KR20140015155A - 곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ1Ｃａ 및 ＣＲＹ1Ａｂ 단백질의 조합 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 곤충에 의한 내성의 발생을 지연시키거나 방지하기 위해 Cry1Ca 살충 단백질 및 Cry1Ab 살충 단백질을 조합하여 포함하는, 인시류 곤충의 방제를 위한 방법 및 식물을 포함한다.

Description

곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ1Ｃａ 및 ＣＲＹ1Ａｂ 단백질의 조합 용도 {COMBINED USE OF CRY1Ca AND CRY1Ab PROTEINS FOR INSECT RESISTANCE MANAGEMENT}
인간은 식량과 에너지 용도로 옥수수를 재배하고 있다. 또한, 인간은 콩 및 면화를 포함한 다른 많은 작물들을 재배하고 있다. 곤충들은 이러한 식물을 먹고 손상시키며 이에 의해 인간의 노력을 훼손시킨다. 해충을 방제하기 위하여 수십억 달러가 매년 소비되고, 이들이 입히는 손상에 추가로 수십억이 낭비되고 있다. 합성 유기 화학 살충제들이 이러한 해충을 방제하기 위해 사용되는 주된 수단이지만, 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) (Bt)로부터 유래된 살충 단백질과 같은 생물학적 살충제가 일부 분야에서 중요한 역할을 하고 있다. Bt 살충 단백질 유전자로의 형질전환을 통해 곤충-내성 식물을 생산하는 능력이 현대 농업에 혁명을 일으키고 있고 살충 단백질 및 그들의 유전자의 중요성과 가치가 강조되고 있다.
성공적으로 등록되고 현재까지 시판되는 곤충-내성 유전자이식 식물(transgenic plant)을 만들기 위하여 몇 개의 Bt 단백질이 사용되었다. 이들은 옥수수에서 Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa 및 Cry3Bb, 면화에서 Cry1Ac 및 Cry2Ab, 및 감자에서 Cry3A를 포함한다.
2종의 단백질의 조합된 살충 스펙트럼이 요망되는 경우(예를 들어, 각각 인시류 해충 및 뿌리벌레에 대한 내성을 제공하기 위해 조합된 옥수수에서의 Cry1Ab 및 Cry3Bb), 또는 단백질들의 독립적인 작용에 의하여 그 단백질들이 감수성 해충 집단에서의 내성 발생을 지연하기 위한 수단으로서 유용하게 되는 경우(예를 들어 담배 나방(budworm)에 대해 내성 관리를 제공하기 위해 조합된 면화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab)를 제외하고는, 이러한 단백질을 발현하는 시판 제품은 단일 단백질을 발현한다.
다시 말해서, 이러한 기술을 빠르게 그리고 널리 채택하도록 이끌어 온 곤충-내성 유전자이식 식물의 품질은 일부, 해충 집단이 이러한 식물에 의해 생성되는 살충 단백질에 대해 내성을 나타내게 될 지의 염려를 야기한다. 피난처(refuge) 및 상이한 독소들과의 교대 또는 공동-활용과 조합하여 단백질을 고 투여량으로 활용하는 것을 포함하는, Bt-기반의 곤충 내성 특성의 사용을 보존하기 위한 몇가지 전략이 제안되었다 [McGaughey et al., (1998), "B.t.Resistance Management" Nature Biotechnol. 16: 144-146].
곤충 내성 관리(IRM) 스택에서 사용하기 위해 선택된 단백질들은, 하나의 단백질에 대해 나타난 내성이 두 번째 단백질에 대한 내성을 부여하지 않도록 독립적으로 살충 효과를 발휘하는 것(즉, 단백질에 대한 교차 내성이 존재하지 않는 것)을 필요로 한다. 예를 들어, "단백질 A"에 대한 내성으로 선택된 해충 집단이 "단백질 B"에 대해 감수성이라면, 교차 내성이 존재하지 않고, 단백질 A와 단백질 B의 조합이 단백질 A 단독에 대한 내성을 지연하는데 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다.
내성 곤충 집단의 부재 시에, 작용 메카니즘과 교차-내성 가능성에 관련되는 것으로 추측되는 다른 특징들을 기초로 하여 평가가 이루어질 수 있다. 교차 내성을 나타내지 않을 것 같은 살충 단백질을 확인하는데 있어서 수용체-매개 결합의 이용이 제안되었다 (van Mellaert et al. 1999). 이러한 접근법에서 고유한 교차 내성의 결여의 주된 예측인자는, 살충 단백질들이 감수성 곤충 종의 수용체에 대해 경쟁하지 않는다는 것이다.
2종의 B.t. Cry 독소가 동일한 수용체에 대해 경쟁하는 경우에, 그러한 수용체가 그 곤충에서 돌연변이되어 독소 중의 하나가 더 이상 그 수용체에 결합되지 않고 따라서 더 이상 곤충에 대해 살충성이 아니게 되면, 곤충이 (동일한 수용체에 경쟁적으로 결합하는) 두 번째 독소에 대해서도 내성이 되는 경우가 존재할 수 있다. 그러나, 2종의 독소가 2개의 상이한 수용체에 결합한다면, 이것은 곤충이 2개의 독소에 동시에 내성은 아니라는 표시일 수 있다.
Cry1Ab는 각종 해충으로부터 식물을 보호하기 위해 유전자이식 옥수수에 보통 사용되는 살충 단백질이다. Cry1Ab가 보호를 제공하는 옥수수의 주된 해충은 유럽 옥수수 나무좀(European corn borer)이다.
공식 B.t. 명명 위원회의 웹사이트에 추가의 Cry 독소가 기재되어 있다 (Crickmore et al.,; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). 첨부된 부록 A 참조. 추가의 Cyt 독소 및 VIP 독소 등과 함께 현재 "Cry" 독소의 거의 60개 주요 군 (Cry1-Cry59)이 존재한다. 각각의 숫자로 나타낸 군의 다수는 대문자 하위군을 갖고, 대문자 하위군은 소문자 하위-하위군을 갖는다 (예를 들어, Cry1은 A-L을 갖고, Cry1A는 a-i를 갖는다).
발명의 요약
본 발명은 부분적으로, Cry1Ca가 Cry1Ab에 내성인 사탕수수 명나방(sugarcane borer) 집단을 포함하여 사탕수수 명나방에 대해 매우 활성이라는 놀라운 연구결과에 관한 것이다. 당업자가 본 발명의 장점으로 인식할 수 있는 바와 같이, Cry1Ca 및 Cry1Ab (그의 살충성 부분 포함)를 생성하는 식물이 상기 살충 단백질 중의 어느 하나 단독에 대한 내성의 발생을 지연시키거나 방지하는데 유용할 것이다. 예를 들어 Cry1Fa 유전자 또한 이러한 2종의 기본적인 쌍의 유전자/단백질과 스택킹될 수 있다.
또한, 본 발명은 Cry1Ca 및 Cry1Ab가 밤나방 (fall armyworm; 스포도프테라 프루기페르다; FAW)로부터의 장 수용체(gut receptors)에 결합하기 위해 서로 경쟁하지 않는다는 연구 결과에 관한 것이다.
도 1 - Cry1Ab 코어 독소, Cry1Ca 코어 독소 및 125I-표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질에 의한 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) BBMV에 결합하기 위한 경쟁
도 2 - Cry1Ca 코어 독소, Cry1Ab 코어 독소 및 125I-표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질에 의한 스포도프테라 프루기페르다 BBMV에 결합하기 위한 경쟁
<서열의 간단한 설명>
SEQ ID NO:1 - Cry1Ca 코어/Cry1Ab 전독소 키메라 단백질 1164 aa (DIG-152)
SEQ ID NO:2 - Cry1Ca 코어 독소
SEQ ID NO:3 - Cry1Ab 코어 독소
본 발명은 부분적으로, Cry1Ca가 Cry1Ab에 대해 내성인 사탕수수 명나방 (SCB: 디아트라에아 사카랄리스 (Diatraea saccharalis)) 집단에 대해 매우 활성이라는 놀라운 연구결과에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 부분적으로, 이러한 살충 단백질 어느 하나의 단독에 대한 내성의 발생과 싸우기 위하여 Cry1Ca가 Cry1Ab와 조합되거나 "스택킹"되어서 사용될 수 있다는 놀라운 연구 결과에 관한 것이다. 달리 언급하면, 본 발명은 부분적으로 Cry1Ab에 대한 내성으로 선택된 사탕수수 명나방 집단이 Cry1Ca에 대해 내성이 아니고; Cry1Ab 독소에 대해 내성인 사탕수수 명나방이 Cry1Ca에 대해 민감하다는 (즉, 교차-내성이 아니라는) 놀라운 연구결과에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 Cry1Ab에 대해 내성인 사탕수수 명나방 집단을 방제하기 위한 Cry1Ca 독소의 사용을 포함한다.
당업자가 본 발명의 장점으로 인식할 수 있는 바와 같이, Cry1Ca 및 Cry1Ab (그의 살충성 부분 포함)를 발현하는 식물이 상기 살충 단백질 중의 어느 하나 단독에 대한 내성의 발생을 지연시키거나 방지하는데 유용할 것이다.
본 발명은 Cry1Ab에 대한 내성이 발생한 사탕수수 명나방 또는 사탕수수 명나방 집단에 의해 유발되는 손상 및 수확 손실로부터 사탕수수 및 다른 경제적으로 중요한 식물 종을 보호하기 위한 Cry1Ca의 용도를 포함한다. 사탕수수 명나방은 또한 옥수수의 해충일 수 있다. 이것은 브라질 및 아르헨티나와 같은 일부 중앙 및 남아메리카에도 해당된다. 따라서, 본 발명에 따라 예를 들어 옥수수도 보호될 수 있다.
따라서, 본 발명은 Cry1Ab 및/또는 Cry1Ca에 대한 사탕수수 명나방에 의한 내성의 발생을 방지하거나 경감시키기 위한 곤충 내성 관리(IRM) 스택을 교시하고 있다.
추가로, 방사능표지화 Cry1Ca 및 스포도프테라 프루기페라; 밤나방(FAW) 곤충 조직을 사용한 수용체 결합 연구는, Cry1Ca가 결합하는 고 친화성 결합 부위에 대해 Cry1Ab가 경쟁하지 않는다는 것을 보여준다. 이러한 결과는, Cry1Ab 및 Cry1Ca의 조합이, 양쪽 단백질을 생성하는 식물 (예컨대 옥수수 및 사탕수수)에서 Cry1Ab 및/또는 Cry1Ca에 대한 곤충 집단 (예컨대 FAW 및 SCB)의 내성 발생을 경감하기 위한 효과적인 수단으로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 독소 오버레이 연구는, Cry1Ca 단백질이 S.프루기페르다(frugiperda)로부터의 BBMV의 2개 단백질, 즉 40kDa의 것과 44kDa의 것에 결합하는 반면, Cry1Ab 단백질은 비-경쟁적 결합 연구에 관련되지 않은 150 kDa의 단일 단백질에 결합한다(Aranda et al., 1996)는 것을 증명하였다.
따라서, 본 발명은 Cry1Ab에 대해 내성이 발생한 사탕수수 명나방 집단에 대한 또는 밤나방 및/또는 사탕수수 명나방에 의한 어느 하나의 단백질에 대한 내성 발생을 경감시키기 위한 IRM 스택으로서 Cry1Ca 및 Cry1Ab의 조합을 또한 포함한다.
본 발명은
Cry1Ca 코어 독소-함유 단백질 및 Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질을 발현하는 세포를 포함하는, 인시류 해충의 방제를 위한 조성물;
Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질 및 Cry1C 코어 독소 함유 단백질 양쪽 모두를 발현하도록 형질전환된 숙주, 여기에서 상기 숙주는 미생물 또는 식물 세포이다 (본 폴리뉴클레오티드(들)는 바람직하게는 비-바실러스-투린기엔시스 프로모터의 제어 하에 있는 (작동적으로 연결되거나/포함하는) 유전자 구조물에 있고, 본 폴리뉴클레오티드는 식물에서 발현 증진을 위해 코돈 사용을 포함할 수 있다);
상기 해충 또는 상기 해충의 환경을 Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질을 생성하는 조성물 및 Cry1C 코어 독소-함유 단백질을 발현하는 세포의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는 인시류 해충의 방제 방법;
Cry1Ca 코어 독소-함유 단백질을 코드화하는 DNA 및 Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질을 코드화하는 DNA를 포함하는 식물 (예컨대 옥수수 식물, 또는 예를 들어 대두 또는 면화 또는 사탕수수); 및 이러한 식물의 종자;
Cry1Ca 코어 독소-함유 단백질을 코드화하는 DNA 및 Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질을 코드화하는 DNA가 상기 옥수수 식물에 유전자이입된 식물(예컨대 옥수수 식물, 또는 예를 들어 대두 또는 면화 또는 사탕수수); 및 이러한 식물의 종자를 제공한다.
본 발명자들은, Cry1Ca(재조합 슈도모나스 플루오레센스 주 MR 1206/DC639; 플라스미드 pMYC2547)가 인공 사료 생물검정법에서 Cry1Ab에 대한 내성으로 선택된 사탕수수 명나방(SCB; 디아트라에아 사카랄리스) 집단을 방제하는데 매우 효과적임을 증명하였다. 이것은, Cry1Ca가 Cry1Ab에 대해 내성이 발생한 SCB 집단을 방제하거나, SCB 집단에서 Cry1Ab 내성의 발생을 경감시키는데 있어서 유용함을 나타낸다.
부분적으로 여기에 설명된 데이터를 기초로 하면, Cry1Ca 및 Cry1Ab의 공동-발현이 SCB를 방제하기 위한 고 용량 IRM 스택을 생성할 수 있다. 스펙트럼을 추가하기 위하여 이러한 조합에 다른 단백질을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 옥수수에서, Cry1Fa를 첨가하면 유럽 옥수수 나무좀(ECB), 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis (Huebner)를 위한 IRM 스택이 만들어지고, SCB를 방제하기 위해서는 다른 MOA를 첨가한다.
식물에서 잠재적인 바이오살충제로서 Cry1C를 검토하기 위하여, 문헌 [Avisar et al., 2009, Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176: 315-324]을 참조한다.
곤충 수용체. 실시예에 기재된 바와 같이, 방사능표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질을 사용한 경쟁적인 수용체 결합 연구는, Cry1Ab 코어 독소 단백질이 Cry1Ca 가 결합하는 FAW 곤충 조직에 존재하는 고 친화성 결합 부위에 대해 경쟁하지 않음을 나타낸다. 이러한 결과는, Cry1Ab 및 Cry1Ca 단백질의 조합이 FAW 집단에서 Cry1Ab에 대한 내성의 발생 (유사하게, Cry1Ca에 대한 내성의 발생)을 경감시키기 위해 효과적인 수단이고, 마찬가지로 양쪽 단백질을 발현하는 옥수수 식물에서 이러한 해충에 대한 내성 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
이러한 데이터는, Cry1Ca가 Cry1Ab에 대해 내성이 발생한 SCB 집단을 방제하는데 효과적임을 제안한다. 하나의 활용 옵션은, Cry1Ab가 내성의 발생으로 인해 SCB를 방제하는데 효과가 없어진 지역에서 Cry 단백질을 사용하는 것이다. 다른 활용 옵션은 Cry1Ab에 대한 SCB의 내성 발생을 경감하기 위하여 Cry1Ab와 조합하여 Cry1Ca를 사용하는 것이다.
인시류 해충을 방제하기 위하여 본 발명에 기재된 독소의 조합을 사용할 수 있다. 성충 인시류, 즉 나비 및 나방은 주로 꽃 화밀을 먹고 산다. 유충, 즉 애벌레는 거의 모두 식물을 먹고, 많은 것들은 심각한 해충이다. 모충은 식물의 잎, 또는 뿌리 또는 줄기를 먹거나 그 안을 먹고, 식물에서 영양소를 빼앗아서 종종 식물의 물리적 지지 구조를 파괴한다. 추가로, 애벌레는 과일, 직물 및 저장 곡류와 밀가루를 먹고, 판매용 제품을 망쳐놓거나 그들의 가치를 심하게 저하시킨다. 여기에서 사용된 인시류 해충이란 언급은 유충 단계를 포함하여 해충의 다양한 생존 단계를 가리킨다.
본 발명의 키메라 독소는 B.t. 독소의 전체 코어 N-말단 독소 부분을 포함하고, 독소 부분의 말단을 지난 일부 지점에서 단백질은 이종 전독소 서열로의 전이를 갖는다. B.t. 독소의 N-말단 독소 부분은 여기에서 "코어" 독소로 언급된다. 이종 전독소 단편으로의 전이는 대략 독소/전독소 결합부에서 발생할 수 있거나, 또는 대안적으로 천연 전독소의 부분 (독소 부분을 지나 연장됨)이 하류에서 발생하는 이종 전독소로의 전이와 함께 유지될 수 있다.
일례로서, 본 발명의 하나의 키메라 독소는 Cry1Ab의 전체 코어 독소 부분(아미노산 1 내지 601) 및 이종 전독소 (아미노산 602 내지 C-말단)를 갖는다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 전독소를 포함하는 키메라 독소의 부분은 Cry1Ab 단백질 독소로부터 유래된다. 두 번째 예로서, SEQ ID NO:1 (DIG-152)에 개시된 본 발명의 두 번째 키메라 독소는 Cry1Ca (아미노산 1 내지 619)의 전체 코어 독소 부분 및 이종 전독소 (아미노산 620 내지 C-말단)을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 전독소를 포함하는 키메라 독소의 부분은 Cry1Ab 단백질 독소로부터 유래된다.
당업자라면, 심지어 Cry1Ca와 같은 특정한 부류 내의 B.t. 독소가 길이 및 독소 부분으로부터 전독소 부분으로의 정확한 전이 위치에 있어서 어느 정도 변한다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, Cry1Ca 독소는 약 1150 내지 약 1200개 아미노산 길이이다. 독소 부분으로부터 전독소 부분으로의 전이는 전형적으로 전체 길이 독소의 약 50% 내지 약 60%에서 일어난다. 본 발명의 키메라 독소는 이러한 코어 N-말단 독소 부분의 전체 연장부를 포함한다. 따라서, 키메라 독소는 적어도 약 50%의 전체 길이 Cry1Ca 또는 Cry1Ab B.t. 독소를 포함할 것이다. 이것은 전형적으로 적어도 약 590개 아미노산일 것이다. 전독소 부분에 관하여, Cry1A(b) 전독소 부분의 전체 연장부는 독소 부분의 말단으로부터 분자의 C-말단까지 뻗어있다. 본 발명의 키메라 독소에 포함되는 것이 가장 중요한 것은 이 부분의 마지막 약 100 내지 150개 아미노산이다.
유전자 및 독소. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소는 개시된 전체 길이 서열 뿐만 아니라 여기에 구체적으로 예시된 독소의 특징적인 살충 활성을 보유한 서열의 단편, 변형체, 돌연변이체 및 융합 단백질을 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 유전자의 "변형체" 또는 "변형"이란 동일한 독소를 코드화하거나 살충 활성을 가진 동등한 독소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열들을 가리킨다. 여기에서 사용된 용어 "동등한 독소"는 여기에 청구된 표적 해충에 대해 동일하거나 필수적으로 동일한 생물학적 활성을 가진 독소를 가리킨다.
여기에서 사용된 바와 같이, 경계는 "바실러스 투린기엔시스 살충 결정 단백질에 대한 개정 명명법" [N.Crickmore, D.R.Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum and D.H.Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813]에 따라 대략 95% (Cry1Ab's 및 1Ca's), 78% (Cry1A's 및 Cry1C's) 및 45% (Cry1's) 서열 동일성을 나타낸다. 이러한 컷오프는 또한 코어 독소 단독 (Cry1Ab 및 Cry1C 독소)에도 적용될 수 있다. 첨부된 부록 A에 기재된 GENBANK 번호는 여기에 개시되거나 언급된 유전자 및 단백질에 대한 서열을 얻기 위해 사용될 수도 있다.
활성 독소를 코드화하는 유전자가 몇 가지 방법을 통해 확인되고 수득될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 여기에 예시된 특정한 유전자 또는 유전자 부분은 상기 기재된 배양물 기탁기관에 기탁된 단리물로부터 수득될 수 있다. 이러한 유전자 또는 그의 일부 또는 변형체는 예를 들어 유전자 합성장치의 사용에 의해 인공적으로 구축될 수도 있다. 유전자의 변형은 점 돌연변이를 만들기 위한 표준 기술을 사용하여 쉽게 구축될 수도 있다. 또한, 이러한 유전자의 단편은 표준 절차에 따라서 통상적으로 입수가능한 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 컷 오프하기 위하여 Bal31과 같은 효소 또는 부위-지정 돌연변이유발이 사용될 수 있다. 또한, 다양한 제한 효소를 사용하여 활성 단편을 코드화하는 유전자가 수득될 수 있다. 이러한 독소의 활성 단편을 직접적으로 수득하기 위하여 프로테아제가 사용될 수도 있다.
예시된 독소의 살충 활성을 보유하는 단편 및 동등물이 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 유전자 코드의 중복 때문에, 다양한 다른 DNA 서열들이 여기에 개시된 아미노산 서열을 코드화할 수 있다. 동일하거나 본질적으로 동일한 독소를 코드화하는 대안적인 DNA 서열을 만드는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 이러한 변형 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 동일한" 서열이라는 언급은 살충 활성에 현저하게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 삽입을 가진 서열을 가리킨다. 살충 활성을 보유한 단편이 이 정의에 또한 포함된다.
본 발명에 따라 유용한 유전자-코드화 독소 및 유전자 부분을 확인하기 위한 추가의 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이다. 이러한 프로브는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 이러한 서열은 적절한 표지에 의해 검출될 수 있거나, 또는 국제 출원 번호 WO 93/16094에 기재된 바와 같이 고유하게 형광성으로 만들어질 수 있다. 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 2개의 분자 간의 강한 결합을 형성함으로써 프로브 분자와 핵산 샘플이 혼성화한다면, 프로브와 샘플이 실질적인 상동성을 가진 것으로 타당하게 추측될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp.169-170]에 기재된 바와 같이, 당 분야에 공지된 기술에 의하여 엄격한 조건 하에 혼성화가 수행된다. 염 농도 및 온도 조합의 일부 예는 다음과 같다 (증가하는 엄격성의 순서로): 실온에서 2X SSPE 또는 SSC; 42 ℃에서 1X SSPE 또는 SSC; 42 ℃에서 0.1X SSPE 또는 SSC; 65 ℃에서 0.1X SSPE 또는 SSC. 프로브의 검출은 혼성화가 발생했는지의 여부를 공지된 방식으로 결정하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코드화 유전자를 확인하기 위해 빠른 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드 단편은 DNA 합성장치 및 표준 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 유전자를 증폭하기 위한 PCR 프라이머로서 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 특정한 독소가 본 명세서에서 구체적으로 예시되어 있다. 이러한 독소는 단순히 본 발명의 독소의 일례이기 때문에, 본 발명은 예시된 독소의 동일하거나 유사한 살충 활성을 가진 변형체 또는 동등한 독소 (및 동등한 독소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다는 것은 명확할 것이다. 동등한 독소는 예시된 독소와의 아미노산 상동성을 가질 것이다. 이 아미노산 상동성은 전형적으로 75% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과일 것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성의 원인이 되거나 궁극적으로 생물학적 활성의 책임이 있는 3-차원 배열의 결정에 관여하는 독소의 중요한 영역에서 가장 높다. 이러한 측면에서, 활성에 중요하지 않거나 분자의 3-차원 배열에 영향을 미치지 않는 보존 아미노산 치환인 영역에서 치환이 일어난다면 특정한 아미노산 치환이 허용될 수 있고 예측될 수 있다. 예를 들어, 아미노 산이 하기 부류로 분류될 수 있다: 비-극성, 비하전 극성, 염기성 및 산성. 치환이 화합물의 생물학적 활성을 현저히 변화시키지 않는 이상, 하나의 부류의 아미노산이 동일한 유형의 다른 아미노산으로 대체되는 보존 치환이 본 발명의 범위에 속한다. 표 1은 이러한 부류에 속하는 아미노산의 일례를 제공한다.
Figure pct00001
일부 경우에, 비-보존성 치환이 또한 행해질 수 있다. 주요 요인은, 이러한 치환이 독소의 생물학적 활성을 유의하게 손상시키지 않아야 한다는 것이다.
재조합체 숙주. 본 발명의 독소를 코드화하는 유전자를 다양한 종류의 미생물 또는 식물 숙주에 도입할 수 있다. 독소 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 살충제의 세포내 생성 및 유지를 가져온다. 본 발명의 양쪽 독소를 발현하는 B.t. 주를 만들기 위해 접합 전달 및 재조합체 전달이 사용될 수 있다. 다른 숙주 유기체를 독소 유전자의 하나 또는 둘 다로 형질전환한 다음 상승 효과를 달성하기 위해 사용할 수도 있다. 적절한 미생물 숙주, 예를 들어 슈도모나스를 사용하여 미생물을 해충의 위치에 적용할 수 있고, 이곳에서 미생물이 증식하고 섭취될 수 있다. 그 결과 해충이 방제된다. 대안적으로, 독소 유전자의 숙주인 미생물을 독소의 활성을 연장하고 세포를 안정화하는 조건 하에서 처리할 수 있다. 독소 활성을 보유한 처리된 세포를 표적 해충의 환경에 적용할 수 있다.
적절한 벡터에 의해 B.t. 독소 유전자를 미생물 숙주 내로 도입하고 상기 숙주가 살아있는 상태로 환경에 적용되는 경우에, 특정한 숙주 미생물이 사용되는 것이 필수적이다. 주된 하나 이상의 작물의 "식물권" (엽면, 엽권, 근권 및/또는 근면)을 차지하는 것으로 알려진 미생물 숙주가 선택된다. 이러한 미생물들은 특정한 환경 (작물 및 기타 곤충 서식지)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있도록 선택되고, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지 및 발현을 제공하고, 바람직하게는 환경적 퇴화 및 불활성화로부터 살충제의 개선된 보호를 제공한다.
다수의 미생물은 다양한 종류의 중요한 작물의 엽면 (식물 잎의 표면) 및/또는 근권 (식물 뿌리 주위의 토양)에 서식하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미생물은 세균, 조류 및 진균류를 포함한다. 특히 관심있는 것은 세균, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas), 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 크렙시엘라(Klebsiella), 크산토모나스(Xanthomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 리조븀(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸로필리우스(Methylophilius), 아그로박테눔(Agrobactenum), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실러스(Lactobacillus), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc) 및 알칼리게네스(Alcaligenes) 속; 진균류, 특히 효모, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula) 및 아우레오바시듐(Aureobasidium) 속과 같은 미생물이다. 특히 관심있는 것은 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 아세토박터 자일리늄(Acetobacter xylinum), 아그로박테늄 투메파시엔스(Agrobactenium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 리조븀 멜리오티(Rhizobium melioti), 알칼리게네스 엔트로푸스(Alcaligenes entrophus) 및 아조토박터 빈란디이(Azotobacter vinlandii)와 같은 식물권 세균 종; 및 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), R.글루티니스(glutinis), R.마리나(marina), R.아우란티아카(aurantiaca), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), C.디플루엔스(diffluens), C.라우렌티이(laurentii), 사카로마이세스 로세이(Saccharomyces rosei), S.프레토리엔시스(pretoriensis), S.세레비지애(cerevisiae), 스포로볼로마이세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), S.오도루스(odorus), 클루이베로마이세스 베로나에(Kluyveromyces veronae) 및 아우레오바시듐 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 식물권 효모 종이다. 특히 관심있는 것은 색소를 함유하는 미생물이다.
유전자의 안정한 유지 및 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 미생물 숙주 내로 독소를 코드화하는 B.t. 유전자를 도입하기 위하여 다양한 종류의 방식이 이용될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 5,135,867 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
세포의 처리. 독소 활성을 연장시키고 세포를 안정화하기 위하여 바실러스 투린기엔시스 또는 B.t. 독소를 발현하는 재조합 세포를 처리할 수 있다. 형성된 살충제 미소캡슐은 안정화된 세포 구조 내에 B.t. 독소 또는 독소들을 포함하고, 표적 해충의 환경에 미소캡슐이 적용될 때 독소를 보호할 것이다. 적절한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함할 수도 있고, 보통 고등 유기체, 예컨대 포유동물에 독성인 물질을 생성하지 않는 세포에 제한된다. 그러나, 고등 유기체에 독성인 물질을 생성하는 유기체가 사용될 수 있고, 여기에서 독성 물질은 불안정하거나 포유동물 숙주에 독성 가능성을 피하기 위해 적용 수준이 충분히 낮다. 숙주로서, 특히 관심있는 것은 원핵세포 및 하급 진핵세포, 예컨대 진균류이다.
세포는 보통 원상태(intact)이고, 일부 경우에 포자가 사용될 수도 있긴 하지만 포자 형태보다는 오히려 처리될 때 실질적으로 증식 형태로 존재한다.
처리 기술이 독소의 성질에 해로운 영향을 미치지 않고 독소를 보호하는 세포의 능력을 감소시키지 않는 이상, 미생물 세포, 예를 들어 B.t. 독소 유전자 또는 유전자들을 함유하는 미생물의 처리는 화학적 또는 물리적 수단에 의해, 또는 화학적 및/또는 물리적 수단의 조합에 의해 일어날 수 있다. 화학적 시약의 예는 할로겐화 시약, 특히 원자 번호 17-80의 할로겐이다. 더욱 특별하게는, 원하는 결과를 달성하기 위하여 온화한 조건 하에서 충분한 시간 동안 요오드를 사용할 수 있다. 다른 적절한 기술은 알데히드, 예컨대 글루타르알데히드; 항-감염제, 예컨대 제피란 클로라이드 및 세틸피리디늄 클로라이드; 알콜, 예컨대 이소프로필 및 에탄올; 다양한 조직학적 고정제, 예컨대 루골(Lugol) 요오드, 보인(Bouin's) 고정제, 다양한 산 및 헬리(Helly's) 고정제로의 처리 (참조: [Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H.Freeman and Company, 1967]); 또는 세포가 숙주 환경에 투여될 때 세포에서 생성된 독소의 활성을 보존하고 연장하는 물리적 (열) 및 화학적 시약의 조합을 포함한다. 물리적 수단의 예는 감마-복사선 및 X-복사선과 같은 단 파장 복사선, 냉동, UV 조사, 동결건조 등이다. 미생물 세포의 처리 방법이 미국 특허 4,695,455 및 4,695,462 (참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
세포는 일반적으로 환경 조건에 대한 내성을 증진시키는 향상된 구조적 안정성을 가질 것이다. 살충제가 전구형태인 경우에, 전구형태가 표적 해충 병원체에 의해 살충제의 성숙한 형태로 프로세싱되는 것을 억제하지 않도록 세포 처리 방법을 선택해야 한다. 예를 들어, 포름알데히드는 단백질들을 가교시키고 폴리펩티드 살충제의 전구형태의 처리를 억제할 수 있다. 처리 방법은 독소의 생체-이용가능성 또는 생활성의 적어도 실질적인 정도를 보유해야 한다.
생성의 목적을 위해 숙주 세포를 선택하는데 있어서 특히 중요한 특징은 B.t. 유전자 또는 유전자들을 숙주 내로 도입하는 용이성, 발현 체계의 이용가능성, 발현 효율, 숙주에서 살충제의 안정성, 및 보조 유전 능력의 존재를 포함한다. 살충제 미소캡슐로서 사용하기 위해 중요한 특징은 살충제를 위한 보호 품질, 예컨대 두꺼운 셀 벽, 색소침착 및 내포체의 세포내 패키징 또는 형성; 수성 환경에서의 생존; 포유동물 독성의 결여; 수집을 위해 해충에 대한 유인성; 독소에 대한 손상 없이 사멸 및 고정의 용이성 등을 포함한다. 다른 고려사항은 제형 용이성 및 취급, 경제, 저장 안정성 등을 포함한다.
세포의 성장. B.t. 살충 유전자 또는 유전자들을 함유하는 세포 숙주를 편리한 영양소 배지에서 성장시킬 수 있고, 이 곳에서 DNA 구축물이 선택적인 장점을 제공하고, 세포의 실질적으로 전부 또는 전부가 B.t. 유전자를 보유하도록 선택 배지를 제공한다. 이어서 이러한 세포를 통상적인 방식에 따라 수집할 수 있다. 대안적으로, 수집에 앞서서 세포를 처리할 수 있다.
표준 기술 배지 및 발효 기술을 사용하여 본 발명의 독소를 생성하는 B.t. 세포를 배양할 수 있다. 발효 주기의 완결 시에, 먼저 발효 브로쓰로부터 당업자에게 공지된 방법에 의하여 B.t. 포자 및 결정을 분리함으로써 세균을 수확할 수 있다. 특정한 표적 해충을 위한 취급 및 적용을 수월하게 하기 위하여 회수된 B.t. 포자 및 결정을 계면활성제, 분산제, 불활성 담체 및 기타 성분의 첨가에 의하여 습윤가능한 분말, 액체 농축물, 과립 또는 기타 제제로 제형할 수 있다. 이러한 제형 및 적용 절차는 당 기술분야에 공지되어 있다.
제형. 유인제와, B.t. 단리물의 포자, 결정 및 독소, 또는 여기에 개시된 B.t. 단리물로부터 수득가능한 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 함유하는 제형된 미끼 과립을 토양에 적용할 수 있다. 또한, 작물 주기의 마지막 단계에서, 제형된 생성물을 종자-코팅 또는 뿌리 처리 또는 전체 식물 처리로서 적용할 수 있다. 다양한 불활성 물질, 예컨대 무기 미네랄 (필로실리케이트, 카르보네이트, 설페이트, 포스페이트 등) 또는 식물 물질 (분말화된 옥수수속대, 쌀겨, 월넛 껍질 등)과 혼합함으로써, B.t. 세포의 식물 및 토양 처리를 습윤가능한 분말, 과립 또는 가루로서 사용할 수도 있다. 제형은 전개제-고정제 아주반트, 안정화제, 기타 살충 첨가제 또는 계면활성제를 포함할 수도 있다. 액체 제형은 수성 또는 비-수성일 수도 있고, 거품, 겔, 현탁액, 유화가능한 농축액 등으로 사용될 수도 있다. 성분은 유동화제, 계면활성제, 유화제, 분산제 또는 중합체를 포함할 수도 있다.
당업자라면 이해할 수 있듯이, 살충제 농도는 특정한 제형의 성질에 의존하여, 특히 이것이 농축물인지 또는 직접 사용되는지의 여부에 따라서 다양할 것이다. 살충제는 적어도 1 중량%로 존재하고 100 중량%일 수도 있다. 액체 제형은 일반적으로 액체 상에 약 1 내지 60 중량%의 고체를 갖는 반면, 건조 제형은 약 1 내지 95 중량%의 살충제를 가질 것이다. 제형은 일반적으로 약 102 내지 약 104 세포/mg을 가질 것이다. 제형은 헥타르당 약 50 mg (액체 또는 건조) 내지 1 kg 이상으로 투여될 것이다.
제형은 분무, 살포, 살수 등에 의하여 인시류 해충의 환경, 예를 들어, 잎 또는 토양에 적용될 수 있다.
식물 형질전환. 본 발명의 살충 단백질의 생성을 위해 바람직한 재조합 숙주는 형질전환된 식물이다. 여기에 개시된 Bt 독소 단백질을 코드화하는 유전자는 당 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 식물 세포에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아 콜리에서의 복제 체계 및 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하는 다수의 클론화 벡터가 고등 식물로의 외래 유전자 삽입을 위한 제조에 이용될 수 있다. 벡터는 특히 예를 들어 pBR322, pUC 계열, M13mp 계열, pACYC184를 포함한다. 따라서, Bt 독소 단백질을 코드화하는 서열을 가진 DNA 단편을 적절한 제한효소 부위에서 벡터 내에 삽입할 수 있다. 얻어진 플라스미드를 이.콜리 내로의 형질전환을 위해 사용한다. 이.콜리 세포를 적절한 영양 배지에서 배양하고 수확하고 세포용해시킨다. 플라스미드를 회수한다. 일반적으로 서열 분석, 제한효소 분석, 전기영동 및 기타 생화학적-분자 생물학적 방법을 분석 방법으로서 수행한다. 각각의 조작 후에, 사용된 DNA 서열을 절단하고 이후의 DNA 서열에 연결시킬 수 있다. 각각의 플라스미드 서열을 동일하거나 다른 플라스미드에 클론화할 수 있다. 식물 내로 원하는 유전자를 삽입하는 방법에 의존하여, 다른 DNA 서열이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 식물 세포의 형질전환을 위해 Ti 또는 Ri 플라스미드가 사용된다면, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 경계, 종종 오른쪽 및 왼쪽 경계가 삽입되어지는 유전자의 인접 영역으로서 연결되어야 한다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용이 집중적으로 연구되었으며 EP 120 516, 문헌 [Lee and Gelvin (2008)], [Hoekema (1985)], [Fraley et al. (1986)] 및 [An et al. (1985)]에 충분히 기재되어 있고 당 기술분야에 공지되어 있다.
일단 삽입된 DNA가 식물 게놈에 통합되면, 비교적 안정하다. 형질전환 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 살생물제 또는 항생물질, 예컨대 특히 비알라포스(Bialaphos), 카나마이신, G418, 블레오마이신 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 선별가능한 마커를 함유한다. 따라서, 개별적으로 사용된 마커는 삽입된 DNA를 함유하지 않는 세포에 비하여 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 한다.
식물 숙주 세포 내에 DNA를 삽입하기 위해 다수의 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 형질전환 유발 인자로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용한 T-DNA로의 형질전환, 융합, 주입, 입자사출(biolistics) (미세입자 충돌) 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다. 아그로박테리아가 형질전환을 위해 사용된다면 삽입되어지는 DNA가 특별한 플라스미드 내에, 즉 중간체 벡터 또는 바이너리(binary) 벡터 내에 클론화되어야 한다. T-DNA에 있는 서열에 상동성인 서열에 기인하여 동종 재조합에 의하여 중간체 벡터를 Ti 또는 Ri 플라스미드 내에 통합할 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달을 위해 필요한 vir 영역을 포함한다. 중간체 벡터는 아그로박테리아에서 스스로 복제할 수 없다. 헬퍼 플라스미드에 의하여 중간체 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 전달할 수 있다(접합). 이.콜리 및 아그로박테리아 양쪽 모두에서 바이너리 벡터가 스스로 복제할 수 있다. 이들은 오른쪽 및 왼쪽 T-DNA 경계 영역에 의해 둘러싸인 링커 또는 폴리링커 및 선별 마커 유전자를 포함한다. 이들은 아그로박테리아 내로 직접적으로 형질전환될 수 있다 (Holsters et al., 1978). 숙주 세포로서 사용된 아그로박테리움은 vir 영역을 보유한 플라스미드를 포함한다. vir 영역은 식물 세포 내로 T-DNA의 전달을 위해 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수도 있다. 이렇게 형질전환된 세균은 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다. 유리하게는, 식물 외식체를 식물 세포 내로 DNA의 전달을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스와 함께 재배할 수 있다. 선택을 위해 항생물질 또는 살생물제를 함유할 수도 있는 적절한 배지에서 감염된 식물 물질 (예를 들어, 잎 조각, 줄기 단편, 뿌리 뿐만 아니라 원형질체 또는 현탁-배양된 세포)로부터 전체 식물을 재생할 수 있다. 이렇게 수득된 식물을 삽입된 DNA의 존재에 대해 시험할 수 있다. 주입 및 일렉트로포레이션의 경우에 플라스미드에 특별한 요구사항이 없다. 예를 들어 pUC 유도체와 같은 통상적인 플라스미드를 사용할 수 있다.
형질전환된 세포는 통상적인 방법으로 식물 내에서 성장한다. 이들은 생식 세포를 형성할 수 있고 형질전환된 특성을 자손 식물로 전달할 수 있다. 이러한 식물은 통상적인 방식으로 생육될 수 있고, 동일한 형질전환된 유전 인자 또는 기타 유전 인자를 가진 식물과 교배된다. 얻어진 혼성 개체는 상응하는 표현형 성질을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 코돈 이용이 식물을 위해 최적화된 유전자로 식물을 형질전환한다. 예를 들어, 미국 특허 5380831 참조 (여기에서 참고문헌으로 포함됨). 일부 끝이 절단된 독소(truncated toxin)가 예시되어 있으나, 130 kDa-유형 (전체 길이) 독소가 코어 독소인 N-말단 절반 및 전독소 "꼬리"인 C-말단 절반을 갖는 것이 Bt 기술에 공지되어 있다. 따라서, 적절한 "꼬리"는 본 발명의 끝이 절단된 독소/코어 독소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 6218188 및 미국 특허 6673990 참조. 추가로, 식물에서 사용하기 위한 합성 Bt 유전자를 생성하는 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다 (Stewart and Burgin, 2007). 바람직한 형질전환된 식물의 하나의 비-제한적인 예는 Cry1Fa 단백질을 코드화하는 식물 발현가능한 유전자를 포함하고, Cry1Ca 단백질을 코드화하는 두 번째 식물 발현가능한 유전자를 더 포함하는 비옥한 옥수수 식물이다.
동종번식 옥수수 주 내에 Cry1Ab 및 Cry1C 특성(들)을 전달 (또는 유전자이입)하는 것은, 반복적인 선택 육종에 의해, 예를 들어 여교잡에 의해 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 바람직한 반복 친(recurrent parent)을 먼저 Cry1Ab 및 Cry1C 특성을 위해 적절한 유전자(들)를 보유하는 동종번식된 공여체 (비-반복 친)에 교배한다. 이러한 교배의 자손을 반복 친에 다시 교배시키고, 이어서 얻어진 자손에서 비-반복 친으로부터 전달되어지는 바람직한 특성(들)에 대하여 선택한다. 바람직한 특성(들)에 대한 선택을 가진 반복 친과의 3회, 바람직하게는 4회, 더욱 바람직하게는 5회 이상의 세대의 여교잡 후에, 자손은 전달되는 특성(들)을 조절하는 위치에 대해 이형접합성이지만, 대부분 또는 거의 모든 다른 유전자에 대해서도 유사하게 반복 친이 될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175]; [Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol.1 :Theory and Technique, 360-376] 참조).
곤충 내성 관리( IRM ) 전략. 예를 들어 Roush 등은 살충 유전자이식 작물의 관리를 위하여 "피라미드화" 또는 "스택킹"이라 불리우는 2-독소 전략의 개요를 나타낸다. 문헌 [The Royal Society, Phil.Trans.R.Soc. Lond.B. (1998) 353, 1777-1786] 참조. 이들의 웹 사이트에서, 미국 환경 보호국 (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)은, 표적 해충에 대해 활성인 하나의 Bt 단백질을 생성하는 유전자이식 작물과 함께 사용하기 위해 비-유전자이식 (즉, 비-B.t.) 피난처 (비-Bt 작물/옥수수의 블록)를 제공하기 위한 하기 요건을 공지하고 있다.
옥수수 나무좀-보호된 Bt (Cry1Ab 또는 Cry1F) 옥수수 생성물에 대한 특정한 구조적 요건은 다음과 같다:
구조적 피난처:
옥수수 지대에서 20% 비-인시류 Bt 옥수수 피난처
면화 지대에서 50% 비-인시류 Bt 면화 피난처
블록(Blocks):
1. 내부 (즉, Bt 지역 내)
2. 외부 (즉, 무작위 교배를 최대화하기 위해 Bt 지역의 1/2 마일 (가능하다면 1/4 마일) 이내의 별도 지역)
지역 내 긴 땅(In-field Strips):
긴 땅은 유충 이동 효과를 감소시키기 위해 적어도 4개 줄 폭 (바람직하게는 6개 줄)이어야 한다.
국립 옥수수 재배 협회는, 그들의 웹사이트 (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)에서, 요건에 관해 유사한 지침을 제공한다. 예를 들어:
옥수수 나무좀 IRM의 요건:
● 옥수수 에이커의 적어도 20%를 피난처 하이브리드에 배치한다.
● 면화 생산 영역에서 피난처는 50%이어야 한다.
● 피난처 하이브리드의 1/2 마일 이내에 심어야 한다.
● 피난처는 Bt 영역 내에 긴 땅으로 배치될 수 있다; 피난처 긴 땅은 적어도 4개 줄 폭이어야 한다.
● 표적 곤충에 대해 경제적 역치에 이르를 때에만 통상적인 살충제로 피난처를 처리할 수 있다.
● 피난처 옥수수에는 Bt-기반의 분무가능한 살충제를 사용할 수 없다.
● Bt 옥수수를 가진 모든 농장에서 적절한 피난처가 배치되어야 한다.
문헌 [Roush et al., 예를 들어 1780 및 1784 면 우측 컬럼]에 언급된 바와 같이, 표적 해충에 대해 효과적이고 교차-내성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 2개의 상이한 단백질의 스택킹 또는 피라미드화는 더욱 작은 피난처를 사용할 수 있게 한다. Roush는, 성공적인 스택킹 시에, 10% 피난처 미만의 피난처 면적이, 단일 (비-피라미드화) 특성에서의 약 50% 피난처에 필적하는 내성 관리를 제공할 수 있음을 제시한다. 통상적으로 이용가능한 피라미드화 Bt 옥수수 생성물의 경우, 미국 환경 보호 협회는 단일 특성 생성물 (일반적으로 20%)에 대해서 보다 비-Bt 옥수수의 훨씬 낮은 (일반적으로 5%) 구조적 피난처를 요구한다.
이중 또는 삼중 적층 또는 피라미드에 대하여 상기 퍼센트 (예컨대 1F/1Ab에 대한 것)의 어느 것 또는 유사한 피난처 비율이 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따라 피난처와 함께 (또는 없이) 배치되고 식물과 함께 심어진 통상적인 에이커 수 - 예를 들어 10 에이커 초과 -를 포함한다.
Roush에 의해, 그리고 예를 들어 미국 특허 6,551,962에 더욱 언급된 바와 같이, 지역에 다양한 기하학적 배치 패턴 (상기 언급됨)을 포함한 피난처를 주머니-안 종자 혼합물에 제공하는 다양한 방법이 존재한다.
모든 특허, 특허 출원, 임시 출원 및 본 명세서에 참조되거나 인용된 문헌들은, 이들이 본 명세서의 명백한 교시내용과 불일치하지 않는 정도까지 그 전체내용이 참고문헌으로 포함된다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 단수 표현은 "하나 이상"을 나타낸다.
<실시예>
하기 실시예는 본 발명을 예증한다. 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
Cry1 코어 독소 및 이종 전독소를 포함하는 키메라 독소의 설계, 및 슈도모나스 플루오레센스에서 생성된 DIG -152 단백질의 살충 활성
키메라 독소. 다른 Cry 독소의 전독소 단편에 융합된 하나의 Cry 독소의 코어 독소 도메인을 사용하는 키메라 단백질은 예를 들어 미국 특허 5593881 및 미국 특허 5932209에 보고되었다.
본 발명의 Cry1Ca 키메라 단백질 변형체는, 코어 독소 단편의 말단을 지난 일부 지점에서 이종 델타 내독소 전독소 단편에 융합된 Cry1Ca3 살충 독소로부터 유래되는 N-말단 코어 독소 단편을 포함한 키메라 독소를 포함한다. 대략 천연 코어 독소/전독소 접합부에서 코어 독소로부터 이종 전독소 단편으로의 전이가 일어날 수 있고, 하류에서 일어나는 이종 전독소로의 전이와 함께 천연 전독소의 ora 부위 (코어 독소 단편을 지나 뻗어있음)가 유지될 수 있다. 변형체 형태에서, 코어 독소 및 전독소 단편은 실제로 이들이 유래된 천연 독소의 아미노산 서열을 포함할 수도 있거나, 또는 서로 융합될 때 단편의 생물학적 기능을 감소시키지 않고 증가시킬 수도 있는 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 키메라 독소는 Cry1Ca3으로부터 유래된 코어 독소 단편 및 이종 전독소를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Cry1Ca3 (619 아미노산)으로부터 유래된 코어 독소 단편을 Cry1Ab 델타-내독소 (545 아미노산)으로부터 유래된 전독소 단편을 포함하는 이종 단편에 융합시킨다. 여기에서 DIG-152로 언급된 키메라 단백질의 1164 아미노산 서열을 SEQ ID NO:1으로 나타낸다. Cry1Ca3 코어 독소 변형체 및 Cry1Ab로부터 유래된 전독소를 포함하는 다른 키메라 융합이 본 발명의 범위 내인 것으로 이해된다.
DIG-152 단백질의 인시류 살충 활성은 사료 혼입 절차를 사용한 투여량-반응 실험에서 사탕수수 명나방(SCB; 디아트라에아 사카랄리스)의 신생 유충 및 Cry1Ab-내성 SCB (rSCB)에서 입증되었다. DIG-152 내포체를 7.5 mL의 100 mM CAPS pH 11, 1mM EDTA 중에 4 ℃에서 4시간 동안 서서히 진탕시킴으로써 용해시키고, 여기에 200 ㎕의 세균 프로테아제 억제제 (시그마 P4865; 공급업자 지시에 따라 제조됨)를 첨가하였다. 불용성 물질을 펠릿화하기 위한 원심분리 후에, 원액 단백질 농도를 100 mM CAPS, pH 11에서 4.0 mg/mL로 조절하였다. 곤충 생물검정을 위하여, 128-세포 트레이 (Bio-Ba-128, C-D 인터내셔날)의 개별 세포 내에 약 0.7 ml의 사료를 분배하기 직전에, 적절한 부피를 반합성 사료 (Bio-Serv, 미국 뉴저지주 프렌치타운)와 혼합함으로써 0.030 ㎍ 내지 102 ㎍/gm 사료의 DIG-152 단백질 농도를 제조하였다.
트립신-활성화 Cry1Ab 단백질 (살충 활성을 위한 포지티브 대조로서 사용됨)을 0.03125 ㎍ 내지 32 ㎍/gm 사료의 범위에서 시험하였다 (사료 제조 전에 동결건조된 분말을 적절한 양의 증류수와 혼합함으로써 제조됨).
증류수와 함께 제조된 사료 (블랭크 대조, Cry1Ab 시험을 위함) 또는 완충제 단독 (100 mM CAPS pH 11, DIG-152 시험을 위함)을 대조 처리로서 사용하였다. 각각의 셀에서 사료 표면 위에 D.사카랄리스의 하나의 신생 유충 (부화 후 24 시간 미만)을 방출하였다. 유충 접종 후에, 셀을 구멍을 가진 뚜껑으로 덮고 (C-D 인터내셔날), 생물검정 트레이를 28 ℃, 50% RH 및 16 시간:8시간 (광:암) 광주기로 유지시킨 환경 챔버에 놓았다. 유충 치사율, 유충 중량, 및 중량 증가를 나타내지 않은 (유충 당 0.1 mg 미만) 생존 유충의 수를 접종 후 7일 째에 기록하였다. 각각의 복제물에서 16 내지 32개 유충과 함께, 곤충 주/Cry 단백질 농도의 각각의 조합을 4회 반복하였다.
유충 치사율 기준을 "실질적" 치사율로 측정하였으며, 죽은 (병에 의해) 유충과 체중의 의미있는 증가를 나타내지 않는 (즉, 유충 당 0.1 mg 미만) 생존 (발육 저해, 비-먹이섭취) 유충 양쪽 모두가 고려되었다. 처리에서 유충의 실질적 치사율을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
실질적 치사율(%) = [TDS/TNIT] × 100
식에서, TDS는 죽은 유충의 수 + 발육 저해 유충의 수의 총 수이고,
TNIT는 처리에서 곤충의 총 수이다.
각각의 D.사카랄리스의 "실질적" 치사율 (이하, 치사율로 약기함)을, Cry1Ab 처리 후의 결과를 분석하기 위해 물 블랭크 대조 사료에서, 또는 DIG-152 처리를 위해 완충액 단독-처리 사료에서 측정된 유충 치사율에 대해 보정하였다.
GI50 값 [즉, 유충 성장 억제율(% GI) 값이 50인 사료에서 B.t. 단백질의 농도]을 설정하기 위하여 투여량 반응 실험 결과를 더욱 분석하였다. Cry1Ab-단백질을 함유하는 사료에서 유충의 % GI 값을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
% GI = [TWC-TWT]/TWC × 100
상기 식에서,
TWC는 물 대조 사료를 먹은 유충의 총 체중이고,
TWT는 Cry1Ab 처리된 사료를 먹은 유충의 총 체중이다.
반면, DIG-152 단백질 섭취 결과로서 유충 % GI를 분석하기 위하여 하기 식을 사용하여 계산하였다.
% GI = [TWB-TWT]/TWB × 100
상기 식에서,
TWB는 완충액- 단독 대조 처리된 사료를 먹은 유충의 총 체중이고,
TWT는 DIG-152 처리된 사료를 먹은 유충의 총 체중이다.
의미있는 체중 증가(유충 당 0.1 mg 미만)를 가진 유충이 존재하지 않는다면 100%의 유충 성장 억제를 복제물에 지정하였다. 곤충 주 및 Cry 단백질 농도를 2개 주요 인자로써 이원분산분석(two-way ANOVA)을 사용하여 성장 억제 데이터를 분석하였다. α=0.05 수준에서 처리 차이를 결정하기 위하여 LSMEANS 시험을 사용하였다.
디아트라에아 사카랄리스 유충에 대한 사료-혼입 생물검정 결과를 표 2에 나타낸다.
데이터 분석. 50% 치사율 (LC50) 값을 유발하는 처리 단백질 농도 및 상응하는 95% 신뢰도 구간(CI)를 결정하기 위하여 보정된 투여량/치사율 데이터를 프로빗 분석(probit analysis) 처리하였다. 프로빗 분석에서 사용된 처리는 제로 치사율을 가져오는 최고 농도, 100% 치사율을 가져오는 최저 농도, 및 이러한 극한 사이의 모든 결과를 포함하였다. rSCB 주의 LC50 값을 SCB 곤충의 값으로 나눔으로써 내성 비율을 계산하였다. α=0.05 수준에서 내성 비율이 의미있는지의 여부를 결정하기 위하여 치사율 투여량 비율 시험을 사용하였다. 치사율 데이터를 분석하기 위하여 이원분산분석을 사용한 다음, 처리 차이를 결정하기 위하여 α=0.05 수준에서 LSMEANS 시험을 수행하였다. 분석 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
동일한 생물학적 반응을 제공하는 활성화된 Cry1Ab 단백질과 유사한 수준으로 DIG-152 단백질의 섭취 후에, 신생 사탕수수 명나방 (디아트라에아 사카랄리스) 유충의 성장이 억제되거나 유충이 사멸되는 것이 본 발명의 DIG-152 단백질의 특징이다. Cry1Ab 단백질의 독성 효과에 대해 내성인 디아트라에아 사카랄리스가 그럼에도 불구하고 DIG-152 단백질의 독성 작용에 대해 감수성인 것이 DIG-152 단백질의 추가의 특징이다.
실시예 2
키메라 단백질을 코드화하는 발현 플라스미드의 구축 및 슈도모나스에서의 발현
전체-길이 DIG-152 키메라 단백질을 생성하기 위해 조작된 슈도모나스 플루오레센스(Pf) 발현 구축물 pMYC2547의 구축에서 표준 클론화 방법 [예를 들어, Sambrook et al. (1989) 및 Ausubel et al. (1995) 및 그의 최신정보]을 사용하였다. 미국 특허 5169760에 개시된 것과 같이 변형된 lac 오페론이 삽입된 슈도모나스 플루오레센스 주 MB214 (주 MB 101의 유도체; P.플루오레센스 비오바르 I)에서 단백질 생성을 수행하였다. 기본 클론화 전략은 DIG-152를 코드화하는 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 서브클론화하는 것을 수반하고, 이에 의해 플라스미드 pKK223-3 (PL 파르마시아, 미국 위스콘신주 밀워키)로부터의 Ptac 프로모터 및 rrnBT1T2 터미네이터의 발현 조절 하에 두었다. 하나의 플라스미드는 pMYC2547로 명명되고, 이러한 플라스미드를 가진 MB214 단리물은 Dpf108로 명명되었다.
진탕 플라스크에서의 성장 및 발현 분석. 진탕 플라스크에서 생육된 P.플루오레센스 주 Dpf108에 의하여 특징결정 및 곤충 생물검정을 위한 DIG-152 단백질의 생성을 수행하였다. 미국 특허 5527883에 기재된 것과 같이 Ptac 프로모터에 의해 유도된 DIG-152 단백질 생성을 수행하였다. 미생물 조작의 세부사항을 문헌 [Squires et al. (2004)], 미국 특허출원 20060008877, 미국 특허출원 20080193974 및 미국 특허출원 20080058262 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에서 입수할 수 있다. 진탕과 함께 30 ℃에서 24시간의 초기 배양 후에, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 첨가에 의하여 발현을 유도하였다. 유도 시간에 그리고 유도후 다양한 시점에서 배양액의 샘플을 취하였다. 600 nm (OD600)에서 광학 밀도에 의해 세포 밀도를 측정하였다.
진탕 플라스크 샘플의 세포 분별 및 SDS - PAGE 분석. 각각의 샘플채집 시간에, 샘플의 세포 밀도를 OD600=20으로 조절하고, 1mL 분취액을 5분 동안 14000 × g에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 -80 ℃에서 동결하였다. 이지라이스(EasyLyse)TM 세균 단백질 추출 용액(EPICENTRE?, 바이오테크놀로지스, 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 동결된 진탕 플라스크 세포 펠릿 샘플로부터의 가용성 및 불용성 분획을 얻었다. 각각의 세포 펠릿을 1mL 이지라이스TM 용액에 재현탁하고, 세포용해 완충액에서 추가로 1:4로 희석하고 실온에서 30분 동안 진탕하면서 배양하였다. 세포용해물을 4 ℃에서 14,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 가용성 분획으로서 회수하였다. 이어서, 펠릿 (불용성 분획)을 동일한 부피의 포스페이트 완충 염수 (PBS; 11.9 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 재현탁하였다.
샘플을 β-머캡토에탄올(Sambrook et al., 상동)을 함유하는 2X 래밀리(Laemmli) 샘플 완충액과 1:1 혼합하고, 크리테리온(Criterion) XT Bis-Tris 12% 겔(바이오-래드 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 헤르큘스)에 로딩하기 전에 5분 동안 비등시켰다. 추천된 XT MOPS 완충액에서 전기영동을 수행하였다. 제조업자 (바이오-래드) 프로토콜에 따라서 바이오-세이프 쿠마시(Bio-Safe Coomassie) 염색으로 겔을 염색하고, 알파 이노테크 이미징 시스템 (Alpha Innotech Imaging system) (미국 캘리포니아주 샌 린드로)를 사용하여 영상화하였다.
내포체 제조. SDS-PAGE 및 MALDI-MS (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법)에 의해 증명되는 바와 같이, 불용성 Bt 살충 단백질을 생성하는 P.플루오레센스 발효로부터의 세포에서 DIG-152 단백질 내포체(IB) 제조를 수행하였다. 37 ℃ 수조에서 P.플루오레센스 발효 펠릿을 해동하였다. 세포용해 완충액 [50 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA 디소듐 염 (에틸렌디아민테트라아세트산), 1% 트리톤 X-100, 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT); 사용 직전에 5 mL/L의 세균 프로테아제 억제제 칵테일 (목록 번호 P8465; 시그마-알드리치, 미국 미조리주 세인트루이스)을 첨가하였다]에서 세포를 25% w/v로 재현탁하였다. 세포를 수동식 균질화기를 사용하여 최저 설정에서 현탁하였다 (조직 파쇄기, 바이오스펙 프러덕츠 인코포레이티드, 미국 오클라호마 바틀스빌). 금속 약주걱으로 혼합함으로써 리소자임 (25 mg의 시그마 L7651, 닭 난백으로부터)을 세포 현탁액에 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 현탁액을 15분 동안 얼음 위에서 냉각한 다음 브랜슨 초음파처리기 250 (2개의 1-분 기간, 50% 듀티 주기, 30% 출력)을 사용하여 초음파처리하였다. 세포 용해를 현미경으로 점검하였다. 필요하다면 추가의 25 mg의 리소자임을 첨가하고, 배양 및 초음파처리를 반복하였다. 현미경을 통한 세포 용해의 확인 후에, 세포용해물을 11,500 × g에서 25분 (4 ℃)에서 원심분리하여 IB 펠릿을 형성하고 상층액을 버렸다. IB 펠릿을 100 mL 세포용해 완충액으로 재현탁하고 수동식 혼합기로 균질화하고 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 상층액이 무색이 되고 IB 펠릿이 단단해지고 회백색이 될 때까지, IB 펠릿을 재현탁 (50 mL 세포용해 완충액), 균질화, 초음파처리 및 원심분리에 의해 반복하여 세척하였다. 최종 세척을 위하여, IB 펠릿을 2 mM EDTA를 함유하는 무균-여과 (0.22 ㎛) 증류수에 재현탁하고 원심분리하였다. 최종 펠릿을 2 mM EDTA를 함유하는 무균-여과된 증류수에 재현탁하고, -80 ℃에서 1 mL 분취액으로 보관하였다.
IB 펠릿의 1 mL 분취액을 해동하고, 무균-여과된 증류수로 1:20으로 희석함으로써, IB 제제에서 SDS-PAGE 분석 및 단백질 정량을 수행하였다. 희석된 샘플을 4X 환원 샘플 완충액 (250 mM 트리스, pH 6.8, 40% 글리세롤 (v/v), 0.4% 브로모페놀 블루(w/v), 8% SDS (w/v) 및 8% β-머캡토에탄올(v/v))과 함께 비등시키고, 노벡스(Novex)? 4-20% 트리스-글리신 위에 로딩하고, 12+2 웰 겔 (인비트로겐)을 1X 트리스/글리신/SDS 완충액 (바이오래드)과 함께 주행시켰다. 겔을 200 볼트에서 60분 동안 주행시키고 쿠마시 블루 (45% 메탄올, 10% 아세트산에서 50% G-250/50% R-250)으로 염색하고, 증류수에서 7% 아세트산, 5% 메탄올로 탈색시켰다. 동일한 겔에서 주행된 소 혈청 알부민(BSA) 표준 샘플에 대해 띠의 밀도계측 값을 비교함으로써 표적 띠의 정량화를 수행하여 표준 곡선을 얻었다.
내포체의 가용화. Pf 클론 DPf108로부터의 DIG-152 내포체 현탁액의 6 mL를 에펜도르프 모델 5415C 미량원심분리기 (대략 14,000 × g)의 최고 설정에서 미량원심분리하여 세포함유물을 펠릿화하였다. 저장 완충액 상층물을 제거하고 50 mL 원추형 관에서 25 mL의 100 mM 탄산나트륨 완충액, pH 11으로 대체하였다. 피펫을 사용하여 세포함유물을 재현탁하고 와류시켜 철저히 혼합하였다. 관을 서서히 진동하는 플랫폼에서 4 ℃에서 밤새 놓아두어 표적 단백질을 추출하였다. 추출물을 30,000 × g에서 4 ℃에서 30분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층물을 아미콘 울트라-15 재생 셀룰로스 원심분리 필터 장치 (30,000 분자량 컷오프; 밀리포어)를 사용하여 5-배 농축하였다. 일회용 PD-10 컬럼 (GE 헬쓰캐어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 샘플 완충액을 10 mM CAPS [3-(시클로헥사미노)-1-프로판술폰산] pH 10으로 변화시켰다.
내포체 단백질의 가용화 및 트립신 활성화. 일부 경우에, Pf 클론 DPf108로부터의 DIG-152 내포체 현탁액을 에펜도르프 모델 5415C 미량원심분리기 (대략 14,000 × g)의 최고 설정에서 원심분리하여 세포함유물을 펠릿화하였다. 보관 완충액 상층물을 제거하고 100 mM CAPS, pH 11로 대체하여 약 50 mg/mL의 단백질 농도를 제공하였다. 관을 실온에서 3시간 동안 진동시켜 단백질을 완전히 가용화시켰다. 트립신을 5% 내지 10% (w:w, IB 분말의 초기 중량 기준)의 양으로 첨가하고 4 ℃에서 밤새 진동시키면서 배양하거나 실온에서 90 내지 120분 동안 진동시킴으로써 소화(digestion)를 달성하였다. 10,000 × g에서 15분 동안 원심분리함으로써 불용성 물질을 제거하고, 상층액을 모노Q 음이온 교환 컬럼 (10 mm × 10 cm)에 적용하였다. 25개 컬럼 부피로 0% 내지 100% 1M NaCl 구배에 의하여 활성화된 DIG-152 단백질을 용출시켰다 (SDS-PAGE에 의해 결정됨. 하기 참조). 활성화된 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 필요하다면 상기 기재된 아미콘 울트라-15 재생 셀룰로스 원심분리 필터 장치를 사용하여 10 mL 미만으로 농축하였다. 물질을 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5% 트윈-20 및 1mM EDTA를 함유하는 완충액에서 슈퍼덱스 200 컬럼 (16 mm × 60 cm)를 통해 통과시켰다. 활성화된 (효소적으로 끝이 절단된) 단백질이 65 내지 70 mL로 용출된다는 것을 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. 활성화된 단백질을 함유하는 분획을 모으고 상기와 같은 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다.
겔 전기영동. 농축된 단백질 제제를 환원제로서 5 mM DTT를 함유하는 NuPAGE? LDS 샘플 완충액 (인비트로겐)에서 1:50으로 희석함으로써 전기영동을 위해 준비하고 95 ℃에서 4분 동안 가열하였다. (표준 곡선 생성을 위하여) 0.2 ㎍ 내지 2 ㎍/레인 범위의 5개 BSA 표준을 따라서 샘플을 4 내지 12% NuPAGE? 겔의 이중 레인에 로딩하였다. MOPS SDS 주행 완충액 (인비트로겐)을 사용하여, 겔의 바닥에 추적 염료가 이르를 때까지 전압을 200 V로 적용하였다. 겔을 45% 메탄올, 10% 아세트산에서 0.2% 쿠마시 블루 G-250으로 염색하고, 먼저 45% 메탄올, 10% 아세트산으로 짧게 탈색시키고, 이어서 배경이 투명해질 때까지 7% 아세트산, 5% 메탄올로 길게 탈색시켰다. 탈색 후에, 겔을 바이오래드 플루오르(BioRad Fluor)-S 멀티이미져로 스캔하였다. 장치의 퀀터티 원 소프트웨어 v.4.5.2를 사용하여, 염색된 단백질 띠의 배경-제거 부피를 얻고, BSA 표준 곡선을 만들었으며, 이것을 원액에서 키메라 DIG-152 단백질의 농도를 계산하기 위해 사용하였다.
실시예 3
Cry1Ca 및 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 제조 및 경쟁 결합 실험에서 사용하기 위한 스포도프테라 프루기페르다 솔 가장자리 막 소포체( brush border membrane vesicle)의 단리
하기 실시예는 곤충 장 조직에서 추정상 수용체에 대한 Cry1 코어 독소 단백질의 경쟁적 결합을 평가한다. 125I-표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질이 고 친화력으로 스포도프테라 프루기페르다 (밤나방)의 솔 가장자리 막 소포체 (BBMV)에 결합한다는 것과, Cry1Ab 코어 독소 단백질이 이러한 결합과 경쟁하지 않는다는 것이 나타난다. 대안적으로, 125I-표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질은 고 친화력으로 S.푸르기페르다로부터 제조된 BBMV에 결합하고, Cry1Ca 코어 독소 단백질은 이러한 결합과 경쟁하지 않는 것이 나타난다.
Cry 단백질의 정제. Cry1Ca3 코어 독소 및 Cry1Ab 전독소를 포함하는, 키메라 DIG-152 단백질을 코드화하는 유전자를 실시예 2에 기재된 바와 같이 슈도모나스 플루오레센스 발현 주에서 발현시켰다. 유사한 방식으로, Cry1Ab 단백질을 코드화하는 유전자를 Pf 시스템에서 발현시켰다. Cry1Ab 단백질을 발현하는 P.플루오레센스 주를 DPf88로 명명하였다.
실시예 2의 방법에 의해 단백질을 정제하고, 전체-길이 단백질로부터 활성화 코어 독소를 생성하기 위한 트립신 소화를 수행하고, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 생성물을 정제하였다. 트립신 처리된 (활성화된 코어 독소) 단백질의 제제는 >95% 순수하고, SDS-PAGE에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 대략 65kDa의 분자량을 가졌다. 여기에서 사용된 바와 같이, DIG-152 단백질로부터 제조된 활성화된 코어 독소를 Cry1Ca 코어 독소 단백질이라 명명하고, Cry1Ab 단백질로부터 제조된 활성화된 코어 독소를 Cry1Ab 코어 독소 단백질이라 명명한다.
가용화된 BBMV 의 제조 및 분별. 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., (1989)] 및 [Ausubel et al. (1995)] 및 그의 최신정보에 교시된 바와 같이 단백질 정량화 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 표준 방법을 사용하였다.
마지막 영 S.프루기페르다 유충을 밤새 굶기고 15분 동안 빙냉시킨 후에 해로딩였다. 중장 조직을 체강으로부터 제거하고 외피에 부착된 후장 뒤에 남겼다. 중장을 9배 부피의 빙냉 균질화 완충액 (300 mM 만니톨, 5 mM EGTA, 17mM 트리스 염기, pH 7.5)에 넣고, 공급업자에 의해 추천된 바와 같이 희석된 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치 P-2714)로 보충하였다. 조직을 유리 조직 균질화기의 15 스트로크로 균질화하였다. 월퍼스베르거(Wolfersberger) (1993)의 MgCl2 침전 방법에 의하여 BBMV를 제조하였다. 간략하게, 300 mM 만니톨 중의 24 mM MgCl2 용액의 동일한 부피를 중장 균질화물과 혼합하고, 5분간 교반하고 15분 동안 빙냉시켰다. 용액을 2,500 × g에서 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 얻고 펠릿을 0.5 × 희석된 균질화 완충액의 동일한 부피에 현탁하고 다시 원심분리하였다. 2개의 상층액을 합하고 27,000 × g에서 4 ℃에서 30분 동안 원심분리하여 BBMV 분획을 형성하였다. 펠릿을 BBMV 저장 완충액 (10 mM HEPES, 130 mM KCl, 10% 글리세롤, pH 7.4)에 약 3 mg/mL의 단백질 농도까지 현탁하였다. 표준으로서 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 제조업자의 지시에 따라서 퀀티크롬(QuantiChrom)TM DALP-250 알칼리성 포스파타제 분석 키트 (겐타우르 몰레큘라 프러덕츠, BE 캄펜하우트)를 사용하여 샘플을 동결하기 전에 알칼리 포스파타제 결정 (BBMV 분획을 위한 마커 효소)을 수행하였다. 이러한 효소의 비활성은 출발하는 중장 균질화물 분획에서 발견되는 것에 비하여 전형적으로 7-배 증가하였다. BBMV를 250 ㎕ 샘플로 분취하고, 액체 질소에서 순간 동결시키고 -80 ℃에서 보관하였다.
전기영동. 환원 (즉, 5% β-머캡토에탄올, BME) 및 변성 (즉, 2% SDS의 존재 하에서 90 ℃에서 5분 동안 가열됨) 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 단백질의 분석을 수행하였다. 단백질을 4% 내지 20% 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 겔 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르큘스)의 웰에 로딩하고, 200 볼트에서 60분 동안 분리하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (바이오래드)로 1시간 동안 염색함으로써 단백질 띠를 검출하고, 7% 아세트산 중의 5% 메탄올의 용액으로 탈색시켰다. 바이오래드 플루로(BioRad Fluro)-S 멀티 이미저 TM를 사용하여 겔을 영상화하고 분석하였다. 겔의 하나의 웰에 로딩된 벤치마크(BenchMark)TM 단백질 래더(Protein Ladder) (라이프 테크놀로지스, 미국 미들랜드주 록빌)의 샘플에서 관찰된 공지된 분자량 단백질의 이동성과 비교하여, 단백질 띠의 상대적 분자량을 결정하였다.
Cry1Ca 또는 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 요오드화. 피어스 요오드화 비드 (서모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드)를 사용하여 정제된 Cry1Ca 코어 독소 단백질 또는 Cry1Ab 코어 독소 단백질을 요오드화하였다. 간략하게, 2개의 요오드화 비드를 500 ㎕의 PBS (20 mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5)로 2회 세척하고 100 ㎕의 PBS와 함께 1.5 mL 원심분리 관에 넣었다. 0.5 mCi의 125I-표지화 요오드화나트륨을 첨가하고, 성분들을 실온에서 5분 동안 반응시킨 다음, 1 ㎍의 Cry1Ca 코어 독소 단백질 (또는 1 ㎍의 Cry1Ab 코어 독소 단백질)을 용액에 첨가하고, 추가로 3 내지 5 분 동안 반응시켰다.
요오드화 비드로부터 용액을 피펫팅하고 이것을 50 mM CAPS, pH 10.0, 1mM DTT (디티오트레이톨), 1mM EDTA 및 5% 글리세롤로 평형화된 제바(Zeba)TM 스핀 컬럼 (인비트로겐)에 적용함으로써 반응을 종료하였다. 요오드화 비드를 10 ㎕의 PBS로 2회 세척하고, 세척 용액을 제바TM 탈염 컬럼에 적용하였다. 방사능 용액을 1,000 × g에서 2분 동안 원심분리함으로써 스핀 컬럼을 통해 용출하였다. 125I-방사능표지 Cry1Ca 코어 독소 단백질 (또는 Cry1Ab 코어 독소 단백질)을 50 mM CAPS, pH 10.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA 및 5% 글리세롤에 대해 투석하였다.
영상화. 요오드화 Cry1Ca 또는 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 방사능-순도를 SDS-PAGE 및 인광영상분석에 의해 결정하였다. 간략하게, 제조업자의 지시에 따라서 바이오래드(BioRad) 겔 건조 장치를 사용하여 SDS-PAGE 겔을 건조하였다. 건조된 겔을 마일라(Mylar) 필름 (12 ㎛ 두께)에 감싸고 이것을 1시간 동안 몰레큘러 다이나믹스 저장 인광 스크린 (35 cm × 43 cm)하에 노출함으로써 영상화하였다. 몰레큘러 다이나믹스 스톰(Molecular Dynamics Storm) 820 인광영상분석기를 사용하여 플레이트를 현상하고, 이미지퀀트TM 소프트웨어를 사용하여 영상을 분석하였다.
실시예 4
스포도프테라 프루기페르다로부터의 BBMV 에 125I-표지화 Cry1 코어 독소 단백질의 결합
Cry1Ca 및 Cry1Ab 코어 독소 단백질과의 결합 분석에서 사용하기 위해 BBMV 단백질의 최적 양을 결정하기 위하여 포화 곡선을 생성하였다. 0.5 nM의 125I-방사능표지화 Cry1 코어 독소 단백질을 0 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL (0.5 mL의 총 부피) 범위의 BBMV 단백질의 양과 함께 결합 완충액 (8mM NaHPO4, 2mM KH2PO4, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, pH 7.4)에서 28 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 150 ㎕의 반응 혼합물을 별도의 1.5 mL 원심분리 관에 3번 중복하여 샘플링하고 실온에서 14,000 × g에서 8분 동안 원심분리함으로써 BBMV 단백질에 결합된 125I-표지화 Cry1 코어 독소 단백질을 비결합된 분획으로부터 분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 빙냉 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 펠릿을 함유하는 원심분리 관의 바닥을 컷오프하고, 13 × 75 mm 유리 배양 관에 넣고 샘플을 각각 5분 동안 감마 계수기에서 계수하였다. 수득된 CPM (분 당 수) - 배경 CPM (BBMV 단백질을 갖지 않은 반응)을 BBMV 단백질 농도에 대해 그래프화하였다. 다른 문헌 [Luo et al. 1999]에 보고된 결과에 따라, 결합 분석에서 사용하기 위한 BBMV 단백질의 최적 농도가 150 ㎍/mL인 것으로 결정되었다.
실시예 5
Cry1Ab 및 Cry1Ca 의 코어 독소 단백질을 가진 S. 프루기페르다로부터의 BBMV 에 대한 경쟁적 결합 분석
150 ㎍/mL의 S.프루기페르다 BBMV 단백질 및 0.5 nM의 125I-방사능표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질을 사용하여 동종 및 이종 경쟁 결합 분석을 수행하였다. 반응 혼합물에 첨가된 경쟁적 비-방사능표지 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 농도는 0.045 nM 내지 300 nM의 범위이고, 진정한 결합 경쟁을 보장하기 위하여 방사능 Cry1Ca 코어 독소 단백질과 동시에 첨가하였다. 배양을 28 ℃에서 1시간 동안 수행하고, BBMV에 결합된 (특이적 결합) 125I-표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질의 양을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 비-특이적 결합은 1,000 nM의 비-방사능표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질의 존재 하에서 수득된 수로 표시된다. 100% 총 결합은 경쟁인자 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 부재 하에서의 결합의 양인 것으로 간주되었다.
125I-표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질을 사용한 수용체 결합 분석은, S.프루기페르다로부터의 BBMV 위의 결합 부위로부터 방사능표지화 리간드를 치환하기 위한 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 능력을 결정하였다. 결과 (도 1)는, Cry1Ab 코어 독소 단백질이 300 nM의 높은 농도 (방사능 결합 리간드의 600배 농도)에서 그의 수용체 단백질(들)로부터 결합된 125I-표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질을 치환하지 않았다는 것을 나타낸다. 예상한 대로, 비표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질은 그의 결합 단백질(들)로부터 방사능표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질을 치환할 수 있었고, 이것은 5 nM에서 50% 치환이 일어나는 S자 투여량 반응 곡선을 나타낸다.
따라서, Cry1Ca 코어 독소 단백질이 Cry1Ab 코어 독소 단백질에 결합하지 않는 S.프루기페르다 BBMV에서의 결합 부위와 상호작용한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6
Cry1Ca 및 Cry1Ab 의 코어 독소 단백질을 가진 S. 프루기페르다로부터의 BBMV 에 대한 경쟁적 결합 분석
150 ㎍/mL BBMV 단백질 및 0.5 nM의 125I-방사능표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질을 사용하여 동종 및 이종 경쟁적 결합 분석을 수행하였다. 반응 혼합물에 첨가된 경쟁적 비-방사능표지화 Cry1Ca 코어 독소 단백질의 농도는 0.045 nM 내지 1000 nM의 범위이고, 진정한 결합 경쟁을 보장하기 위하여 방사능 Cry1Ab 코어 독소 단백질과 동시에 첨가하였다. 배양을 28 ℃에서 1시간 동안 수행하고, BBMV에 결합된 (특이적 결합) 125I-표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 양을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 비-특이적 결합은 1,000 nM의 비-방사능표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질의 존재 하에서 수득된 수로 표시된다. 100% 총 결합은 경쟁인자 Cry1Ca 코어 독소 단백질의 부재 하에서의 결합의 양인 것으로 간주되었다.
125I-표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질을 사용한 수용체 결합 분석은, S.프루기페르다로부터의 BBMV 위의 결합 부위로부터 방사능표지화 리간드를 치환하기 위한 Cry1Ca 코어 독소 단백질의 능력을 결정하였다. 결과 (도 2)는, Cry1Ca 코어 독소 단백질이 300 nM의 높은 농도 (방사능 결합 리간드의 600배 농도)에서 그의 수용체 단백질(들)로부터 결합된 125I-표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질을 치환하지 않았다는 것을 나타낸다. 예상한 대로, 비표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질은 그의 결합 단백질(들)로부터 방사능표지화 Cry1Ab 코어 독소 단백질을 치환할 수 있었고, 이것은 5 nM에서 50% 치환이 일어나는 S자 투여량 반응 곡선을 나타낸다.
따라서, Cry1Ab 코어 독소 단백질이, Cry1Ca 코어 독소 단백질은 결합하지 않는 S.프루기페르다 BBMV에서의 결합 부위와 상호작용한다는 것을 알 수 있다.
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부록 A
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SEQUENCE LISTING <110> Dow AGROSCIENCES LLC <120> COMBINED USE OF CRY1CA AND CRY1AB FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS <130> DAS-P0162-US-02 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DIG-152 Chimeric protein <400> 1 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser 610 615 620 Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Ser 625 630 635 640 Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Arg 645 650 655 Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu 660 665 670 Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp 675 680 685 Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln 690 695 700 Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly 705 710 715 720 Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp 725 730 735 Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu 740 745 750 Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln 755 760 765 Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val 770 775 780 Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Pro Ser Pro 785 790 795 800 Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp 805 810 815 Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe 820 825 830 Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe 835 840 845 Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg 850 855 860 Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr 865 870 875 880 Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val 885 890 895 Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile 900 905 910 His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro 915 920 925 Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu 930 935 940 Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val 945 950 955 960 Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys 965 970 975 Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val 980 985 990 Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro 995 1000 1005 Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr 1010 1015 1020 Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp 1025 1030 1035 Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn 1040 1045 1050 Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr 1055 1060 1065 Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr 1070 1075 1080 Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu 1085 1090 1095 Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Ser 1100 1105 1110 Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val 1115 1120 1125 Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile 1130 1135 1140 Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu 1145 1150 1155 Leu Leu Leu Met Glu Glu 1160 <210> 2 <211> 619 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry1Ca <400> 2 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly 20 25 30 Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val 50 55 60 Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu 100 105 110 Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Lys Asn Pro Ala Thr Arg Thr 115 120 125 Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val 165 170 175 Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn 180 185 190 Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala 195 200 205 Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln 210 215 220 Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu 260 265 270 Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe 275 280 285 Asn Val Met Glu Asn Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile 290 295 300 Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn 305 310 315 320 Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro 340 345 350 Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro 355 360 365 Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu 405 410 415 Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His 420 425 430 Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val 435 440 445 Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp 450 455 460 Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 485 490 495 Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile 500 505 510 Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser 515 520 525 Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly 530 535 540 Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu 545 550 555 560 Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser 565 570 575 Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu 580 585 590 Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile 595 600 605 Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr 610 615 <210> 3 <211> 612 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry1Ab <400> 3 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr 465 470 475 480 Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg 500 505 510 Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg 515 520 525 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg 530 535 540 Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn 545 550 555 560 Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn 565 570 575 Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn 580 585 590 Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu 595 600 605 Val Thr Phe Glu 610

Claims (28)

  1. Cry1C 살충 단백질을 코드화하는 DNA 및 Cry1Ab 살충 단백질을 코드화하는 DNA를 포함하는 유전자이식 식물.
  2. 제1항의 식물의 종자.
  3. 제1항에 있어서, Cry1Ca 살충 단백질을 코드화하는 DNA 및 Cry1Ab 살충 단백질을 코드화하는 DNA가 상기 식물에 유전자이입된(introgressed) 유전자이식 식물.
  4. 제3항의 식물의 종자.
  5. 비-Bt 피난처 식물 및 다수의 제1항의 유전자이식 식물을 포함하고, 상기 피난처 식물이 경작지 내의 전체 작물 식물의 40% 미만을 구성하는 식물의 경작지.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지 내의 전체 작물 식물의 30% 미만을 구성하는 경작지.
  7. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지 내의 전체 작물 식물의 20% 미만을 구성하는 경작지.
  8. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지 내의 전체 작물 식물의 10% 미만을 구성하는 경작지.
  9. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지 내의 전체 작물 식물의 5% 미만을 구성하는 경작지.
  10. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 블록으로 또는 긴 땅으로 존재하는 식물의 경작지.
  11. 비-Bt 피난처 식물로부터의 피난처 종자, 및 다수의 제7항의 종자를 포함하고, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 전체 종자의 40% 미만을 구성하는, 종자의 혼합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 전체 종자의 30% 미만을 구성하는 종자의 혼합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 전체 종자의 20% 미만을 구성하는 종자의 혼합물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 전체 종자의 10% 미만을 구성하는 종자의 혼합물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 피난처 종자가 혼합물 내의 전체 종자의 5% 미만을 구성하는 종자의 혼합물.
  16. 제5항의 식물의 경작지를 만들기 위해 종자를 심는 것을 포함하는, 곤충에 의한 Cry 독소에 대한 내성의 발생을 관리하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, Cry1Fa 코어 독소-함유 단백질을 코드화하는 DNA를 더 포함하는 식물.
  18. 비-Bt 피난처 식물 및 다수의 제17항의 옥수수 식물을 포함하고, 상기 피난처 식물이 경작지 내 전체 작물 식물의 약 20% 미만을 구성하는, 식물의 경작지.
  19. 경작지가 약 10% 미만의 피난처 식물을 포함하는, 다수의 제17항의 식물을 포함하는 식물의 경작지.
  20. 제19항의 식물의 경작지를 만들기 위해 종자를 심는 것을 포함하는, 곤충에 의한 Cry 독소에 대한 내성의 발생을 관리하는 방법.
  21. Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질 및 Cry1C 코어 독소-함유 단백질의 양쪽 모두의 유효량을 발현하는 세포를 포함하는, 인시류 해충의 방제용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, Cry1Ab 코어 독소-함유 단백질 및 Cry1C 코어 독소-함유 단백질 양쪽 모두를 발현하기 위해 형질전환된 숙주를 포함하고, 상기 숙주가 미생물 또는 식물 세포인 조성물.
  23. 제21항의 조성물의 유효량을 해충 또는 해충의 환경에 제공하는 것을 포함하는, 인시류 해충의 방제 방법.
  24. 제5항 또는 제18항에 있어서, 상기 식물이 10 에이커 초과를 차지하는 경작지.
  25. 제1항, 제3항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 대두, 사탕수수 및 면화로 구성된 군에서 선택되는 식물.
  26. 제1항, 제3항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수 식물인 식물.
  27. 식물 세포가 Cry1C 살충 단백질을 코드화하는 DNA 및 Cry1Ab 살충 단백질을 코드화하는 DNA를 포함하고, 상기 Cry1C 살충 단백질이 SEQ ID NO:2와 적어도 99% 동일하고 상기 Cry1D 살충 단백질이 SEQ ID NO:3과 적어도 99% 동일한, 제1항, 제3항, 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 식물의 식물 세포.
  28. 제1항, 제3항, 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cry1C 살충 단백질이 SEQ ID NO:2를 포함하고, 상기 Cry1Ab 살충 단백질이 SEQ ID NO:3을 포함하는 식물.
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