CN103140585B - 鞘翅目害虫的控制 - Google Patents

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Abstract

在此提供了改进的用于控制鞘翅目害虫的多种组合物和方法。具体地说，提供了对鞘翅目害虫（例如玉米根虫）具有改进的毒性的新颖的杀虫蛋白的组合。此外，在此披露了一种使用本发明的这些组合物杀死或控制鞘翅目害虫的方法。

Description

鞘翅目害虫的控制
发明领域
本发明总体上涉及由于其摄食活动而引起对作物植物损害的害虫的控制，并且更具体地涉及通过包含协同水平的鞘翅目活性蛋白毒素以及鳞翅目活性蛋白毒素的组合物控制鞘翅目害虫。本发明进一步涉及包含这些蛋白毒素的组合物以及使用这些组合物的方法。
背景技术
鞘翅目昆虫被认为是一些对作物植物最重要的害虫。例如，玉米根虫种类是最具破坏性的玉米害虫，引起了估计每年超过10亿美元的损失。重要的根虫害虫种类包括西方玉米根虫（Diabroticavirgiferavirgifera）、北方玉米根虫（D.longicornisbarberi）、南方玉米根虫（D.undecimpunctatahowardi）、以及墨西哥玉米根虫（D.virgiferazeae）。科罗拉多马铃薯甲虫（CPB；马铃薯甲虫）是另一种类型的鞘翅目昆虫，这种昆虫在世界范围内的是马铃薯、番茄以及茄子严重害虫。
鞘翅目害虫主要是通过密集应用化学杀虫剂来控制，这些化学杀虫剂通过抑制昆虫成长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而有效。由此可以达到良好的昆虫控制，但这些化学品有时也会影响其他益虫。由化学杀虫剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗性昆虫品系。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但对于可替代的害虫控制剂存在着越来越多的需要。
苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry蛋白（还被称为δ-内毒素）是在芽孢杆菌属中形成一种结晶基体的蛋白质，已知这些蛋白质当被某些昆虫摄入时具有杀虫活性。已经鉴定并且命名了在58个家族中的超过180全型Cry蛋白（holotypeCryprotein）。已经根据各种Cry蛋白的活性谱和序列同源性对它们进行分类。在1990年以前，主要分类是通过它们的活性谱定义的（Hofte和Whitely，1989，《微生物综述》（Microbiol.Rev）53:242-255），但是最近开发了一种新的命名法，它根据氨基酸序列同源性而不是昆虫目标特异性而将Cry蛋白系统地分类（Crickmore等人，1998，《微生物分子生物学综述》（Microbiol.Molec.Biol.Rev.）62:807-813）。
已经分离了Cry蛋白编码基因并且它们在作物植物中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的害虫的手段。这样的表达该Cry蛋白的转基因植物已经商品化，从而允许农场主减少或增加化学昆虫控制剂的施用。在转基因植物中有用的鞘翅目活性Cry蛋白包括例如Cry3A、Cry3B以及Cry34/Cry35复合物。在转基因植物中表达的鳞翅目活性蛋白Cry蛋白的实例包括例如除其他之外，Cry1A（例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac）、Cry1B、Cry1F以及Cry2。
还鉴定了在生长的营养阶段由芽孢杆菌属类产生的另一个杀虫蛋白家族（营养期杀虫蛋白（Vip））。美国专利5,877,012、6,107,279以及6,137,033（通过引用结合在此）描述了被称为Vip3的一个新类型的杀虫蛋白。其他披露，包括WO98/18932、WO98/33991、WO98/00546，以及WO99/57282，还鉴定了该Vip3类蛋白的同系物。Vip3编码序列编码大约88kDa的蛋白质，这些蛋白质具有针对广谱的鳞翅目害虫的杀虫活性，这些害虫包括但不限于，黑切根虫（blackcutworm）（BCW，Agrotisipsilon）、秋粘虫（fallarmyworm）（FAW，Spodopterafrugiperda）、烟草夜蛾幼虫（tobaccobudworm）（TBW，Heliothisvirescens）、甘蔗螟（sugarcaneborer）（SCB，Diatraeasaccharalis）、玉米茎蛀虫（cornstalkborer）（LCB，南美玉米苗斑螟（Elasmopalpuslignosellus））、以及棉铃虫（cornearworm）(CEW，美洲棉铃虫（Helicoverpazea）），并且当在转基因植物（例如玉米（玉蜀黍））中表达时，对植物给予保护使其免受昆虫摄食损害。
对于使用这样的具有杀虫活性的组合物和方法，例如用于作物保护或昆虫介导的疾病的控制存在着不断的需要。需要新颖的组合物来克服对现有杀虫剂的抗性问题或者防止产生对现有转基因植物方法的抗性。理想地，这样的组合物具有高毒性并且当目标害虫口服摄食时是有效的。因此，提供了其中这些特性中的任一种被增强的组合物的任何发明将代表本领域的进步。
概述
本发明提供了改进的用于控制鞘翅目害虫的组合物和方法，该方法包括向在鞘翅目昆虫可能摄食的场所施用协同有效量的至少一种鞘翅目活性蛋白以及至少一种鳞翅目活性蛋白。进一步提供了一种用于转基因植物的增强保护而使其免受由鞘翅目昆虫攻击和侵染所引起的损害的方法。
定义
为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：
“活性”表示蛋白毒素以及这样的毒素的组合作为口服活性昆虫控制剂而发挥作用，具有一种毒性作用、或者能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本发明的一种组合物被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以使该组合物可供该昆虫使用的来源为食。这样一种组合物可以是一种表达本发明的毒素组合的转基因植物。一个实例是一种表达修饰Cry3A蛋白和Cry1Ab蛋白的转基因玉米植物，其引起了针对以该转基因玉米植物为食的玉米根虫的协同活性。
“控制”（control）或“控制”（controlling）昆虫表示通过一种毒性作用来抑制害虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物的损失。“控制”昆虫可以表示或可以不表示杀死这些昆虫，虽然它优选地表示杀死这些昆虫。
如在此所使用的，术语“玉米”表示玉蜀黍（Zeamays）或玉蜀黍（maize）并且包括所有的可以用玉米繁殖的植物品种，包括野生玉蜀黍种类。
“递送”（deliver）或“递送”（delivering）一种组合物或毒素表示使该组合物或毒素与一种昆虫接触，从而产生一种毒性作用以及对昆虫的控制。可以按照许多公认的方式，例如，通过昆虫经口摄入或通过经由转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、一种饵基、或任何其他的领域公认的毒素递送系统来递送该组合物或毒素。
“有效的昆虫控制量”表示一种或多种毒素的浓度，该一种或多种毒素通过一种毒性作用抑制了昆虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物的损失。“有效的昆虫控制量”可以表示或可以不表示杀死昆虫，虽然它优选地是表示杀死这些昆虫。
如在此所用的“表达盒”表示能够指导特定的核酸序列在一种适当的宿主细胞中的表达的一个核酸序列，包含一个启动子，该启动子可操作地连接至该感兴趣的核酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含正确翻译该核酸序列所需要的序列。包含该感兴趣的核酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然发生于该宿主细胞中，并且必须已经通过一个转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先（ancestor）中。该核酸序列在该表达盒中的表达可以是在一个组成型启动子或一个诱导型启动子的控制之下，只有当该宿主细胞暴露于某一特定的外部刺激时该启动子才引发转录。在多细胞生物（如一种植物）的情况下，该启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的。
“转殖项MIR604”或“MIR604转殖项”或“MIR604”表示在美国专利7,361,813（通过引用结合在此）中披露的一种转基因玉米转殖项，该转基因玉米转殖项已经结合到其基因组cry3A055转基因（在美国专利7,230,167中披露）以及一种pmi转基因（在美国专利号5,767,378中披露）中。因此，MIR604包括一种编码Cry3A055杀虫蛋白（修饰的Cry3A或mCry3A）的第一转基因（在控制玉米根虫（根萤叶甲属）害虫中是有用的）以及一种编码磷酸甘露糖异构酶（PMI）的第二转基因（作为一种选择标记是有用的，它允许玉米植物利用甘露糖作为碳源）。
“转殖项MIR162”或“MIR162转殖项”或“MIR162转殖项”表示在国际公开号WO07/142840中披露的转基因玉米转殖项，该转殖项已经将vip3Aa20转基因和pmi转基因结合到其基因组中。因此，MIR162包括一种编码Vip3Aa20杀虫蛋白的第一转基因（在控制鳞翅目害虫中是有用的）以及一种编码磷酸甘露糖异构酶（PMI）的第二转基因（作为一种选择标记是有用的，它允许玉米植物利用甘露糖作为碳源）。
“转殖项Bt11”或“Bt11转殖项”或“Bt11”表示在美国专利6,114,608（通过引用结合在此）中披露的转基因玉米转殖项，该转殖项已经将cry1Ab转基因和pat转基因结合到其基因组中。因此，Bt11包括一种编码Cry1Ab杀虫蛋白的第一转基因（在控制鳞翅目害虫中是有用的）以及一种编码PAT酶的第二转基因（作为一种选择标记是有用的，它赋予玉米植物除草剂耐受性）。
一个“基因”是一个定义的区域，该区域位于一个基因组之内并且，除了前述的编码核酸序列之外，它包含其他的（主要是调控性的）负责编码部分的表达（即，转录和翻译）的控制的核酸序列。一个基因还可以包含其他5'和3'未转译序列和终止序列。其他可能存在的元件是，例如，内含子。
“感兴趣的基因”是指当被转移至一个植物时赋予该植物一种所希望的性状的任何基因，该性状如抗生素抗性、病毒抗性、抗虫性、抗病性，或者对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、以及在一个工业过程中的改进的性能或者改变的繁殖能力。“感兴趣的基因”还可以是这样一个基因，该基因被转入植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢产物。
如在此使用的，术语“栽培者”表示参与农业中培养用于食品或原材料的活的生物（例如作物植物）的人或实体。
一个“异源”核酸序列是这样一个核酸序列，该序列与将其引入的一个宿主细胞并非天然结合，包括一个天然发生的核酸序列的非天然发生的多个拷贝。
一个“同源”核酸序列是与它被引入到其中的一个宿主细胞天然结合的一个核酸序列。
“杀虫的”被定义为一种能够控制昆虫（优选是通过杀死它们）的毒性生物活性。
“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是通过人工从其天然环境中分开而存在的一种核酸分子或蛋白质并因此不是自然的产物。一种分离的核酸分子或蛋白质可以按照一种纯化的形式而存在、或可以存在于一种非天然环境（例如像，一种重组宿主细胞）中。例如，没有分离在苏云金芽孢杆菌中的一种天然Cry蛋白，但是分离了在一种转基因植物中的相同的Cry蛋白。
“修饰的Cry3A（mCry3A）”表示在2006年4月18日公布的美国专利号7,030,295（通过引用结合在此）中披露的一种基因或蛋白质，该基因或蛋白质在控制玉米根虫（根萤叶甲属）害虫中是有用的。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明的背景下，核酸分子或核酸序列优选地是一个DNA片段。
“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是一种植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于一种分离的单细胞或一种培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位（例如，植物组织、植物器官、或整株植物）的一部分。
“植物细胞培养物”表示植物单位的培养物，例如像原生质体、细胞培养物的细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及处于不同发育阶段的胚。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的一个独特的、并且具有可见结构的、并且已分化的部分，如根、茎、叶、花芽、或胚。
如在此所使用的“植物组织”表示被组织成为一种结构和功能单位的一组植物细胞。包括在培养物或在植物中的任何植物组织。本术语包括但不局限于：整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞群。本术语与如以上所列出的任何特异类型的植物组织一起（或在其缺乏下）使用、或通过由这项定义所涵盖的其他方式的使用并非旨在排除任何其他类型的植物组织。
“转化”是将异源核酸引入至一种宿主细胞或生物中的一个过程。具体地说，”转化”表示将一个DNA分子稳定整合到一种感兴趣的生物的基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”是指已经引入了异源核酸分子的一种宿主生物，如一种细菌或一种植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为一种染色体外分子存在。这样一种染色体外分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应当理解为不仅包含一个转化过程的终产物，而且包含其转基因子代。一个“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指一种野生型生物，例如，一种细菌或植物，其不含异源核酸分子。
该“Vip3”类的蛋白质包括例如Vip3Aa、Vip3Ab、Vip3Ac、Vip3Ad、Vip3Ae、VipAf、Vip3Ag、Vip3Ba、和Vip3Bb以及他们的同系物。“同系物”表示所指示的蛋白质或多肽具有与Vip3类的蛋白质的其他成员之间的一种定义的关系。“Vip3Aa20”（Genbank登录号：DQ539888）是对于转殖项MIR162独特的Vip3同系物。它是通过在植物转化过程中引入至玉蜀黍优化的vip3Aa19基因（Genbank登录号DQ539887）的自发突变而产生的。
在此使用的对于DNA碱基和氨基酸给出的命名法如在37C.F.R.§1.822中提出。
详细说明
本发明涉及用于协同控制鞘翅目害虫的组合物和方法，包括向其中鞘翅目害虫可能摄食的场所施用协同有效量的组合物，该组合物包含至少一种鞘翅目活性毒素和至少一种鳞翅目活性毒素。在本领域中熟知的是，如果两种不相关的蛋白分开时不是毒性的，则将它们组合时将不会是毒性的。已知的是，将一种没有针对目标害虫的活性的蛋白质与针对该目标害虫活性的蛋白质组合，则该非活性蛋白质将增加该已经具有活性的蛋白质的活性。
根据本发明，现在已经出人意料地发现，施用至少一种鞘翅目活性蛋白毒素与至少一种鳞翅目活性蛋白毒素的组合表现出一种显著的协同作用（即，所得的鞘翅目昆虫控制远远好于将预期的来自单独使用鞘翅目活性毒素的鞘翅目昆虫控制）。这种协同作用使得能够进行商业上有用水平的鞘翅目昆虫控制并且帮助缓和针对单一毒素的抗虫性的产生。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于控制鞘翅目害虫的方法，该方法包括：向一种鞘翅目害虫或其环境递送一种包含至少一种鞘翅目活性蛋白和至少一种鳞翅目活性蛋白的组合物，其中该组合物将鞘翅目害虫控制到好于由于单独包含在其中的任何单独的鞘翅目活性蛋白的所预期的程度。
在这个实施方案的一个方面，该鞘翅目活性蛋白是一种修饰的Cry3A蛋白并且该鳞翅目活性蛋白是一种Cry1蛋白或Vip3蛋白。在又另一个实施方案中，该Cry1蛋白是Cry1Ab。Cry1Ab蛋白的实例具有以下GenBank登录号：Cry1Ab1(AAA22330)、Cry1Ab2(AAA22613)、Cry1Ab3(AAA22561)、Cry1Ab4(BAA00071)、Cry1Ab5(CAA28405)、Cry1Ab6(AAA22420)、Cry1Ab7(CAA31620)、Cry1Ab8(AAA22551)、Cry1Ab9(CAA38701)、Cry1Ab10(A29125)、Cry1Ab11(I12419)、Cry1Ab12(AAC64003)、Cry1Ab13(AAN76494)、Cry1Ab14(AAG16877)、Cry1Ab15(AAO13302)、Cry1Ab16(AAK55546)、Cry1Ab17(AAT46415)、Cry1Ab18(AAQ88259)、Cry1Ab19(AAW31761)、Cry1Ab20(ABB72460)、Cry1Ab21(ABS18384)、Cry1Ab22(ABW87320)、Cry1Ab23(HQ439777)、Cry1Ab24(HQ439778)、Cry1Ab25(HQ685122)和Cry1Ab26(HQ847729)。在再另一个实施方案中，该Cry1Ab蛋白是包含在Bt11转殖项中并且披露于美国专利6,114,608中的蛋白质。本领域的技术人员将认识到其他鞘翅目活性Cry蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry3B、Cry8和Cry34/Cry35。本领域的技术人员还将认识到其他鳞翅目活性蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1J、Cry2A和Cry9。Vip3蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成：Vip3A、Vip3B和Vip3C。在一个实施方案中，Vip3A蛋白是Vip3Aa20。然而，本领域的技术人员将认识到其他的Vip3蛋白在本发明中是有用的。
在这个实施方案的又另一个方面中，鞘翅目害虫是一种科罗拉多马铃薯甲虫或一种玉米根虫。在另一个实施方案中，玉米根虫是一种西方玉米根虫、北方玉米根虫、南方玉米根虫或墨西哥玉米根虫。
在所包含的方法中的另一个实施方案中，该组合物是一种表达鞘翅目活性蛋白或鳞翅目活性蛋白的转基因植物。在一个方面，该转基因植物是选自下组，该组由以下各项组成：大豆、棉花、油菜、卡诺拉、蔬菜、向日葵、烟草、番茄、甘蔗、水稻、小麦、玉米、黑麦、燕麦、大麦、草皮草以及饲料作物。在另一个方面，该转基因植物是一种转基因玉米植物。在又另一个方面中，该转基因玉米植物是一种包含转基因玉米转殖项MIR604和Bt11的育种叠加（breedingstack）。在又另一个方面中，该转基因玉米植物是一种包含转基因玉米转殖项MIR604、Bt11和MIR162的育种叠加。
在另一个实施方案中，本发明包括一种控制玉米根虫害虫的方法，该方法包括：向该玉米根虫害虫或其环境递送一种包含一种修饰的Cry3A（mCry3A）蛋白和一种Cry1Ab蛋白的组合物，其中该组合物将该玉米根虫害虫控制到好于由于单独的mCry3A蛋白的所预期的程度。
在另一个实施方案中，该组合物是一种转基因玉米植物。在又一个实施方案中，该转基因玉米植物是包含MIR604转殖项和Bt11转殖项。
在一个实施方案中，本发明包括一种控制鞘翅目的组合物：该组合物包含至少一种鞘翅目活性蛋白和至少一种鳞翅目活性蛋白，其中该组合物将鞘翅目害虫控制到好于由于单独包含在其中的任何单独的鞘翅目活性蛋白的所预期的程度。
在这个实施方案的一个方面，该鞘翅目活性蛋白是一种修饰的Cry3A蛋白并且该鳞翅目活性蛋白是一种Cry1蛋白或Vip3蛋白。在另一个实施方案中，该Cry1蛋白是Cry1Ab。Cry1Ab蛋白的实例具有以下GenBank登录号：Cry1Ab1(AAA22330)、Cry1Ab2(AAA22613)、Cry1Ab3(AAA22561)、Cry1Ab4(BAA00071)、Cry1Ab5(CAA28405)、Cry1Ab6(AAA22420)、Cry1Ab7(CAA31620)、Cry1Ab8(AAA22551)、Cry1Ab9(CAA38701)、Cry1Ab10(A29125)、Cry1Ab11(I12419)、Cry1Ab12(AAC64003)、Cry1Ab13(AAN76494)、Cry1Ab14(AAG16877)、Cry1Ab15(AAO13302)、Cry1Ab16(AAK55546)、Cry1Ab17(AAT46415)、Cry1Ab18(AAQ88259)、Cry1Ab19(AAW31761)、Cry1Ab20(ABB72460)、Cry1Ab21(ABS18384)、Cry1Ab22(ABW87320)、Cry1Ab23(HQ439777)、Cry1Ab24(HQ439778)、Cry1Ab25(HQ685122)和Cry1Ab26(HQ847729)。在再另一个实施方案中，该Cry1Ab蛋白是包含在Bt11转殖项中并且披露于美国专利6,114,608中的蛋白质。本领域的技术人员将认识到其他鞘翅目活性Cry蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry3B、Cry8和Cry34/Cry35。本领域的技术人员还将认识到其他鳞翅目活性蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1J、Cry2A和Cry9。Vip3蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成：Vip3A、Vip3B和Vip3C。在一个实施方案中，Vip3A蛋白是Vip3Aa20。然而，本领域的技术人员将认识到其他的Vip3蛋白在本发明中是有用的。
在这个实施方案的又另一个方面中，鞘翅目害虫是一种科罗拉多马铃薯甲虫或一种玉米根虫。在另一个实施方案中，玉米根虫是一种西方玉米根虫、北方玉米根虫、南方玉米根虫或墨西哥玉米根虫。
在再另一个实施方案中，该组合物是一种表达鞘翅目活性蛋白或鳞翅目活性蛋白的转基因植物。在一个方面，该转基因植物是选自下组，该组由以下各项组成：大豆、棉花、油菜、卡诺拉、蔬菜、向日葵、烟草、番茄、甘蔗、水稻、小麦、玉米、黑麦、燕麦、大麦、草皮草以及饲料作物。在另一个方面，该转基因植物是一种转基因玉米植物。在另一个方面，该转基因植物是一种转基因玉米植物。在另一个方面，该转基因玉米植物是一种包含转基因玉米转殖项MIR604和Bt11的育种叠加。在另一个方面，该转基因玉米植物是一种包含转基因玉米转殖项MIR604、Bt11和MIR162的育种叠加。
在又一个实施方案中，本发明包括一种为栽培者提供一种控制鞘翅目害虫种群的手段的方法，该方法包括：向栽培者提供或出售转基因种子，该转基因种子包括一种编码至少一种鞘翅目活性蛋白和至少一种鳞翅目活性蛋白的核酸，其中从所述种子生长的转基因植物将鞘翅目害虫控制到好于由于单独包含在其中的任何单独的鞘翅目活性蛋白的所预期的程度。
在另一个实施方案中，该鞘翅目活性蛋白是一种修饰的Cry3A蛋白并且该鳞翅目活性蛋白是一种Cry1蛋白或Vip3蛋白。在又另一个实施方案中，该Cry1蛋白是Cry1Ab。Cry1Ab蛋白的实例具有以下GenBank登录号：Cry1Ab1(AAA22330)、Cry1Ab2(AAA22613)、Cry1Ab3(AAA22561)、Cry1Ab4(BAA00071)、Cry1Ab5(CAA28405)、Cry1Ab6(AAA22420)、Cry1Ab7(CAA31620)、Cry1Ab8(AAA22551)、Cry1Ab9(CAA38701)、Cry1Ab10(A29125)、Cry1Ab11(I12419)、Cry1Ab12(AAC64003)、Cry1Ab13(AAN76494)、Cry1Ab14(AAG16877)、Cry1Ab15(AAO13302)、Cry1Ab16(AAK55546)、Cry1Ab17(AAT46415)、Cry1Ab18(AAQ88259)、Cry1Ab19(AAW31761)、Cry1Ab20(ABB72460)、Cry1Ab21(ABS18384)、Cry1Ab22(ABW87320)、Cry1Ab23(HQ439777)、Cry1Ab24(HQ439778)、Cry1Ab25(HQ685122)和Cry1Ab26(HQ847729)。在再另一个实施方案中，该Cry1Ab蛋白是包含在Bt11转殖项中并且披露于美国专利6,114,608中的蛋白质。本领域的技术人员将认识到其他鞘翅目活性Cry蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry3B、Cry8和Cry34/Cry35。本领域的技术人员还将认识到其他鳞翅目活性蛋白在本发明中是有用的，包括但不限于：Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1J、Cry2A和Cry9。Vip3蛋白可以选自下组，该组由以下各项组成：Vip3A、Vip3B和Vip3C。在一个实施方案中，该Vip3A蛋白是Vip3Aa20。然而，本领域的技术人员将认识到其他的Vip3蛋白在本发明中是有用的。
在再另一个实施方案中，鞘翅目害虫是一种科罗拉多马铃薯甲虫或一种玉米根虫。在一个实施方案中，玉米根虫是一种西方玉米根虫、北方玉米根虫、南方玉米根虫或墨西哥玉米根虫。
在另一个实施方案中，该转基因植物种子以及植物是选自下组，该组由以下各项组成：大豆、棉花、油菜、卡诺拉、蔬菜、向日葵、烟草、番茄、甘蔗、水稻、小麦、玉米、黑麦、燕麦、大麦、草皮草以及饲料作物。在另一个实施方案中，该转基因植物种子和植物是一种转基因玉米种子和植物。
可以通过将一种植物遗传工程化以包含并表达所有的在所谓的分子堆积（molecularstack）中必需的基因来实现至少一种鞘翅目活性蛋白和至少一种鳞翅目活性蛋白在同一个转基因植物中的共表达。可替代地，可以将一种植物（亲本1）遗传工程化，用于本发明的编码杀虫蛋白的某些基因的表达。可以将一种第二植物（亲本2）遗传工程化，用于本发明的编码杀虫蛋白的某些其他基因的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入到亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物，在此指定为一种“育种叠加”（breedingstack）。可以通过将包含MIR604转殖项的玉米植物与包含Bt11转殖项的玉米植物杂交来实现这样的用来产生本发明的组合物的育种叠加。因此，该育种叠加的子代包含在此披露的mCry3A蛋白和Cry1Ab蛋白以提供对鞘翅目害虫的协同控制。
本发明的组合物，例如转基因植物种子还可以用一种杀虫种子包衣进行处理，如在美国专利号5,849,320和5,876,739中所说明的，通过引用结合在此。其中本发明的杀虫种子包衣与转基因种子具有针对同一种目标昆虫的活性，该组合(i)在用于进一步增强本发明的协同组合物针对目标昆虫的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该目标昆虫的又另一种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的一种方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强活性的方法，这种活性对抗或防止在一种目标昆虫（例如，玉米根虫）中产生抗性，该方法包括将一种杀虫种子包衣施用到本发明的一种转基因种子上。这样的化学处理可以包括杀虫剂、杀真菌剂或杀线虫剂。这样的杀虫剂的实例包括但不限于：呋虫胺，如噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、呋虫胺（nidinotefuran）、溴虫腈、吡螨胺、虫酰肼、甲氧虫酰肼、氯虫酰肼、唑蚜威、阿维菌素、多杀菌素、氟虫腈（fiprinol）、乙酰甲胺磷、苯线磷、二嗪农、毒死蜱、甲基毒死蜱（chlorpyrifon-methyl）、马拉硫磷、甲萘威、涕灭威、虫螨威、硫双威以及杀线威。即使在杀虫种子包衣针对一种不同的昆虫是活性的情况下，该杀虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将一种具有针对鳞翅目昆虫活性的杀虫种子包衣加入本发明的转基因种子（具有针对鞘翅目昆虫的活性）中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目害虫两者。
实例
通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是出于说明性目的而提供的，并且并不旨在进行限制，除非另外指明。在此所使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的，并且由以下文献进行说明：J.Sambrook等人《分子克隆：实验室手册第3版》（MolecularCloning:ALaboratoryManual,3dEd）冷泉港，纽约（ColdSpringHarbor,N.Y.）:冷泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress）（2001）；T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，《基因融合实验》（ExperimentswithGeneFusions），冷泉港实验室，冷泉港，纽约（1984）、以及Ausubel,F.M.等人《分子生物学实验手册》（CurrentProtocolsinMolecularBiology）（约翰威利父子出版公司，纽约）（JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork）（1988）、Reiter等人《拟南芥属研究方法》（MethodsinArabidopsisResearch），世界科学出版社（1992）、以及Schultz等人，《植物分子生物学手册》（PlantMolecularBiologyManual），克鲁沃学术出版社（KluwerAcademicPublishers）（1998）。
实例1.针对科罗拉多马铃薯甲虫的毒素之间的相互作用
在这个实例中，用测试单独的以及组合的杀虫蛋白的生物测定测量了mCry3A对Cry1Ab毒性以及Cry1Ab对Cry3A毒性的影响。转殖项Bt11玉米和转殖项MIR604玉米分别表达了杀虫蛋白Cry1Ab和修饰的Cry3A（mCry3A）。Cry1Ab针对某些鳞翅目是活性的，而mCry3A是针对鞘翅目的一些种类是活性的。在美国，Bt11玉米的主要用途是用于控制欧洲玉米螟（玉米螟属（(Ostrinianubilalis）；ECB）并且MIR604玉米的主要目标是西方玉米根虫（Diabroticavirgiferavirgifera；WCR）以及北方玉米根虫（Diabroticalongicornisbarberi；NCR）。通过Bt11和MIR604植物的常规育种叠加，创造了产生Cry1Ab和mCry3A两者的叠加的Bt11xMIR604玉米杂交体。这些玉米杂交体提供了对ECB连同WCR和NCR的控制。
所使用的指示生物是一龄ECB（对Cry1Ab高度敏感的）以及一龄马铃薯甲虫（马铃薯甲虫（Leptinotarsadecemlineata）CPB）（对mCry3A高度敏感的）。ECB是对mCry3A不敏感的，并且CPB是对Cry1Ab不敏感的。尽管CPB不是MIR604或Bt11xMIR604玉米的目标害虫，它比mCry3A靶向的根虫种类更易于进行实验室测试。ECB和CPB幼虫均是使用标准人工饲料在相同的实验室条件下很容易生物测定的。由于一龄的这些种类是高度易受Cry1Ab或mCry3A影响的，因此将检测这两者之一的蛋白质的毒性的许多显著变化的能力最大化。在每个组合的生物测定中，将每个敏感的种类暴露于高浓度毒素和低浓度毒素（分别由LC70和LC30表示）、连同高浓度的非毒素（由针对相应的敏感种类的LC90表示）。
不同的实验设计对于测试毒素之间的相互作用是可得的。该设计取决于用来预测毒素混合物的效应的模型（没有来自单独的这些化合物的效应的相互作用）；当观察到不同于该模型的预测的混合物的效应时，检测到了相互作用。当毒素具有相似效应时，则一种化合物可以被取代为另一种的恒定比例，这种零模型被称为相似联合作用。当应用这种模型时，相互作用的测试确定了对于固定比率的化合物的剂量响应（例如，Tabashnik,1992）。当毒素独立地发挥作用时（不同的作用模式），最佳模型独立于联合作用，并且对于相互作用的测试检测了不同比率的化合物在因子设计中的效应（例如Tajima等人，2002）。Cry1Ab和mCry3A的广泛的数据表明了对一种蛋白敏感的有机体对其他蛋白将不是敏感的；换言之，仅一种化合物对一种具体的有机体是毒性的并且零假设是该化合物没有另外的作用。在这些情况下，在单独的蛋白A的毒性与其在蛋白B的存在下的毒性之间的差异表明了一种相互作用。对于蛋白A敏感的生物，在效应中不存在针对蛋白B的剂量响应，并且因此没有理由预期蛋白B的浓度影响了蛋白A的毒性。因此，测试固定浓度的蛋白B的效应是测试任何相互作用的一种简单并且有效的方法。这种方法最近似地类似于由Tabashnik描述的“简单的经验方法”（1992）。
在两种杀虫蛋白之间的相互作用被检测为在用单一的毒性蛋白观察到的死亡率和当与该毒性蛋白相结合加入该第二蛋白质时所观察到的死亡率之间的差异。将一龄ECB暴露于处于LC30和LC70的Cry1Ab，单独地以及结合一种高浓度的mCry3A（相应于针对一龄CPB的LC90）。相应地，将一龄CPB暴露于处于LC30和LC70的mCry3A，单独地以及结合一种高浓度的Cry1Ab（相应于针对一龄ECB的LC90）。
将处于它们的LC30和LC70两者的敏感种类暴露，允许评估在剂量响应曲线中的两个不同的点与该第二蛋白质的潜在相互作用。暴露于对该敏感种类高度毒性（LC90）的第二蛋白质提供了足够高的暴露，以便检测在两种蛋白质之间存在相互作用时的任何生物学相关的毒性。
在生物测定中所使用的Cry1Ab和mCry3A的来源是通过在重组大肠杆菌中过表达每种蛋白质随后进行纯化所产生的测试物质。如在这些测试物质中所包含的Cry1Ab和mCry3A是基本上等效于分别在Bt11和MIR604转基因玉米植物中表达的杀虫蛋白。使用在微生物中产生的纯化蛋白质优选使用源于植物的Cry1Ab和mCry3A制剂。微生物衍生的测试物质的相对较高纯度允许更精确的毒性测定，而没有来自植物物质的干扰。在源于Bt11的材料和源于MIR604的材料两者中、以及在对照材料中，这些植物物质可能不以等量存在，并且可以使生物测定结果的解释混淆。
Cry1Ab测试物质的产生：Cry1Ab测试物质被确定为含有大约127μgCry1Ab/ml的测试物质（0.0127%w/v）。在制备之后，将测试物质在大约4℃下储存。在测试物质中的胰蛋白酶截短Cry1Ab大致相应于在Bt11玉米中编码的截短Cry1Ab。在Bt11玉米中编码的截短Cry1Ab代表来自苏云金杆菌库斯塔克亚种的全长天然Cry1Ab蛋白的前615个N末端氨基酸。通过对比，在测试物质中的主要形式的胰蛋白酶截短的Cry1Ab是一种587个氨基酸的蛋白质，代表在Bt11玉米中存在的相同的截短Cry1Ab蛋白，减去前28个N末端氨基酸（Kramer，2006）。Bt11玉米中的Cry1Ab的胰酶消化去除了这28个N端氨基酸（这是对杀虫活性不需要的），并且进一步证明大肠杆菌产生的胰蛋白酶截短的Cry1Ab和在Bt11中产生的截短Cry1Ab的实质等同性，如通过SDSPAGE、蛋白质印迹分析、N端测序、肽谱、针对新生ECB幼虫的生物活性、以及可检测糖基化的缺乏所测量的。因此，在该测试物质中存在的截短Cry1Ab蛋白可以被认为是实质上等同于在Bt11玉米中编码的截短Cry1Ab蛋白。
mCry3A测试物质的产生：mCry3A测试物质被确定为含有按重量计大约90%的mCry3A蛋白，具有针对敏感性鞘翅目种类的生物活性并且被证明实质上等同于如在转殖项MIR604玉米中所产生的mCry3A，如通过不同的生物化学和功能参数所评定的。在制备之后，将mCry3A测试物质在-20℃下储存。
针对Cry1Ab的ECB剂量响应的LC30、LC70和LC90的估计：根据本领域已知的标准方法，在昆虫摄食测定中使用一龄ECB幼虫评定Cry1Ab的生物活性。简言之，这些生物测定是在Costar24孔板（飞世尔科技（FisherScientific），目录号PD10-047-05）上进行的。通过将该液体Cry1Ab测试物质稀释在0.6μM的碳酸铵缓冲溶液中来制备这些测试溶液。将一百μl的每种稀释液加入到100μlECB食物（来自博仕生物医学服务中心（BioServe,Inc.）美国新泽西州的弗伦奇敦（Frenchtown）的通用鳞翅目饮食）中并且充分混合。根据本领域已知的方法制备ECB昆虫食物。每个孔含有200μl的昆虫食物，该昆虫食物含有范围从3ng/ml至372ng/ml浓度的Cry1Ab。每个处理由含有一个ECB幼虫/孔的24个复孔组成。将这些板保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。为了控制偏差，将幼虫随机分配到处理组中。作为对照，将幼虫暴露于没有测试物质的昆虫食物（单独的食物）；在与向该食物中施用最高测试物质浓度中所使用的相同缓冲液浓度处理的昆虫饮食（100μl的大约0.6μM50mMNH4HCO3，pH9.25，缓冲液/100ml饮食）；以及用热灭活的Cry1Ab测试物质溶液处理（在100℃下30分钟）的食物，该溶液处于与在生物测定中所使用的最高测试物质浓度（372ngCry1Ab/ml食物）相等的浓度。该热灭活蛋白质处理用作加入到该昆虫食物中的蛋白质以及在该测试物质中的杂质（即，非Cry1Ab组分）的潜在效应的对照。在大约144小时之时评定了死亡率。
使用USEPAProbit分析程序（1.5版本，USEPA,1992）来确定LC50和LC90；另外，使用对于对数剂量概率单位关系的回归的斜率方程结合正态分布概率单位表来确定LC30和LC70值（嘉基科学表（GeigyScientificTables），Lentner，1982）。也可以使用其他的概率单位程序。
针对mCry3A的CPB剂量响应的LC30、LC70和LC90的估计：使用mCry3A测试物质，以与以上对于ECB描述的相同方式使用本领域已知的标准方法确定针对一龄CPB的mCry3A的LC30、LC70和LC90。通过将冻干的测试物质溶解在水中制备这些测试溶液。将一百μg的每种稀释液加入到100μgCPB食物（来自博仕生物医学服务中心（BioServe,Inc.），美国新泽西州的弗伦奇敦（Frenchtown））中并且充分混合。使用本领域已知的方法制备CPB昆虫食物。每个孔含有200μl的昆虫饮食，具有范围从0.01μg/m1至5μg/m1食物的mCry3A浓度。作为对照，将幼虫暴露于没有加入测试物质的昆虫食物（单独的食物）；用与向该单独的食物中施用该测试物质溶液所使用的相同体积的MilliQ水处理的昆虫食物；以及用来自该测试物质的热灭活的（在100℃下30分钟）mCry3A蛋白的溶液处理的食物，该溶液处于与在生物测定中所使用的最高测试物质浓度（5μgmCry3A/ml食物）相等的浓度。在96小时之时评定了死亡率。
mCry3A对Cry1Ab毒性的影响的评估：通过将一龄ECB暴露于LC30（等于27ngCry1Ab/ml食物）以及LC70（等于70ngCry1Ab/ml食物）浓度的Cry1Ab并且比较在mCry3A的存在和缺乏下的死亡率来测量mCry3A对Cry1Ab毒性的影响。如以上所述确定相应于CPBLC90（等于2.4μgmCry3A/ml食物）的mCry3A的浓度。
使用以上所述的相同培养程序和条件来进行相互作用的生物测定，除了对于每个处理使用一式三份的24孔培养板之外。每个处理板含有24只幼虫，每个处理总共72只幼虫。作为对照，将幼虫暴露于没有测试物质的昆虫食物（单独的食物）；在与向该食物中施用最高测试物质浓度中所使用的相同缓冲液浓度处理的昆虫饮食（100μl的大约0.6μM的50mMNH4HCO3，pH9.25，缓冲液/100ml饮食）；以及用热灭活（在100℃下30分钟）Cry1Ab的溶液处理的食物，该溶液处于与在生物测定中所使用的最高Cry1Ab浓度（372ngCry1Ab/ml食物）相等的浓度；以及配制为2.4μg/ml的mCry3A，相应于针对CPB的mCry3A的LC90。针对CPB的LC70的mCry3A（等于1.4μgmCry3A/ml食物）处理的CPB食物用作并行阳性对照来证实mCry3A的杀虫活性。在大约144和168小时之后评定了死亡率。用ECB进行两次整个相互作用的生物测定。
Cry1Ab对mCry3A毒性的影响的评估：通过将一龄CPB暴露于LC30（等于0.62μgmCry3A/ml食物）以及LC70（等于1.35μgmCry3A/ml食物）浓度的mCry3A中并且比较在Cry1Ab的存在和缺乏下的死亡率来测量Cry1Ab对mCry3A毒性的影响。Cry1Ab的浓度是ECBLC90（等于142ngCry1Ab/ml食物）。重复处理的次数以及CPB死亡率数据的分析与以上描述的相同。
使用以上描述的相同培养程序和条件来进行相互作用的生物测定，除了对于每个处理使用一式三份的24孔培养板之外。每个处理板含有24只幼虫，每个处理总共72只幼虫。作为对照，将幼虫暴露于没有测试物质的昆虫食物（单独的食物）；在与向该单独食物中施用测试物质溶液中所使用的相同体积的MilliQ水处理的昆虫食物；以及用热灭活（在100℃下30分钟）的Cry1Ab的溶液处理的食物，该溶液处于与在生物测定中所使用的最高mCry3A浓度（5μgmCry3A/ml食物）相等的浓度；以及配制为142ng/ml饮食的Cry1Ab，相应于针对ECB的Cry1Ab的LC90。用针对ECB的LC70浓度（等于70ngCry1Ab/ml食物）的Cry1Ab处理的ECB食物被用作阳性对照来证实在组合生物测定中使用的Cry1Ab的杀虫活性。在大约72和96小时之后评定死亡率。用ECB进行两次整个相互作用的生物测定。
统计方法：在每个研究中，一些标准必须满足以下描述为对于在蛋白质之间的相互作用有效且实际的检验的实验设计和数据分析：(1)用来溶解这些蛋白质的缓冲液没有影响；(2)加入蛋白质本身没有影响；或(3)“非毒素”对于处于在本实验中所使用的浓度的不敏感生物测定种类是没有毒性的。对于ECB和CPB实验两者，满足这些标准。
一旦在生物测定中观察到死亡率，则每天报告死亡率直到在LC30处理中有大约30%的死亡率以及在LC70处理中有70%的死亡率。分开地分析来自在每个蛋白相互作用研究中的每个采样场合的数据。在每次采样中，对于单独的测定以及对于来自两种测定的组合数据进行分开分析。
在每个生物测定中的每次采样，所分析的响应是每个重复的死亡幼虫的平方根反正弦变换的比例。通过方差分析测试不同处理的作用。对于两个实验（ECB和CPB），对两个实验进行分开分析并且组合（如果有效的话）。方差分析的关键假设是在多个处理中存在方差同质性并且残差是正态分布的。如果包含阴性对照处理，这不太可能是真实的，因为死亡幼虫的比例在许多重复中是零。对于平方根反正弦变换的数据的方差分析，这是一个具体的问题。因此，从该分析中排除阴性对照数据，因为该方法的假设的它们的确认是清楚的，无需统计分析。对于分开分析的测定，进行具有处理效应的方差分析。使用Levene检验（SAS，2002-2003）来检查在四个处理中的每一个中的方差同质性并且使用Shapiro-Wilks检验（SAS，2002-2003）来检查正态分布的残差的假设。对于组合测定的分析，进行了具有测定和处理效应的方差分析。使用Shapiro-Wilks检验来检查正态分布的残差的假设。没有进行方差同质性的假设的正式检验，因为如果在方差分析中存在一种以上的效应的话，不能应用Levene检验（SAS，2002-2003）。然而，使用平方根反正弦变换数据的绘图的视觉比较来证实方差同质性假设对于组合数据是有效的。
这些处理的因子结构允许研究三种效应。(1)毒性蛋白的主效应（毒素的浓度影响该响应吗？）；(2)非毒性蛋白的主效应（非毒素的存在影响该响应吗？）；以及(3)在毒素的浓度与非毒素的存在之间的相互作用（非毒素的效应取决于毒素的浓度，并且毒素浓度的效应取决于非毒素的存在吗？）。
通过建立关注这种效应同时去除其他效应的处理对比，对这些效应进行研究。这是通过检查处理手段的适当组合（处理手段的组合被称为一种对比）来实现的。每个对比是单独的对比系数乘以它们的相关处理手段的总数。可以在适当的零假设情况下评定每个对照的统计显著性。对于三个项目的零假设如下：(1)Ho：在低和高浓度下的毒素蛋白的响应是相同的；(2)Ho：具有或没有非毒性蛋白的响应是相同的；以及(3)Ho：毒性和非毒性蛋白的任何效应是彼此独立的。
使用来自方差分析的误差估计以5%的I型误差率来评估每个对比。处理对比2测试了在两种蛋白质之间是否存在协同作用（或拮抗作用）。因此，如果对于对比2的零假设被拒绝，那么这些数据提供了协同作用（或拮抗作用）的证据。任何显著对比的标记的进一步检查决定了是否存在协同作用或拮抗作用（例如，正对比2的值暗示当非毒性蛋白存在时更大的死亡率，因此是协同作用）。
使用Microsoft计算组合生物测定的平均值和标准偏差。
结果
针对ECB的Cry1Ab的LC30、LC70和LC90的估计：对于针对欧洲玉米螟幼虫的Cry1Ab的生物活性估计显示在144小时之后大约27的LC30、大约70的LC70以及大约142ngCry1Ab/ml食物的LC90。这些阴性对照食物仅仅显示了低死亡率，对于单独的食物处理是8%，对于缓冲液处理的食物是4%，并且对于用灭活Cry1Ab处理的食物是4%。
针对CPB的mCry3A的LC30、LC70和LC90的估计：对于mCry3A针对科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的生物活性估计显示在96小时之后大约0.6的LC30，大约1.4的LC70以及大约2.4μgmCry3A/ml食物的LC90。这些阴性对照食物显示了没有或仅仅低的死亡率，对于单独的食物处理是0%，对于水处理的食物是8%，并且对于用灭活mCry3A处理的食物是4%。
mCry3A对Cry1Ab毒性的影响的评估：在168小时之后对于单独的食物、对于缓冲液处理的食物、对于热灭活Cry1Ab处理的食物以及用LC90CPB的mCry3A处理的食物（2.4μgmCry3A/ml食物）存在低的平均死亡率（7%或更低）。此外，在毒素处理的食物与阴性对照食物之间存在明确的差异。因此，证明了对于有效的实验设计的若干必要条件。
在144小时之后的两个测定中，在LC30和LC70处理中的死亡率（具有或没有mCry3A）分别在统计学上显著低于30%和70%。因此，继续这些测定以达到该实验的所希望的毒性终点。在168小时之后，已经达到终点（即，在单独的LC30Cry1Ab和单独的LC70Cry1Ab处理中分别是30%和70%死亡率）。这些144小时的数据被认为具有检测mCry3A对Cry1Ab的影响的效力。
组合数据的结果表明，针对欧洲玉米螟虫，Cry1Ab浓度和mCry3A的存在的影响在144小时和168小时是独立的（p>0.05）。因此，可以通过将具有或没有mCry3A的数据的联合分析来测试Cry1Ab浓度的影响。同样，可以通过LC30和LC70数据的联合分析来测试mCry3A的影响。
在这些组合数据中，存在着Cry1Ab浓度的统计学显著影响（p<0.05）。在144小时和168小时，在这些组合数据中Cry1Ab浓度的影响是统计学显著的。这些数据表明，ECB正如对于不同浓度的Cry1Ab所预期而响应。
在这些组合数据中，在144小时或在168小时没有检测到mCry3A对Cry1Ab毒性的统计学显著影响（p>0.05）。因为在这个研究中没有检测到单独的mCry3A对ECB的影响，这些结果没有为在杀死或控制欧洲玉米螟中Cry1Ab与mCry3A之间的相互作用的证据。
Cry1Ab对mCry3A毒性的影响的评估：对于CPB测定，在96小时之后对于单独的食物、对于水处理的食物、对于热灭活Cry1Ab处理的食物以及用LC90ECB的Cry1Ab处理的食物（142ngCry1Ab/ml食物）存在低的平均死亡率（4%或更低）。此外，在毒素处理的食物与阴性对照食物之间存在着明确的差异。因此，证明了对于有效的实验设计的若干必要条件。
在两个CPB生物测定中，在72小时之后观察到某一死亡率；然而，在LC30和LC70处理中的死亡率在至少一个生物测定中分别统计学显著地低于30%和70%。因此，继续这些测定以达到该实验的所希望的死亡率终点。在96小时之后，已经达到终点（即，在单独的LC30mCry3A和单独的LC70mCry3A处理中分别是30%和70%的死亡率）。这些72小时的数据被认为具有检测mCry3A对Cry1Ab影响的效力。对于这些分开的测定和这些组合的数据，在72小时和96小时均满足正规性准则和方差同质性。
在这些组合数据中，在72小时和96小时的mCry3A浓度和Cry1Ab的存在的影响是独立的（p>0.05）。因此，可以通过具有或没有Cry1Ab的数据的联合分析来测试mCry3A浓度的影响。同样，可以通过LC30和LC70数据的联合分析来测试Cry1Ab的影响。
在这些组合数据中，在72小时和96小时存在mCry3A浓度的统计学显著影响（p<0.05）。这些数据表明，CPB正如对于不同浓度的mCry3A所预期而响应。
在这些组合数据中，在96小时没有检测到Cry1Ab对mCry3A毒性的统计学显著影响（p>0.05）。然而，在这些联合数据中，在72小时检测到Cry1Ab浓度的统计学显著影响（p<0.05）。因此，在这些组合数据中表明了在72小时在mCry3A与Cry1Ab之间的相互作用。在Cry1Ab存在下更高的死亡率表明，这种影响是协同（如由Tabashnik定义的，1992）或增强（如由Haghdoostetai定义的，1997）。因此，Cry1Ab增强或协同加强了mCry3A的活性，从而引起mCry3A比单独用mCry3A所预期的更快地对目标鞘翅目昆虫起作用。在商业规模上，更快的杀死转换为更小的植物损害以及更低的鞘翅目害虫产生抗性的机会。
实例2.针对玉米根虫的毒素之间的相互作用
这个实例研究了关于杀虫活性是否在包含Cry1Ab和Vip3Aa20的鳞翅目活性蛋白混合物（“Lep组合物”）与包含mCry3A的鞘翅目活性蛋白混合物（“Col组合物”）之间存在一种相互作用。
研究了在存在或缺乏该Col组合物下，Lep组合物对敏感的害虫种类欧洲玉米螟虫（Ostrinianubilalis；ECB）的影响。使用一龄幼虫来进行ECB食物结合生物测定。在侵染之后120小时评定在ECB死亡率百分比。首先确立了对于Lep组合物的八个浓度的ECB剂量响应曲线。从剂量响应曲线中选择给出中间水平响应的Lep组合物的两个剂量（ECB剂量1和ECB剂量2）来进行鳞翅目活性和鞘翅目活性蛋白相互作用的生物测定。ECB剂量1包含大约每ml食物25ngCry1Ab以及大约12.5ngVip3Aa20，并且ECB剂量2包含大约每ml食物50ngCry1Ab以及大约25ngVip3Aa20。因此，ECB剂量2具有如ECB剂量1的大约2X量的Cry1Ab和Vip3Aa20蛋白。
ECB生物测定的结果显示在表1中。当存在WCR剂量2的Col组合物时，没有检测到在ECB死亡率百分比方面的统计学显著性增加，表明根据ECB生物测定在包含mCry3A的Col组合物与包含Cry1Ab+Vip3Aa20的Lep组合物之间不存在相互作用。
表1.ECB生物测定的结果
处理 ECB死亡率百分比
ECB剂量1 21
ECB剂量1+WCR剂量2 22
ECB剂量2 36
ECB剂量2+WCR剂量2 40
WCR剂量2 4
LepBuffer（Neg检查） 1
Lep+Col Buffer(Neg检查) 4
研究了在存在或缺乏Lep组合物下，Col组合物对敏感的害虫种类西方玉米根虫（WCR,Diabroticavirgifera）的影响。使用一龄幼虫来进行WCR食物结合生物测定。在侵染之后120小时评定WCR死亡率百分比。首先确立了具有Col组合物的八个浓度的WCR剂量响应曲线。从剂量响应曲线中选择给出中间响应水平的Col组合物的两个剂量（WCR剂量1和WCR剂量2）来进行Lep组合物和Col组合物相互作用的生物测定。WCR剂量1包含每ml食物大约50μg的mCry3A，并且WCR剂量2包含每ml食物大约200μg的mCry3A。因此，WCR剂量2具有如WCR剂量1的大约4X量的mCry3A蛋白。
WCB生物测定的结果显示在表2中。这些结果表明，当存在包含Cry1Ab+Vip3Aa20的剂量2的Lep组合物时的更高的WCR死亡百分比，表明Lep组合物和Col组合物的组合以比单独的Col组合物所预期的更高的程度杀死WCR。
表2.WCR生物测定的结果
处理 WCR死亡率百分比
WCR剂量1 17
WCR剂量1+ECB剂量2 46
WCR剂量2 48
WCR剂量2+ECB剂量2 65
ECB剂量2 1
Col Buffer（Neg检查） 1
Col+LepBuffer(Neg检查) 1
应当理解的是，在此描述的实例和实施方案仅是为了说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请以及随附的权利要求书的范围的精神和范围之内。
在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的技术人员的技术水平是指示性的。所有公开物和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。
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Claims (8)

1.一种用于控制鞘翅目害虫的方法，该方法包括：向鞘翅目害虫或其环境递送包含至少一种鞘翅目活性蛋白和至少一种鳞翅目活性蛋白的组合物，其中该组合物将鞘翅目害虫控制到好于由于单独包含在其中的任何单独的鞘翅目活性蛋白所预期的程度，其中该鞘翅目活性蛋白是由转殖项MIR604玉米所表达的修饰的Cry3A蛋白，并且其中该鳞翅目活性蛋白是Cry1Ab蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该鞘翅目害虫是科罗拉多马铃薯甲虫或玉米根虫。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该玉米根虫是选自由以下各项组成的组：西方玉米根虫、北方玉米根虫、南方玉米根虫和墨西哥玉米根虫。
4.根据权利要求2所述的方法，其中该鞘翅目害虫为玉米根虫害虫，并且其中所述方法包括向该玉米根虫害虫或其环境递送包含修饰的Cry3A(mCry3A)蛋白和Cry1Ab蛋白的组合物，其中该组合物将玉米根虫害虫控制到好于由于单独的mCry3A蛋白所预期的程度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该组合物是表达该鞘翅目活性蛋白和该鳞翅目活性蛋白的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该转基因植物是转基因玉米植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该转基因玉米植物是包含转基因玉米转殖项MIR604和Bt11的育种叠加。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该转基因玉米植物进一步包含转基因玉米转殖项MIR162。
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