384での25μl/w KCl注入(3x Tyrode液)。グラフの値はKCl注入後のMax-Minを表す。
パッチクランプ分析
1回目の限界希釈由来の2つの最良のクローンを全細胞パッチクランプ技術によって試験した。示されるように(図５２ａおよびｂ)、+100 mVまでの脱分極パルスをかけると、典型的な高速活性化および高速不活性化プロファイルを有するDm-Shaker電流が誘発された。一部の実験では、図５２ｂに示されるように、TTX感受性内向き電流が存在した。
各クローンに関して、6回の実験を実施し、非常に有望な結果を得た: クローン3a10の100%の細胞はDm-Shaker電流プロファイルを示し、平均電流密度(+60 mV)は56.3±36 pA/pFであったが、クローン4d1に関する5つの細胞はカリウム電流を示し、平均電流密度は13.4±18 pA/pFであった。
最良の電気生理学結果がDm-Shaker Aサブタイプクローンから得られたので、ShakerチャネルプラスH-kvβ Aサブユニットでトランスフェクトされた細胞のみを限界希釈に付することを決定した。その間、3a10クローンの活性を2週毎に通常通り検査し; さらに細胞解凍後のクローン発現安定性も検査した。
図５３では、発明者らは、+60 mV (b)または+ 100 mV (aおよびc)までの脱分極のパルスがDm-Shakerの活性化を誘発したことを観察することができる。特に機能的チャネル発現の安定性は、培養物中で細胞を少なくとも5〜6週まで維持した場合(図５３ａ)および細胞解凍後(図５３ｃ)に、依然として非常に高かった。この実験では、それぞれ83,3%および100%の細胞がDm-Shaker電流を示した(n=6および7)。
クローン3a10を2か月以上継代培養した後(第17〜20継代)、チャネルの発現は低下し、Dm-Shaker電流を示す細胞は50%であった(n=8)。Dm-Shaker活性の電位依存についての動力学的情報を有するために、I-V関係をプロットした(図５４)。ピーク電流を測定し、膜電位に対して標準化された値をプロットすることによってI-Vプロットを構築した(n=8±SD)。
そして2回目の限界希釈由来のクローン1を電気生理学分析に使用し、選択されたクローンに対して2つの化合物をさらに試験した。2つの化合物はDm-Shaker活性に影響する。
スクリーニングプロトコール
最終アッセイの、スクリーニング用の改作では、プロトコールのいくつかの改変を行った。これらの変化のうちで最も重要なものは:
・ 色素ローディングの自動化手順の実装
・ 50mM KCl: スクリーニングのための終濃度(活性化バッファーの1:3希釈)
・ 自動化プロセス
ここに、活性化バッファーは以下のように調製した:
150mM KCl, 2mM CaCl2*2H2O, 1mM MgCl2, 5mM NaHCO3, 20mM HEPES, pH 7.4。
活性化バッファーの組成は、モル浸透圧濃度に関して生理的条件にできるだけ近い溶液を示す。それが、スクリーニングの適合化、およびこのバッファーを標準タイロードの代わりに使用することによるフルスクリーニングを実施することを決定した理由である。
スクリーニングのための最終FLIPRプロトコール
最終FLIPRプロトコールはこの構成を有する:
・ ソースプレート1: 化合物希釈プレート
・ ソースプレート2: アクチベータープレート
・ 読み取り位置: アッセイプレート
・ ソースプレート3/チップ: 使用せず(チップボックス)
・ フィルター: 励起: 510-545; 発光: 565-625
・ 読み取り設定(典型): ゲイン60. Exp.時間0.6; 励起60
・ 洗浄バッファーA: 水
・ 洗浄バッファーB: 2.5% DMSOを有する水。
プロトコール(上で図示している)はこれらのステップを含む:
・ 化合物希釈プレートを混合
・ 化合物希釈プレートから10μLをアッセイプレートに移す
・ 3.0分間の読み取りを開始
・ 30秒後、アッセイウェルを混合
・ チップを(読み取りつつ)洗浄
・ アクチベータープレートから25μLをアッセイプレートに移し、すぐに混合
・ 4.0分間読み取る
・ チップを(読み取りつつ)洗浄。
マニュアル手順と対比した自動化手順でのプレートの物理的処理の唯一の実質的変化は色素ローディングの際の物理的処理である。マニュアルプロセスでは、液体をシンク中へ「弾き飛ばす(flicking)」ことによってまずウェルから外へ培地を廃棄し、次いで色素をウェル中へ分注することによってこれを達成する。
自動化手順では、発明者らのスクリーニング系の自動化384ウェルピペットによって色素ローディングを達成する。細胞単層を乱すことなく培養培地を除去するために、発明者らは、吸引/バッファー分配/吸引のサイクルを実施して、ウェルの「洗浄」を達成する。実際には、発明者らのピペッティング手順では、色素を含むウェル中に培養培地の5%の残留が生じた。最終色素ローディングステップは、洗浄バッファーを除去し、最終の40μLの0.5X色素のために、ウェル中に10μLを残し、そして30μLの0.666X色素を加えることを含む。発明者らは、これにより、ウェルのマニュアル排出と比較した場合にアッセイの同一の(またはさらに良好な)性能が生じることを見出した。
自動化プロセスの作動のために、プレート処理量を最大にするよう最適化スケジュールを計算する。多数のプレートに関する最適化スケジュールの例を図５４に示す。このスケジュールされたプロセスの処理量は13分ごとに1プレートである。これにより、発明者らは1日で50〜60プレートを処理することが可能である。
自動化され、スケジュールされたプロセスの概要
記載したステップは単一実験の処理を示す。スケジューラーシステムは、処理量を最適化するために、組み合わせた複数のアッセイを処理する。
Figure 2012507273
以下の実施例はGタンパク質共役受容体に関するものである。
オクトパミン受容体は、受容体アイソフォームに応じて、サイクリックAMP生産または細胞内カルシウム放出によってその作用をモジュレートすることができる。Oa2は内因的にcAMPによってシグナル伝達するが、発明者らは、その活性化時にカルシウム放出をもたらすプロミスキュアスG-アルファ-16-タンパク質を発現するセルラインに該受容体をトランスフェクトすることによってカルシウムにカップリング（共役）させることができた。カルシウム放出は蛍光カルシウム検出色素(この場合Fluo-4)によって測定可能である(図５５Ａ)。
細胞生物学
セルライン構築
OctR-pcDNA3.1(+)_zeo発現ベクターを作製した。蛍光タグ付きpcDNA3.1-OctR-GFPプラスミドの作製のための鋳型としてこの構築物を使用した。メガ-プライマーストラテジーを使用して、タグなしOctR発現ベクターにpAcGFP配列を挿入した。このストラテジーの第1ステップはPCRを使用し、OctR-pcDNA3.1ベクターに特異的な約20塩基対の追加のオーバーハングを有するpAcGFPベクターに特異的なプライマーを使用して、pAcGFP-N1-Asc1プラスミド由来の遺伝子断片を作製することであった。
このステップで使用されるプライマーは、6919-For (5' ctgcatcccctgtacaccaacggcgcgcccatggtgagcaag 3')および6919-Rev2 (5' ggatatctgcagaattcgcccttcacttgtacagctcatccatgc 3')であった。そして、この771塩基対遺伝子断片をアガロースゲルから精製し、濃度を測定し、鋳型としてのOctR-pcDNA3.1(+)_neo発現ベクターおよびQuickChange XL部位特異的突然変異誘発キットプロトコールを使用する、第2のPCR反応のメガ-プライマーとして、125ngの精製されたPCR産物を使用した。このPCR反応によってpcDNA3.1-OctR-pAcGFPが生成し、それはCG6919 dmOa2オクトパミン受容体配列であり、該遺伝子のC末端にAcGFP配列が結合している。該構築物のコード領域をシークエンシングして、二本鎖配列の完全性を確認した。(図５５Ｂ)。
G 16を共発現する哺乳類CHO細胞での一時的発現
天然にcAMPと共役する、タグなしおよびGFPタグ付きバージョンのOctRを、カルシウムによってシグナル伝達するG-アルファ-16プロミスキュアス(promiscuous;無差別的)Gタンパク質を安定に発現するCHO細胞で一時的に発現させた。これにより、受容体の活性化をカルシウム検出蛍光色素によって測定することが可能になった。
図５５のＡでは、種々の量のタグなしOctR-pcDNA3.1 DNAをCHO細胞(6ウェル皿, 300,000細胞/ウェル)にトランスフェクトし、Discovery顕微鏡でFluo-4色素を使用して48時間の時点で機能を試験した。以下に示されるグラフは、cyanベクターを発現する細胞由来のすべての単一細胞読み取り値の平均を表す。cyanベクターを発現する大多数の細胞はまた、OctRを発現すると想定される。この実験は、OctR-pcDNA3.1発現ベクターが完全に機能的であること、OctR受容体がG-アルファ16と共役すること、および最大投与量のオクトパミンが添加されるとコントロールでトランスフェクトされた細胞より大きいアッセイウインドウが存在することを実証した。さらに、それは、OctRがCHO細胞にとって毒性でないこと、および増加量のDNAが高い発現および高いシグナルを生じさせることを実証した。
図５５のＢでは、GFPタグ付きOctR発現ベクターを用いた類似の実験を示す。やはり、実験は、該構築物が完全に機能的であること、および該アッセイが特異的にオクトパミンでの刺激に応答してカルシウム放出を測定可能であることを示した。図５５のＣは、オクトパミン受容体がチラミンによっても活性化されることを示す。用量曲線および競合研究を実施しなかったが、予備的データおよび公開されている報告は、チラミンがOctRに対してオクトパミンよりわずかに効果が弱いだけであり、類似の効力を有することを示唆する。
図５５. G-アルファ-16を安定に発現しかつ増加量のタグなしまたはGFPタグ付きOctR-pcDNA3.1を一時的に発現するCHO細胞でのオクトパミンまたはチラミン刺激に対するカルシウム検出Fluo-4蛍光色素応答。トランスフェクトされた細胞のマーカーとしてpAmCyanベクターで共トランスフェクトされた細胞を最大投与量のオクトパミンまたは準最大投与量(sub-maximal dose)のチラミンで刺激した。Discovery顕微鏡で測定された単一細胞応答のウェル平均を上にグラフで示す。
G-アルファ-16を共発現する哺乳類CHO細胞での安定な系統の作製
pcDNA3(+)-OctR-AcGFPおよびG-アルファ-16を安定に共発現するCHO細胞の系統を作製した。G(16構築物を安定に発現するCHO細胞(第20継代)を、図５５で決定されるように最適量のDNAである、1.5ugのpcDNA3(+)-OctR-AcGFPで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞(すでに4ug/mlハイグロマイシン選択条件下で維持されている)をゼオシン選択(300ug/ml)条件下に置いた。選択条件下で3週間、細胞を培養して継代し、そして蛍光による単一細胞フローサイトメトリー選別をDuke Universityで完了させ、モノクローナル安定セルラインを作製した。図５６は、細胞選別の直前に完了した実験を示し、該実験は、安定なプール集団の約10%がオクトパミンに応答したことを示す。選別の時点で、G-アルファ-16 CHO系統は第22継代の時点であった。
図５６. ゼオシン選択の3週間後、ゼオシン耐性CHO- G-アルファ-16細胞の安定なプールが存在する。安定なプールの約10%が測定可能なレベルでオクトパミンに応答した。次いでこのプールを単一細胞モノクローナルコロニーに選別した。
モノクローナルコロニーの、緑色蛍光タンパク質、したがって推定するところ融合OctR受容体の発現を、視覚的に評価した。緑色蛍光タンパク質発現に関する陽性コロニーを増殖させ、オクトパミンへの応答を試験した。
緑色蛍光タンパク質発現に関して陽性の約30種のモノクローナル系統を、オクトパミンに対する応答に関してFLIPR Tetraで試験した(図５７)。すべてのクローンを、ポジティブコントロールおよび最大カルシウム応答の基準としてのUTP、2用量のオクトパミン、およびネガティブコントロールのバッファーによって刺激した。20,000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。約30系統のうち、2種のクローン系統のみ(#13および#30)がオクトパミンに対する測定可能な応答を示した(図５８)。さらなる試験のためにこれらの2系統を選択した。
図５７. オクトパミンへの応答に関するすべてのGFP陽性モノクローナルセルラインのスクリーニング。すべての系統はポジティブコントロール(10μM UTP)に応答し、ネガティブコントロール(バッファー添加)への応答はなかったが、クローン#13および#30のみが最大投与量のオクトパミンに対する測定可能な応答を有した。
図５８. FLIPR Tetraでのクローン#13および#30の応答。各グラフで、上2つのラインは最大投与量のUTPに応答するものであり、それに続いて、降順に、10uMオクトパミン、50nMオクトパミン、およびバッファーコントロールである。
安定な系統#13および#30はオクトパミンへの最良の応答を示す
約30種のGFP陽性モノクローナル系統の評価後、さらなる分析のためにクローン#13および#30を、それらのオクトパミンへの測定可能な応答に起因して、選択した。オクトパミンに対する単一細胞応答を評価することによってこれらの各クローン系統の均一性を試験した。クローン#13を、カルシウムイメージング系でFura-2蛍光色素を使用して評価し、クローン#30を、Discovery顕微鏡でFluo-4蛍光色素を使用して調査した。図５９は、これらの試験の結果を示す。両クローンは、それらのオクトパミンへの応答によって示されるように、完全に、OctRを発現する細胞から構成されていると思われる。しかし、強い応答者と弱い応答者との間に注目すべき線引きが存在する。これは、細胞ごとの受容体発現またはG 16発現レベルの差異に起因するかもしれない。これらの実験をモノクローナル系統への流動選別後の第7継代に続いて実施した。
図５９. クローン#13 および#30の、オクトパミンに対する単一細胞応答。クローン#13 (A)を、カルシウムイメージング系でFura-2蛍光色素によって評価し、クローン#30 (B)を、Discovery顕微鏡でFluo-4蛍光色素によって評価した。
FLIPRでの経時的なシグナルの縮小のために(Do to)、両系統#13および#30のさらなるサブクローニングを行った。蛍光による単一細胞フローサイトメトリー選別をDuke Universityで完了して、OctR-GFPおよびG(16を共発現する、さらにサブクローニングされたモノクローナル安定セルラインを作製した。緑色蛍光タンパク質(および想定により、融合されたOctR)の中または高発現を有する単一細胞を96ウェル皿に選別し、ハイグロマイシンおよびゼオシンの選択条件下に置いた。
安定なセルラインの作製およびクローン選択
ベースラインを超える最大オクトパミン応答を探して、元の#30クローン系統由来の50を超えるサブクローンをFLIPRで数週間評価した。アッセイ開発に進むために、FLIPRの良好なダイナミックレンジ(図６０: OCTRクローン55選択)およびDiscovery顕微鏡での82%を超える均質性(図６１: OCTRクローン55の均質性)に基づいてクローン55を選択した。
図６０. OCTRクローン55選択。黒色96ウェルプレートに20K/ウェルでOCTRクローンをプレーティングし、翌日アッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたりプロベネシドを含む50ulの2μM Fluo-4を25℃で1時間、細胞にローディングした。色素を除去し、プロベネシドを含む50μlのバッファーを加えた。Tetraで単一添加を実施した。50μLのバッファーまたは(2X) 200μMオクトパミンを細胞に加え、最大細胞内カルシウムシグナルに関するコントロールとして10μM UTPを使用した。
図６１. OCTRクローン55の均質性。黒色96ウェルプレートに6K/ウェルでOCTR細胞をプレーティングし、翌日アッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたり50ulのFluo-4を25℃で1時間、細胞にローディングした。色素を除去し、プロベネシドを含む50μlのバッファーを加えた。50μlの10μMオクトパミンまたはバッファーを加え、Discovery顕微鏡を使用してシグナルを記録した。Discovery顕微鏡で測定された単一細胞応答のウェル平均を上にグラフで示す。
薬理学
クローン55を正確な薬理学に関して評価し、cAMP読み取り値に基づいて、公開されている結果と比較した。図６２Ａ＆Ｂに示されるように、アゴニストおよびアンタゴニストは、公開されているデータと同じ順番の効力を示し、ここに、アゴニストの場合は、ナファゾリン>オクトパミン>アミトラズ>クロニジン>トラゾリンであった(Evans P, et al. 2005. Invertebrate Neuroscience 5: 111-118)。図６２Ｃでは、これらの同化合物は親セルラインに対する影響を有さなかった。それは、オクトパミン受容体に対する該リガンドの特異性を示す。
図６２. 384ウェルプレートに10K/ウェルで細胞をプレーティングし、370Cで一晩インキュベートしておいた。接種の18〜24時間後に細胞をアッセイした。培地を除去し、2μM Fluo-4で60分間、細胞に色素ローディングした。1時間後、色素を除去し、20μlのバッファーをプレートに加え、FLIPRに入れた。1回目の添加はアンタゴニスト用量応答曲線であり、2回目の添加はアゴニスト用量応答曲線であった。アンタゴニストを100nMオクトパミンとチャレンジさせた。さらに、親セルラインCHO-Gアルファ16でこれらの化合物を試験した。
アッセイ開発
HTSスクリーニングストラテジー
このアッセイは2液添加を使用して、1回の実験でアクチベーターおよびインヒビターの検出を可能にする。スクリーニングでは、試験化合物を1回目の添加で加え、3分間インキュベートしておく。そしてアクチベーターオクトパミンを2回目の添加においてEC80濃度で導入し、蛍光を2分間読み取る。コントロールを両添加に関して実行する。1回目の添加でのベースラインを超える蛍光の増加はアクチベーター候補を示し、2回目の添加において応答が減少するかまたは増加がなければ、インヒビター候補を示す。図５５Ｃ。
基本的試験プロトコール
384ウェル黒色TCプレートに50μl中で10,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、37℃/ 5% CO2で一晩インキュベートしておいた。接種の18〜24時間後に細胞をアッセイした。培養培地を弾き飛ばすことによって除去し、アッセイバッファー中の2μM Fluo-4プラスプロベネシド20ulで25℃で60分間、細胞に色素ローディングした。1時間後、色素を弾き飛ばすことによって除去し、20μLのアッセイバッファーを加え、5分待った後、FLIPRに入れ、2回添加プロトコールを使用して作動させた。1回目の添加(20ul, 2x)はアッセイバッファー中の最終0.5% DMSOであった。2回目の添加(20ul, 3x)はアッセイバッファーまたは最終100nMオクトパミンのいずれかであった。
細胞プレーティング方法
アッセイプレートへの細胞のマニュアルvs.マルチドロップ分配(multidrop dispensing)を調査するための実験を行った(データは示していない)。マルチドロッププレーティングが手作業のプレーティングより再現性が高いことがデータによって示された。マルチドロップで細胞をプレートする場合に覚えておくべき2つの要点がある。
1. 細胞は、細胞プレーティング時に懸濁状態のままである必要がある。発明者らは、回転式プレートまたは、ホルダーが取り付けられているロトミキサー(rotomixer)を使用し、発明者らは、該ホルダーに、細胞を含む500ml円錐底チューブを置くことができる。
2. プレート間でマルチドロップチューブに細胞が着いた(sitting)ままにしない。該細胞はチューブにとどまり、データ中のストリークパターンを生じさせる。細胞が着いた場合、チューブを空にして再開する必要がある。
DMSO耐性研究
1回目および2回目の添加で完全オクトパミン用量応答曲線を実施して、種々の濃度のDMSOに対するこのアッセイの感受性を試験した。図６３Ａに示されるように、2% DMSO (最終)でオクトパミンに関するEC50の顕著なシフトが存在した。2回目の添加(図６３Ｂ)では、0.67%より高い最終DMSO濃度はEC50の顕著なシフトを示した。このアッセイでは、発明者らは、1回目の添加で0.5% DMSO、2回目の添加で0.33%の終濃度を使用している。それはオクトパミンEC50に対して最小の影響しか有さない。
図６３: 1回目および2回目の添加の種々のDMSO濃度でのオクトパミンEC50曲線。OctR細胞を10K細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に分析した。培養培地を除去し、ウェルあたり20ulの2μM Fluo-4プラスプロベネシドを25℃で1時間、細胞にローディングした。1時間後、色素を除去し、20μlのバッファープラスプロベネシドをプレートに加え、Tetraに入れた。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)は、指定% DMSO + オクトパミンDRC 20ul(図６３Ａ)またはアッセイバッファー中の指定% DMSO 20ul(図６３Ｂ)のいずれかであり、それを180秒間読み取った。図６３Ｂの2回目の添加は(2x) 20μlのオクトパミンDRCであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大(1回目の添加)および読み取り値200-360の最大値(2回目の添加)を使用して統計を算出した。
細胞密度最適化
ウェルあたり7K、10K、および14Kのプレーティング密度の変動性およびZ'統計を調査した。データを図６４に示す。実施されたすべての試験密度で、優れたZ'統計が得られた。低い変動性およびコスト削減に基づいて10K /ウェルで進めることを決定した。
図６４: 細胞密度最適化。指定密度でのフルプレートに関する最大および最小統計を、得られたCVおよびZ'統計とともに示すFLIPRデータ。4K細胞/ウェル未満のプレートでは、翌日、集密単層が得られず、試験しなかった。OCTR細胞を適切な密度で手作業でプレーティングし、次の日にアッセイした。培養培地を除去し、20ul/ウェルの2μM Fluo-4プラスプロベネシドを細胞にローディングし、25℃で1時間インキュベートした。1時間後、色素を除去し、20μl/ウェルのバッファープラスプロベネシドを加え、Tetraに入れた。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)はアッセイバッファー中の1% DMSO (0.5% [最終]) 20ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(3x)はアッセイバッファー中の300nMオクトパミン(100nM [最終]) 20ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大値(最小応答)および読み取り値200-360の最大値(最大応答)を使用して統計を算出した。
色素濃度
1μM、2μMおよび4μM Fluo-4色素を1時間ローディングされた細胞の応答を比較する実験(ノート1052125 #1 p.102)を図６５に示す。すべての試験Fluo-4濃度で、許容されるウインドウサイズおよびZ'統計が得られた。良好なダイナミックレンジおよびかなりのコスト削減に基づいて2μM Fluo-4を用いて進めることを決定した。
図６５: 色素濃度。ウインドウサイズへの色素濃度の影響を示す最大統計。OCTR細胞を10K細胞/ウェルでプレーティングし、次の日にアッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたり20ulの1μM、2μMまたは4μM Fluo-4を25℃で1時間、細胞にローディングした。1時間後、色素を除去し、20μlのバッファーをプレートに加え、Tetraに入れた。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)はアッセイバッファー中の1% DMSO (0.5% [最終]) 20ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(3x)はアッセイバッファー中の300nMオクトパミン(100nM [最終]) 20ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大値(最小応答)および読み取り値200-360の最大値(最大応答)を使用して統計を算出した。(示されていないZ' 1μM Fluo-4 = 0.73, 2μM= 0.70, および4μM= 0.80)。
色素ローディング時間
変動性およびZ'統計に対する色素ローディング時間の影響を図６６で調査した。さらに、発明者らは、MDCチップとAxygen Tetraチップを比較した。結果は、1.0〜3.0時間の範囲の色素ローディング時間が、EC50、ウインドウサイズまたは、結果として、Z'統計に顕著な影響を有さないことを示した。MDCまたはAxygenチップとの間に差異はなかった。
図６６: 色素ローディング時間。色素ローディング時間の増加に伴ってオクトパミンEC50のシフトが存在するかどうかを決定するために、OctR細胞に、1時間、2時間および3時間ローディングした。さらに、発明者らはMDCチップとAxygenチップを同時間量にわたって比較した。OctR細胞を10K細胞/ウェルでプレーティングし、次の日にアッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたり20ulの2μM Fluo-4/プロベネシドを25℃で細胞にローディングした。1、2、および3時間後、色素を除去し、20μlのバッファーをプレートに加え、Tetraに入れた。2回添加プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)はアッセイバッファー中のDMSO (0.5%最終) 20ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(3x)はアッセイバッファー中の所定の用量でのオクトパミン20ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大値(最小応答)および読み取り値200-360の最大値(最大応答)を使用して統計を算出した。
色素ローディング温度
OctR細胞へのローディングは室温で良好だったので、37℃を調査しなかった。
アッセイバッファーpH最適化
アッセイ開発中を通してずっと標準HBSSバッファーpH 7.4を使用した。
アッセイバッファーの安定性
4℃で保存されたアッセイバッファーを1週間まで試験し(データは示していない)、性能の有意差はなかった。
オクトパミンの安定性
オクトパミンを、新たに希釈されたものと24時間溶液とを比較して試験した(データは示していない)。室温で保存された24時間溶液の場合に得られた応答は、新たに希釈された溶液の応答と同一であった。発明者らは、10mMオクトパミンの4℃ DMSOストックを繰り返し凍結解凍したが、活性の減少はなかった。
ピペット洗浄およびオクトパミンキャリーオーバー評価
スクリーニングのコストを削減するために、チップを複数回使用できるよう、チップ洗浄実験を実施して、チップからオクトパミンを除去する能力を評価した。オクトパミンは、非常に粘着性であり、チップ上で次のプレートに容易にキャリーオーバーされる。以下のDMSO洗浄プロトコールを評価した。
4サイクル x 2.5% DMSO中の28μLでの2ストローク
100% DMSO中の25μLでの混合10ストローク
1サイクル x 2.5% DMSO中の28μLでの2ストローク
1サイクル x 水中の28μLでの2ストローク。
図６７ＡおよびＢに示されるデータに基づくと、DMSO洗浄プロトコールはチップからオクトパミンを除去せず、第2プレートへの顕著なキャリーオーバーが生じた(図６７Ｂ)。さらに、アッセイの長さが11分を超えて増加したことに留意すべきであり、それは1日あたりに走らすことができるプレートの数に顕著に影響した(ノート1052125 #1 p124)。また、アセトンを一度試験した。アセトンはキャリーオーバーを除去するために非常に良好に機能した(データは示していない)が、低い引火点のせいで、Tetra装置でアセトンを使用することは安全上の問題になりうる。このスクリーニングでは、プレートの間でチップを交換する。
図６７: チップ洗浄評価。フルプレートに関する最大および最小統計を、得られたCVおよびZ'統計とともに示すFLIPRデータ。OCTR細胞を10K/ウェルでプレーティングし、次の日にアッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたり20ulの2μM Fluo-4プラスプロベネシドを25℃で1時間、細胞にローディングした。1時間後、色素を除去し、20μlのバッファープラスプロベネシドをプレートに加え、Tetraに入れた。2回添加洗浄プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)はアッセイバッファー中の1% DMSO (0.5% [最終]) 20ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(3x)はアッセイバッファー中の300nMオクトパミン(100nM [最終]) 20ulであり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大値(最小応答)および読み取り値200-360の最大値(最大応答)を使用して統計を算出した。
3日の変動性評価
3回の独立したアッセイを、異なる3日に実施して、スクリーニング時に使用されるアゴニスト(オクトパミン)またはアンタゴニスト(ミアンセリン)の適切な濃度を検証し、かつアッセイのプレート間およびプレート内変動性を検証した。それぞれの日に、各条件に関して重複するプレートを試験した。アッセイプロトコールは以下の通りであった。OctR細胞を50μl培地中で10K/ウェルでプレーティングし、37℃/5% CO2で18〜24時間インキュベートした後、Tetraで試験した。アッセイの日に、2μl Fluo-4で25℃で1時間、細胞に色素ローディングし、色素を除去し、20μlバッファーをプレートに加え、室温で5分間インキュベートし、そしてTetraで試験した。
3日の変動性評価では、以下の濃度のアゴニストおよびアンタゴニストを使用した。
100%アゴニスト= 100nM (1日目)および1μM (2および3日目)
80%アゴニスト= 40nM (1日目)および100nM (2および3日目)
50%アゴニスト= 5nM (すべての日)
50%アンタゴニスト= 40nM (すべての日)。
タイムカット(Time cuts):
読み取り1 = 20-180 max stat
読み取り2 = 200-360 max stat。
(1) バッファー+ 50%アゴニスト+ 100%アゴニスト。以下の散布図は、アゴニストを同定するためのアッセイの能力を検証するための3日の重複プレートを示す。2および3日目にオクトパミンの50%用量が達成された。
(2) バッファー+ 80%アゴニスト+ 100%アゴニスト。以下の散布図は、2回目の添加で使用されるオクトパミンの80%用量を検証するための3日の重複プレートを示す。示されるように、3日間すべてで80%用量が達成された。
(3) バッファー+ 50%アンタゴニスト+ 80%アゴニスト。以下の散布図は、アンタゴニストを同定するためのアッセイの能力を検証するための3日の重複プレートを示す。残念ながら、3日間すべてで不正確な用量のミアンセリンが使用された; しかし、20プレートDMSO試験実施時に正確な用量が達成された(図６９Ｂ)。
3日のアゴニストおよびアンタゴニスト用量応答曲線
オクトパミンおよびミアンセリン用量応答曲線を独立した3日で行い、EC50シフトを経時的に分析した。図６８ＡおよびＢのデータは、オクトパミンのEC50およびミアンセリンのIC50が3日にわたって非常に再現性が高いことを示す。
図６８. OCTR細胞を10K/ウェルでプレーティングし、次の日にアッセイした。培養培地を除去し、ウェルあたり20ulの2μM Fluo-4プラスプロベネシドを25℃で1時間、細胞にローディングした。1時間後、色素を除去し、20μlのバッファー＋プロベネシドをプレートに加え、Tetraに入れた。2回添加洗浄プロトコールを使用した。1回目の添加(2x)はアッセイバッファー中の所定の用量のDMSOまたはミアンセリン20ulであり、それを180秒間読み取り、2回目(3x)は20μlの所定の用量のオクトパミン(図５５Ａ)または100nM最終オクトパミン(図５５Ｂ)であり、それをさらに180秒間読み取った。読み取り値20-180の最大値(最小応答)および読み取り値200-360の最大値(最大応答)を使用して統計を算出した。
20プレートDMSO試験実施
以下のことを試験するために20プレートDMSO試験を実施した。
化合物希釈スキーム(ページ30)
20プレート試験のための試薬調製容量(SOPページ30〜31)
試験実施のダイナミクス: タイミング、装置の問題など。
表5は全20プレートのZ'を示す。すべてのプレートは、プレート6を除き、許容されるZ'を有した。プレート6では、プレートを横切って液体添加量の変動を生じさせるマルチドロップピペッティングエラーがあった。プレート2は、低い1回目の添加(活性化)での1コントロールウェルを有した。該ポイントを計算から除去すると、Z'活性化= 0.60が得られた。
Figure 2012507273
図６９Ａはプレート#7の散布図であり、スクリーニングのアゴニスト部分のコントロールおよび試験ウェルを示す。緑色の四角形は100% (1μM)オクトパミンコントロールであり、青色の四角形は0%またはバッファーコントロールであり、黒色のひし形は試験サンプルであり、この場合、0.5%最終DMSOである。
図６９Ｂはプレート#7の散布図であり、スクリーニングのアンタゴニスト部分のコントロールおよび試験ウェルを示す。緑色の四角形は80% (100nM)オクトパミンコントロールであり、青色の四角形は0%またはバッファーコントロールであり、黒色のひし形は試験サンプルであり、この場合、100nMオクトパミン(octpamine) + 0.33%最終DMSOである。緑色の四角形より大きい値を有する黒色のひし形は100%用量のオクトパミン(1μM)である。これらのウェルをデータ計算に使用しないが、オクトパミンの80%用量を検証するためのアッセイに含める。緑色の四角形より低い値を有する黒色のひし形は、経時的に低下している1回目の添加由来の100%コントロールである。それらをいかなるデータ計算にも含めない。四角い形の赤色は50%アンタゴニストコントロール(267nMミアンセリン)であり、細胞が適正に応答することを確実にするために含める。
データ計算
活性化%および阻害%を以下の式によって算出した。
活性化%= ((試験サンプル - 平均0%活性)/(平均100%活性 - 平均0%活性)) x 100
阻害%= ((試験サンプル - 平均0%阻害)/(平均80%阻害 - 平均0%阻害))x 100。
以下の式を使用して活性化のZ'統計を算出した。
1 - ((3 x 平均STDEV min + 3 x 平均STDEV max)/(吸光度 平均100% - 平均0%))
式中、min = 0%活性化であり、Max = 100%活性化である。
以下の式を使用して活性化のZ'統計を算出した。
1 - ((3 x ave. STDEV min + 3 x ave STDEV max)/(abs ave 80% - ave 0%))
式中、min = 0%活性化であり、Max = 80%活性化である。
HTS SOP
(1) 材料
Figure 2012507273
アッセイバッファー(HBSS):
20mM Hepes; 11.1mM Glucose; 1.8mM CaCl2; 1mM MgCl2; 125mM NaCl; 2.5mM KCl; 5mM Probenecid; pH 7.4 Osm 290。
1LのHBSSを作製するために、20mlの1M Hepes、11.1mlの1Mグルコース、1.8mlの1M CaCl2、31.25 mlの4M NaCl、1mlの1M MgCl2および0.83mlの3M KClを935mlのdH20に加える。NaOHでpHを7.4にする。4℃で保存する。
プロベネシド:
MW= 285.4; ICN Biomedical (156370)
14.2グラムの粉末を100mlの1M NaOHに加える=500mM
10mlの500mMストックを1LのHBSSに加え、HCLでpHを7.4にする。室温で保存する。
Fluo-4AM:
MW= 1096.95; Molecular Probes (F-14202)
912μlの100% DMSOを1mgバイアルに加える= 1mMストック。
20% Pluronic F-127:
MW約12500; Invitrogen (P3000MP)
DMSO中の20%溶液。
オクトパミン:
MW= 189.64; Sigma (O-0250)
10mMストックを100% DMSO中で調製する。
ミアンセリン:
MW = 300.8; Sigma (M-2525)
10mMストックを100% DMSO中で調製する。
(2) 細胞培養
(A) 細胞培養プロトコール
このアッセイは、1セルライン: OCTRクローン55を使用する。
完全培養培地: バイオセーフティキャビネット/層流フード中で調製する。
1. 500 mlのダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養混合物F-12 (Ham's Nutrient Mixture F-12)。
2. 50ml mlウシ胎児血清を加える。
3. 5mlペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加える。
4. 2.2mlハイグロマイシンを加える。
5. 1.5mlゼオシンを加える。
6. 0.2umフィルターを通して滅菌フィルターし、4℃で保存する。
凍結細胞の解凍: 最初に、月曜日の日の早期に細胞を解凍して、その週の間、細胞増殖をモニターでき、数を調節できるようにすることが最良である。以下に列挙される細胞数は大まかな指針とみなされるのみであり、その理由は、培養培地によって、異なる割合で細胞が成長するからである。
1. 液体窒素保存からバイアルを取り出し、それを37℃の水浴にすぐに入れて穏やかに撹拌することによって細胞を急速に解凍する。汚染の可能性を減少させるため、O-リングおよびキャップを水に浸けないようにする。
2. 内容物がほぼ解凍されたら、水浴からバイアルを取り出し、反転によって混合し、70%エタノールをスプレーすることによって浄化する。この時点から、すべての操作を無菌条件下で実行する。
3. 解凍された細胞懸濁液1mlを、30mlの完全培地を含む50ml円錐底遠心チューブに移す。
4. 細胞を150gで5〜7分間、遠心分離する。
5. 遠心分離後、吸引によって培地を除去し、ペレットを5mlの完全培地に再懸濁する。
6. 5mlの再懸濁細胞を、25mlの完全培地を含む225cm2フラスコに移す。
7. 次の朝、培養フラスコを点検し、増殖のために分割するか、またはさらなる培養のために培地を置換する。
(B) 細胞の継代培養/回収プロトコール
1. フラスコをインキュベーターから取り出す。
2. フード内でフラスコから古い培地を無菌的に吸引する。
3. フラスコあたり5〜10 ml PBSを加える。
4. 簡単にPBSでフラスコをすすぐ。
5. PBSを吸引除去する。
6. 3〜5ml RTトリプシンを加える。
7. 簡単に細胞上にトリプシンを流す(wash)。
8. トリプシンを吸引除去する。
9. 細胞を3分間剥離させ、フラスコをタッピングして細胞をゆるめる。
10. 培地8mlをフラスコに加える。
11. 数回ピペットして、すべての凝集塊を壊し、フラスコの底から細胞を洗い流す。フラスコをまっすぐに立たせ、次のステップを完了する。
12. 複数のフラスコを回収する場合、すべてのフラスコ由来の細胞を1つのフラスコにまとめ、十分に混合する。
13. 細胞懸濁液20ulをフラスコから取り出し、カウントのためにチューブに入れる。
14. 以下のステップCに進む。
(C) 細胞および生存カウントの実施/フラスコおよびプレートの接種:
1. 細胞を回収した後、トリパンブルーおよびPBS中で1:1希釈で希釈することによってカウント用に細胞を調製する: 20μl細胞懸濁液+ 20μlの0.4%トリパンブルー溶液。
注: トリパンブルーは0.4%溶液として利用可能であり、0.02%〜0.04%の作業濃度で使用するが、0.2%で良好に機能する。トリパンブルーでの染色後、3分以内に細胞をカウントする; 該時間の後、生存細胞は該色素を取り込み始める。
2. ピペットを使用して、少量の染色細胞懸濁液を回収し、ピペットのチップを、カバーガラスを有する透明な血球計のスロット上に置く。細胞懸濁液は毛細管作用によってカバーガラスの下を通る。反対のチャンバを満たす。いっぱいにし過ぎない。細胞分布は両チャンバで一様であるべきである。
3. 血球計を顕微鏡のステージに置き、3つのラインによって規定される4つのラージコーナースクエアの1つを見る。生存細胞はわずかに乳白色で丸くて淡く、暗い輪郭を有する。非生存細胞は暗くて不透明な青色である。
4. 4つのスクエア中の生存細胞をカウントする。スクエアの外側境界と重なる細胞をカウントするが、内側境界と重なる細胞はカウントしない。スクエアあたりの平均の生存細胞数を算出する(4スクエア中のトータル生存細胞を4で割る)。
5. 両チャンバー由来の細胞カウントを記録する。カウントが20%以上異なる場合、第3のサンプルを調製して、カウントを検証する。
6. 以下の式を使用して生存細胞数を算出する。
生存細胞数/ml = 平均生存細胞数x 104 x 希釈係数。
生存%= カウントされた生存細胞数/細胞の総数 x 100。
フラスコに接種するため、懸濁液1 mlあたりの細胞および必要な細胞の量を算出する。
例えば、
・ 2.5e6細胞/mlの細胞懸濁液を使用して10フラスコに8.5e6細胞/フラスコで接種する。
・ 25mlの完全培地を各フラスコにピペットする。
・ 各フラスコに加えるために必要な細胞懸濁液の容量を計算する。
・ 8.5e6 / 2.5e6 = 3.4mlの細胞を各フラスコに加える。
・ 細胞を各フラスコにピペットする。
・ フラスコを穏やかに揺らし、フラスコを細胞および培地で均一にコーティングする。
・ フラスコを37℃/5% CO2インキュベーターに入れる。
・ 以下の表は接種スケジュールおよびT175フラスコの密度を示す。
Figure 2012507273
プレートに接種するため、必要とされるプレートあたりの細胞の数を算出する。
例えば、
・ 2.5e6細胞/mlの細胞懸濁液を使用して10K細胞/ウェルで20プレートに接種する。
・ 必要とされる細胞懸濁液の容量を計算する。
・ 10,000細胞/ウェル x 384ウェル/プレート= 3.84e6細胞/プレート。
・ 3.84e6細胞/プレート x 23プレート= トータル8.832e7細胞。
・ (注: 23プレートを計算に使用して、マルチドロップにデッドボリュームが存在するようにする)。
・ トータル8.83e7細胞/2.5e6細胞/ml = 35.3mlの細胞懸濁液。
・ 細胞懸濁液を加える総容量を計算する。
・ 50μl/ウェル x 384ウェル/プレート= 19.2 ml/プレート。
・ 19.2ml/プレート x 23プレート= トータル442ml。
・ 細胞懸濁液35.3mlに、培地406.3mlを加える。
・ 十分に混合し、カウントするためにサンプルを採取する。
・ 細胞カウントは5e5細胞/mlまたは2.5e4細胞/50μlであるべきである。
・ マルチドロップを使用して、細胞をプレートに分配する。
- マルチドロップヘッドをディスペンサーに入れる。
- 50mlの70% EtOHでヘッドを洗い流す。
- 70mlの滅菌PBSで洗い流す。
- 500ml円錐底チューブ中の細胞懸濁液をrotomixテーブルに置き、マルチドロップチューブを細胞懸濁液に入れる。
- ヘッドに細胞懸濁液を入れる。
- 各プレートに50μl/ウェルを分配する。分配中に細胞が懸濁状態のままであることおよび細胞がチューブに着いていないことを確認する。いずれもデータにパターンを生じさせる。
- プレートを単層で室温で少なくとも30分置いた後、37℃/5% CO2インキュベーターに入れる。
- インキュベーター中でプレートが単層であることを確認する。
- 70mlの70% EtOHおよびその後の70mlのdH2Oで洗い流すことによってマルチドロップチューブをきれいにする。
(3) HTS 20プレートスクリーニングアッセイ
(A) アッセイの1日前:
- フラスコから細胞を回収する。20x 384ウェルプレートに10K細胞/ウェル/ウェルあたり50μlで接種する。プレートを室温で少なくとも30分置いておき、縁効果を減少させる(詳細に関してはページ29を参照のこと)。
- 37(C/ 5%CO2で一晩インキュベートする(16〜24時間, 1プレートの高さしか積み重ねない)。
(B) アッセイの日:
1. Tripos Read 1の調製:
- 45μLの2mMストックプレートをTetraのソースポジション#1に置く。
- 45μlのHBSS (DMSOなし)を含む新たな384ウェルプレートをソースポジション#2のカラム3〜22に置く。
- 90μlのHBSS (DMSOなし)を含む新たな384ウェルプレートをリードポジションのカラム3〜22に置く。
- Tripos化合物希釈コントロールファイルを作動させる。
Figure 2012507273
または、
1. Divpick Read 1の調製:
- マルチドロップを使用して、最終ストック200μMのために5μlの化合物を含むストックプレートに45μlのHBSSを加える。
- 50μLの200μMストックプレートをTetraのソースポジション#2に置く。
- 90μlのHBSS (DMSOなし)を含む新たな384ウェルプレートをリードポジションのカラム3〜22に置く。
- Divpick化合物希釈コントロールファイルを作動させる。
Figure 2012507273
2. Readプレート1コントロールの調製。
- 750μlの100% DMSOを75mlのHBSSに加えることによってHBSS 1% DMSOバッファーを構成する。下のREAD 1プレート地図にしたがって適切なウェルに60μlを加える。
- 2μM (2X)濃度のために5μLの10mMストックを25mlのHBSSに加えることによって100%オクトパミンを構成する。下のREAD 1プレート地図にしたがって適切なウェルに60μlを加える。
- 800nM (2X)濃度のために50μLの100μMストックを6.25mlのHBSSに加えることによって50%ミアンセリンを構成する。下のREAD 1プレート地図にしたがって適切なウェルに60μlを加える。
Figure 2012507273
3. Read 2プレートの調製
- 300nM (3X)濃度のために165μLの1mMストックを550mlのHBSSに加えることによって80%オクトパミンを構成する。下のREAD 2プレート地図にしたがって適切なウェルに60μlを加える。
- 3μM (3X)濃度のために37.5μLの1mMストックを12.5mlのHBSSに加えることによって100%オクトパミンを構成する。下のREAD 2プレート地図にしたがって適切なウェルに60μlを加える。
- 下のREAD 2プレート地図にしたがって適切なウェルに60μLのHBSS (DMSOなし)を加える。
Figure 2012507273
4. 色素ローディング
- 0.5mlの1mM Fluo-4を0.5mlの20% pluronicとともにチューブに加えることによって色素を調製し、混合し、次いで混合物を250mlのHBSS/プロベネシドに加える。
- プレートをCloroxを含むシンク中へ弾くことによって細胞プレートから培地を除去し、キムワイプ上で穏やかにタッピングして過剰量を除去し、マルチドロップを使用して20μl/ウェルの色素を加える。
- RTインキュベーターに60分入れる。
5. アッセイの実施
- 漂白剤を含むシンク中へ弾くことによって細胞プレートから色素を除去し; キムワイプ上で穏やかにタッピングして過剰色素を除去する。
- マルチドロップを使用して20μlのHBSSを細胞プレートに加え; FLIPRのリードポジションに置き、5分待った後、FLIPRで試験する。(*** 5分待たないと、プレートの変動性が増加する)。
- Read 1化合物プレートをソース#1に置く。
- Read 2化合物プレートをソース#2に置く。
- 作動プロトコール: TetraでのOCTR HTSスクリーニング。
- FLIPR読み取り設定:
1回目の添加= 10ベースライン読み取り後の20μl添加で1秒間隔の180読み取り。
2回目の添加= 10ベースライン読み取り後の20μl添加で1秒間隔の120読み取り。
7. データエクスポート
20プレートを走らせた後、stat1として読み取り1-180およびstat2として読み取り200-300の最大統計を手動でバッチエクスポートする。そして、これらの統計をexcelのスプレッドシートにコピーし、阻害および活性化のコントロールパーセントを計算する。
Figure 2012507273
以下の実施例はSKチャネルに関するものである。
1.
カリウムチャネルはDmの生存に関与する。一時的RNAi実験では、生存度の減少および致死効果がDmで誘発されることが示された。バッファーコントロールならびに公知の非致死のRNAiの注入と比較して、配列番号２２７から製造されたRNAiは、Dmで測定可能な生存度減少を示す。
Figure 2012507273
2. ショウジョウバエSK遺伝子の、CHO細胞での発現
遺伝子名 小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル
シノニム CG10706
種 Drosophila melanogaster
最終クローン名 pCRII-SK2+4D (コード配列のみ) 図７０
基本ベクター pCRII-TOPO (Invitrogen)
プライマー
フォワード: SK 5'1 5'ATGAAAACACCTTCCATTGC 3' (配列番号２３３)
リバース: SK 3'2 5'TCAGCTGCCGTATTTGTTGG 3' (配列番号２２４)。
クローニングストラテジー: 上記プライマーを使用して、混合fs-cDNA (頭部および二齢)由来のコード配列をPCRで増幅し、pCRII-TOPOベクターにクローニングした。シークエンシングのために2つの独立したクローン、2および4Dを選択し、2由来のAvrI/NdeI 498 bp断片を4DのAvrI/NdeI 5233 bpベクター断片にサブクローニングすることによって完全な配列を作製した。
発現構築物
pCRII-SK2+4D由来の1.8kb EcoRV/BamHI断片をpTriEx3-NeoのEcoRVおよびBamHI部位にライゲートすることによってpTriEx3 Neo SKを作製した。得られた構築物は、CMVプロモーターの下流のSK CDSを含み、5'末端に9コドンを付加し、それは、結果として、Kozak翻訳開始コンセンサス配列とインフレームである。図７１ トランスフェクション: CHOK1細胞を35mm 6ウェルプレートに2.5x104細胞/ウェルでプレーティングし、次の日に、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics Corporation)および製造元の推奨を使用して3種の異なる細菌クローンのそれぞれ由来の1ug pTriEx3 Neo SK DNAでトランスフェクトした。24時間後に細胞を75cm2フラスコに継代し、抗生物質選択条件(400ug/ml G-418, Calbiochem)下に置いた。
3. 機能性の試験
基本的試験プロトコール: 96ウェルポリ-D-リシンアッセイプレート(BD Biosciences)に5x104/ウェルで細胞をプレーティングし、試験前の日に37C / 5% CO2で置いた。培養培地を吸引し、アッセイバッファー中の0.4x青色膜電位色素(Molecular Devices Corporation)で置換し、室温で1時間インキュベートした。ベースライン蛍光を20秒間読み取り、活性化後にさらに60または180秒間読み取ることによってアッセイを実施した。
プール試験: 選択が完了(約10日)したら、アッセイプレートおよび増殖のための培養容器に細胞を再び継代した。1uM [最終]イオノマイシン(Ca2+イオノフォア)をアクチベーターとして使用して3つのトランスフェクションプールの機能を試験した。プール3 (クローンSK3)は、推定Ca2+流入に応答して予測される過分極を示した。図７２。
4. アッセイプロトコール
アッセイバッファー(毎日新たに調製):
Figure 2012507273
原液を滅菌ろ過し、4℃で保存されるグルコースを除き、無期限に室温で保存することができる。0.8容量の高品質水で出発し; 保存成分を終濃度まで加え、容量を調節することによって、アッセイバッファーを調製する。溶液を滅菌ろ過し、1N NaOHでpHを7.4に調節する。
粉末をDMSOに溶解して7.1 mg/mlの終濃度にすることによって10mMイオノマイシン(MW = 709)ストックを調製する。この溶液を4℃で保存する。1年間安定である。
10mMイオノマイシンをアッセイバッファーに加えて5uMの終濃度にする(1:2000希釈)ことによって活性化溶液(5x)を調製する。この溶液は、毎日新たに調製するべきである。発明者らは、特定のタイプのポリプロピレンへのイオノマイシン固着の報告を聞いているが、黒色FLIPR Tetra 96ウェルチップを除き、発明者らが使用しているチップ、チューブおよび化合物プレートでこれは観察されていない。
0.4x通常濃度のMolecular Devices青色膜電位色素を使用してこのアッセイを開発した。水和時に色素をボルテックスし、繰り返しバイアルをリンスして、すべての色素が回収されかつそれが溶液状態であることを確実にすることが重要である。色素は、当日、4℃で保存することができる。培養培地を96ウェルポリ-D-リシンプレートからフリップし、キムワイプ上でプレートを穏やかにタップして過剰の培地を除去し、ウェルあたり180ul 0.4x色素でそれを置換し、暗所で室温(25℃〜28℃)で3〜5時間インキュベートすることよって色素ローディングを実施する。20ul (10x)の1回目の添加および50ul (5x)の2回目の添加を含むアッセイプレートは今や、試験の準備ができている。50uMプロパフェノン[最終]をコントロールインヒビターとして使用する。活性化後、3分間アッセイを読み取り、コントロールに対して最大ウインドウの発生を可能にする。
特殊な試薬:
イオノマイシン、遊離酸(Calbiochem # 407950)
プロパフェノン塩酸塩(Sigma # P4670)。
5. クローニング:
プール3由来の細胞を12細胞/mlに希釈し、2つの96ウェル培養プレートの各ウェルに250ulを分配した。1週間の培養後に単一コロニーを含むウェルを同定し、増殖および次の週の試験用に採取した。
クローンスクリーニング: プールでの試験と同じ条件を使用して15の個別のクローンの機能をスクリーニングした。最大過分極の時間および程度ならびに過分極の持続可能性(sustainability)の測定を使用して、優良性質クローン(the best performing clones)をさらなる評価のために選択した。
6. 機能的検証
外部Ca2+の除去に対する応答を調査するための実験に着手した。イオノマイシンによるCa2+のインポートによってチャネルが実際に活性化されるならば、細胞の外側からのCa2+の除去は、反応差を減少させるはずである。図７３。
結論: アッセイバッファーからCa2+を除去すると、最大過分極が野生型の20%以内に減少し、120秒の時点までに反応差が完全になくなった。したがって、SK発現細胞は完全応答にCa2+を必要とし、それはCa2+依存的活性化を示す。
7. 活性化最適化/ EC50
コントロールに対して大きい応答ウインドウを有する強いシグナルを生じさせるために必要な、活性化バッファー中の最適なイオノマイシン濃度を決定するための試験を行った。3回の独立した実験でSK3に対するイオノマイシンのEC50を算出し、200nM (SD=10)の値を得た。800nMイオノマイシン以上で、コントロールに対する応答ウインドウのサイズの増加はなかった。これらの結果は、Ca2+依存的チャネルの完全活性化に関する1uMの、文献での値と一致する(Terstappen et al., 2001. Neuropharmacology 40)。
サンプルデータ: 図７４。
pTX-CHOはモックトランスフェクトされたセルライン、すなわち、スクリーニングにおいて、目的の遺伝子に起因しかつベクターに起因しない任意の活性を示すための、目的の遺伝子を含まないベクターでトランスフェクトされたセルラインである。
8. 色素ローディング時間に関する変動性
色素ローディング時間に関するアッセイウインドウサイズを調査するための試験を行った。24ウェルの各SK3-9およびpTx-CHOに、室温で、5時間近くまでの以下のグラフで指定される時間ローディングした: 図７５。
ウインドウサイズは最大3時間後に安定化し、ウェル間の変動性は減少した(データは示していない)。これらの結果に基づき、3〜5時間の色素ローディング時間がスクリーニングに推奨される。
9. DMSO耐性
予測されるように、細胞は1回目(10x)の添加の増加レベルのDMSOに応答し、不安定性が増加し、アッセイウインドウが狭くなった。0.2%を超えるDMSOレベルを生じさせる添加は、イオノマイシン活性化後の深刻な混乱を示した。図７６。
10. イオノマイシン安定性
溶液中のイオノマイシンの安定性を調査するための実験を行った(データは示していない)。イオノマイシンをアッセイバッファー中で5uMに希釈し、化合物プレートに入れ、次の日に、新鮮調製されたイオノマイシンとSK活性化に関して比較した。新鮮調製されたイオノマイシンは、アッセイウインドウサイズの、統計学的に有意な6%増加を生じさせた。よって、発明者らは新鮮調製したイオノマイシンを推奨する。
11. 統計学的試験
以下のハーフプレートデータ(図７７)を使用し、80秒の遅延時間でゼロベースラインを使用して260秒の時点から2つの統計学的パラメータを算出した。
t検定: 両側P値は0.0001未満である。したがって、偶然に発生する反応差の確率は本質的にゼロである。
Z'因子データ表(単位は-K RFUである, n=24):
Figure 2012507273
この統計は該試験を「優れたアッセイ」カテゴリーに入れる。
(Zhang et al., 1999. Journal of Biomolecular Screening 4., A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays)。
12. イオンチャネルライブラリー試験
主要なイオンチャネルタイプにわたる既知のアクチベーター、アゴニストおよびインヒビターからなる71化合物のセット(BIOMOL #2805, イオンチャネルリガンドライブラリ(Ion Channel Ligand Library))に対して10uMでDmSK3クローンを試験した。細胞を化合物と1分インキュベートした後、1uMイオノマイシンによって活性化した。
結果の概要
71化合物のうちの17種(24%)は、イオノマイシンに対する細胞の応答への明らかな影響を有した。これらのうちの9種(13%)は過分極に阻害性であると思われ、8種(11%)は応答に対するアクチベーター/アゴニスト効果を有した。大まかに言えば、DmSK3は、Ca2+運動に関与する化合物に応答する傾向があり、K+およびNa+チャネルモジュレーターに比較的非感受性であった(一部の例外を除く)。
選択された結果(SK3試験から)
BAY K-8644 L-タイプCa2+チャネルアゴニスト 図７８
プロパフェノン 効果的なカリウムチャネルブロッカー。図７９
TEA (SK3) (テトラエチルアンモニウム) 図８０
4-AP (SK3-4) (4-アミノピリジン) 図８１
プロパフェノン(SK3) 図８２。
13. アパミン感受性
哺乳類SKチャネルを、ハチ毒由来のペプチド毒素アパミンへのその感受性によって特徴付ける。発明者らは、DmSKが、高用量(10uM, データは示していない)でさえも、アパミン非感受性であることを見出した。
14. パッチクランプ技術で試験されたCHO細胞でのSK発現
材料および方法
細胞:
ショウジョウバエSK遺伝子で安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞をすべての測定に使用した。実験の18〜22時間前に細胞を35 mmペトリ皿にプレーティングした。
電気生理学:
データを取得し、pClampソフトウェア(バージョン9.0.1.16)を使用して解析した。室温(22〜25℃)で電位固定細胞に対して全細胞構成のパッチクランプ技術を使用した。DMZ Universal Puller (Zeitz, Munich, Germany)を使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー(8250, Garner Glass, Claremont, CA)からピペットを引き出し、それはピペット液を充填されて浴液中で測定された場合に2〜3 MOhmの抵抗を有した。ギガオームシールの形成前に浴液とピペット液の間の液間電位差を常に相殺した。
全細胞固定条件下で膜電流を測定し、Axoclamp 200B (Axon Instruments)によって2 kHzでサンプリングし、1 kHzでフィルタリングした。各実験の開始時時に電気容量電流を電子的に相殺した。IV曲線の線形性の理由から、リーク補正を適用しなかった。
CHO細胞上のSK電流を研究するために、細胞を-40mVの状態にしておき、-100で出発し、2秒毎に10mV増分で+130mVまでの一群の200ms試験電位パルスをかけた。電流・電圧関係に関して測定される振幅を、所定の脱分極電位での最大外向き電流として定義した。
インヒビターを浴液に直接加えた。
Figure 2012507273
結果
実験: CHO細胞でのDmSK発現の試験(クローンSK) 図８３。
結論:
DmSK遺伝子でトランスフェクトされたCHO細胞(クローンSK)はチャネルの機能的発現を示す。
実験: DmSKを発現するCHO細胞(クローンSK)に対するプロパフェノンの影響。
目的: プレートベースのFlexStation IIおよびFLIPR実験手順で得られた結果を確認するために、全細胞パッチクランプ条件下で細胞を70uMプロパフェノンに付した。図８５ 結論:
70uMプロパフェノンの添加によってDmSK-A2チャネルは完全にブロックされる。
15. アフリカツメガエル卵母細胞でのDmSKカリウムチャネル発現
目的: アフリカツメガエル卵母細胞内での電位開口型Drosophila melanogaster小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル(SK)の機能的発現をアッセイするために卵母細胞2電極電位固定発現系を利用するため。
アフリカツメガエルから新たに回収された卵巣葉をNASCO (Fort Atkinson,WI)に注文した。
室温の20mlのカルシウムフリーOR-2卵母細胞バッファー中の1.5mg/ml 1A型コラゲナーゼを用いて卵母細胞を単離した。
Drummond Nanoject Injector (HindIIIで直線化され、Ambion T7 mMessage mMachine転写キットを使用して転写されたpCRII-SK2+4Dプラスミド)を使用して50nlのin vitro転写DmSK RNA (1ug/ul)をV〜VI期卵母細胞に注入した。
補充されたND-96中で18℃で2日間、卵母細胞をインキュベートした。
ADInstruments PowerLabシステムを介してApple PowerMac G3に接続されたTurbo Tec 10C Amplifier (NPI Instruments)経由の2電極電位固定(3M KClで満たされたホウケイ酸ガラス1.5mm x 1.12mm)を使用してチャネル発現をアッセイした。
-30mVより高い静止電位を有する、注入された卵母細胞を+5mVで固定し、ND-96浴液(96mM NaCl, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 0.3mM CaCl2, 5mM HEPES pH 7.5および230 mOsm)で潅流した。測定された電流を2kHzでフィルタリングし、50/60Hz HumBugノイズ除去装置(noise eliminator)を用いた。
固定しながら、ナノジェクト(nanoject)を使用して100mM塩化カドミウム(9.2nl)を細胞内注入し、SKチャネルを活性化した。測定された電流を、卵母細胞内のSK活性化についての公開されている結果と比較した(図８５)。
結果:
卵母細胞発現系内のDmSKチャネルの機能的発現の初期評価は、卵母細胞内の少なくとも3回の塩化カドミウム9.2nl注射によって活性化された外向き電流を生じさせた。ラットSKの発現を使用して調査された結果(ref. 4)と比較すると、この昆虫SKチャネルは、より多くのカルシウム様活性化を必要とすると思われる(28nlの100mM CdCl2)。
Figure 2012507273
Grunnet et. al. Journal of Neuroscience Methods 2004より。

Claims (16)

  1. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための方法であって、以下のステップ:
    (a) 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドを膜中で組み立てるステップであって、該ポリペプチドはもともとは該膜中に存在しないものである、
    (b) もともとは該膜中に存在しない該ポリペプチドの活性を阻害する能力を有すると疑われる化合物を膜の片側に適用するステップ、
    (c) 該ポリペプチドの活性を測定するステップ、および
    (d) 該ポリペプチドの活性を減少させる(b)で適用された化合物を同定するステップ
    を含む方法。
  2. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞の膜中で発現させる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記膜が、以下の核酸分子:
    (a) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
    (b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
    (c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
    (d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
    (e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
    (f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
    (g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
    (h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列、または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
    (i) 配列番号３、４; ７、８; １１、１２; １５、１６、１９、２０; ２３、２４; ２７、２８および/または３１、３２のそれぞれのプライマーを使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得される、ポリヌクレオチドを含む核酸分子;および
    (j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子、
    からなる群から選択される核酸分子によってコードされる少なくとも1種のポリペプチドを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有する該ポリペプチドの活性を電気生理学的に、好ましくはパッチクランプ法によって、またはHTSアッセイで測定する、請求項１に記載の方法。
  5. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、哺乳類細胞、好ましくは、CHO細胞およびHEK293からなる群から選択される哺乳類細胞で発現させる、請求項２に記載の方法。
  6. 以下のステップ:
    (e) 昆虫、昆虫集団、または該昆虫を抑制しようとする場所に、請求項１(d)にしたがって同定した化合物の昆虫抑制量を適用するステップ、および
    (f) 該処理された昆虫もしくは昆虫集団の、または該場所の昆虫もしくは昆虫集団の、および無処理の昆虫、昆虫集団または場所の、増殖または生存度を測定するステップ、および
    (g) ステップ(e)の化合物の適用後の、該処理された昆虫もしくは昆虫集団のまたは該場所の昆虫もしくは昆虫集団の増殖または生存度を減少させる化合物を選択するステップ
    を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 請求項３(a)〜３(j)に記載される核酸分子からなる群から選択される核酸分子、およびこの核酸分子の発現に基づく、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの生物学的活性を有するポリペプチドが、埋め込まれるか、組み立てられているか、挿入されるか、または組み込まれている宿主生物、組織、細胞またはその細胞消化物または膜を含む、昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KChIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を減少させる殺虫性活性化合物を同定するための、アッセイ系。
  8. 宿主生物が、請求項３(a)〜３(j)に記載の核酸分子からなる群から選択される核酸分子を発現する、好ましくはCHO-細胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-1、HepC-2-、アフリカツメガエル卵母細胞、Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pc12およびU2OSからなる群から選択される安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞である、請求項７に記載のアッセイ系。
  9. 昆虫を死滅させるかまたは昆虫の増殖もしくは生存度を阻害する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定した化合物を昆虫に適用するステップを含む方法。
  10. 以下の核酸分子:
    (a) ２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に示されるポリペプチドをコードする核酸分子;
    (b) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子;
    (c) 遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６および/または３０に記載のポリペプチド配列から誘導することができる核酸分子;
    (d) 配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５および/または２９に示される核酸分子を含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と少なくとも50 %の同一性を有する核酸分子;
    (e) (a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50 %の同一性を有し、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KchIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
    (f) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)〜(c)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子;
    (g) (a)〜(e)の核酸分子の1つによってコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて単離でき、かつ電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KchIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
    (h) 配列番号３３および/または３４のそれぞれに示されるコンセンサス配列、または配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および/または５５、および/または５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および/または７１のそれぞれからなる群から選択される1種以上のモチーフを含むポリペプチドをコードする核酸分子;
    (i) 配列番号３、４; ７、８; １１、１２; １５、１６; １９、２０; ２３、２４; ２７、２８および/または３１、３２のそれぞれのプライマーを使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを増幅することによって取得される、ポリヌクレオチドを含む核酸分子;
    および
    (j) (a)または(b)の核酸分子の相補配列を含むプローブを用いて、または(a)〜(e)で特徴付けられる核酸分子配列に相補的な少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 ntもしくは500 ntの核酸分子を有するその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつカリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KchIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子、
    からなる群から選択される核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
  12. 請求項１１に記載の核酸構築物または請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
  13. 請求項１２に記載のベクター、請求項１１に記載の核酸構築物または請求項１０に記載の核酸分子を含むトランスジェニック細胞。
  14. 請求項１０に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
  15. 昆虫電位開口型カリウムチャネルShal (ShakerコグネートlまたはShaker様)および/またはそのアクセサリータンパク質KchIP (カリウムチャネル相互作用タンパク質)のそれぞれの活性を有するポリペプチドの、殺虫剤標的としての使用であって、好ましくは該ポリペプチドが、請求項３(a)〜３(j)に記載の核酸分子からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、使用。
  16. 表Iに記載の少なくとも1種の化合物またはその誘導体を殺虫性活性成分として含む組成物を適用するステップを含む、殺虫剤害虫抑制方法。
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