CN108226105A - 一种对毒死蜱及其水解产物具有可视化检测的罗丹明b修饰金纳米颗粒探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于功能性纳米材料及荧光探针材料技术领域，特别涉及一种对毒死蜱及其水解产物可视化检测的表面功能化金纳米颗粒探针及其制备方法。所述的新型检测探针为单分散的金纳米颗粒与罗丹明B结合产物。该其合成方法简单、检出限低、原料易得、可视化明显，其检测时荧光强度随检测产物浓度成正比，而颜色恢复至橙色，可检测痕量农药残留。荧光及紫外可见吸收研究结果表明其可以作为一种检测农药毒死蜱及其水解产物的新型探针。

Description

一种对毒死蜱及其水解产物具有可视化检测的罗丹明B修饰 金纳米颗粒探针及其制备方法
技术领域
本发明属于功能性纳米材料及荧光探针材料技术领域，特别涉及一种表面功能化的金纳米颗粒的制备方法。所发明的金纳米颗粒通过与罗丹明B相结合，利用荧光共振能量转移的原理(FRET)出发，能得到荧光增强型的农药荧光探针，可用于检测痕量农药残留。
背景技术
农药是包括多种种类的有机毒性化合物，由于其对昆虫，细菌，野草，线虫等危害农作物的物种具有防御作用而被广泛应用于农业生产中。其中有机磷农药的使用最为广泛，也造成有机磷农药在水资源，土壤以及农作物中的蓄积与残留现象严重，危害环境安全以及人体健康。美国环境保护局(the U.S.Environmental Protection Agency，EPA)已经对各种有机磷农药在环境和农产品中残留量规定严格的限制标准，即最高残留限量(MRL)。农药的高毒性源于它可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，某些农药即使很小的剂量，也会对健康造成极大的危害，临床上农药中毒会引起头痛，头晕，呕吐，肺水肿甚至呼吸与心脏衰竭引起的死亡。因此发展新型的灵敏以及经济地检测环境以及农作物中农药残留的传感方法对于保护人类健康以及环境安全都具有重要的研究价值。毒死蜱(chlorpyrifos，CP)是一种广谱性有机磷杀虫剂，是目前世界应用广泛的杀虫剂之一。2013年农业部发出公告，对毒死蜱和三唑磷等7种农药采取进一步禁限用管理措施，控制其在蔬菜中的使用，设计针对毒死蜱的灵敏检测方法可以有效应用于实践中。
目前已有多种方法被用于农药的检测，例如气、液相色谱-质谱联用，电化学分析，酶联免疫吸附实验等，但是这些方法含有一些弊端，例如操作繁琐，数据重复性差以及设备不便携等，无法满足实时在线检测的需求。而纳米材料具有独特的表面效应，体积效应和量子尺寸效应以及量子穿隧效应，显示优异的光谱特性，如贵金属纳米材料的表面等离子体共振，量子点的多色光致发光，表面增强拉曼现象等。将纳米材料的独特光学特性与荧光传感方法高灵敏度，高选择性的优势相结合，可以构筑一系列具有优越性能的荧光传感器，可以实现对不同分析物的实时，灵敏可视化检测。纳米材料作为传感器件构筑纳米探针，为有机磷农药残留分析提供新的新的检测手段与方法。探针的设计基于两个必要条件：(1)探针与目标分子之间有荧光共振能量转移(FRET)的通道，通过目标分子的加入可以调节能量转移通道的开关；(2)探针与待检测物质表面的非共价作用力强于目标分子，因此可以将目标分子从探针表面置换下来，达到荧光变化的目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种非共价修饰罗丹明B的表面功能化的金纳米颗粒及其制备方法。所述金纳米颗粒通过非共价修饰罗丹明B(RhB-AuNPs)，从荧光共振能量转移的信号响应原理出发，结合罗丹明B与农药分子在金纳米颗粒表面的竞争吸附作用，发展了荧光增强型的灵敏检测农药残留的传感方法。当农药分子存在时，体系荧光强度呈现四倍左右的增强并伴随由微弱荧光-强橙色荧光的灵敏可视化变化。该方法不需要为了实现FRET过程在纳米材料表面进行复杂繁琐的表面修饰过程，简单易行，在环境与农产品中有机磷农药残留的检测方面能够得到应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下的技术内容：
本发明金纳米颗粒探针为非共价修饰罗丹明B的金纳米颗粒(RhB-AuNPs)。
本发明金纳米颗粒探针制备及修饰方法：氯金酸溶液在圆底烧瓶内加热至沸腾，在强力搅拌下快速注入柠檬酸三钠，得到深红色液体，其中氯金酸溶液与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶4。取罗丹明B溶于水中搅拌并加入金纳米颗粒中，其中金纳米颗粒与罗丹明B的摩尔比为400∶3。混合溶液在室温下搅拌，反应完全后收集得到浅橙色溶液。
上述的水为二次去离子水。
上述的金纳米颗粒探针为单分散，平均的粒径为13.3nm。金纳米颗粒的浓度通过监测520nm的吸收(摩尔吸光系数为108M-1cm-1)，利用朗伯比尔定律计算为15nM。
上述的金纳米颗粒其荧光特征为：未修饰罗丹明B的金纳米颗粒在520nm左右有明显的特征吸收(图2)，而罗丹明B在580nm左右有特征的荧光发射峰，未修饰罗丹明B的金纳米颗粒的吸收与罗丹明B的荧光发射存在一定程度的光谱重叠，满足荧光共振能量转移的发生条件。当罗丹明B非共价吸附在金纳米颗粒表面时，由于能量转移，荧光将会被淬灭，荧光强度较低。在没有加入毒死蜱水解产物硫代二乙氧基磷酸(diethylphosphorothioate，DEP)时，RhB-AuNPs的荧光强度较低，当向探针中加入1μM的DEP，体系的荧光强度明显增强两倍多，数值从11增强到28(图2B)。当体系中没有DEP时，在紫外灯365nm照射下，探针溶液呈现十分微弱的橙色荧光，而引入DEP到探针溶液中则显示明亮的橙色荧光，从光谱分析与照片中可以看出罗丹明B的特征荧光发射峰恢复，DEP可以将罗丹明B从金纳米颗粒上置换下来，使其荧光恢复，探针RhB-AuNPs可以灵敏地识别DEP。取探针溶液分散至2mL水中并分别加入1μM CP(图3A)与DEP(图3B)，CP与DEP均能使体系的荧光增强，相比之下，DEP使荧光增强的趋势更明显(图3)。当DEP加入到RhB-AuNPs体系中，荧光强度逐渐增强，荧光增强过程遵循一个非线性行为，存在一个饱和的DEP浓度，表明了吸附在金纳米颗粒表面的DEP与罗丹明B有一个动态平衡的过程。而在低至0.1nM的DEP浓度时，仍然能够检测到明显的荧光增强，说明探针对DEP有很好的灵敏度。当DEP的浓度达到1mM时，体系的荧光强度变化趋势平缓，相较于加入DEP之前，荧光强度增强了四倍左右(图3)。
附图说明
图1是本发明金纳米颗粒探针的透射电镜图；
图2(A)是本发明金纳米颗粒的吸收与罗丹明B的发射光谱之间的光谱重叠谱图，(B)是加入DEP前后，金纳米荧光探针的荧光光谱变化图，(C)是毒死蜱在碱性条件下发生水解反应生成硫代二乙氧基磷酸(DEP)和三氯吡啶酚(TCP)的结构图；
图3是本发明金纳米颗粒荧光探针加入CP及DEP引起的荧光强度的变化图；
具体实施方式
下面结合具体实施实例进一步阐述本发明。
实施例1：金纳米颗粒的制备。50mL氯金酸溶液(1mM)在装有回流冷凝管的圆底烧瓶中加热至沸腾，在强力搅拌下快速注入38.8mM柠檬酸三钠5mL，继续回流30分钟。溶液颜色由浅黄色变成深红色，停止加热，继续搅拌冷却至室温。放到冰箱4℃保存，备用。
实施例2：金纳米颗粒的修饰。利用超纯水制备2mM的罗丹明B溶液。取10μL罗丹明B溶液搅拌加入10mL浓度约为15nM的粒径为13nm的金纳米颗粒中。混合溶液在室温下搅拌两小时，反应完全后收集溶液。
实施例3：毒死蜱碱性水解产物二乙氧基硫代磷酸的制备。在单口烧瓶中加入体积比为1.25∶1的乙腈和水，并在磁力搅拌下使其混合均匀。然后在混合液中加入2mL的二乙氧基硫代磷酰氯和1.6g氢氧化钠，摩尔比约为3∶1。反应在30℃的条件下搅拌12小时，然后利用盐酸将反应液调至弱酸性，并用三氯甲烷萃取，收集有机相，旋蒸后得到产物。
本发明对罗丹明B修饰金纳米颗粒进一步表征及检测，其过程如下：
(1)罗丹明B修饰的金纳米颗粒形貌观察
用Hitachi H7100透射电镜观察了金纳米颗粒的形貌，其结果如图1所示：
金纳米颗粒是单分散的，平均的粒径为13.3nm。金纳米颗粒的浓度通过监测520nm的吸收(摩尔吸光系数为108M-1cm-1)，利用朗伯比尔定律计算为15nM。
(2)罗丹明B及金纳米颗粒的荧光共振能量转移测定
配置适当浓度的罗丹明B溶液，并在Perkin-Elmer LS-55荧光光谱仪(Liantriant，UK)下检测，同时取适量金纳米颗粒分散至2mL水中，并使用Shimazu UV-2550分光光度仪测定紫外-可见吸收光谱。如图2(A)中所示，金纳米颗粒在520nm左右有明显的特征吸收，同时罗丹明B在580nm左右有特征的荧光发射峰，金纳米颗粒的吸收与罗丹明B的荧光发射存在一定程度的光谱重叠，满足荧光共振能量转移的发生条件。因此，当罗丹明B非共价吸附在金纳米颗粒表面时，由于能量转移，罗丹明B的荧光被淬灭。
(3)罗丹明B修饰的金纳米颗粒对农药响应的荧光光谱测定
取适量探针溶液分散至2mL水中，在Perkin-Elmer LS-55荧光光谱仪(Liantriant，UK)下检测荧光图谱。在金纳米颗粒没有加入DEP时，RhB-AuNPs的荧光强度较低，当向探针中加入1μM的DEP，体系的荧光强度明显增强两倍多，数值从11增强到28(图2B)。从荧光光谱分析中可以看出罗丹明B的特征荧光发射峰恢复，DEP可以将罗丹明B从金纳米颗粒上置换下来，使其荧光恢复，探针RhB-AuNPs可以灵敏地识别DEP。
(4)罗丹明B修饰的金纳米颗粒对CP和DEP的荧光光谱测定
取相同体积金纳米溶液分散至2mL水中，分别加入不同梯次浓度的CP(图3A)与DEP(图3B)，并在Perkin-Elmer LS-55荧光光谱仪(Liantriant，UK)下检测荧光图谱。结果发现CP与DEP均能使体系的荧光增强，相比之下，DEP使荧光增强的趋势更明显(图3)。当DEP加入到RhB-AuNPs体系中，荧光强度逐渐增强，荧光增强过程遵循一个非线性行为，存在一个饱和的DEP浓度，表明了吸附在金纳米颗粒表面的DEP与罗丹明B有一个动态平衡的过程。而在低至0.1nM的DEP浓度时，仍然能够检测到明显的荧光增强，说明探针对DEP有很好的灵敏度。当DEP的浓度达到1mM时，体系的荧光强度变化趋势平缓，相较于加入DEP之前，荧光强度增强了四倍左右(图3)，为其作为超痕量农药检测提供了可靠的保证。

Claims (4)

1.一种对毒死蜱及其水解产物具有可视化检测的罗丹明B修饰金纳米颗粒探针及其制备方法。其特征在于：所述的金纳米颗粒探针为非共价修饰罗丹明B的金纳米颗粒。
2.权利要求1所述的金纳米颗粒探针，其特征在于所述的金纳米颗粒探针为单分散颗粒，平均粒径在13.3nm，在520nm处有吸收。
3.权利要求1所述的金纳米颗粒探针的制备方法，其特征在于：50mL氯金酸溶液(1mM)在装有回流冷凝管的圆底烧瓶中加热至沸腾，在强力搅拌下快速注入38.8mM柠檬酸三钠5mL，继续回流30分钟。溶液颜色由浅黄色变成深红色，停止加热，继续搅拌冷却至室温。放到冰箱4℃保存，备用。利用超纯水制备2mM的罗丹明B溶液。取10μL罗丹明B溶液搅拌加入10mL浓度约为15nM的粒径为13nm的金纳米颗粒中。混合溶液在室温下搅拌两小时，反应完全后收集溶液。溶液为非常微弱的橙色荧光。
4.权利要求1所述的金纳米颗粒探针的应用，其特征在于所述的纳米材料可以作为荧光增强探针得到应用，用于检测痕量农药残留。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109991204A (zh) * 2019-04-24 2019-07-09 杭州嘉灏生态农业科技有限公司 一种农产品残留农药的检测方法
CN112391158A (zh) * 2019-11-08 2021-02-23 重庆科技学院 检测心脏损伤早期标志物的多色荧光探针及其制备和使用方法
CN114354591A (zh) * 2022-01-10 2022-04-15 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN2864678Y (zh) * 2005-12-07 2007-01-31 万积成 快速检测毒死蜱残留的胶体金试纸
CN104316693A (zh) * 2008-11-06 2015-01-28 巴斯夫欧洲公司 杀虫剂的筛选测定法
CN105143885A (zh) * 2012-12-11 2015-12-09 克拉里安特诊断服务公司 染料的光敏化化学漂白

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN2864678Y (zh) * 2005-12-07 2007-01-31 万积成 快速检测毒死蜱残留的胶体金试纸
CN104316693A (zh) * 2008-11-06 2015-01-28 巴斯夫欧洲公司 杀虫剂的筛选测定法
CN105143885A (zh) * 2012-12-11 2015-12-09 克拉里安特诊断服务公司 染料的光敏化化学漂白

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
彭菊村等: "试剂的浓度和加入顺序对水相合成金纳米颗粒的影响", 《稀有金属》 *
晏菲: "《胰蛋白酶保护金纳米团簇的制备及其在含硫化合物检测中的研究》", 《浙江理工大学硕士学位论文》 *
杜勇: "《纳米金属胶体的制备及其表面光谱学特性研究》", 《首都师范大学硕士学位论文》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109991204A (zh) * 2019-04-24 2019-07-09 杭州嘉灏生态农业科技有限公司 一种农产品残留农药的检测方法
CN112391158A (zh) * 2019-11-08 2021-02-23 重庆科技学院 检测心脏损伤早期标志物的多色荧光探针及其制备和使用方法
CN114354591A (zh) * 2022-01-10 2022-04-15 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法
CN114354591B (zh) * 2022-01-10 2023-06-02 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法

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