ES2598491T3 - Uso combinado de proteínas cry1ca y cry1ab para la gestión de la resistencia a insectos - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida Cry1C que comprende una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO: 2 y variantes de la misma, ADN que codifica una proteína insecticida Cry1Ab que comprende una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO: 3 y variantes de la misma y cualquiera de ADN que codifica una proteína insecticida Cry1Fa1 que comprende una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO: 4 y variantes de la misma o ADN que codifica una proteína insecticida Cry1Fa2 que comprende una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO: 5 y variantes de la misma, en la que las variantes comprenden una secuencia aminoacídica que tiene más de un 90 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica según las SEQ ID NO: 2, 3, 4 y 5, respectivamente, y que tiene la misma actividad insecticida que las proteínas respectivas.

Description

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de B.t. divulgados en la presente memoria, pueden aplicarse al suelo. El producto formulado puede aplicarse también como recubrimiento de semilla o tratamiento de raíz o tratamiento de planta total en etapas posteriores del ciclo de la cosecha. Los tratamientos de planta y suelo de células de B.t. pueden emplearse como polvos humectables, gránulos o polvos finos, mezclando con diversos materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes de extensión-adhesión, agentes estabilizantes, otros aditivos plaguicidas o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como se apreciaría por un especialista en la materia, la concentración de plaguicida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o para usar directamente. El plaguicida estará presente en al menos un 1 % en peso y puede ser de 100 % en peso. Las formulaciones secas tendrán aproximadamente 1-95 % en peso del plaguicida, mientras que las formulaciones líquidas serán de aproximadamente 1-60 % en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán de aproximadamente 50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones pueden aplicarse al ambiente de la plaga de lepidóptero, p.ej. follaje o suelo, por pulverización, espolvoreado, rociado o similar.

Transformación de plantas. Es un hospedador recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la invención en cuestión una planta transformada. Los genes que codifican proteínas toxinas de Bt, como se divulgan en la presente memoria, pueden insertarse en células vegetales usando una variedad de técnicas que son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, están disponibles un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp y pACYC184, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína toxina de Bt puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, se recolectan entonces y se lisan. Se recupera el plásmido. Se llevan generalmente a cabo análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos bioquímicos o de biología molecular como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Puede clonarse cada secuencia de plásmido en el mismo u otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si se usa, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces tiene que unirse al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho e izquierdo, del ADN-T de plásmido Ti o Ri como región flanqueante de los genes para insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha investigado extensamente y se ha descrito suficientemente en el documento EP 120.516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) y An et al., (1985), y está bien establecido en la materia.

Una vez se ha integrado el ADN insertado en el genoma vegetal, es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador selectivo que confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tales como bialafós, kanamicina, G418, bleomicina o higromicina, entre otros. El marcador empleado individualmente debería permitir por consiguiente la selección de células transformadas en lugar de células que no contienen el ADN insertado.

Está disponible un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula hospedadora vegetal. Esas técnicas incluyen transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas) o electroporación, así como otros métodos posibles, Si se usan Agrobacterium para la transformación, el ADN para insertar tiene que clonarse en plásmidos especiales, a saber, cualquiera de un vector intermedio o un vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a secuencias que son homólogas con secuencias del ADN-T. El plásmido Ti o Ri comprende también la región vir necesaria para la transferencia de ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacterium. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacterium. Comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están en fase con las regiones de borde derecho e izquierdo de ADN-T. Pueden transformarse directamente en Agrobacterium (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium usada como célula hospedadora ha de comprender un plásmido portador de una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células vegetales. Pueden cultivarse ventajosamente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula vegetal. Pueden regenerarse plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para selección. En las plantas así obtenidas puede ensayarse entonces la presencia del ADN insertado. No plantean demandas especiales los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible

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4,0 mg/ml en CAPS 100 mM, pH 11. Para biosensayo de insectos, se prepararon concentraciones de proteína DIG152 en el intervalo de 0,030 µg a 102 µg/g de dieta mezclando volúmenes apropiados con una dieta merídica (Bio-Serv, Frenchtown, NJ), justo antes de dispensar aproximadamente 0,7 ml de la dieta en células individuales de bandejas de 128 células (Bio-Ba-128, C-D International).

Se ensayó proteína Cry1Ab activada con tripsina (usada como control positivo para actividad insecticida) en el intervalo de 0,03125 µg a 32 µg/g de dieta (preparada mezclando polvo liofilizado con cantidades apropiadas de agua destilada antes de la preparación de la dieta).

Se usaron como tratamientos de control dietas preparadas con agua destilada (control de blanco para las pruebas de Cry1Ab) o solo tampón (CAPS 100 mM, pH 11, para las pruebas de DIG-152). Se liberó una larva neonata de D. saccharalis (<24 h después de la eclosión) en la superficie de dieta de cada célula. Después de la inoculación larval, se cubrieron las células con tapas ventiladas (C-D International) y se dispusieron las bandejas de bioensayo en una cámara ambiental mantenida a 28 ºC, 50 % de HR y un fotoperiodo de 16 h:8 h (luz:oscuridad). Se registraron la mortalidad larval, peso larval y número de larvas supervivientes que no demostraron ganancias de peso (< 0,1 mg por larva) el séptimo día después de la inoculación. Se repitió cada combinación de estirpe de insecto/concentración de proteína Cry cuatro veces, con 16 a 32 larvas en cada repetición.

Se midieron los criterios de mortalidad larval como mortalidad “práctica”, que consideraba tanto las larvas muertas (mórbidas) como supervivientes (atrofiadas, sin alimentación) que no mostraban una ganancia significativa de peso corporal (concretamente, < 0,1 mg por larva). Se calculó la mortalidad práctica de las larvas en un tratamiento usando la ecuación:

Mortalidad práctica (%)= [TDS/TNIT] x 100

en la que TDS es el número total de larvas muertas más el número de larvas atrofiadas,

y TNIT es el número total de insectos en el tratamiento

La mortalidad “práctica” (simplificado de aquí en adelante como mortalidad) de cada cepa de D. saccharalis se corrigió para la mortalidad larval observada con dieta de control de blanco de agua para analizar los resultados después de tratamiento con Cry1Ab, o la dieta de tratamiento con solo tampón para el tratamiento de DIG-152.

Se analizaron adicionalmente los resultados de los experimentos de respuesta a la dosis para establecer el valor de GI50, [concretamente, la concentración de proteína de Bt. en la dieta a la que la inhibición del crecimiento larval (% GI) era de 50]. Se calculó el valor de % GI de las larvas en la dieta que contenía proteína Cry1Ab usando la fórmula:

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en la que TWC es el peso corporal total de larvas que se alimentan con dieta de control de agua, y TWT es el peso corporal total de larvas que se alimentan con dieta tratada con Cry1Ab mientras que, para analizar el % GI larval como resultado de la ingestión de proteína DIG-152, se calculó usando la

fórmula:

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en la que TWB es el peso corporal total de larvas que se alimentan con dieta tratada con control de solo tampón y

TWT es el peso corporal total de larvas que se alimentan con dieta tratada con DIG-152.

Se asignó una inhibición del crecimiento larval del 100 % a una repetición si no había larvas que tuvieran una ganancia de peso significativa (<0,1 mg por larva). Se analizaron los datos de inhibición del crecimiento usando un ANOVA de dos factores con cepa de insecto y concentración de proteína Cry como los dos factores principales. Se usaron pruebas de LSMEANS para determinar las diferencias de tratamiento a nivel de α= 0,05.

Se dan en la Tabla 2 los resultados de los bioensayos de incorporación a dieta en larvas de Diatraea saccharalis.

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Tabla 2. Mortalidad larval de respuesta a la dosis e inhibición del crecimiento (% media ± eem) de Diatraea saccharalis sensible a Cry1Ab (SCB) y resistente a Cry1Ab (rSCB) que se alimentan con dieta que contiene Cry1Ab

o proteína DIG-152a

Proteína Cry1Ab

DIG-152

Insecto

Conc. de proteínab Nº de larvas Mortalidadc % GId Conc. proteínab de Nº de larvas Mortalidadc % GIe

SCB

Blanco 126 3,2 ± 1,3 a --- Blanco 124 10,4 ± 3,2 b 5,9 ± 4,8 a

rSCB

Blanco 128 4,7 ± 2,0 --- Blanco 125 4,1 ± 2,5 a 3,1 ± 5,5 a

SCB

Tampón NTf Tampón 121 10,9 ± 3,9 b --

rSCB

Tampón NT Tampón 127 1,6 ± 0,9 a ---

SCB

0,03125 124 38,6 ± 4,8 c 90,7 ± 1,6 ef 0,03 126 53,1 ± 2,3 c 69,5±6,5 c

rSCB

0,03125 123 8,3 ± 3,2 ab -15,9 ± 4,6 a 0,03 127 3,2 ± 0,0 a 8,0 ± 5,1 a

SCB

0,125 128 34,3 ± 7,9 c 87,4 ± 2,5 e 0,1 127 88,2 ± 3,5 d 100 ± 0,0 d

rSCB

0,125 126 8,6 ± 2,3 ab 10,0 ± 5,3 b 0,1 127 11,8 ± 0,8 b 49,0 ± 3,5 b

SCB

0,5 119 75,6 ± 2,9 e 94,3 ± 1,0 fg 0,4 130 96,2 ± 1,9 e 100 ± 0,0 d

rSCB

0,5 128 5,5 ± 1,5 a 26,7 ± 3,1 c 0,4 125 91,2 ± 2,0 d 100 ± 0,0 d

SCB

2 125 93,6 ±2,2 f 100 ± 0,0 g 1,6 122 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

rSCB

2 128 14,8 ± 2,7 b 67,5 ± 1,5 d 1,6 127 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

SCB

8 122 95,9 ± 1,6 fg 100 ± 0,0 g 6,4 125 100 ± 0,0 f 100 ± 0,0 d

rSCB

8 120 40,6 ± 5,1 c 85,2 ± 1,9 e 6,4 128 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

SCB

32 126 99,2 ± 0,8 g 100 ± 0,0 g 25,6 78 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

rSCB

32 128 60,9 ± 5,8 d 90,3 ± 2,2 ef 25,6 119 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

SCB

102 60 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

rSCB

102 126 100 ±0,0 f 100 ± 0,0 d

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Proteína Cry1Ab

DIG-152

Insecto

Conc. de proteínab Nº de larvas Mortalidadc % GId Conc. de proteínab Nº de larvas Mortalidadc % GIe

a Los valores medios en una columna con todos los tratamientos seguidos por la misma significativamente diferentes (P < 0,05; prueba de LSMEANS). eem = error estándar de la media. b µg de proteína/g de dieta. c La medida de la mortalidad larval era como se define en el texto. d Estos valores porcentuales se calcularon usando la fórmula descrita en el texto. e Estos valores porcentuales se calcularon usando la fórmula descrita en el texto. f NT = No ensayado

letra no son

Análisis de datos. Se sometieron los datos de dosis/mortalidad corregidos a análisis de probit para determinar las concentraciones de proteína de tratamiento que causaban un valor de 50 % de mortalidad (CL50) y los correspondientes intervalos de confianza del 95 % (IC). Los tratamientos usados en el análisis de probit incluían la 5 máxima concentración que producía cero mortalidad, la mínima concentración que daba como resultado un 100 % de mortalidad y todos los resultados entre estos extremos. Se calcularon las relaciones de resistencia dividiendo el valor de CL50 de la cepa de rSCB entre el de insectos SCB. Se usó una prueba de relación de dosis letal para determinar si las relaciones de resistencia eran significativas al nivel de α= 0,05. Se usó también un ANOVA de dos factores para analizar los datos de mortalidad, seguido de una prueba de LSMEANS al nivel de α= 0,05 para

10 determinar las diferencias de tratamiento. Se presentan en la Tabla 3 los resultados de los análisis.

Tabla 3. Compendio de pruebas de bioensayo sobre larvas de SCB y rSCB usando dieta de insecto en la que se ha incorporado proteína DIG-152 o proteína Cry1Ab.

Insecto

Nº de larvas ensayadas CL50 (IC del 95 %) (µg/g)a RRb

DIG-152

SCB 505 0,03 (0,02-0,03) 6,0 NS

rSCB

506 0,18 (0,15-0,24)

Cry1Ab

SCB 744 0,13 (0,08-0,20 142S

rSCB

440 18,46 (13,93-26,29

a La medida de la mortalidad larval se definió como se describe en el texto. b Las relaciones de resistencia con una letra “S” son significativas, mientras que aquellas con las letras “NS” son no significativas al nivel del 5 % basado en las pruebas de dosis letal.

Es un rasgo de la proteína DIG-152 de la invención en cuestión que inhibe el crecimiento de larvas de barrenador de

15 caña de azúcar neonatas (Diatraea saccharalis), o las larvas mueren, después de la ingestión de proteína DIG-152 a niveles similares a los de proteína Cry1Ab activada, que da la misma respuesta biológica. Es un rasgo adicional de la proteína DIG-152 que las larvas de Diatraea saccharalis que son resistentes a los efectos tóxicos de la proteína Cry1Ab son no obstante sensibles a la acción tóxica de la proteína DIG-152.

Ejemplo 2

20 Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas quiméricas y expresión en Pseudomonas

Se usaron métodos de clonación estándares [como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y actualizaciones de los mismos] en la construcción del constructo de expresión pMYC2547 de Pseudomonas fluorescens (Pf) genomanipulado para producir una proteína quimérica DIG-152 completa. Se efectuó la producción de proteína en Pseudomonas fluorescens cepa MB214 (un derivado de la cepa MB 101; P. 25 fluorescens biovar I), que tiene una inserción de un operón lac modificado como se divulga en la patente de EE.UU.

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