UA112056C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА ЦУКТОВОЇ ТРОСТИНИ, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Fa, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Ab, ДЛЯ БОРОТЬБИ З ВОГНІВКОЮ ЦУКРОВОЇ ТРОСТИНИ - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується способів і рослин цукрової тростини для боротьби з комахою вогнівкою цукрової тростини (SCB), де вказані рослини цукрової тростини містять корові токсиновмісні білки Cry1Fa і Cry1Ab, в комбінації для затримки або попередження розвитку резистентності у SCB.

Description

опис

Рівень техніки

Щорічно мільярди доларів витрачаються на боротьбу з комахами-шкідниками, і ще мільярди доларів втрачаються за рахунок збитку, який вони наносять. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були основними інструментами, які використовувалися для боротьби з комахами- шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Васійи5

ІШигіпдіепві5 (ВО), в деяких областях зіграли дуже важливу роль. Можливість отримання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генів інсектицидних Ві-білків привела до революційних перетворень в сучасному сільському господарстві, і підкреслила важливість і значення інсектицидних білків і їх генів.

Деякі Ві-білки використовували для створення стійких до комах трансгенних рослин, які до теперішнього часу були успішно зареєстровані і стали промислово доступними. Вони включають СтгутАб, СтуТАс, СтуїРа і СтузВьЬ в кукурудзі, Стгу1тАс і Сту2АБ в бавовнику і СгузЗА в картоплі.

Промислово доступні продукти, які експресують дані білки, експресують один білок, за винятком тих випадків, коли бажаний комбінований спектр 2 інсектицидних білків (наприклад,

СтутАБ ї СтузЗВЬ в комбінації в кукурудзі для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і кореневих нематод), або коли незалежна дія білків робить їх придатною як інструмент для затримки розвитку резистентності у чутливих популяцій комах (наприклад,

СтутАс і Сгу2АбБ в комбінації в бавовнику для забезпечення керування резистентністю у тютюнової листовійки).

Тобто, деякі властивості стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широкого впровадження даної технології, також дали підставу вважати, що в популяціях комах буде розвиватися резистентність до інсектицидних білків, які продукуються такими рослинами.

Було запропоновано декілька стратегій для того, щоб зберегти застосування Ві-ознак стійкості до комах, які включають застосування діючих білків у високій дозі в комбінації зі "сховищем" і альтернативно зі спільним розміщенням інших токсинів (Месацйднпеу еї аї. (1998) "ВІ. Кезічапсе

Мападетепі", Майте ВіоїесппоЇ!., 16:144-146).

Для білків, вибраних для застосування в стеках керування резистентністю комах (ІМ),

Зо потрібно виявляти їх інсектицидний ефект незалежно, так, щоб резистентність, що виникла до одного білка, не додавала резистентності до другого білка (тобто була відсутня перехресна резистентність до білків). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана за рахунок наявності резистентності до "білка А", одночасно є сприйнятливою до "білка В", то заявники стверджують, що відсутня перехресна резистентність і що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці розвитку резистентності до одного білка А.

При відсутності резистентних популяцій комах можна провести прогностичні оцінки, основані на інших характеристиках, ймовірно пов'язаних з механізмом дії і можливістю розвитку перехресної резистентності. Було запропоновано використовувати опосередковане рецептором зв'язування для ідентифікації інсектицидних білків, для яких, ймовірно, не характерна перехресна резистентність (мап МейПаєгі еї аіІ., 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної резистентності в даному підході є той факт, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у сприйнятливих видів комах.

У тому випадку, коли два Ві-токсини конкурують у комах за один і той же рецептор, і якщо рецептор мутує у цієї комахи таким чином, що один з токсинів більше не зв'язується з рецептором і в результаті більше не виявляє інсектицидної активності проти цієї комахи, то це може бути випадком, коли у комахи також буде розвиватися резистентність до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно мати резистентність до цих двох токсинів.

Білок Стгу!Ба використовується для боротьби з багатьма лускокрилими комахами, включаючи кукурудзяного стеблового метелика (Нирпег) і кукурудзяну листову совку (ГАМУ;

Зродорієга їидірегда), і білок активний проти вогнівки цукрової тростини (ЗСВ; Оіаїгаєа взасспагаїї5).

Білок Сгту1Ра, продукований в трансгенних рослинах кукурудзи, що містить подію ТС1507, відповідальний за провідну в галузі ознаку резистентності комах в заходах для боротьби з ГАМУ.

Білок СтуїРа також входить до складу продуктів НегсшехФб, Зтагіегах "м і УМіде Бігіке "М,

Можливість проводити дослідження, основані на зв'язуванні (конкурентному або гомологічному) з рецептором з використанням білка Стгу!Ра була обмежена, оскільки доступний звичайний метод введення мітки в білки для детектування в тестах зв'язування з рецептором бо приводив до інактивації інсектицидної активності білка СтуїРа.

СтулАБ і Стуїба є інсектицидними білками, які застосовуються в цей час (окремо) в трансгенній кукурудзі для захисту рослин від різних комах-шкідників. Ключовим шкідником кукурудзи, від якого забезпечується захист даними білками, є кукурудзяний стебловий метелик (ЕСВ). Патент США Мо 2008/0311096 стосується частково застосування Сту1тАБб для боротьби з резистентною до Сту1!Ра популяцією ЕСВ.

Суть винаходу

Даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що СгтуїРа є дуже активним проти популяції вогнівки цукрової тростини (ЗСВ), яка є резистентною до СтуТтАбБ. Як це буде зрозуміло фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини цукрової тростини, які продукують СтуїРа і СтутАБ (включаючи інсектицидні фрагменти повнорозмірних білків), будуть придатними для затримки або попередження розвитку резистентності у СВ до будь- якого одного з даних інсектицидних білків.

Докладний опис винаходу

Даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що СтуїРа є дуже активним проти популяції вогнівки цукрової тростини (ЗСВ; Оіаїгаєа 5засспагаїї5), яка резистентна до

СтутАБ. Отже, даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що СтгуїЕа можна використовувати в комбінації з або "в стеку" з СтутАб в цукровій тростині для боротьби з розвитком резистентності у 5СВ до будь-якого одного з даних інсектицидних білків. Кажучи інакше, даний винахід частково стосується неймовірного відкриття того, що популяція вогнівки цукрової тростини, вибрана внаслідок резистентності до СгуТтАб, не є резистентною до СгуїРа; вогнівка цукрової тростини, резистентна до токсину СгтуТтАб, чутлива (тобто не має перехресної резистентності) до Стуї!Ра. Таким чином, даний винахід включає застосування Сгу1!Ра-токсину на цукровій тростині для боротьби з популяціями вогнівки цукрової тростини, які резистентні до

СтутАБ.

Як буде зрозуміло фахівцям в даній галузі за допомогою даного розкриття, рослини цукрової тростини, які експресують сгуіба і сгуїАр (включаючи їх інсектицидні фрагменти), будуть придатними для затримки або попередження розвитку резистентності СВ до будь-якого одного з даних інсектицидних білків.

Даний винахід включає застосування Стгу!Ра і СтутАбБ для захисту цукрової тростини від

Зо пошкодження і втрат урожаю, викликаного вогнівкою цукрової тростини або популяціями вогнівки цукрової тростини, у яких розвинулася резистентність до СтутАб.

Таким чином, даний винахід стосується стека ІКМ для придушення розвитку резистентності до СтуТАБ і/або СтгуїРа у вогнівки цукрової тростини.

Частково основуючись на даних, описаних в цьому документі, спільна експресія генів сгутАб і сгу!Ра в цукровій тростині може продукувати високу дозу стека ІКМ для контролю 5СВ. До даної комбінації можна додати інші білки для розширення спектра дії.

На основі цих даних можна передбачити, що Сгу!Ра буде ефективним в контролі популяцій

ЗСВ, у яких розвинулася резистентність до СтутАбБ. Однією можливістю впровадження є застосування даних Сгу-білків в географічних зонах, в яких СгутїАр став неефективним в боротьбі з 5СВ за рахунок розвитку резистентності. юІншою можливістю впровадження буде застосування одного або обох таких Сгу-білків в комбінації з СтутАб для придушення розвитку резистентності у БСВ до СтутАБ.

Химерні токсини за даним винаходом включають повний М-кінцевий фрагмент, відповідний коровому токсину Ві-токсину, в тій же точці після кінця фрагмента токсину білок має перехід в гетерологічну послідовність протоксину. М-кінцевий фрагмент токсину в Ві-токсині далі стосується "корового токсину". Перехід в сегмент гетерологічного протоксину має місце приблизно в сполуці токсину/протоксину, або альтернативно фрагмент нативного протоксину (що простягається за фрагментом корового токсину) може зберегтися, з переходом в гетерологічний протоксин, який розташований даунстрим.

Як приклад один химерний токсин за даним винаходом містить повний фрагмент корового токсину СтутАБб (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти 602 до С-кінця).

У одному переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, який містить протоксин, отримують з білка-токсину СтгутАб. Як другий приклад другий химерний токсин за даним винаходом містить повний фрагмент корового токсину СтуїСа (амінокислоти 1-619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти 620 до С-кінця). У переважному варіанті здійснення фрагмент химерного токсину, який містить протоксин, отримують з білка-токсину СгтутАр (вказане вище також стосується інсектицидних білків Сту!Ра). Якщо не указано інакше, то послідовності можна отримати, як описано в заявці на патент США Мо 2008/0311096.

Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що Ві-токсини, навіть всередині певного класу, бо такого як Сту!Ра або СгутАБ, до деякої міри будуть варіювати в довжині і точному положенні переходу від фрагмента корового токсину до фрагмента протоксину. Як правило, токсини

Сту1їРа мають довжину приблизно від 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Звичайно перехід від фрагмента токсину до фрагмента протоксину складає приблизно від 50 96 до приблизно 60 95 від повної довжини токсину. Химерний токсин за даним винаходом буде включати повну експансію даного М-кінцевого фрагмента корового токсину. Таким чином, химерний токсин буде включати щонайменше приблизно 50 95 від повної довжини Сту!Ра або СтутАБ Ві-токсину. Це буде становити щонайменше приблизно 590 амінокислот. Відносно фрагмента протоксину, то повна експансія фрагмента протоксину СтутАБ простягається від кінця фрагмента токсину до С- кінця молекули. Це приблизно останні 100-150 амінокислот даного фрагмента, які є найбільш важливими для включення в химерний токсин за даним винаходом.

Гени і токсини. Гени і токсини, придатні для застосування за даним винаходом, включають не тільки розкриті повнорозмірні послідовності, але також фрагменти даних послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають специфічну пестицидну активність токсинів, конкретно приведених як приклад. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни "варіанти" або "варіації" генів, вони стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують одні і ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну активність. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "еквівалентні токсини", він стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як і токсини за даним винаходом.

У тому значенні, в якому в даному документі використовується цей термін, межі становлять приблизно 95 95 (СтгутАбБ'є і СтуїРа'5), 78 956 (СтгутАбр'є і Сту1Ра'5) і 45 95 (Сгу1"5) ідентичність послідовностей згідно з "Кемізіоп ої Ше Мотепсіайге їТог Ше Васійи5 (игіпдіепвіз Резіісіда

Стувзіа! Ргоївїнв", М. СтісКтоге, 0. В. 7еїдіег, у. Рейе!воп, Е. ЗсеНпері, у. Мап Віеє, 0. І егесімв, у).

Вайт апа О.Н. Оєап. Містобіоюду апа Моїесшіаг Віоіоду Немієм (1998), Мої. 62:807-813. Ці пороги відсікання молекулярної маси також можуть бути застосовні тільки до корових токсинів (для токсинів СтгутАб і Сту1 Ра).

Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що гени, що кодують активні токсини, можна ідентифікувати і отримати декількома способами. Конкретні гени або фрагменти генів, приведені як приклад, можна отримати з ізолятів, які депоновані в колекції культур, як описано

Зо вище. Дані гени або їх фрагменти, або варіанти, також можна сконструювати синтетичним шляхом, наприклад, при використанні синтезатора генів. Варіації генів можна легко сконструювати з використанням звичайних способів отримання точкових мутацій. Також фрагменти даних генів можна отримати з використанням промислово доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, слідуючи стандартним процедурам. Наприклад, можна використовувати ферменти, такі як ВаЇ3!1, або сайт-направлений мутагенез для методичного відсікання нуклеотидів від кінців таких генів. Також гени, які кодують активні фрагменти, можна отримати з використанням різних рестриктаз. Протеази можна використовувати для безпосереднього отримання активних фрагментів даних токсинів.

Фрагменти і еквівалентні варіанти, які зберігають пестицидну активність приведених як приклад токсинів, будуть знаходитися в об'ємі даного винаходу. Також за рахунок виродженості генетичного коду широкий ряд різних ДНК-послідовностей може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному документі. Фахівцям в даній галузі добре відоме отримання таких альтернативних ДНК-послідовностей, що кодують одні і тих же або по суті одні і ті ж токсини. Такі варіантні ДНК-послідовності знаходяться в об'ємі даного винаходу. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "по суті одні і ті ж" послідовності, він стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які не впливають істотно негативним чином на пестицидну активність. Фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також входять в об'єм даного визначення.

Додатковим способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і фрагментів генів, придатних для даного винаходу, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такі зонди представляють детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можна детектувати з використанням відповідної мітки або їх можна зробити спочатку флуоресцентними, як описано в міжнародній заявці М/093/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням сильного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що зонд і зразок мають значну гомологію. Переважно гібридизацію проводять в жорстких умовах з використанням методів, відомих в даній галузі, описаних, наприклад, КеПег

С.Н., М.М. Мапак (1987) ОМА Ргобев, 5іоскіоп Ргевзв, Мем/ Мо, М.М., рр. 169-170. Деякі приклади концентрацій солей і комбінацій температури є наступними (в порядку збільшення жорсткості); 2Х 55РЕ або 55: при кімнатній температурі; 1Х 55РЕ або 55Х при 4220; 01Х 60 ЗОРЕ або 55С при 422С; 0,1Х З5РЕ або 55С2 при 652С. Детектування зонда забезпечує спосіб визначення відомим шляхом того, чи мала місце гібридизація. Такий аналіз зонда забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди за винаходом, можна синтезувати з використанням

ДНК-синтезатора і стандартних методів. Такі нуклеотидні послідовності також можна використовувати як ПЛР-праймери для ампліфікації генів за даним винаходом.

Деякі токсини за даним винаходом конкретно приводяться як приклад в даному документі.

Оскільки дані токсини є тільки прикладами токсинів за даним винаходом, то, очевидно, зрозуміло, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж або аналогічну пестицидну активність зразкового токсину. Еквівалентні токсини повинні мати амінокислотну гомологію із зразковим токсином. Як правило, така амінокислотна гомологія буде складати більше 75 95, переважно більше 90 95 і найбільш переважно більше 95 95. Амінокислотна гомологія буде найбільш високою в найбільш важливих областях токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка в кінцевому результаті відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні прийнятні деякі амінокислотні заміни, і можна очікувати, що такі заміни знаходяться в областях, які не є важливими для прояву активності, або являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не впливають негативним чином на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можна розділити на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, за допомогою яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, знаходяться в об'ємі даного винаходу, за умови, що заміна істотно не змінює біологічну активність сполуки. Нижче приводиться перелік прикладів амінокислот, що стосуються кожного класу. забхнНЕ

Неззряюжені колераї амінокнсвотю Су, бео Ті Сук Гук Ав, Ов ин НН НК РКК ХК ХК КК Я о ек амінокненон т бань І

У деяких випадках також можна провести неконсервативні заміни. Критичним чинником є те, що такі заміни не повинні істотно знижувати біологічну активність токсину.

Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсини за даним винаходом, можна ввести в

Зо широкий ряд мікробних або рослинних хазяїв. Експресія гена токсину, прямо або опосередковано, приводить до внутрішньоклітинної продукції і збереження пестициду.

Кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення можна використовувати для отримання

Ві-штаму, який експресує обидва токсини за даним винаходом. Також можна трансформувати інші мікроорганізми-хазяї одним або обома генами токсинів для отримання синергічного ефекту.

Відносно відповідних мікроорганізмів-хазяїв, наприклад, Рзепдотопах, то мікроби можна застосувати в положення шкідника, де вони будуть проліферувати і поглинатися. Результатом є боротьба зі шкідником. Альтернативно мікроорганізм, що містить ген токсину, можна обробити в умовах, які пролонгують активність токсину і стабілізують клітину. Потім на оброблену клітину, яка зберігає токсичну активність, можна впливати середовищем шкідника-мішені.

У тому випадку, коли ген Ві-токсину вводять в мікроорганізм-хазяїн за допомогою відповідного вектора, і на вказаний хазяїн впливають середовищем в живому стані, то важливо, щоб використовувалися певні мікроорганізми-хазяї. Вибирають мікроорганізми-хазяї, про яких відомо, що вони мешкають в "фітосфері" (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше культур, які цікавлять. Дані мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатні успішно конкурувати в певному навколишньому середовищі (культура і інші комахи- мешканці) з мікроорганізмами дикого типу для забезпечення стабільної підтримки і експресії гена, який експресує поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечення підвищеного захисту пестициду від деградації і інактивації в навколишньому середовищі.

Відома велика кількість мікроорганізмів, які мешкають в філоплані (на поверхні листя рослин) і/або ризосфері (в грунті, який оточує коріння рослин) широкого ряду важливих сільськогосподарських культур. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби.

Особливий інтерес представляють мікроорганізми, такі як бактерії, наприклад, родів

Резепдотопах, ЄЕпміпіа, Зеїтайа, Кіервієїа, Хапіпотопаз, Бігеріотусе5, ВПі2обійт,

Аподорзейдотопаз, Меїпуіорпйіив, Адгорасіепит, Асеїюобасієї, Іасіорасіи5, АппНгобасієг,

А?обасіег, І еисоповіос і АіІасаіїдепев; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, родів Засспаготусев,

Стуріососси5, Кіпумеготусе5, Зрогобоіотусев, ЕПодоїогиїа і Аєйгеобавзідішт. Особливий інтерес представляють такі види бактерій, які мешкають в фитосфере, як Рхеидотопах зугіпдає,

Рзепдотопах Пиогезсепв5, Зеїтайа тагсезсеп5, Асеїобрасієг хуїпит, Адгобасівепійт Кштеїасіепв,

Аподорзейдотопаз 5рпегоїд5, Хапіпотопах сатрезвігі5, Апі2гобішт теїіоїї, АІсаїїдепе5 епігорпиз і

А?обБасіег міпіапайї, і види дріжджів фітосфери, такі як Кподоїогшиа гибга, К. дішіпіб, К. тагіпа, К. аигапінаса, Стуріососсиз аїріди5, С. дітнеп5, С. Іаимгепії, Засспаготусез гозеї, 5. ргефогіепвів, 5. сегемізіае, 5рогороІотусев гозец5, 5. одоги5, Кіпумеготусе5 мегопає і Ацгеоравзідішт роїйміапв.

Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми.

Є велика кількість способів інтродукції Ві-сена, що кодує токсин, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, які забезпечують стабільне збереження і експресію гена. Ці способи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США Мо 5135867, який включений в даний документ для ознайомлення.

Обробка клітин. ВасШив5 ІпПигіпдіепзі5 або рекомбінантні клітини, які експресують Ві-токсини, можна обробити для пролонгування активності токсинів і стабілізації клітини. Пестицидна мікрокапсула, яка утворюється, містить Ві-токсин або Ві-токсини в клітинній структурі, яку стабілізована і буде захищати токсин, коли мікрокапсула піддається впливу навколишнього середовища шкідника-мішені. Прийнятні клітини-хазяї можуть включати прокаріоти або еукаріоти, і звичайно обмежуються клітинами, які не продукують речовин, токсичних для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можна використовувати мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, в тому випадку, коли токсичні речовини є нестабільними, або їх вміст є досить низьким для того, щоб уникнути вияву будь-якої можливої токсичності для ссавця-хазяя. Як хазяї особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби.

При обробці звичайно клітини повинні бути інтактними і в основному знаходитися в проліферативній формі, краще не в формі спор, хоч, в деяких випадках можна використовувати

Зо спори.

Обробку клітини мікроорганізму, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени Ві- токсину, можна проводити хімічним або фізичним методами, або комбінацією хімічного і/або фізичного методів, при умові, що метод не впливає негативним чином на властивості токсину і не знижує здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогеновані сполуки, зокрема, галогенвмісні сполуки з 17-80 атомами. Конкретніше, можна використовувати йод в м'яких умовах і протягом достатнього періоду часу для досягнення бажаних результатів.

Інші відповідні способи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними препаратами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридиній хлорид; спиртами, такими як ізопропіловий і етиловий спирт; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголю, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (дивись Нитазоп,

Сгеїспеп Г., Апіта! Тіє5це Тесппідцеб5, ММ.Н. ЕРгеетап апа Сотрапу, 1967) або обробку комбінацією фізичного (нагрівання) і хімічного агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, продукованого в клітині, коли клітину вводять в середовище хазяя. Прикладами фізичних методів є короткохвильове опромінення, таке як гамма-опромінення, і рентгенівське опромінення, Уф-опромінення, ліофілізація і тому подібне. Способи обробки клітин мікроорганізмів розкриті в патентах США Мо 4695455 і 4695462, які включені в даний документ для ознайомлення.

Як правило, клітини мають підвищену стабільність структури, яка підвищує стійкість до впливу умов навколишнього середовища. У тих випадках, коли пестицид знаходиться в проформі, то метод обробки клітин потрібно вибрати таким чином, щоб не інгібувати процесинг проформи в зрілу форму пестициду під дією патогену шкідника-мішені. Наприклад, формальдегід буде поперечно зшивати білки і може інгібувати процесинг проформи поліпептиду- пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну частину біологічної доступності або біологічної активності токсину.

Характеристики, що представляють особливий інтерес при виборі клітини-хазяя для цілей продукції, включають простоту введення Ві-гена або Ві-генів хазяю, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяї і наявність додаткових генетичних властивостей. Характеристики, що представляють особливий інтерес для застосування як мікрокапсул пестициду, включають захисні властивості для пестициду, такі як бо товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість для захоплення шкідниками; простота в індукції загибелі і фіксації без пошкодження токсину і тому подібне. Інші чинники включають простоту формуляції і поводження, економічні міркування, стабільність при зберіганні і тому подібне.

Ріст клітин. Клітину-хазяїн, що містить інсектицидний Ві-ген або Ві-гени, можна культивувати в будь-якому звичайному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує вибіркову перевагу, забезпечуючи селективне середовище, в якому по суті всі або всі клітини зберігають Ві-ген. Потім можна зібрати такі клітини з використанням звичайних методів.

Альтернативно клітини можна обробити до збору.

Ві-клітини, які продукують токсини за винаходом, можна культивувати з використанням звичайних в даній галузі середовищ і методів ферментації. Після здійснення циклу ферментації бактерії можна зібрати першим відділенням спор і кристалів Ві з культурального бульйону способами, відомими в даній галузі. Виділені спори і кристали Ві можна формулювати у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул і інших препаративних форм з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергаторів, інертних носіїв і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їх застосування проти конкретних шкідників-мішеней. Такі препаративні форми і способи застосування відомі в даній галузі.

Препаративні форми. Формульовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини Ві-ізолятів, або рекомбінантні мікроорганізми, що містять гени, отримані з Ві- ізолятів, розкритих в даному документі, можна вносити в грунт. Формульований продукт також можна застосовувати у вигляді покриття насіння або агента для обробки коріння, загальної обробки рослин на більш пізніх стадіях вегетаційного періоду. Для обробки рослин і грунту Ві- клітинами можна використовувати змочувані порошки, гранули або дусти, які отримують змішуванням з різними інертними речовинами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і тому подібне) або матеріали рослинного походження (такі як подрібнена серцевина кукурудзяного качана, рисова лузга, шкаралупа горіхів і тому подібне). Препаративні форми можуть включати ад'юванти прилипачі, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препаративні форми можуть бути на водній або неводній основі, і їх можна застосовувати у вигляді пін, гелів,

Зо суспензій, емульгованих концентратів або тому подібне. Інгредієнти можуть включати реологічну добавку, поверхнево-активні речовини, диспергатори або полімери.

Фахівцям в даній галузі, очевидно, зрозуміло, що концентрація пестициду буде варіювати в широких межах залежно від природи конкретної формуляції, зокрема, чи є вона концентратом або призначена для безпосереднього застосування. Пестицид буде знаходитися в концентрації, що становить щонайменше 1 95 мас., або концентрація може дорівнювати 100 95 мас. Сухі препаративні форми будуть містити приблизно 1-9595 мас. пестициду, в той час як рідкі препаративні форми звичайно будуть містити приблизно 1-60 95 мас. твердих часток в рідкій фазі. У препаративних формах звичайно буде знаходитися приблизно від 102 до приблизно 107 клітин/мг. Такі препаративні форми будуть застосовуватися в кількостях приблизно від 50 мг (рідина або суха речовина) до 1 кг або більш на га.

Препаративні форми можна застосовувати в середовищі мешкання лускокрилого шкідника, наприклад, на листя або в грунт, обприскуванням, запиленням, поливом або тому подібне.

Трансформація рослин. Переважний рекомбінантний хазяїн для продукції інсектицидних білків за даним винаходом являє собою трансформовану рослину. Гени, що кодують Ві-білки токсини, розкриті в даному документі, можна вставити в рослинні клітини з використанням різних способів, добре відомих в даній галузі. Наприклад, є велика кількість клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему ЕбсПпегіспіа соїї, і маркер, який дозволяє відібрати трансформовані клітини для проведення інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори включають, серед іншого, наприклад, рРВК322, серії рОсС, серії МіЗтр, рАСУС184. Отже, фрагмент ДНК, що містить послідовність, що кодує Ві-білок токсин, можна вставити у вектор у відповідному сайті рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. соїї.

Клітини Е. соїї культивують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують.

Плазміду виділяють. Як правило, проводять аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і використовують інші біохімічні-молекулярні біологічні методи як методи аналізу.

Після кожної маніпуляції використовувану ДНК-послідовність можна розщепити і приєднати до наступної ДНК-послідовності. Кожну послідовність плазміди можна клонувати в одну і ту ж або різні плазміди. Залежно від способу вставки бажаних генів в рослину, можуть бути необхідні інші

ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використовують Ті- або Кі-плазміду, то щонайменше праву межу, але часто праву і ліву межі Т-ДНК Ті- або Кі- 60 плазміди, потрібно з'єднати у вигляді фланкуючої області генів, призначених для вставки.

Застосування Т-ДНК для трансформації рослинних клітин інтенсивно досліджувалося і в достатній мірі описано в Європейському патенті 120516, І ее апа Сеїміп (2008), НоеКкета (1985),

Егаїеу єї аї. (1986) і Ап еї а. (1985), і добре відоме в даній галузі.

Після інтеграції вставленої ДНК в геном рослини вона є відносно стабільною. Звичайно вектор для трансформації містить селектований маркер, який додає трансформованим рослинним клітинам резистентності, серед іншого, до біоциду або антибіотику, такому як біалафос, канаміцин, (5418, блеоміцин або гігроміцин. Маркер, що індивідуально використовується, отже, дозволить відібрати трансформовані клітини краще, ніж клітини, які не містять вставлену ДНК.

Є велика кількість методів для інсерції ДНК в рослинну клітину-хазяїн. Такі методи включають трансформацію Т-ДНК з використанням Адгобасіегічт їшптегасієеп5 або Адгобасіегійт "підодепе5 як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біологічну балістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовують Адгобасіегіа, то ДНК, призначену для вставки, клонують в спеціальні плазміди, а саме в проміжний вектор або бінарний вектор. Проміжні вектори можна інтегрувати в Ті- або

Ві-плазміду гомологічною рекомбінацією завдяки послідовностям, які є гомологічними до послідовностей Т-ДНК. Ті- або Кі-плазміда також містить мігобласть, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть реплікуватися самостійно в Адгобасіегіа.

Проміжний вектор можна перенести в Адгорасіегішт ішптеїасіепе за допомогою плазміди- хелпера (кон'югацією). Бінарні вектори можуть реплікуватися в Е. соїї ії Адгорасієгіа. Вони включають селективний ген-маркер і лінкер або полілінкер, який вставлений в рамку з правої і лівої приграничних областей Т-ДНК. їх можна безпосередньо трансформувати в Адгобасіегіа (Ноївіегз еї а!., 1978). При використанні як клітини-хазяя Адгобасієегічт повинні містити плазміду, яка несе міг-область. Міг-область необхідна для перенесення Т-ДНК в рослинну клітину. Можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформовану таким чином бактерію використовують для трансформації рослинних клітин. Експланти рослин переважно можна культивувати з

Адгорасіегішт ішптеїасіеп5 або Адгорасіегішт гпігодепе5 для перенесення ДНК в рослинну клітину. Потім можна регенерувати цілі рослини з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочків листа, сегментів стебла, коріння, а також протопластів або

Зо культивованих в суспензії клітин) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди за винаходом. Потім отримані таким чином рослини можна тестувати на присутність вставленої ДНК. Відсутні особливі вимоги відносно плазмід у разі методів ін'єкції і електропорації. Можна використовувати звичайні плазміди, наприклад, такі як похідні РОС.

Трансформовані клітини розвиваються в рослинах звичайним шляхом. Вони можуть утворити зародкові клітини і передати трансформовану ознаку(ознаки) потомству рослин. Такі рослини можна вирощувати звичайним шляхом і схрещувати з рослинами, які мають ті ж трансформовані спадкові чинники або інші спадкові чинники. Отримані гібриди мають відповідні фенотипічні властивості.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини потрібно трансформувати генами, в яких кодон переважно оптимізований для застосування в рослинах. Дивись, наприклад, патент США Мо 5380831, який включений в даний документ для ознайомлення.

Незважаючи на те, що в даному документі як приклад приводяться зрізані токсини, добре відомо в області Ві-токсинів, що токсини масою 130 КОа (повна довжина) мають М-кінцевий фрагмент, який є коровим токсином, і С-кінцевий фрагмент є "хвостом" протоксину. Таким чином, відповідні "хвости" можна використовувати зі зрізаними/коровими токсинами за даним винаходом. Дивись, наприклад, патент США Мо 6218188 і патент США Мо 6673990. Крім того, в даній галузі відомі способи отримання синтетичних Ві-генів для застосування в рослинах (Зіємжматй апа Вигдіп, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований в рослині ген, що кодує білок СтуїРа, і додатково містить другий експресований в рослині ген, що кодує білок СтутАБ.

Перенесення (або інтрогресію) ознаки(ознак), що визначається СтуїтАБ і СгуїРа, в інбредні лінії кукурудзи можна здійснити рекурентною селекцією, наприклад, зворотним схрещуванням.

У цьому випадку необхідну рекурентну батьківську форму спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентною батьківською формою), який несе відповідний ген(и) для ознак, що визначаються СтутАбБ і Сту!Ба. Потомство даного гібрида потім зворотно схрещують з рекурентною батьківською формою з подальшою селекцією отриманого потомства на необхідну ознаку(ознаки), яка призначена для перенесення від нерекурентної батьківської форми. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно п'яти і більше покоління зворотних гібридів з рекурентною батьківською формою з селекцією на необхідну ознаку(ознаки), потомство буде бо гетерозиготним відносно локусів, контролюючих ознаку(ознаки), яка переноситься, але буде такою ж як рекурентна батьківська форма відносно більшості або майже всіх інших генів (дивись, наприклад, Роепітапас!іерег (1995) Вгеєдіпд Рівеій Сторв, Ай Еа., 172-175; Ренг (1987)

Ргіпсірієз ої Сийімаг ОемеІортенпі, Мої. 1: Тнеогу апа Тесппідце, 360-376).

Стратегії керування резистентністю комах (КМ). Наприклад, Коизп еї аї. описують стратегії, основані на двох токсинах, так зване "нагромадження" або "стекінг" для контролю інсектицидних трансгенних культур (Те Коуаї Зосієїу. РПЇ. Тгап5. К. ос. І опа. В. (1998) 353, 1777-1786). На веб-сайті Агентства по захисту навколишнього середовища США (ера.дом/оррорра1/ріорезіїсідев/рір5/рі согп геїиде 2006.піт) приводяться наступні вказівки для забезпечення нетрансгенних сховищ (розділ не-ВІ культури/кукурудзи) для застосування з трансгенними культурами. "Специфічними структурованими вимогами для Ві-захищеної (СтутАбБ їі Сту1Ра) кукурудзи від кукурудзяного стеблового метелика продукти є наступними: структуровані сховища: 20 95 сховищ не-лускокрилих з Ві-кукурудзою в Кукурудзяному поясі; 50 965 сховищ не-лускокрилих з Ві-кукурудзою в Кукурудзяному поясі

Блоки 1. Внутрішній (тобто в Ві-поле) 2. Зовнішній (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Ві-поля для максимального довільного схрещування)

Смуги в полі

Смуги повинні мати ширину щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зниження ефектів, пов'язаних з пересуванням личинок".

Крім того, Національна Асоціація виробників кукурудзи на їх веб-сайті (псда.сот/іпбесі- гебвівтапсе-тападетепі-Тасі-5певі-БІі-согп) також приводить аналогічні вказівки відносно вимог для сховищ. Наприклад: "Вимоги відносно ІЕМ кукурудзяного стеблового метелика: засадити щонайменше 20 95 територій з кукурудзою гібридами сховища; у районах з виробництвом бавовни сховище повинне складати 50 95; повинні висаджуватися в межах 1/2 милі від гібридів сховища; сховище можна засівати у вигляді смуг у Ві-полі; смуги сховища повинні бути шириною щонайменше 4 ряди; сховище можна обробити звичайними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для шкідника-мішені; не можна використовувати розпилювані інсектициди на основі Ві на кукурудзі сховища; відповідне сховище повинне бути засаджене у кожному господарстві з Ві-кукурудзою".

Як стверджує Ноивн 6вї аї. (на сторінках 1780 і 1784 правої колонки, наприклад), "стекінг" або "накопичення" дозволяє використовувати менше сховище. Кои5п пропонує приблизно 10 95 сховища при наявності успішного стека в порівнянні (і нижче) із приблизно 30-40 95.

Будь-який з вищевказаних відсотків (такий як для 1Е/1АБ) або аналогічні співвідношення сховищ можна використовувати для подвійних або потрійних стеків або пірамід за даним винаходом на цукровій тростині.

Є різні шляхи забезпечення сховища, включаючи різні геометричні патерни висадження в полях (згадані вище) і суміші насіння у мішках, як додатково обговорюється Коизп еї аї. (вище) і в патенті США Мо 6551962.

Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, що стосуються або цитовані в даному документі, у повному обсязі включені в даний документ для посилання в тому ступені, до якого вони не суперечать положенням даної заявки.

Наступні приклади ілюструють винахід. Приклади не слід розглядати як обмежувальні винахід.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 - Резюме - Відповідь чутливої і резистентної до СтутАБ вогнівки цукрової тростини на Сгу-білок Васійи5 (пигіпдіепві5 СтуїРа

Білок Стуї!Ра виявляв інсектицидну активність як проти Ві-чутливих (ВІ-55), так і проти ВІ- резистентних (ВІ-КК) штамів вогнівки цукрової тростини Оіаїгаєа засспагаїй5. Штам ВІ-ВА 0. зассепагаїї5 показав 142-кратну резистентність до трипсин-активованого білка СтгутАб. Даний ВІ- резистентний штам О. засспага|й5 виявив деяку перехресну резистентність до Стгу1Ра, але співвідношення резистентності були достовірно нижчими (в 4 рази). На основі цих результатів можна передбачити, що СтуїРа може бути ефективним в керуванні резистентністю до СтутАб у р. засспагаїз і інших видів вогнівки кукурудзи.

Приклад 2 - Матеріали і методи (510) Сту-білки Васійи5 (пигіпдіепвів

Очищений трипсин-активований білок СтгутАб Васійи5 ІПигіпдіепзі (ВО отримували від Окг.

Магіаппе Ригіаі-Сагеу, кафедра біохімії, Університет Кейс Вестерн Резерв, Клівленд, штат

Огайо. Сту!ба отримували від Юом/ Адгобсіепсе5 Сотрапу (Іпаіапароїї5, ІМ) в буферному розчині. СтутлАБб ліофілізували з чистотою 99,9 95.

Джерела комах

Ві-чутливий штам (ВІ-55) 0. засспагаїї5 отримували з використанням личинок, зібраних на кукурудзяних полях біля Віннсборо в Північній Луїзіані в 2004 р. Ві-/резистентний штам (ВЕВВ) р. засспагаїй5 отримували з сімейства однієї ізолінії з використанням скринінгу покоління Е».

Дані Вірезистентні комахи завершили розвиток личинкової стадії на виробничих гібридах кукурудзи СтуТАБб і виявили високу резистентність до очищеного трипсин-активованого СтутАбБ- токсину. Під час підтвердження наявності Ві-резистентності окремі особні Ві-резистентного штаму піддавали зворотному схрещуванню з Ві-чутливим штамом і повторно відбирали по резистентності на тканині листа кукурудзи з СтутАб в Рео-поколінні гібрида, отриманого зворотним схрещуванням.

Біологічні тести з комахами

Чутливість штамів ВІ-55 і ВЕЖКК 0. 5асспагайб5 до СтутАбБ і СтуїБа визначали з використанням методу включення в корм. У кожному біологічному тесті використовували 6 або 7 концентрацій Стгу-білка. Межі концентрацій ВІ складали від 0,03125 до 32 мкг/г білка СтулАБ і від 0,03125 до 128 мкг/г для оцінки білка СтгуїРа. Розчини Сгу-білків готували змішуванням Ві- білків з відповідною кількістю дистильованої води для дослідів з СтутїАб або буфера для дослідів з Сту!Ра. Потім розчини ВІ змішували з ітпегідіс кормом перед розливом корму в окремі ямки в 128-ямковому підносі (Віо-Ва-128, С-О Іпіегпайопаї, Рітап, МУ). У біологічних тестах приблизно 0,7 мл обробленого корму вміщували в кожну ямку з використанням шприців на 10 мл (Весіоп, ОЮіскіпбоп апа Сотрапу, гапКіп аке5, Му) Корм, оброблений тільки дистильованою водою (чистий контроль) або буфером, використовували для контрольних обробок. Одна новонароджена особина 0. 5асспагаїй5 (протягом «24 год.) вивільнялася на поверхні корму в кожній ямці. Після інокуляції личинок ямки покривали кришками з вентиляційними отворами (С-О Іпіегпайопа!ї, Рітап, МУ). Підноси для постановки біологічних тестів вміщували в кліматичну камеру при 282С, 50 95 відносній вологості і фотоперіоді 16:8

Зо (світло:темрява). Реєстрували загибель личинок, масу личинок і число личинок, що вижили, у яких був відсутній приріст маси тіла («0,1 мг на личинку) на 7 добу після інокуляції. Кожну комбінацію штаму комах по концентрації Сгу-білка повторювали чотири рази з 16-32 личинками в кожній повторності.

Аналіз даних

Загибель личинок оцінювали по "фактичній" загибелі личинок, коли враховували число фактично загиблих личинок і число личинок, що вижили, без достовірних приростів маси тіла («0,1 мг на личинку), тобто як мертвих або не споживаючих корм комах. Фактичну загибель 0. засепагаїї5 в досліді розраховували з використанням рівняння: фактична загибель (95) - 100 х

Їчисло мертвих личинок «т число личинок, що вижили, без достовірних приростів маси тіла («0,1 мг на личинку) /загальна кількість тестованих комах. У значення показника "фактичної" загибелі (нижче просто "загибель") личинок кожного штаму 0. засспагаїї5 вносили поправку на загибель личинок, що знаходяться на необробленому контрольному кормі при аналізі СгутАр або на кормі, обробленому тільки буфером при оцінці Стгу!Ра. Потім скориговані дані по концентрації/загибелі обробляли пробіт-аналізом для визначення концентрацій Сгу-білка, які викликали 50 95 загибель личинок (І Сво), і відповідних 95 95 довірчих інтервалів (СІ). Обробки, використані в пробіт-аналізі, включали найбільш високу концентрацію, яка викликала нульову загибель, найменшу концентрацію, яка приводила до 100 95 загибелі, і всі дані між цим крайніми значеннями. Розраховували співвідношення резистентності розподілом значення /!С5о для штаму ВІЕЖКК на даний показник для штаму ВІ-55. Тест співвідношення летальних доз використовували для визначення того, чи є співвідношення резистентності достовірними при рівні значущості а4-0,05. Двосторонній аналіз АМОМА використовували для аналізу даних по загибелі з подальшим проведенням тесту І 5МЕАМ5 при рівні значущості а-0,05 для визначення відмінностей в обробці.

Інгібування росту личинок О. 5асспагайє на кормі з білком СтутАБбБ розраховували з використанням формули: інгібування росту личинок (95) - 100 х (маса тіла личинок на необробленому контрольному кормі - маса тіла личинок на Ві-кормі)/маса тіла личинок на необробленому контрольному кормі), в той час як для аналізу Стуїба цей показник розраховували з використанням наступної формули: інгібування росту личинок (95) - 100 х (маса тіла личинок на контрольному кормі, обробленому тільки буфером - маса тіла личинок на 60 Ві-кормі)/(маса тіла личинок на контрольному кормі, обробленому тільки буфером). 100 95 інгібування росту личинок відносили за рахунок реплікації, якщо були відсутні личинки, які мали достовірні прирости маси тіла («0,1 мг/личинка). Дані по інгібуванню росту аналізували двостороннім аналізом АМОМА з штамом комах і концентрацією білка Стгу як два основні чинники. Тести | ЗМЕАМЗ використовували для визначення відмінностей між обробками при рівні значущості а-0,05. Нетрансформовані дані приведені на фігурах і в таблицях.

Приклад З - Результати

Загибель личинок штамів ВІ-55 і ВЕК 0. засспагаїї5 на кормі, обробленому Сгу-білками

Білок СтуТтАбБ (фігура 1): концентрація білка СтутАБб впливала достовірний чином на загибель личинок 0. засспагаїї5 обох штамів ВІ-55 і ВВА (Е-90,67; аг-6,42; Р«0,0001) (фіг. 1). Загибель личинок зростала по мірі збільшення концентрації білка СтутАб. Достовірне підвищення загибелі личинок штаму ВІ-55 спостерігали в концентрації 0,031 мкг/г або вище, і загибель досягала майже 10095 при 32 мкг/г. Для штаму ВІКК достовірну загибель спостерігали в концентрації 2 мкг/г, і цей показник досягав 61 95 в концентрації 32 мкг/г. Спостерігали достовірні відмінності в загибелі личинок між двома штамами комах (Б-346,73; аг1,42, Р«е0,0001).

Загибель личинок, що стосуються штаму ВІ-КК, була достовірно нижча (Р«е0,05) в порівнянні з комахами ВІ-55 у всіх перевірених концентраціях СтутАБр. Взаємозв'язок штаму комах і концентрації був також достовірним (Е-18,82; аг-6,42; Р«0,0001). Загибель личинок штаму ВІі-

КК зростала повільніше в порівнянні зі штамом ВІ-55 по мірі підвищення концентрації СтутАб.

Розрахункові значення І Со, основані на загибелі личинок, для штамів ВІ-55 і ВЕ КК склали відповідно 0,13 і 18,46 мкг/г (таблиця 1). Різниця в 142 рази в значеннях І С5о між двома штамами була статистично достовірною (Р«е0,05), засновуючись на тесті відношення летальних концентрацій.

Білок СтуїРа (фіг. 2): білок Сту!Ра виявив інсектицидну активність і тільки деяку перехресну резистентність. Концентрація Стгу-білюка впливала достовірним чином на загибель личинок О. зассепагаїй5 для обох штамів ВІ-55 і ВКК (Б-251,78; аг8,54; Р«0,0001). Достовірні показники загибелі личинок спостерігали в концентрації 0,125 мкг/г для штаму ВІ-55 і в концентрації 0,5 мкг/г для штаму ВЕР, і цей показник досягав 100 95 в концентрації 8 мкг/г для обох штамів.

Відмінності в загибелі личинок також були достовірними між двома штамами комах (Б-11,82; аг1,54; Р«0,0011). Штам ВІ-КЕ мав достовірно більш низьку загибель (Р«0,05) в концентраціях

Зо 0,125; 0,5 і 2 мкг/г в порівнянні зі штамом ВІ-55. Взаємозв'язок штаму і концентрації також був достовірним (Е-8,61; аг8,54; Ре0,0001). Загалом, загибель личинок штаму ВІК в концентраціях Стгу-білка «8 мкг/г підвищувалася повільніше в порівнянні зі штамом ВІ-55.

Розрахункові значення І С»о, основані на показниках загибелі личинок, для штамів ВІ-55 і Ві-

ЕК склали відповідно 0,29 і 1,15 мкг/г (таблиця 1). Різниця в 4 рази в значеннях І Со між двома штамами була статистично достовірною (Р«е0,05), основуючись на тесті відношення летальних концентрацій.

Інгібування росту личинок 0. засспагаїї5 на кормі, обробленому Стгу-білком

Білок СтгутАб (фіг. 3): інгібування росту личинок штамів ВІ-55 і ВІ-КК 0. засспагаїй5, що знаходяться на кормі, обробленому СгтуТтАБ, статистично достовірно розрізнювалося серед концентрацій (Б-175,07; аге5,36; Р«0,0001). Ріст личинок ВІ-55 і ВЕКК знижувався по мірі підвищення концентрацій СтутАбБ. Вплив штаму комах на інгібування росту статистично розрізнювався між штамами ВІ-55 і ВІКК (Б-1182,51; аг1,36; Р«е0,0001). Інгібування росту личинок штаму ВІ-55 було достовірно вище в порівнянні зі штамом ВІ-КЕ в діапазоні всіх перевірених концентрацій ВІ. У концентрації 0,031 мкг/г, найнижча перевірена концентрація, Ві-

ЕК не виявляв якого-небудь інгібування росту, але ріст личинок ВІ-55 інгібувався на »90 95 в порівнянні з контролем. У концентрації 0,5 мкг/г штам ВІ-ЕК показував 27 95 інгібування росту, в той час як ріст личинок ВІ-55 практично повністю зупинявся. Взаємозв'язок штаму комах і концентрації Ві також був достовірним (Б-110,72; аг-5,36; Р«0,0001). Загалом, інгібування росту штаму ВЕРК зростало повільніше по мірі збільшення концентрації СтутАр в порівнянні зі штамом ВІЕ-55.

Білок СгуїРа (фіг. 4): інгібування росту личинок штамів ВІ-55 і ВІ-КК 0. засспагаїй5, що знаходяться на кормі, обробленому білком Стгу!Ра, статистично достовірно розрізнювалося серед концентрацій (Б-301,69; аг, 48; Р«е0,0001). Інгібування росту личинок ВІ-55 було статистично достовірно вищим (Р«е0,05) в порівнянні з личинками ВІ-КК в концентраціях 0,125; 0,5 і 2 мкг/г. Вплив штаму комах на інгібування росту статистично розрізнювався між двома штамами комах (Е-45,88; аг-1,48; Р«е0,0001), і взаємозв'язок штаму комах і концентрації Ві також достовірно розрізнювався (Е-18,38; аг7,48; Р«0,0001). Інгібування росту личинок штаму

ВІ-55 зростало швидше в порівнянні з цим показником для штаму ВІ-КЕ. Достовірне інгібування росту личинок обох штамів комах спостерігали в концентрації 0,03125 мкг/г. Ріст личинок штаму

ВІ-55 повністю інгібувався в концентрації 2 мкг/г, в той час як для ВІ-КЕК це мало місце тільки в концентрації 8 мкг/г.

Джерела літератури

Еіппеу, 0.9. 1971. Ргобії апаіузіз. Сатбгідде Опімегейу Ргезв, Епдіапа.

Ниа, а., Г. Маззоп, 9... Уигаї-Репіев, Сх. 5спугар, апа М... Адапа. Віпаїпу апаїузез ої Васйив5

Іишгіпдієпвів Сту а-епдоїохіп5 ивіпд бгибп рогаег тетрбгапе мевісієв ої Овігіпіа пибіїаіів. Арріїєа апа Епмігоптепіа! Містобіоіоду 6721, 872-879. 2001.

ГеОга Зоїмаге. 1987. РОГ О-РО. А изегз диїде о ргобії апа події апа|узів. Ве Кеїєу, СА.

МесСацонеу, МУ.Н., Е. Соцід, апа М/. Сеіегпієг. Ві гтезізтапсе тападетенпі. Маїшге ВіотесппоЇоду 1621, 144-146. 1998.

Магсоп, Р.А.С.С, ІЛ). Мойпа, К. біейвєу, апа В.О. бієднеєа. 1999. Вазеїїпе зизсеріїбійу ої Те

Егтореап сот бБогег, О5ігіпіа пибіїіаії5 (Нибпег) (І ерідорієга: Ругаїїдає) о Васіїйив5 ІПигіпдієпвів їохіп5. У. Есоп. Епіотої. 92 (2): 280-285.

Вобрегізоп, І..). апа Н.К. Ргєїзівсг. 1992. Резіїсіде Біоаззау5 мййп аппгородез. САС Ргезз, Воса

Вапоюп, РІ.

ЗА5 Іпзійше Іпс. 1988. 5А5 ргоседигез дціде, НеїІеазе 6.03 вайіоп. АБ Іпзійціе Іпс, Сагу, МО. зЗіопе, В.Р. 1968. А їогтшціа тюг аеїептіпіпд дедгее ої дотіпапсе іп сазе5 ої топоїасіогіа! іппегпапсе ої гезівїапсе о спетіса!5. Виїї. М/НО 38:325-329.

Мап Меїаєт, НІ, у. Войеттанп, 9. Мап Віє, апа Н. доо5. Тгтапздепіс ріапів Тог їйе ргемепійп ої демеіортепі ої іпзесів гевівіїапі то Васійн5 Іпигіпдіепвів їохіп5. (Ріапі Сепеїїс бувзієтв М.М., Ве/д. 89-401499|400246), 57-19901205. ЕР. 5-31-1989.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 йо АОВОЗСЕБМСЕВ БО «1805 КОМБІНОВАНЕ ЗАСТОСУВАННЯ БІЛКІВ СВТІКА І СОКУТАВ ДЛЯ БОРОТЬБИ З

ДОГНІВКОЮ ЦУКРОВОЇ ТРОСТИНИ, РЕЗНСТЕНЕНОЮ дО сЖ-БТЛКА, ХХ ДЛЯ

КЕРУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ КОМАХ ЧА ПУКРОВІЙ ТРОСТНИНІ хізо» рАБ-вО162-иК-03 ків» 2 «АЧИаж жарезкїїх туесвиог В к«ІО» 1 «вії» 505 хиї?х ваЕх «РУ црсучна послідовних сте тех «ВОЗ» сСкУутЕа кас 1

Ме сій Ап оляп оті зів Азва о 5ін Сув Маю Бко Тук КБп буяє тес Аве ї А 19 15

Дал ово біч Уаї сій ї1ї6 Бей одяпобій 013 Ако Бех оТйжх п1іу Дкб дей 20 25 Зо

Рух іє) Аврої18 бБет Сей Ве ей Тв Ак Бе пед пей оБеє бій Реве 35 4 ї5

Уві Рко біу Уаї щі Маї Аіз РБе біу Гсм Ре Авр їмо їіє Тер Сіу 50 35 бо

Вве ІТ1і2 ТБЕ реко Бег Ав оїхр Бек Бе Ре рей йем сіп Т1е бій бівп 55 то 75 що

Пе їТІ1в біз сід АрЯ Т1іе піз ТЕ пен біб Аа вви вх Ахта з1є Те ва ЗУ

Твж їенх вха біу Сей вза вв Зетх Тук бій ї1і6 туї б3іе Сіда Аза зей 120 Т25 їїо

Ака біз їТср із Аза Авп Бгто двп ода Ада бій ред бусрі; ввр Уві 115 о 125

Аг пі ба Рре Аза деп ТВх Дер оДвроДіа цей 16 Тк Мія ЇІТе Ави 135 135 150

Ази пе Тву Гей бСнк обеєс Бе біа їле Бко Без обео беє Узі Тух Маї т45 159 155 160 іп вія Аїа АвпоСец Ніз Тейш бек Те оцез Ахо Авро Аза Уад бЗес рве 155 ї79 їх сту біп біу ТевобЗіу їви Азроїів А1Та Тако Уві Авзп о Ав Нів Тук АБИ 180 185 159

Аху цем їі Авт оїе» І1Ме Нія Ах; Тух Твко був Ні Сувх Без о Азро ту 155 290 25

Тую Ап блі: Сіу Бей бій Вп оБеш Атя Су Тпх Ава Тр ода пів Тер 218 218 зей

Аїв ба Ре Ап біт Ра Во АкФ о дво Пем ТВкоїжна ТвкоУаї Пей Дер рас 23 235 240 тів Уаї Аїа без Рлпе Бра Авпоїух Або Уві Ако ТВ оТухк Бо Ті біп 243 50 -855

Тпх бек бек бів Без ТБк о Ако бів їТє тую ТвЕ бек оБек Маї їі 00 280 265 2

Ар вах РЕо Уаі Бех Аїа Авт ІТ рус Ав сдіу Ра АвподкгЯ ів СТИ 215 289 285

Епе ві Маї Ака го Бо Ні Без оМеб АБО вне МеЄ Аепобек Бей Ре 295 85 зп

Чаї Тнт два бін ТвЕ уві Деу бе бій тк Маї Тв о біу бі Біб ей зо Зх5 320 уві 5ех Зв»вк Агу Ази оївВЕ Аїа сіу Ан о АкФ Зі6 Ави Рпе реє беж Туг

Зв 339 -е

Зі Уві Ре Авпорко плу слу Атїа їіє тТжро їв вія дво зів Ар обко зай з4А5 з5О вк орко ЕВе тук Акоа Такт тей ву Акрорто Маії Ре уЩї дта бБіУу Бу 155 Зо 355

Епе бе Авий Бо нів Тук Уві рей пі пе) АКЧ ту Чаї Атіа РА ос1н

Зо з75 зва сіт ТБЕосіу Твроаза На б Або Твж Ре АкЯ АБвобеК осі тик І1е з85 50 | за5 408

Ава бек пес Авробін ІЗ Беб Рг осів Авр о Ан беж бі діа рко тт. 405 119 415

Ана Аз отТує бех Ні Маї Без йвп Нв Маї ТЕ Ре Уа Ахо Тк оРхо 220 425 «39

СЬУ БК 116 Беж С1у Бек АБр обех ТЕ Ак АтТа Во Мес Вре веж Тер 345 440 ча5

Тв Нів о дка цех Аза Тих РКО ТБЕ АвпоЖїКК сів дво Рко Зі; Ак о Т1е 45О 455 що

Тато о ї18е Бкс рей Уаї був Віа Кан тТпг ей зіп ЯЖвж Зі ТЕ ТпЕ 455 479 75 во

Уві чаї лк біу ржо бі Ре Тв біб бі1у с двроїЖе пед Ака АкУ Тв 185 430 а5 бек біу біу Рус Бпе Аіз Тук ТВж їЗ1е Уві деп Іі деп б1у біпобву

ЗО 505 510

Рг Бхп о Ака Тук Аха Аїа Ак ї112е Ак Тук Віа бек Ах Тл АБИ лем 55 Бей зав

Ака Т1є Тук Уві Та Маю Аїа Сіу Ба АкФ тіе Рле Ав сту біп. РБе 535 ЗА

Авт оБуз Тв Меє вер отак бу дврорро Генм Твк о ББе біп Чех Бпе бек а ЗО 5ББУ » бо

Тук Вів тих їїе ДАвп Тв А18 Ре Те Рпє Бтго Мес Зак бійя Вех бву 7О З75

Риіе Таж уаї сбіу вйіа Дер Тих Рпе Бех Бех СЛУ Азя 61 Маї Тут їїв ува 5-5 БО

Аяр о АкФ РВе біз без о г1е вко Уа1ї Так Ава Тк о Пей б1іч ах 500 тав «вій «1» ВІЙ «байт РВІ «213» Штучна посльповнЕсте «адм «ве СеУкАБ час»

МессАво Ав Авт Рго два о Т16 Ав бій був ї18 Его Тук АвпосСув ви ї й 16 15 бек АБИ Бго біз Уяії бЗіш Уаї Без шШіу бі ба Ак4 Їзе біз ТНК осіу а 25 за ту тах РХО тре Авротіє Зеж Бей беї ви тн сЗйп ЕвпЕ ем пе Зех 35 4 45 пра бле уві Реб бЕУ с А1а б1іу ре Уаї ши біу тво Маї Ар ої1е Ії6 35 50

ТЕв О01уУ 118 впе Лу Рго Зек сій Жкр Абробів Баш ей хаї Зіз її

БЕ то 5 на біч бій без лів Авпобів Аку ЇїЩфе піц біз Ре Азїа деко Авп біп Аїа в5 за 5

Ї1ее бех АкФф без па біу Іви Бех о Авхв Бей Тук біп Тіє Тух АКа а 150 та5 115

Бех Бре Ага бій Тр біз Атїа Аврорхо Ту Аза Рго Ака рев Ака 3 115 124 125 січ Месє дра І1іе біо Рае АБподДаяо Меї Авпобдек АЇїя Без ТВготах Аїа 130 їз 150

Тіа хо цеб Рьае йла Уаї біт АЛвпоТуг бів Уаї Рей Гей Без бек Уа 145 150 155 162 тТук Уві сіп Аза Аіа Ап оПбей Нів Бей бек уя1і Теп Ака Аяб Маї бек 165 І7О0 175 чаї ВББе віу О1п о Ахо Тр о зіу Ре ВвроАїа Аїз ТТН ї1ео два бекоАка 80 185 тав тТук вви АБЕ цей Тих дУщ пед їіе С1У АвпотТук Тих дар отУї Ата Уа 185 299 205

ВтЗ Ткр Тук Авп от о б5іу рей сін Ат Уді Тер о ціу Рго Азр бек Ак 210 815 го

Аеротжр Чаї Акт Ту Ав обід Бе Ах Акс стій пев ТВБЖ без Тбт Уві

Рез 23 25 рев ем Ар І1є Уві Абалобеа Ре Бо АвпотТух Авробек Ак АЕу Тує Рко 245 250 й їл1е Ата Ти Ус бет бій без ТЕ Ага б о т1іЄє Тег ТИП Ава Рко чаї 260 БУ вій їцез Зіш два Ре дер біу бак Ре дто СІУ бек діа біп біх ІІ» бід 275 285 285

Ак Бек Тіз Ав пек о Бго ків Ге Меб Авр Гі Без бло Зетїт гів ТК вза 295 ЗО тів отут їБлх оАвройла о Нів Ако бі Тух Тук Туг Тгробек бу нів ЗТ 305 319 315 25 її- Ме вла Зег Рко Уаї б1іу Бе бет біу Рко Ба РБе Те ра РІО 325 330 335 це стух піу ТвВкоМає бі» двп Аза Ата го бів бір Аку 11е Маї Ата

З4о ЗА 355 біт без б1у бів Біу Маї Тук дхо Тл Тем обеє бек оту пед Тк вхо зЗ50 355

Зга Вко Ре Аве їі с1іу Т1і6є Азй Дві сій бій Без обек Маї Без Авр

З 375 зно с іу Трх бій Бре Аза Тук Зту Ту бек озек Ап Меп Рхо Зет із Уві

З5 399 95 400

Тук вка Муз Ве сту ТЕ УВІ Вер Зеж Беа АБр обі Сі вБго Бко бій «5 419 415

Вапй дви Ав! Уаї РБує хо Ар зіл С1у Ре бек Ні Ав без бер Ні 420 425 420 маї Бек Меб Рпе Ако бек біу Епе Зех Вей бах Бах Уві Берг іє Ті л35 340 445

Ат Аза рго Мес Брпе беї Тер о ї1е Нів Ак бер Аїа Бій Рое АвпоАві 450 ап збо

Гі ІТе Бсо Бех Бех біл 116 ТБ біб і1є Ро цей Тйх Був Веко їде 55 її 475 880

Ав отїва біу Зеш (1Уу ТЕ Бет уаї Чаї був ЗРу Вво сіу рБа стих Біу 488 430 1335 сіу Азроїїє йвзо дЕЗ ВтФфотлх бек о рта буу бій гіє єї ТагоТеу Ага

ВО об ІВ

Ууаї Ав Тіз ТЕ дія вко Бей бек іп Акад тує АтЯ Уві АКЗ Тіз Акд 5ІЗ БЖ Ви туш А1їа бек ТЕ Тк о Авп без бій РБе НьБ Твгобех 116 Авросту Вга 535 За зай

РЕ ТТїе Авц осіп біу Авт оре дек АТа Тйжх Мес обек бек обіу бек В з45 о 55а 555 5 цей бій Бех бо1у Бек Ре аку Тйк Уа: сіу рпо ТЕЖ ТЕ Рто Ре Ав з55 570 575

ЕВе Бет АВо зіу беї Беї Уаї Рае ТЬВЖ Цей дет Аїв Нав Чаї Бае Ав во За 596 вх біу дай стій Уві Тух її АвроАгоа 116 бін Рде Уа орхо Атв о біч 585 «за 5

Уа ти ре бід

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

   1. Трансгенна рослина цукрової тростини, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок СтгуїРа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Стут АБ.

   2. Трансгенна рослина цукрової тростини за п. 1, в якій ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок СтуїРа, і ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок СгтуТАб, інтрогресовані у вказану рослину цукрової тростини.

   3. Частина трансгенної рослини за п. 1, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Сгу! Га, і ДНК, що кодує інсектицидний білок СтуТтАБ.

   4. Плід розмноження живцюванням або клонального розмноження трансгенної рослини за п. 1, який містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Стуї1Ра, і ДНК, що кодує інсектицидний білок СтутАБ.

   5. Сукупність рослин, що містить не-Ві-рослини сховища і множину трансгенних рослин за п. 1, де вказані рослини сховища складають менше ніж 40 95 від всіх рослин у вказаній сукупності рослин.

   6. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини сховища складають менше ніж 30 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

   7. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини сховища складають менше ніж 20 90 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

   8. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини сховища складають менше ніж 10 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

   9. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини сховища складають менше ніж 5 95 від всіх злакових рослин у вказаній сукупності рослин.

   10. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини сховища знаходяться в блоках або смугах.

   11. Сукупність за п. 5, де вказані рослини цукрової тростини займають площу більше 10 акрів.

   12. Рослина цукрової тростини за п. 1, де вказаний білок Сгуїба щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:1, і вказаний білок СгуїАбБ щонайменше на 99 95 Ко) ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

   І" ві 108 І кофе Чути вні зитам й о -В леоф же Резистсятумт шлам и . й 80 щу х ! то Н ово. БО і ше | й ; о : щ у І 5403 ші « В | ; й 5 и ! ха ши и пи в й о ; вино пи на пи пи ин! Контропь- 9031 0125 05 2 8 32 ск Конпентрацію СтуТ Ав (мкг) Загибель 55 середвеєстандартналлюмнлкя середнього) Ві-чууливих І. Екерезистецтних мітамів Різіяси засезакаці, зцо знаходяться наз кормі, обробленому білком Сху ТАБ Васійих Шугіпріепвіх на 7 добу, після. інокуляції. Показинк загибелі зизпачали у вигля числа мертемя пичитох плюс личинки, що вижили, у яких: були відсутні постовірні прироєти мася піна (50,41 мг/ллнчинка) з 7-денному біологічному тесті; поділене на загальне числю личннаков тесті. Середні значенця по всіх обробках під ожіікю буквою статистично як дастовірні (00.05; тест ГЗМЕАМОХ Фіг 1 Щ Що Щ ту т Р

   100. поту Зутликий па З діяння ВВ, 2 са яко зеРезустевтний шлам й ря я о Й га В - Й й 8 7 І Й 3 : й і и в, р ване ЖК. я Ше -. й 0 т т ; Контроль-Буфер-бо31 0195 05 2 5 з 8 ск ск - до Канпентрація Сгу (мікс) Загибель (35 серелнекставдартиз помихка середнього) Вісчутливих ії Верезистевтних птамов Ділігаси зассікатаця; що знаходяться на кормі, обробленому білком Сгу1 Ге Васійих (Вогіпрієюхів на 7 любу після іцокуляції. Показник лагибелі вязначати у вятляді чис мертвих личинак плює зитнки, що вижини, у яких були відсутні доставірні приростіз маси тіла (50,1 мг/лічкика) в 7-денному біологічному тесті, поділене ча загальне зисло личинок к тесті, Середні значення по всіх обробках під однією буквою стятистичцо ве достовірні їРеб,05, тест ЕЗМЕАМВ),

   Фіг. 2 пи нн нн в нн «во - ШО иа шен еВ Е йв- т В б х ся Б та хв сі т Кай ех і г в ай бе по Е а , З 2а Дня доро Чутинвий штом р. сег еРаеудстентний штам чн й «- Ра -20 т вом ог ов ? В 32 Концентрація Сут (мкг/г). інгібування росту ничинов (Ув'єерезне стандартний помилка середнього) Ві-чукливих і Ві-рузистентних штамів Рійкгава вассваканя, шо знаходяться на ковмі, обробленому бічком Стуї Ав Басов іногінріствів па 7 добу після інокулянії. Процентні значення розраховучали з ямкористакням. формули: інгібування росту (75) - 100:х(Ммаса тіла личинок, шо знаходилися на необробленому коптрильному кормі - маса тіла личинок, що зняходилися ча кормі з СсгуТ АВ маса тіне личинок, що знаходилися на необробленому контроленому корми). 10092 інгібування. росту відноскли до рейліканії, якщо болі відсутні достовірні прирости С50,1 мг/лиливка): Середні значення по всїх абробкях ціл сднісю бухінно статистично не лостовірні (Р005; тест СЗМЕАМБУ.

   - т.

   Фіг. 3 нипитшннннНнжанНнжлжннннтл нирчн ЧЕ 496 4 , рок реє : Др - ВО г « В д Е 50 й в - ЩО ї ! , - ! З 460 Я ат ї х З 70 мовне Чутливий пітам М іно Да рої Резистентний ІШтаМ. х о і Кз і |! -20 ун шк Контроль 0031 0425 05 2 З 32 428 ск Концентрація Сту (мкс) Інтібування росту личинок (2 середвежстандартна помилка середнього) Ві-чутливих і Всрезистентних штамів. Біанаса вассвага їх, що знаходятяся на кормі, еброблевому білком сту га Васійве Яизкіпріспвів яз 7 добу після інокуляції. Процентні значення розраховували з використанням формули: інгібування росту (903-100 х (маса тіла личинок, що знаходилися на контрольному кормі, обробленому тільки буфером - маса тіла личинок; що знаходилися на Негормі або необробленому кормі (чнотяй контроль) маса ліна личикок, йо знаходилися на контрольному кормі, боробленому тійяки буфером). ЦО угібуваяня: росту підносили до реплікації, Яка були відсутні достовіртй приростя (50, мт/личнука): Сережці значення лю всіх обробках під однією буквою статистична не достовірні хр; тест МОМЕАН).

   Фіг. 4