MX2012007135A - Uso combinado de las proteinas cry1ca y cry1ab para el control de la resistencia a los insectos. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye métodos y plantas para controlar insectos lepidópteros, donde dichas plantas comprenden una proteína insecticida Cry1Ca y una proteína insecticida Cry1Ab en combinación, para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia por parte de los insectos.

Description

USO COMBINADO DE LAS PROTEÍNAS CRY1CA Y CRY1AB PARA EL CONTROL DE LA RESISTENCIA A LOS INSECTOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los seres humanos cultivan maíz para aplicaciones alimentarias y energéticas. Los seres humanos también cultivan numerosos cultivos adicionales, incluyendo soja y algodón. Los insectos comen y dañan las plantas y de esa manera socavan esos esfuerzos del hombre. Cada año se gastan miles de millones de dólares para combatir las plagas de insectos y se pierden miles de millones adicionales por el daño que estos inflingen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas primarias empleadas para combatir las plagas de insectos aunque los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuríngiensis (Bt), han desempeñado un papel de importancia en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a los insectos mediante transformación con genes de proteínas insecticidas de Bt ha revolucionado la agricultura moderna y subrayado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Se han utilizado diversas proteínas de Bt para generar plantas transgénicas resistentes a los insectos que han sido registradas y comercializadas con éxito hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI Fa y Cry3Bb en el maíz, CryIAc y Cry2Ab en el algodón y Cry3A en la papa.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína, excepto en los casos en que se busca el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (por ej., CryIAb y Cry3Bb en el maíz, combinadas para otorgar resistencia a las plagas de lepidópteros y la gusano de la raiz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas hace que sean de utilidad como herramienta para retardar el desarrollo de resistencia en poblaciones susceptibles a los insectos (por ej., CryIAc y Cry2Ab en el algodón combinadas para conferir el control de la resistencia para el gusano de las yemas del tabaco).

En otras palabras, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a los insectos que han llevado a una adopción generalizada y rápida de esta tecnología también dan origen a la inquietud de que las poblaciones de plagas desarrollen resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para preservar la utilidad de los rasgos de resistencia a los insectos basados en Bt, que incluyen el uso de proteínas en una dosis elevada en combinación con un refugio, y la alternación con toxinas diferentes o el uso conjunto de las mismas (McGaughey et al. (1998), uB.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

Es necesario que las proteínas seleccionadas para usar en un cúmulo de control de resistencia a los insectos (IRM) ejerzan su efecto insecticida de manera independiente para que la resistencia desarrollada a una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, que no haya resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plaga seleccionada por su resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", se deduciría que no hay resistencia cruzada y que una combinación de la Proteína A y la Proteína B resultaría eficaz para retrasar la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones resistentes a insectos, se pueden efectuar evaluaciones sobre la base de otras características que se presuman relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la ventaja de la unión mediada por receptores en la identificación de proteínas insecticidas con pocas probabilidades de exhibir resistencia cruzada (van Mellaert et al. 1999). El predictor clave de la falta de resistencia cruzada inherente a este enfoque es que las proteínas insecticidas no compiten por los receptores en una especie sensible a los insectos.

En el caso de que dos toxinas Cry de B.t. compitan por el mismo receptor, luego si ese receptor muta en ese insecto de manera que una de las toxinas ya no se una a este receptor y por consiguiente ya no sea insecticida contra el insecto, también puede ocurrir que el insecto sea resistente además a la segunda toxina (que se une de manera competitiva al mismo receptor). Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría constituir un indicio de que el insecto no es resistente a las dos toxinas en forma simultánea.

CryIAb es una proteína insecticida utilizada en la actualidad en el maíz transgénico para proteger a las plantas de una variedad de plagas de insectos. Una plaga crucial del maíz contra la cual CryIAb confiere protección es el barrenador europeo del maíz.

En el sitio web del comité de nomenclatura oficial de B.t. se enumeran otras toxinas Cry (Crickmore eí al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Ver el Apéndice A adjunto. Hoy en día hay casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con otras toxinas Cyt y toxinas VIP y demás. Muchas de cada grupo numérico tienen subgrupos indicados con letras mayúsculas y los subgrupos con letras mayúsculas tienen sub-subgrupos indicados con letras minúsculas (Cry1 tiene A-L y CryIA tiene a-i, por ejemplo).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, con el sorprendente hallazgo de que Cryl Ca es muy activa contra el barrenador de la caña de azúcar, incluyendo una población de barrenador de la caña de azúcar que es resistente a CryIAb. Como sabrá apreciar un experto en la técnica con el beneficio de esta descripción, las plantas que producen Cry Ca y CryIAb (incluyendo las porciones insecticidas de las mismas) han de ser útiles para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas individuales. También se podría apilar un gen cryI Fa, por ejemplo, con estos dos genes/proteínas de dos pares de bases.

La presente invención se relaciona asimismo con el hallazgo de que CryI Ca y CryIAb no compiten entre sí por la unión a receptores intestinales del gusano cogollero (Spodoptera frugiperda; FA ).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Competencia por la unión a Spodoptera frugiperda BBMV por la toxina de núcleo CryIAb, la toxina de núcleo CryI Ca y la proteína toxina de núcleo CryI Ca marcada con 1251 Figure 2 Competencia por la unión a Spodoptera frugiperda BBMV por la toxina de núcleo CryI Ca, la toxina de núcleo CryIAb y la proteína toxina de núcleo CryIAb marcada con 1251.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1 proteína quimérica de núcleo Cry Ca /proto CryIAb 1164 aa (DIG-152).

SEQ ID NO: 2 una toxina de núcleo CryICa.

SEQ ID NO: 3 una toxina de núcleo CryIAb.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, con el sorprendente hallazgo de que CryI Ca es muy activa contra una población del barrenador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis) que es resistente a CryIAb. En consecuencia, la presente invención se relaciona, en parte, con el sorprendente hallazgo de que se puede emplear CryI Ca en combinación con, o "apilarla con" CryIAb para combatir el desarrollo de resistencia a estas proteínas insecticidas individuales. Dicho de otro modo, la presente invención se relaciona, en parte, con el sorprendente hallazgo de que una población del barrenador de la caña de azúcar seleccionada por su resistencia a CryIAb no es resistente a CryICa; los barrenadores de la caña de azúcar que son resistentes a la toxina CryIAb son susceptibles (es decir, no tienen resistencia cruzada) a CryICa. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso de la toxina CryICa para controlar poblaciones del barrenador de la caña de azúcar resistentes a CryIAb.

Como reconocerá un experto en la técnica contando con el beneficio de esta descripción, las plantas que expresan CryI Ca y CryIAb (incluyendo las porciones insecticidas de las mismas) han de ser ventajosas para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia a cualquiera de estas proteínas individualmente.

La presente invención incluye el uso de CryICa para proteger a la caña de azúcar y otras especies vegetales importantes para la economía del deterioro y la pérdida de rendimiento causados por el barrenador de la caña de azúcar o por poblaciones del barrenador de la caña de azúcar que han desarrollado resistencia a la CryIAb. El barrenador de la caña de azúcar también puede ser una plaga del maíz. Esto es particularmente así en algunos países de América Central y del Sur tales como Brasil y Argentina. Por consiguiente, también se puede proteger al maíz, por ejemplo, de acuerdo con la presente invención.

La presente invención enseña, por lo tanto, una pila de control de la resistencia a los insectos (IRM) para prevenir o mitigar el desarrollo de resistencia por el barrenador de la caña de azúcar a CryIAb y/o CryICa.

Además, los estudios de unión a los receptores que utilizan CryICa radiomarcada y Spodoptera frugipera; los tejidos del insecto del gusano cogollero (FAW) demuestran que CryIAb no compite por el sitio de unión con alta afinidad al cual se une CryI Ca. Estos resultados indican que se puede utilizar la combinación de CryIAb y CryI Ca como medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos (tales como FAW y SCB) a CryIAb y/o CryI Ca en las plantas (tales como maíz y caña de azúcar) que producen ambas proteínas. Sí bien los estudios de superposición de toxinas demostraron que la proteína CryICa se unía a dos proteínas de las BBMV de S. frugiperda, una de 40 kDa y otra de 44 kDa, en tanto que la proteína CryIAb se unía a una proteína única de 150 kDa (Aranda et al., 1996), que no estaba relacionada con los estudios de unión no competitiva.

Por consiguiente, la presente invención incluye asimismo la combinación de CryI Ca y CrylAb como pila de IRM para mitigar el desarrollo de resistencia por el gusano cogollero y/o por el barrenador de la caña de azúcar a una de esas proteínas, o de las poblaciones de barrenador de la caña de azúcar que han desarrollado resistencia a CrylAb.

La presente invención da a conocer composiciones para controlar plagas de lepidópteros que comprenden células que expresan una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Ca y una proteína que contiene la toxina de núcleo CrylAb; un huésped transformado para expresar tanto una proteína que contiene la toxina de núcleo CrylAb como una proteína que contiene la toxina de núcleo CryIC, donde dicho huésped es un microorganismo o una célula vegetal (el o los presentes polinucleótidos están preferentemente en una construcción genética bajo el control de (operativamente ligada a / que comprende) un promotor que no es de Bacillus thuringiensis; los presentes polinucleótidos pueden comprender el uso de codones para la expresión potenciada en una planta); un método para controlar plagas de lepidópteros que comprende poner en contacto dichas plagas o el ambiente de dichas plagas con una cantidad efectiva de una composición que produce una proteína que contiene la toxina de núcleo CrylAb y una célula que expresa una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI C; una planta (tal como una planta de maíz o soja o algodón o caña de azúcar, por ejemplo) que comprende ADN que codifica una proteina que contiene la toxina de núcleo CryI Ca y ADN que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CrylAb y la semilla de dicha planta; una planta (tal como una planta de maíz o soja o algodón o caña de azúcar, por ejemplo) donde el ADN que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CryICa y ADN que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CrylAb han sido introgredidos en dicha planta de maíz, y la semilla de dicha planta.

Se ha demostrado, por ejemplo, que CryICa (proteína de la cepa de Pseudomonas fluorescens recombinante MR1206/DC639; plásmido pMYC2547) es muy eficaz para controlar poblaciones del barrenador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis), en bioensayos con dieta artificial que se ha seleccionado por la resistencia a CrylAb. Esto indica que CryI Ca es útil para controlar poblaciones del SCB que han desarrollado resistencia a CrylAb o para mitigar el desarrollo de resistencia a CrylAb en poblaciones del SCB.

Basándose, en parte, en los datos aquí presentados, la coexpresión de CryI Ca y CrylAb puede producir una elevada dosis de pila de IRM para controlar el SCB. Se pueden agregar otras proteínas a esta combinación para ampliar el espectro. Por ejemplo en maíz, la adición de Cry1 Fa generaría una pila de IRM para el barrenador europeo del maíz (ECB), Ostrinia nubilalis (Hübner), agregando una MOA más para el control del SCB.

Por una reseña de CrylC como bioinsecticida potencial para las plantas, remitirse a (Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CrylC as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324.

Receptores de Insectos.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión competitiva a los receptores utilizando una proteína que contiene la toxina de núcleo CryICa radíomarcada demuestran que la proteína con la toxina de núcleo CrylAb no compite por el sitio de unión de alta afinidad presente en los tejidos del insecto FAW a los cuales se une CryICa. Estos resultados indican que la combinación de las proteínas CrylAb y CryICa constituirían un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia a CrylAb en poblaciones de FAW (y de igual manera, el desarrollo de resistencia a CryICa), y probablemente aumentaría el nivel de resistencia a esta plaga en las plantas de maíz que expresan ambas proteínas.

Estos datos sugieren, además, que CryICa sería eficaz para controlar las poblaciones de SCB que han desarrollado resistencia a CrylAb. Una opción de implementación consistiría en el uso de estas proteínas Cry en zonas geográficas en que CrylAb ha perdido efectividad en el control del SCB debido al desarrollo de resistencia. Otra opción de implementación sería el uso de Cryl Ca en combinación con CryIAb para mitigar el desarrollo de resistencia del SCB a CryIAb.

Se pueden utilizar las combinaciones de las toxinas descritas en la invención para controlar plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, es decir, mariposas y polillas, se alimentan principalmente del néctar de las flores. Casi todas las larvas, es decir las orugas, se alimentan de plantas, y muchas constituyen graves plagas. Las orugas se alimentan de o dentro del follaje o de las raíces o el tallo de una planta, privando a la planta de nutrientes y con frecuencia destruyendo la estructura de sostén físico de la planta. Además, las orugas se alimentan de frutos, tejidos y granos y harinas almacenados, arruinando estos productos para la venta o disminuyendo severamente su valor. En el presente contexto, las referencias a plagas de lepidópteros se refieren a las diversas etapas de la vida de la plaga, incluyendo las etapas larvarias.

Las toxinas quiméricas de la presente invención comprenden una porción de toxina núcleo total N-terminal de una toxina B.t. y, en algún punto posterior en el extremo de la porción de toxina, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heterologa. En la presente se hace referencia a la porción de toxina N-terminal de una toxina de B.t. como toxina "núcleo". La transición al segmento de protoxina heterologa puede tener lugar aproximadamente en el empalme toxina/protoxina o, de lo contrario, una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina) puede quedar retenida con la transición a la protoxina heteróloga que tiene lugar corriente abajo.

Como un ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención consta de la porción de toxina núcleo total de CryIAb (aminoácidos 1 a 601 ) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 602 hasta el término C). En una modalidad preferida, se deriva la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina de una toxina proteica CryIAb. Como segundo ejemplo, una segunda toxina quimérica de la presente invención, descrita en SEQ ID NO: 1 (DIG-152) consta de la porción de toxina núcleo total de Cryl Ca (aminoácidos 1 a 619) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 620 hasta el término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina proteica CryIAb.

Un experto en esta técnica sabrá apreciar que las toxinas de B.t., aun dentro de una determinada clase tal como CrylCa, suelen variar, hasta cierto punto, en cuanto a su longitud y la ubicación precisa de la transición de la porción de toxina a la porción de protoxina. Por lo general, las toxinas cryICa tienen una longitud de aproximadamente 1 150 a aproximadamente 1200 aminoácidos. La transición de la porción de toxina a la porción de protoxina tiene lugar, por lo general, entre aproximadamente 50% a aproximadamente 60% de la toxina de longitud total. La toxina quimérica de la presente invención ha de incluir la extensión total de esta porción de toxina núcleo N-terminal. Por consiguiente, la toxina quimérica comprende por lo menos aproximadamente 50% de la cryI Ca de longitud total o la toxina Cry Ab de B.t.. Esto representa por lo general por lo menos 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la amplitud total de la porción de protoxina Cry1A(b) se extiende desde el extremo de la porción de toxina hasta el término C de la molécula. Son los últimos aproximadamente 100 a 150 aminoácidos de esta porción los más esenciales para incluir en la toxina quimérica de la presente invención.

Genes y toxinas Los genes y toxinas ventajosos de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud total descritas sino también fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente ejemplificadas en este documento. En el presente contexto, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes con actividad pesticida. Como se usa en el presente contexto, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas objetivo que las toxinas reivindicadas.

Como se usa en el presente contexto, los límites representan una identidad de secuencia de aproximadamente 95% (CryIAb's y 1 Ca's), 78% (CryIA's y CryIC's) y 45% (Cryl's), según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuríngiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R.

Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes finales se pueden aplicar a las toxinas núcleo solamente (para toxinas CryIAb y Cry C). También se pueden emplear los números del GENBANK consignados en el Apéndice A adjunto para obtener secuencias correspondientes a cualquiera de los genes y proteínas descritos o mencionados en este documento.

Ha de resultar evidente para un experto en la técnica que los genes que codifican toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos por varios medios. Los genes o porciones de genes específicos ejemplificados en la presente se pueden obtener de aislados depositados en un depositario de cultivos tal como los descritos anteriormente. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también pueden ser construidos sintéticamente, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de genes. Se pueden construir fácilmente variaciones de los genes utilizando técnicas normales para efectuar mutaciones puntuales. Asimismo, se pueden preparar fragmentos de estos genes empleando exonucleasas o endonucleasas existentes en el comercio de acuerdo con los procedimientos habituales. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas tales como Bal31 o mutagénesis sitio dirigidas para recortar sistemáticamente los nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, se pueden obtener genes que codifican fragmentos activos empleando una variedad de enzimas de restricción. Se pueden utilizar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas.

Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Además, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes puede codificar las secuencias de aminoácidos aquí descritas. Es de competencia de un experto en la técnica generar estas secuencias de ADN alternativas que codifican toxinas iguales o esencialmente iguales. Estas secuencias de ADN variantes están dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en el presente contexto, la referencia a "esencialmente igual" se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan sustancialmente la actividad pesticida. También se incluyen en esta definición los fragmentos que retienen la actividad pesticida.

Otro método para identificar las toxinas codificadoras de genes y porciones de genes útiles de acuerdo con la presente invención es mediante el uso de sondas oligonucleotidicas. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectares. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de un marcador apropiado o se las puede hacer inherentemente fluorescentes de acuerdo con lo descrito en la Solicitud internacional No. WO93/16094. Como bien se sabe en la técnica, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando un fuerte vínculo entre ambas moléculas, se puede presumir razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología sustancial. De preferencia, la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas utilizando técnicas muy conocidas en el medio, como se describe, por ejemplo en Keller, G. H., M. . Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperaturas son los siguientes (a fin de aumentar la rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de la sonda otorga un medio para determinar de manera conocida si se ha producido la hibridación. Dicho análisis por sondas ofrece un método rápido para identificar genes codificadores de toxinas de la presente invención. Los segmentos nucleotídicos que se utilizan como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar empleando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden utilizar como iniciadores de PCR para amplificar los genes de la presente invención.

En la presente se han ejemplificado específicamente ciertas toxinas de la presente invención. Dado que estas toxinas son meramente ejemplos de las toxinas de la presente invención, ha de resultar fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican para toxinas equivalentes) con la misma o similar actividad pesticida que la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tienen homología de aminoácidos con la toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos es generalmente superior a 75%, preferentemente suele ser superior a 90% y muy preferentemente es superior a 95%. La homología de aminoácidos ha de ser mayor en las regiones críticas de la toxina, que explican la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que, en última instancia, es responsable por la actividad biológica. En este aspecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden ser lógicas si estas sustituciones se encuentran en regiones que no son esenciales para la actividad o son sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden clasificar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales se reemplaza un aminoácido de una clase por otro aminoácido del mismo tipo caen dentro del alcance de la presente invención, siempre que la sustitución no altere sustancialmente la actividad del compuesto. El cuadro 1 presenta un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 1 En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no deben disminuir significativamente la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinantes Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión del gen de la toxina da lugar, directa o indirectamente, a la producción y mantenimiento intracelular del pesticida. Se puede utilizar la transferencia conjugal y la transferencia recombinante para generar una cepa de B.t. que exprese ambas toxinas de la presente invención. También se pueden transformar otros organismos huésped con uno o ambos genes de toxinas y luego utilizarlos para lograr el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ej., Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, donde proliferan y son ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, se puede tratar el microbio que alberga el gen de toxina en condiciones que prolonguen la actividad tóxica y estabilicen la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada luego al ambiente de la plaga objetivo.

Cuando se introduce el gen de la toxina de B.t. por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica vivo al ambiente, es esencial el uso de ciertos microbios huésped. Se seleccionan microorganismos huésped conocidos por ocupar la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Se seleccionan estos microorganismos de manera que puedan competir favorablemente en el medio específico (el cultivo y otros hábitats del insecto) con los microorganismos de tipo silvestre, dar lugar al mantenimiento y expresión estable del gen que expresa el pesticida polipeptidico y, ventajosamente, dar lugar a una protección mejorada del pesticida contra la degradación e inactivación ambiental.

Se sabe que un gran número de microorganismos habita el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea a las raíces de las plantas) de una gran variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de particular interés microorganismos tales como bacterias, por ej., de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ej., géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de especial interés las especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii, asi como especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Son de particular interés los microorganismos pigmentados.

Se dispone de una amplia variedad de maneras de introducir un gen de B.t. que codifica una toxina en un microorganismo huésped en condiciones que permitan un mantenimiento y expresión estables del gen. Estos métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica y han sido descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5, 135,867, que se incorpora a la presente como referencia.

Tratamiento de las células Se pueden tratar células de Bacillus thuringiensis o recombinantes que expresan las toxinas B.t. para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se forma comprende la toxina o toxinas de B.t. dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protege a la toxina al aplicar la microcápsula al ambiente de la plaga objetivo. Las células huésped adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, limitándose normalmente a las células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, se podrían emplear organismos que produzcan sustancias tóxicas para organismos superiores, donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un huésped mamífero. Como huéspedes, son de particular interés las procariotas y las eucariotas inferiores, como por ejemplo hongos.

Habitualmente la célula está intacta y sustancialmente en etapa proliferativa en el momento de tratarla, en lugar de en forma de espora, aunque en algunos casos se pueden emplear esporas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo un microbio que contiene uno o más genes de toxinas de B.t., puede ser por medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y/o físicos, siempre que la técnica no afecte de manera deletérea las propiedades de la toxina ni disminuya la capacidad celular de proteger la toxina. Los ejemplos de reactivos químicos son agentes de halogenación, especialmente halógenos de No. atómico 17-80. Más específicamente, se puede emplear yodo en condiciones moderadas y durante un tiempo suficiente para obtener los resultados buscados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos tales como glutaraldehído, antiinfectivos tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes tales como de isopropilo y etanol; diversos fijadores histológicos tales como yodo Lugol, fijador de Bouin, diversos ácidos y fijador de Helly (Ver: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967) o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preserven y prolonguen la actividad de la toxina producida en la célula una vez administrada la célula al ambiente del huésped. Los ejemplos de medios físicos son radiación de longitud de onda corta tal como radiación gamma y rayos X, congelación, irradiación UV, liofilización y demás. Los métodos de tratamiento de células microbianas han sido descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,695,455 y 4,695,462, que se incorporan a la presente como referencia.

Por lo general las células han de tener estabilidad estructural mejorada, lo que potencia la resistencia a las condiciones ambientales. Cuando el pesticida se encuentra en una proforma, se debe seleccionar el método de tratamiento de las células de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida por el patógeno de la plaga objetivo. Por ejemplo, el formaldehído entrecruza las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un polipéptido pesticida. El método de tratamiento debe retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de particular interés en la selección de una célula huésped con fines de producción incluyen la facilidad para introducir el gen o genes de B.t. en el huésped, la disponibilidad de los sistemas de expresión, la eficiencia de expresión, estabilidad del pesticida en el huésped y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para usar como microcápsula pesticida incluyen cualidades que protegen el pesticida tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaque intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en medios acuosos; falta de toxicidad para mamíferos; que sea atractiva para la ingestión por las plagas; la facilidad para matar y fijar sin dañar la toxina; y demás. Otros factores incluyen la facilidad de formulación y manejo, la economía, la estabilidad en el almacenamiento y demás.

Cultivo de las células Se puede cultivar el huésped celular que contiene el gen o genes insecticidas B.t. en cualquier medio de nutrientes conveniente, donde la construcción de ADN ofrezca una ventaja selectiva, dando lugar a un medio selectivo de manera que sustancialmente todas o la totalidad de las células retengan el gen B.t. A continuación estas células pueden ser cosechadas de acuerdo con medios convencionales. Alternativamente, las células pueden ser tratadas con anterioridad a la cosecha.

Se pueden cultivar las células B.t. que producen las toxinas de la invención empleando medios y técnicas de fermentación normales en la técnica. Una vez completado el ciclo de fermentación, se pueden cosechar las bacterias separando, en primer lugar, las esporas y cristales de B.t. del caldo de fermentación por medios conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de B.t. recuperados se puede formular un polvo humectable, un concentrado liquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de agentes tensoactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar el manejo y aplicación a plagas objetivo específicas. Estas formulaciones y los procedimientos de aplicación son muy conocidos en la técnica.

Formulaciones Se pueden aplicar al suelo los gránulos de cebo formulados que contienen un agente de atracción y esporas, cristales y toxinas de los aislados de B.t. o microbios recombinantes que comprendan los genes que se obtienen de los aislados de B.t. aquí descritos. También se puede aplicar el producto formulado como revestimiento de la semilla o tratamiento de las raíces o tratamiento de la planta total en etapas posteriores del ciclo del cultivo. Se pueden emplear tratamientos de la planta o el suelo de células de B.t. en forma de polvos humectables, gránulos o espolvoreantes, mezclándolos con diversos materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y demás) o materiales botánicos (mazorca de maíz triturados, cascaras de arroz, cáscaras de nuez y demás). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de diseminación-adhesión, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas o agentes tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser con base acuosa o no acuosa y emplearse en forma de espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensoactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como sabrá apreciar un experto en la técnica, la concentración del pesticida ha de variar ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación específica, especialmente de si es un concentrado o es para utilizar directamente. El pesticida está presente por lo menos en 1 % en peso y puede ser de 100% en peso. Las formulaciones secas han de contener de aproximadamente 1-95% en peso del pesticida, en tanto que las formulaciones líquidas han de contener de aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones contienen por lo general de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administran a razón de aproximadamente 50 mg (líquida o seca) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de la plaga de lepidópteros, por ej., al follaje o al suelo, mediante fumigación, espolvoreo, aspersión o similar.

Transformación de Plantas.

Un huésped recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Se pueden insertar genes que codifican proteínas tóxicas de Bt, de acuerdo con lo aquí descrito, en las células vegetales utilizando una variedad de técnicas que son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, se dispone de un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para la preparación con miras a la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC 84, entre otros. En consecuencia, se puede insertar el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína tóxica de Bt en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido así obtenido es utilizado para la transformación en E. coli. Se cultivan las células de E. coli en un medio nutriente adecuado, luego se las cosecha y somete a lisis. Se recupera el plásmido. Por lo general se lleva a cabo el análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos bioquímicos-biológicos moleculares como métodos de análisis. Después de cada manipulación, se puede escindir la secuencia de ADN utilizada y unir a la siguiente secuencia de ADN. Se puede clonar cada secuencia plasmidica en el mismo plásmido o en otros. Dependiendo del método de inserción de los genes buscados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se utiliza el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, luego por lo menos el borde derecho, aunque con frecuencia el borde derecho y el izquierdo del ADN-T del plásmido Ti o Ri se debe unir como región flanqueante de los genes a insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido extensamente investigado y suficientemente descrito en EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y ya es establecido en la técnica.

Una vez integrado el ADN insertado en el genoma de la planta, ya es relativamente estable. El vector de transformación normalmente contiene un marcador seleccionable que confiere resistencia, en las células vegetales transformadas, a un biocida o un antibiótico, tal como Bialafos, Kanamicina, G418, Bleomicina o Higromicina, entre otros. El marcador empleado individualmente debe permitir, en consecuencia, la selección de las células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado.

Se dispone de un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas) o electroporación, así como también otros métodos posibles. Si se utilizan Agrobacterias para la transformación, se debe clonar el ADN a insertar en plásmidos especiales, es decir en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar al plásmido Ti o Ri mediante recombinación homologa debido a las secuencias que son homologas de las secuencias del ADN-T. El plásmido Ti o Ri comprende además la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no se pueden replicar en Agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido helper (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar tanto en E. coli como en Agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un ligante o poliligante que están enmarcados por las regiones de borde de ADN-T derecha e izquierda. Pueden ser transformados directamente en Agrobacteria (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium utilizada como célula huésped ha de comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede haber más ADN-T en el contenido. La bacteria así transformada es utilizada para la transformación de células vegetales. Se pueden cultivar ventajosamente explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula vegetal. Posteriormente se pueden regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hojas, segmentos del tallo, raíces, aunque también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Seguidamente se pueden analizar las plantas así obtenidas para verificar la presencia del ADN insertado. No hay demandas especiales en cuanto a los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible utilizar los plásmidos habituales, como por ejemplo derivados de pUC.

Las células transformadas se desarrollan dentro de la plantas de la manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir el o los rasgos transformados a las plantas de la progenie. Dichas plantas pueden ser cultivadas de manera normal y cruzadas con plantas que tengan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos así obtenidos tendrían las correspondientes propiedades fenotipicas.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas son transformadas con genes en los cuales se ha optimizado el uso de codones para las plantas. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5380831 , que se incorpora a la presente como referencia. Si bien en la presente se ejemplifican algunas toxinas truncadas, se conoce bien en la técnica del Bt que las toxinas del tipo de 130 kDa (longitud total) tienen una mitad N-terminal que es la toxina núcleo y una mitad C-terminal que es la "cola" de protoxina. Por consiguiente, se pueden utilizar "colas" apropiadas con las toxinas truncas / núcleo de la presente invención. Ver, por ej. la patente de Estados Unidos No. 6218188 y la patente de Estados Unidos No. 6673990. Además, los métodos para generar genes de Bt sintéticos para usar en plantas son conocidos en la técnica (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitante de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en plantas que codifica una proteína CryI Fa y que además comprende un segundo gen expresable en plantas que codifica una proteína CryI Ca.

La transferencia (o introgresión) del rasgo (o rasgos) CryIAb y CryIC en líneas endogámicas de maíz se puede obtener mediante repetida reproducción por selección, por ejemplo mediante retrocruza. En este caso, se cruza en primer lugar una progenitora recurrente deseada con una endogámica donante (la progenitora no recurrente) que porta el gen o genes apropiados correspondientes a los rasgos CryIAb y CryIC. A continuación se vuelve a aparear la progenie de esta cruza con la progenitora recurrente, a lo que sigue la selección en la progenie así obtenida en busca del rasgo (rasgos) deseado(s) a transferir de la progenitora no recurrente. Después de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzas con la progenitora recurrente con la selección del rasgo o rasgos buscados, la progenie ya es heterocigota por los loci que controlan el o los rasgos que se están transfiriendo, aunque serán como la progenie recurrente en lo que respecta a la mayoría o casi todos los demás genes (ver, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1. Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de Control de la Resistencia a los Insectos (IR ).

Roush et al., por ejemplo, esbozan estrategias de dos toxinas, también denominadas "acumulación en forma de pirámide" o "apilamiento" para el control de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (United States Environmental Protection Agency) (epa.gov/oppbppd 1 /biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm) publica los siguientes requisitos para establecer refugios no transgénicos (es decir, no de B.t.) (un bloque de cultivos sin Bt / maíz) para usar con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contra las plagas objetivo.

Los requisitos estructurados específicos para los productos de maíz con Bt (CryIAb o CryI F) protegidos contra el barrenador del maíz son los siguientes: Refugios estructurados: 20% de refugio de maíz sin Bt para lepidópteros en el Corn Belt (Cinturón del Maíz del medio oeste de los Estados Unidos de Norteamérica) 50% de refugio de maíz sin Bt para lepidópteros en el Cotton Belt Bloques 1. - Interno (es decir, dentro del campo de Bt) 2. - Externo (es decir, campos separados dentro de ½ milla (0.80 km) (si es posible VA milla (0.40 km)) del campo de Bt para maximizar el apareamiento aleatorio) Bandas en campo Las bandas deben tener un ancho de por lo menos 4 hileras (preferentemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento larvario La Asociación Nacional de Productores de Maíz (National Corn Growers Association), en su sitio web (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn), también ofrece una guía similar con respecto a los requisitos. Por ejemplo: Requisitos del IRM del Barrenador del Maíz: • Plantar por lo menos 20% de sus acres de maíz con híbridos refugio • En las regiones productoras de algodón, el refugio debe abarcar 50% • Se debe plantar dentro de la 1/2 milla (0.8 km) de los híbridos refugio • Se puede plantar el refugio en forma de bandas dentro de un campo Bt; las bandas de refugio deben tener un ancho de por lo menos 4 hileras • Se puede tratar el refugio con pesticidas convencionales sólo si se alcanzan los umbrales económicos respecto del insecto objetivo • No se pueden emplear insecticidas para fumigar basados en Bt en el maíz refugio • Se debe plantar un refugio apropiado en todas las propiedades rurales con maíz Bt Como indican Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), el apilamiento o acumulación en pirámide de dos proteínas diferentes, cada una de las cuales es eficaz contra las plagas objetivo con poca o ninguna resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio de menor tamaño. Roush sugiere que para una pila satisfactoria, un tamaño de refugio de menos de 10% puede ofrecer un control de resistencia comparable a aproximadamente 50% del refugio en el caso de un rasgo único (no apilado en pirámide). En el caso de los productos de maíz Bt actualmente disponibles en pirámide, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos requiere significativamente menos (generalmente 5%) refugio estructurado de maíz no Bt plantado que en el caso de los productos con un rasgo único (generalmente 20%).

Se puede utilizar cualquiera de los porcentajes antes citados (tales como los correspondientes a 1 F/1Ab), o proporciones de refugio similares para las pilas o pirámides dobles o triples en cuestión. La presente invención incluye una superficie comercial - de más de 10 acres (4.04 ha), por ejemplo - plantada con (o sin) dicho refugio y con las plantas de acuerdo con la presente invención.

Hay diversas maneras de producir un refugio, incluyendo diversos patrones de plantación geométrica en los campos (como ya se mencionara) hasta mezclas de semillas en bolsa, como lo describe en forma más detallada Roush y, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,551 ,962.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones que se mencionan o citan en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad en la medida en que no se contradigan con las enseñanzas vertidas en forma explícita en esta especificación. A menos que se indique específicamente o se implique lo contrario, los términos "un", "una" y "el/la" significan "por lo menos uno" en el presente contexto.

Los siguientes ejemplos ¡lustran la invención. Los ejemplos no deben ser interpretados como limitaciones.

EJEMPLO 1 Diseño de toxinas quiméricas que comprenden toxinas núcleo Cry1 y protoxinas heterólogas, y actividad insecticida de la proteína DIG-152 producida en Pseudomonas fluorescens Toxinas quiméricas.

Ya se han dado a conocer proteínas quiméricas que utilizan el dominio de toxina núcleo de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cry, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5593881 y en la Patente de Estados Unidos No. 5932209.

Las variantes de proteina quimérica CryICa de la presente invención incluyen toxinas quiméricas que comprenden un segmento de toxina núcleo N-terminal derivado de una toxina insecticida Cry1 Ca3 fusionado a un segmento de protoxina endotoxina delta heterologa en algún punto más allá del final del segmento de toxina núcleo. La transición de la toxina núcleo al segmento de protoxina heterologa puede tener lugar aproximadamente en el empalme toxina núcleo nativa/ protoxina, o una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá del segmento de toxina núcleo) puede quedar retenida, donde la transición a la protoxina heterologa tiene lugar corriente abajo. En forma variante, los segmentos de toxina núcleo y protoxina comprenden exactamente la secuencia de aminoácidos de las toxinas nativas de las cuales se derivan, o pueden incluir adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no menoscaban, y pueden potenciar, la función biológica de los segmentos al fusionarse entre sí.

Por ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención comprende un segmento de toxina núcleo derivado de Cry1 Ca3 y una protoxina heteróloga. En una modalidad preferida de la invención, el segmento de toxina núcleo derivado de Cry1 Ca3 (619 aminoácidos) está fusionado a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina derivado de una endotoxina delta CryIAb (545 aminoácidos). La secuencia de 1164 aminoácidos de la proteína quimérica, a la que en la presente se denomina DIG-152, está expuesta en SEQ ID NO: 1. Se debe tener presente que otras fusiones que comprenden variantes de toxinas núcleo Cry1Ca3 y protoxinas derivadas de CryIAb están dentro del alcance de la presente invención.

Se demostró la actividad insecticida contra lepidópteros de la proteina DIG-152 en larvas neonatas del barrenador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis) y SCB resistente a CryIAb (rSCB) en experimentos de respuesta a la dosis que utilizan procedimientos de incorporación a la dieta. Se solubilizaron cuerpos de inclusión de DIG-152 meciéndolos suavemente a 4o por espacio de 4 horas en 7.5 mi de CAPS 100 mM pH1 , EDTA 1 mM, al cual se había agregado 200 µ? de un inhibidor de la proteasa bacteriano (Sigma P4865; preparado según las instrucciones del proveedor). Después de la centrifugación para las pellas del material insoluble, se ajustó la concentración de proteína de reserva a 4.0 mg/ml en CAPS 100 mM, pH1 1. Para el bioensayo con insectos, se prepararon concentraciones de la proteína DIG-152 en el rango de 0.030 pg a 102 pg/gm de la dieta mezclando volúmenes apropiados de una dieta merídica (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) inmediatamente antes de dispensar aproximadamente 0.7 mi de la dieta en células individuales de bandejas de 128 células (Bio-Ba-128, C-D International).

Se analizó la proteína CryIAb activada con tripsina (utilizada como control positivo para determinar la actividad insecticida) en el rango de 0.03125 pg a 32 pg/gm de la dieta (preparada mezclando polvo liofilizado con cantidades apropiadas de agua destilada antes de la preparación de la dieta).

Se utilizaron dietas preparadas con agua destilada (Control sin tratamiento (Blank Control), en el caso de los análisis de CryIAb) o Regulador de pH Solamente (Buffer Only) (CAPS 100 mM pH1 1 , en el caso de los análisis DIG-152) como tratamientos control. Se liberó una larva neonata de D. saccharalis (<24 h después de la eclosión) sobre la superficie de la dieta en cada célula. Después de la inoculación larvaria, se cubrieron las células con tapas con ventilación (C-D International) y se colocaron las bandejas de bioensayo en una cámara ambiental mantenida a 28°, 50% de HR y un fotoperíodo de 16 h:8 h (luz:oscuridad). Se registró la mortalidad de las larvas, el peso de las larvas y el número de larvas sobrevivientes que no demostraron aumento de peso (< 0.1 mg por larva) el séptimo día después de la inoculación. Se repitió cada combinación de cepa de insecto/concentración de proteína Cry cuatro veces, con 16 a 32 larvas en cada réplica.

Se midieron los criterios de mortalidad de las larvas como mortalidad "práctica" que tomó en cuenta tanto las larvas Muertas (mórbida) como las larvas sobrevivientes (atrofiadas, sin alimentación) que no exhibieron un aumento significativo de peso corporal (es decir < 0.1 mg por larva). Se calculó la mortalidad práctica de las larvas en un tratamiento utilizando la ecuación: Mortalidad práctica (%) = [TDS/TNIT] x 100 donde TDS es el número Total de larvas muertas (Dead) más el número de larvas atrofiadas (Stunted), y TNIT es el Número Total de Insectos en el Tratamiento Se corrigió la mortalidad "práctica" (en adelante simplificada con el término Mortalidad) de cada cepa de D. saccharalis según la mortalidad de las larvas observada en la dieta Control sin Tratamiento para analizar los resultados después del tratamiento con CryIAb, o la dieta tratada con Regulador de pH Solamente para el tratamiento con DIG-152.

Los resultados de los experimentos de respuesta a la dosis fueron analizados adicionalmente, para establecer un valor GI50, [es decir, la concentración de la proteína B.t. en la dieta en la cual el valor de inhibición del desarrollo de las larvas (% de Gl) fue de 50]. Se calculó el valor % de Gl de las larvas en la dieta con contenido de proteína CryIAb utilizando la siguiente fórmula: % de Gl = [TWC -TWT]/TWC x 100 donde TWC es el Peso Corporal Total de larvas que se alimentan con la dieta Control en agua y TWT es el Peso Corporal Total de larvas que se alimentan con la dieta tratada con CryIAb en tanto que, para analizar el % de Gl de larvas como resultado de la ingestión de la proteína DIG-152 se la calculó utilizando la fórmula: % de Gl = [TWB -TWT]/TWB x 100 donde TWB es el Peso Corporal Total de larvas que se alimentan con la dieta Control tratada con Regulador de pH Solamente y TWT es el Peso Corporal Total de larvas que se alimentan con la dieta tratada con DIG-152 Se asignó una inhibición del desarrollo de las larvas de 100% a una replicación sin no hubo un aumento de peso significativo (<0.1 mg por larva). Se analizaron los datos de inhibición de desarrollo utilizando un ANOVA de dos vías con una cepa de insectos y la concentración de proteína Cry como los dos factores principales. Se utilizaron análisis LSMEANS para determinar las diferencias de tratamiento en el nivel a = 0.05.

Los resultados de los bioensayos de incorporación a la dieta en larvas de Diatraea saccharalis están consignados en el cuadro 2.

CUADRO 2 Mortalidad en respuesta a la dosis e inhibición del desarrollo (% de la media ± sem) de Diatraea saccharalis susceptibles a CrylAb (SCB) y resistentes a CrylAb (rSCB) alimentadas con una dieta que contenia la " Los valores medios dentro de una columna a través de todos los tratamientos seguidos por una misma letra no son significativamente diferentes (P < 0.05; análisis LSMEANS). sem = error estándar de la media 6 pg de protelna/gm de la dieta c La medida de la mortalidad de las larvas fue la definida en el texto d Se calcularon estos valores porcentuales utilizando las fórmulas descritas en el texto.

* Se calcularon estos valores porcentuales utilizando las fórmulas descritas en el texto.

' NT = No se Analizó Análisis de los Datos A continuación se sometió a los datos corregidos de dosis/ mortalidad a análisis de probabilidad estadística (probit) para determinar las concentraciones proteicas del tratamiento que causaban un valor de 50% de mortalidad (LC5o) y los correspondientes intervalos de 95% de confianza (Cl). Los tratamientos utilizados en el análisis de probabilidad incluyeron la concentración más elevada que produjo mortalidad cero, la concentración más baja que dio lugar al 100% de mortalidad, y todos los resultados entre esos extremos. Se calcularon las relaciones de resistencia dividiendo el valor LC50 de la cepa rSCB por el de los insectos SCB. Se utilizó un análisis de relación de dosis letal para determinar si las relaciones de resistencia eran significativas en un nivel de a = 0.05. También se utilizó un ANOVA de dos vías para analizar los datos de mortalidad, seguido por el análisis LSMEANS en el nivel a = 0.05 para determinar las diferencias de los tratamientos. Los resultados de los análisis están consignados en el cuadro 3.

CUADRO 3 Síntesis de los análisis de bioensavo realizados en larvas de SCB y rSCB utilizando una dieta de insectos a la que se había incorporado la proteína DIG-152 o CrvIAb * La medida de la mortalidad de las larvas fue la definida en el texto.

" Las relaciones de resistencia con una letra 'S' son Significativas, en tanto que las que llevan las letras 'NS" son No Significativas en un nivel de 5% sobre la base de las pruebas de dosis letal.

Es una característica de la proteína DIG-152 de la presente invención la inhibición del desarrollo de las larvas neonatas del barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), o la mortandad de las larvas, después de la ingestión de la proteína DIG-152 en niveles similares a los de la proteína CryIAb activada que producen la misma respuesta biológica Otra de las características de la proteína DIG-152 es que las larvas de Diatraea saccharalis que son resistentes a los efectos tóxicos de la proteína CryIAb son susceptibles, de todas maneras, a la acción tóxica de la proteína DIG-152.

EJEMPLO 2 Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas quiméricas y expresión en Pseudomonas Se utilizaron métodos de clonación estándar [como los descritos, por ejemplo, por Sambrook et ai, (1989) y Ausubel et al., (1995), y actualizaciones de esos textos] en la construcción del constructo de expresión pMYC2547 de Pseudomonas fluorescens (Pf) diseñado para producir una proteina quimérica DIG-152 de longitud total. La producción de la proteína se llevó a cabo en la cepa MB2 4 de Pseudomonas fluorescens (un derivado de la cepa MB101 ; biovar I de P. fluorescens), con una inserción de un operón lac modificado de acuerdo con lo descrito en la patente de Estados Unidos No. 5169760. La estrategia básica de clonación conllevó la subclonación de un fragmento de ADN que codificaba DIG-152 en plásmidos vectores, por la cual se la coloca bajo el control de expresión del promotor Pfac y el terminador rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). Un plásmido de ese tipo fue designado pMYC2547 y el aislado de MB21 que alberga este plásmido se denomina Dpf108.

Desarrollo y Análisis de Expresión en Frascos Agitadores.

Se llevó a cabo la producción de la proteina DIG-152 para el bioensayo de caracterización e insectos por medio de la cepa Dpf108 cultivada en frascos agitadores de P. fluorescens. La producción de la proteina DIG-152 impulsada por el promotor Ptac se llevó a cabo de la manera descrita anteriormente en la patente de Estados Unidos No. 5527883. Se pueden encontrar detalles de las manipulaciones biológicas en el trabajo de Squires ef al., (2004), solicitud de Patente de Estados Unidos 20060008877, Solicitud de patente de Estados Unidos 20080193974 y Solicitud de patente de Estados Unidos 20080058262, que se incorporan a la presente como referencia. Se indujo la expresión mediante la adición de ¡sopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) tras una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Se muestrearon los cultivos en el momento de la inducción y en diversos momentos posteriores a la inducción. Se midió la densidad celular por densidad óptica a 600 nm (??ß??)· Fraccionamiento de las células y Análisis de SDS-PAGE de las Muestras en Frascos Agitadores En cada ocasión de muestreo se ajustó la densidad celular de las muestras a OD600 = 20 y se centrifugaron alícuotas de 1 mi a 14000 x g por espacio de cinco minutos. Se congelaron las pellas celulares a -80°. Se generaron fracciones solubles e insolubles de las muestras de pellas celulares congeladas en los frascos agitadores utilizando la Solución de Extracción de Proteínas Bacterianas EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Se resuspendió cada pella celular en 1 mi de solución EasyLyse™ y se lo volvió a diluir 1 :4 en regulador de pH de lisis y se lo incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se centrifugó el lisado a 14.000 rpm por espacio de 20 minutos a 4o y se recuperó el sobrenadante como fracción soluble. A continuación se resuspendió la pella (fracción insoluble) en un volumen igual de salina regulada en su pH de fosfato (PBS; Na2HP04 1 1.9 mM, NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, pH 7.4).

Se mezclaron las muestras 1 :1 con 2X regulador de pH de muestreo Laemmli con contenido de ß-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) y se las hirvió por espacio de 5 minutos antes de cargarlo en geles Criterion XT de Bis— Tris 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Se realizó la electroforesis en el regulador de pH recomendado XT MOPS. Se colorearon los geles con la Tintura de Azul de Coomassie biológicamente segura (Bio-Safe) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y se tomaron imágenes de los mismos utilizando el sistema de captación de imágenes Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Preparación de los cuerpos de Inclusión.

Se efectuaron preparaciones de cuerpos de inclusión (IB) de la proteina DIG-152 en células obtenidas de fermentaciones de P. fluorescens que produjeron proteina insecticida Bt insoluble, como se demostró por SDS-PAGE y MALDI-MS (Espectrometría de Masa Láser de Desorción/Ionización Asistida por Matriz). Se descongelaron las pellas de P. fluorescens en un baño de agua a 37°. Se resuspendieron las células a 25% p/v en regulaor de pH de lisis [se agregó Tris 50 mM, pH 7.5, NaCI 200 mM, sal disódica de EDTA 20 mM (ácido etilendiaminotetraacético), 1 % de Tritón X-100 y ditiotreitol 5 mM (DTT); 5 ml/l de cocktail inhibidor de la proteasa bacteriana (# de Catálogo P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) antes de usarlas]. Se resuspendieron las células utilizando un homogeneizador manual en su posición más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se agregó lisozima (25 mg de Sigma L7651 , de clara de huevo de pollo) a la suspensión celular mezclando con una espátula de metal y se incubó la suspensión a temperatura ambiente por espacio de una hora. Se enfrió la suspensión en hielo durante 15 minutos, luego se la sometió a sonicación empleando un Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1 minuto en un ciclo de servicio de 50% con 30% de salida). Se verificó la lisis de las células por microscopía. Se agregaron 25 mg más de lisozima cuando fue necesario y se repitió la incubación y sonicado. Después de la confirmación de la lisis celular por microscopía, se centrifugó el lisado a 11 .500 x g por espacio de 25 minutos (4o) para formar la pella de IB, y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió la pella de IB con 100 mi de regulador de pH de lisis, se homogeneizó con la mezcladora manual y se centrifugó de la manera antes expuesta. Se lavó repetidamente la pella de IB mediante resuspensión (en 50 mi de regulador de pH de lisis), homogeneización, sonicado y centrifugación hasta que el sobrenadante se tornó incoloro y la pella de IB se tornó firme y de color blancuzco. Para el lavado final, se resuspendió la pella de IB en agua destilada filtrada en forma estéril (0.22 µ??) que contenía EDTA 2 mM y se centrifugó. Se resuspendió la pella final en agua destilada filtrada en forma estéril que contenía EDTA 2 mM y se almacenó en alícuotas de 1 mi a -80°.

Se realizó el análisis de SDS-PAGE y la cuantificación de proteína en las preparaciones de IB mediante descongelación de una alícuota de 1 mi de la pella de IP y dilución a 1 :20 con agua destilada filtrada estéril. A continuación se hirvió la muestra diluida con 4X regulador de pH de reducción de muestras [Tris 250 mM, pH 6.8, glicerol al 40% (v/v), 0.4% de Azul de Bromofenol (p/v), 8% de SDS (p/v) y 8% de ß-mercaptoetanol (v/v)] y se cargó en un gel Novex® de 4-20% Tris-Glicina, de 12+2 pozos (Invitrogen) corrido con 1X regulador de pH de Tris/Glicina/SDS (BioRad). Se corrió el gel por espacio de 60 min a 200 voltios, luego se tiñó con Azul de Coomassie (50% G-250/50% R-250 en 45% de metanol, ácido acético al 10%) y se decoloró con ácido acético al 7%, metanol al 5% en agua destilada. La cuantificación de las bandas objetivo se llevó a cabo comparando los valores densitométricos correspondientes a las bandas contra muestras estándar de albúmina sérica bovina (BSA) corridas en el mismo gel para generar una curva estándar.

Solubilización de los Cuerpos de Inclusión.

Se centrifugan seis mi de la suspensión de cuerpos de inclusión de DIG-152 del clon de Pf DPf108 en el ajuste más alto de una microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para reducir a pellas las inclusiones. Se retiró el sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento y se reemplazó con 25 mi de regulador de pH de carbonato de sodio 100 mM, pH 1 1 , en un tubo cónico de 50 mi Se resuspendieron las inclusiones utilizando una pipeta y se las sometió a vórtice para mezclarlas a fondo. Se colocó el tubo en una plataforma que se mecía suavemente a 4o de un día para otro para extraer la proteína objetivo. Se centrifugó el extracto a 30.000 x g por espacio de 30 min a 4o y se concentró el sobrenadante así obtenido 5 veces utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra-15 (Corte de peso molecular 30.000; Millípore). Seguidamente se cambió el regulador de pH de muestreo por CAPS 10 mM [ácido 3-(ciclohexamino)1-propansulfónico] pH 10 usando columnas PD-10 descartables (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Solubilización y activación con tripsina de la proteina con Cuerpos de Inclusión.

En algunos casos, se centrifugó la suspensión de cuerpos de inclusión DIG-152 del clon de Pf DPÍ108 en el ajuste más alto de una microcentrífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para reducir a pellas las inclusiones. Se retiró el sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento y se reemplazó con CAPS 100 mM, pH 1 1 para producir una concentración proteica de aproximadamente 50 mg/ml. Se meció el tubo a temperatura ambiente por espacio de tres horas para solubilizar por completo la proteína. Se agregó tripsina en una cantidad igual a 5% a 10% (p:p, sobre la base del peso inicial del polvo de IB) y se realizó la digestión por incubación mientras se mecía a 4o o mediante agitación por espacio de 90- 20 minutos a temperatura ambiente. Se separó el material insoluble mediante centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos y se aplicó el sobrenadante a una columna de intercambio de aniones onoQ (10 mm por 10 cm). Se eluyó la proteína DIG-152 activada (según determinación por SDS-PAGE, como se expone a continuación) por un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en 25 volúmenes de columna. Se agruparon las fracciones que contenían la proteína activada y, en caso necesario, se las concentró a menos de 10 mi utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerada Amicon Ultra— 15 como antes. A continuación se hizo pasar el material a través de una columna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) en regulador de pH con contenido de NaCI 100 mM. 10% de glicerol, 0.5% de Tween-20 y EDTA 1 mM. Se determinó mediante análisis de SDS-PAGE que la proteína activada (truncada por enzimas) eluye a 65 a 70 mi. Se agruparon las fracciones que contenían la protema activada y se las concentró utilizando un concentrador centrifugo de la manera antes descrita.

Electroforesis en qel.

Se realizaron preparaciones concentradas de proteína para la electroforesis mediante dilución 1 :50 en regulador de pH de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía DTT 5 mM como agente reductor y se calentó a 95° durante 4 minutos. Se cargó la muestra en bandas duplicadas de un gel NuPAGE® al 4-12% junto con cinco estándares de BSA en el rango de 0.2 pg a 2 pg/banda (para la generación de curvas estándar). Se aplicó voltaje a razón de 200 V usando el regulador de corrida MOPS SDS (Invitrogen) hasta que la tintura rastreadora alcanzó el fondo del gel. Se tiñó el gel con Azul de Coomassie G-250 al 0.2% en metanol al 45%, 10% de ácido acético y se decoloró, primero brevemente con metanol al 45%, ácido acético al 10% y luego a fondo con ácido acético al 7%, metanol al 5% hasta que el fondo se despejó. Después de la destinción, se exploró el gel con un BioRad Fluor-S Multilmager. Se utilizó el software Quantity One Software v.4.5.2 del instrumento para obtener volúmenes sin el fondo de las bandas de proteína teñidas y para generar la curva estándar de BSA que se utilizó para calcular la concentración de la proteína quimérica DIG-152 en la solución madre.

EJEMPLO 3 Preparación de proteínas de toxina núcleo CrylCa y CryIAb y aislamiento de vesículas de la membrana de borde en cepillo de Spodoptera frugiperda para usar en los experimentos de unión competitiva Los siguientes ejemplos evalúan la unión de competencia de las proteínas de toxina núcleo Cry1 a receptores putativos en tejidos intestinales de insectos. Se demuestra que la proteína de toxina núcleo Cryl Ca marcada con 1251 se une con alta afinidad a las Vesículas de la membrana de borde en cepillo (BBMVs) preparadas de Spodoptera frugiperda (gusano cogollero) y que la proteína de toxina núcleo CryIAb no compite con esta unión. Por el contrarío, se demuestra que la proteína de toxina núcleo CryAb marcada con 1251 se une con alta afinidad a las BBMV preparadas de S. frugiperda y que la proteína de toxina núcleo CryICa no compite con esta unión.

Purificación de Proteínas Crv Se expresó un gen que codifica una proteína quimérica DIG- 152, que comprende la toxina núcleo Cry1 Ca3 y la protoxina Cry Ab, en la cepa de expresión de Pseudomonas fluorescens como se describe en el Ejemplo 2. De manera similar, se expresó un gen que codifica una proteína CryIAb en el sistema Pf. La cepa de P. fluorescens que expresa la proteína CryIAb fue denominada DPf88.

Se purificaron las proteínas por los métodos del Ejemplo 2 y seguidamente se ejecutó la digestión con tripsina para producir toxinas núcleo activadas a partir de las proteínas de longitud total y se purificaron los productos por los métodos descriptos en el Ejemplo 2. Las preparaciones de las proteínas procesadas con tripsina (toxina núcleo activada) fueron >95% puras y tenían un peso molecular de aproximadamente 65 kDa, como se determinó experimentalmente por SDS-PAGE. En el presente contexto, la toxina núcleo activada preparada a partir de la proteína DIG-152 se denomina proteína de toxina núcleo CryI Ca y la toxina núcleo activada preparada a partir de la proteína CryIAb se denomina proteína de toxina núcleo CryI Ab.

Preparación y Fraccionamiento de las BBMV Solubilizadas.

Se emplearon los métodos estándar de cuantificación de proteínas y SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1995), y las actualizaciones de estos textos.

Se sometió a ayuno a larvas de S. frugiperda en último instar de un día para otro y luego se realizó la disección después de enfriarlas sobre hielo durante 15 minutos. Se retiró el tejido del intestino medio de la cavidad corporal, dejando atrás el intestino trasero adherido al integumento. Se colocó el intestino medio en un volumen 9X de regulador de pH de homogeneización helado (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, base de Tris 17 mM, pH 7.5), suplementado con Cocktail de Inhibidores de la Proteasa (Sigma-Aldrich P-2714) diluido según las recomendaciones del proveedor. Se homogeneizó el tejido con 15 recorridos de un homogeneizador de tejidos de vidrio. Se prepararon las BBMV mediante el método de precipitación con MgCI2 de Wolfersberger (1993). En síntesis, se mezcló un volumen igual de una solución de MgCI2 24 mM en manitol 300 mM con el homogenato de intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar sobre hielo por espacio de 5 min. Se centrifugó la solución a 2.500 x g durante 15 min a 4o. Se guardó el sobrenadante y se suspendió la pella en el volumen original de 0.5X regulador de pH de homogeneización diluido y se volvió a centrifugar. Se combinaron los dos sobrenadantes y se centrifugaron a 27.000 x g durante 30 min a 4° para formar la fracción de BBMV. Se suspendió la pella en Regulador de pH de Almacenamiento de BBMV (HEPES 10 mM, KCI 130 mM, 1 0% de glicerol, pH 7.4) a una concentración de la proteína de aproximadamente 3 mg/ml. Se determinó la concentración proteica utilizando Albúmina Sérica Bovina (BSA) como estándar. Se realizó la determinación de fosfatasa alcalina (una enzima marcadora para la fracción de BBMV) antes de congelar las muestras utilizando el Kit de Análisis de Fosfatasa Alcalina QuantiChrom™ DALP-250 (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima se incrementó por lo general 7 veces en comparación con la encontrada en la fracción inicial de homogenato de intestino medio. Se dividieron las BBMV en alícuotas de 250 µ? de muestras, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°.

Electroforesis.

Se llevó a cabo el análisis de las proteínas por SDS-PAGE en condiciones de reducción (es decir en ß-mercaptoetanol 5%, BME) y desnaturalización (es decir que se calentaron durante 5 minutos a 90° en presencia de 2% de SDS) Se cargaron las proteínas en los pozos de un gel de poliacrialmida de Tris-Glicina al 4% a 20% (BioRad; Hercules, CA) y se las separó a 200 voltios por espacio de 60 minutos. Se detectaron las bandas de proteína mediante tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250 (BioRad) durante una hora y se las decoloró con una solución de metanol al 5% en ácido acético al 7%. Se tomaron imágenes de los geles y se los analizó utilizando un Fluro-S Multi Imager™ de BioRad. Se determinaron los pesos moleculares relativos de las bandas de proteína mediante la comparación de las movilidades de las proteínas de peso molecular conocido observadas en una muestra de la proteina Ladder Bench ark™ (Life Technologies, Rockville, MD) cargada en un pozo del gel.

Yodación de las proteínas de toxina núcleo CrylCa o Cry1 Ab. Se yodó la proteína de toxina núcleo purificada CrylCa o la proteína de toxina núcleo CryIAb utilizando Perlas de Yodación Pierce (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). En pocas palabras, se lavaron dos Perlas de Yodación dos veces con 500 mi de PBS (fosfato de sodio 20 mM, NaCI 0.15 M pH7.5), y se colocaron en un tubo de centrífuga de 1.5 mi con 100 µ? de PBS. Se agregó 0.5 mCí de yoduro de sodio marcado con 1251 y se dejó que los componentes reaccionaran durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó 1 pg de la proteína de toxina núcleo Cryl Ca (o 1 pg de la proteina de toxina núcleo CryIAb) a la solución y se dejó que reaccionara durante 3 a 5 minutos más. Se dio por terminada la reacción pipeteando la solución de las Perlas de Yodación y aplicándola a una columna de espín Zeba™ (Invitrogen) equilibrada en CAPS 50 mM, pH 10.0, DTT 1 mM (ditíotreitol), EDTA 1 mM y 5% de glicerol. Se lavaron las Perlas de Yodación dos veces con 10 µ? de PBS y también se aplicó la solución de lavado a la columna de deslación Zeba™. La solución radioactiva se eluyó a través de una columna de espín mediante centrifugación a 1.000 x g por espacio de 2 min. A continuación se dializó la proteína de toxina núcleo CryICa (o la proteína de toxina núcleo CryIAb) marcada con 1251 contra CAPS 50 mM CAPS, pH 10.0, DTT 1 mM, EDTA 1 mM y 5% de glicerol.

Captación de Imágenes.

Se determinó la radiopureza de las proteínas de toxina núcleo yodadas CryI Ca o CryIAb por SDS-PAGE y captación de fosforoimágenes. En pocas palabras, se secaron geles de SDS-PAGE utilizando un aparato secador de geles BioRad siguiendo las instrucciones del fabricante. Se captaron imágenes de los geles secos envolviéndolos en una película Mylar (12 pm de espesor) y exponiéndolos a detección de fósforo en almacenamiento de Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. Se revelaron las placas utilizando un Molecular Dynamics Storm 820 formador de fosforoimágenes y se analizó la imagen utilizando el software ImageQuant™.

EJEMPLO 4 Unión de la proteina de toxina núcleo Cry1 marcada con 1251 a las BBMVs de Spodoptera fruqiperda Se generó una curva de saturación para determinar la cantidad óptima de proteína BBMV para usar en los ensayos de unión con las proteínas de toxina núcleo CryI Ca y CryIAb. Se incubó 0.5 nM de la proteína de toxina núcleo Cry1 radiomarcada con 1251 durante 1 h a 28° en regulador de pH de unión (NaHP04 8 mM, KH2P04 2 mM, NaCI 150 mM, 0.1 % de BSA, pH 7.4) con cantidades de proteína BBMV en el rango de 0 pg/ml a 500 pg/ml (volumen total de 0.5 mi). Se separó la proteína de toxina núcleo Cry1 marcada con 1251 unida a las proteínas BBMV de la fracción no unida tomando muestras de 150 µ? de la mezcla de reacción por triplicado en tubos de centrífuga separados de 1.5 mi y centrifugandp las muestras a 14.000 x g por espacio de 8 minutos a temperatura ambiente. Se separó suavemente el sobrenadante y se lavó la pella tres veces con regulador de pH de unión helado. Se cortó el fondo del tubo de centrífuga que contenía la pella, se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm y se contaron las muestras durante 5 minutos cada una en un contador gamma. Se representaron las CPM (cuentas por minuto) obtenidas contra las CPM de fondo (reacción sin proteína BBMV) contra la concentración de proteína BBMV. De acuerdo con los resultados informados por otros (Luo ef al. 999), se determinó que la concentración óptima de la proteína BBMV para usar en los ensayos de unión era de 150 pg/ml.

EJEMPLO 5 Ensayos de unión competitiva a BBMVs de S. frupiperda con proteínas de toxina núcleo de CryIAb y CryICa Se llevaron a cabo ensayos de unión competitiva homologa y heteróloga usando 150 pg/ml de la proteína BBMV de S. frugiperda y 0.5 nM de la proteína de toxina núcleo CryI Ca radiomarcada con 1251. Las concentraciones de la proteína de toxina núcleo competitiva sin radiomarcar CryIAb agregadas a la mezcla de reacción estuvieron en el rango de 0.045 nM a 300 nM y fueron agregadas al mismo tiempo que la proteína de toxina núcleo radiactiva CryICa, a fin de garantizar una verdadera competencia de unión. Se llevaron a cabo incubaciones durante 1 h a 28° y se midió la cantidad de proteína de toxina núcleo CryICa marcada con 1251 unida a la BBMV (unión específica) de la manera antes descrita. La unión no especifica estuvo representada por las cuentas obtenidas en presencia de 1.000 nM de proteina de toxina núcleo no radiomarcada Cry Ca. Se consideró que cien por ciento de unión total era la cantidad de unión en ausencia de la proteína de toxina núcleo CryIAb competidora.

Los ensayos de unión a receptores utilizando la proteína de toxina núcleo CryI Ca marcada con 1251 determinaron la capacidad de la proteina de toxina núcleo CryIAb para desplazar este ligando radiomarcado del sitio de unión de las BBMVs de S. frugiperda. Los resultados (Figura 1 ) demuestran que la proteína de toxina núcleo CryIAb no desplazó la proteína de toxina núcleo CryI Ca unida radiomarcada con 1251 de su proteína (o proteínas) receptora en concentraciones de hasta 300 nM (600 veces la concentración del ligando radiactivo de unión). Como se estimaba, la proteína de toxina núcleo CryI Ca sin marcar pudo desplazar la proteína de toxina núcleo CryI Ca radiomarcada de su proteína (o proteínas) de unión, exhibiendo una curva sigmoidal de respuesta a la dosis con 50% de desplazamiento producido a los 5 nM.

De esa manera queda indicado que la proteína de toxina núcleo CryI Ca interactúa con un sitio de unión de BBMV de S. frugiperda que no se une a la proteína de toxina núcleo CryIAb.

EJEMPLO 6 Ensayos de unión competitiva de las BBMVs de S. frugiperda con las proteínas de toxina núcleo de CryICa y CryIAb Se llevaron a cabo ensayos de unión competitiva homologa y heteróloga usando 150 pg/ml de la proteína BBMV de S. frugiperda y 0.5 nM de la proteína de toxina núcleo CryIAb radiomarcada con 1251. Las concentraciones de la proteína de toxina núcleo competitiva sin radiomarcar CryICa agregadas a la mezcla de reacción estuvieron en el rango de 0.045 nM a 1000 nM y fueron agregadas al mismo tiempo que la proteína de toxina núcleo radiactiva CryIAb, a fin de garantizar una verdadera competencia de unión. Se llevaron a cabo incubaciones durante 1 h a 28° y se midió la cantidad de proteína de toxina núcleo CryIAb marcada con 1251 unida a la BBMV (unión específica) de la manera antes descrita. La unión no específica estuvo representada por las cuentas obtenidas en presencia de 1.000 nM de proteína de toxina núcleo no radiomarcada CryIAb. Se consideró que cien por ciento de unión total era la cantidad de unión en ausencia de una proteína de toxina núcleo CryI Ca competidora.

Los ensayos de unión a receptores utilizando la proteína de toxina núcleo CryIAb marcada con 1251 determinaron la capacidad de la proteína de toxina núcleo CryICa para desplazar este ligando radiomarcado del sitio de unión de las BBMVs de S. frugiperda. Los resultados (Figura 2) demuestran que la proteína de toxina núcleo CryI Ca no desplazó la proteína de toxina núcleo CryIAb unida radiomarcada con 1251 de su proteína (o proteínas) receptora en concentraciones de hasta 300 nM (600 veces la concentración del ligando radiactivo de unión). Como se estimaba, la proteína de toxina núcleo CryIAb sin marcar pudo desplazar la proteína de toxina núcleo CryIAb radiomarcada de su proteina (o proteínas) de unión, exhibiendo una curva sigmoidal de respuesta a la dosis con 50% de desplazamiento producido a los 5 nM.

De esa manera queda indicado que la proteína de toxina núcleo CryIAb interactúa con un sitio de unión de BBMV de S. frugiperda que no se une a la proteína de toxina núcleo CryI Ca.

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No. Autores Año Cepa origen Comentario Crv1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstaki HD1 Crv1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto Crv1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7 Crv1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus Crv1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7 Crv1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Crv1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12 Cry1Aa8 126149 Liu 1996 Sólo secuencia de ADN Bt dendrolimus Crv1Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 T84A1 CrvIAalO AAD55382 Hou y Chen 1999 Bt kurstaki HD-1-02 Crv1Aa11 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki Crv1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30 Crv1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto Crv1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 sin publicar Crv1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt lNTA Mol-12 Crv1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab2 AAA22613 T orne et al 1986 Bt kurstaki Crv1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1 Cry1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1 Cry1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 Bt kurstaki NRD-12 Crv1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1 Cry1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7 Crv1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 Bt aizawai HD133 Crv1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab11 112419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Sólo secuencia de ADN Cry1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93 Crv1Ab13 AAN76494 Tan el al 2002 Bt c005 Crv1Ab14 eza-Basso & AAG 16877 Theoduloz 2000 Bt Nativo chileno Crv1Ab15 AAO13302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv1Ab16 AA 55546 Yu et al 2002 Bt AC-11 Crv1Ab17 AAT46 15 Huang et al 2004 Bt WB9 Crv1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt Crv1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2 Crv1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008 Cry1Ab21 ABS 18384 Swiecicka el al 2007 Bt IS5056 Crv1Ab22 ABW87320 Wu y Feng 2008 BtS2491Ab Crv1Ab-like AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 secuencia incierta Crv1Ab-like AAK14337 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 secuencia incierta Crv1Ab-like AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 secuencia incierta CrvlAb-like ABG88858 Lin et al 2006 Bt Iy4a3 secuencia insuficiente Crv1Ac1 AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73 Crv1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae Crv1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A Crv1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A1 Crv1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 Bt kurstaki PS81GG Crv1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Crv1Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73 Crv1Ac8 AAC44841 Omolo et al 1997 Bt kurstaki HD73 Crv1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732 CrvlAdO CAA05505 Sun Bt kurstaki YBT- 1997 1520 Makhdoom & Crv1Ac1 1 CAA10270 1998 Riazuddin Crv1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 Sólo secuencia de AON Crv1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1 Crv1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30 Crv1Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt de Taiwan Crv1Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3 Crv1Ac17 AAX 18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549 Crv1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729 Crv1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33 Crv1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005 Crv1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA ol-12 Crv1Ac22 ABZ01836 Z ang & Fang 2008 Bt W015-1 Crv1Ac23 CAQ30431 Kashyap et al 2008 Bt Crv1Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Cry1Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6 Sin vine. NCBl Julio 09 Cry1Ac26 FJ617446 Guan Peng et al 2009 Bt Tm41-4 Sin vine. NCBl Julio 09 Cry1Ac27 FJ617447 Guan Peng et al 2009 Bl Tm44-1 B Sin vine. NCBl Julio 09 Crv1Ac28 AC 90319 Li et al 2009 Bt Q- 2 Crv1Ad1 AAA22340 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81 I Cn lAd2 CAA01880 Anonymous 1995 Bt PS81 RR1 Crv1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti Crv1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423 Crv1Aa1 AAD46137 ustafa 1999 Cn/1Ah1 AAQ 14326 Tan et al 2000 Crv1Ah2 ABB76664 Qi el al 2005 Bt alesti Crv1A¡1 AA039719 Wang et al 2002 Crv1A-like AAK1 339 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3 Crv1 Ba1 Bt Ihuringiensis CAA29898 Brizzard & Whiteley 1988 HD2 Crv1Ba2 Bt entomocidus CAA65003 Soetaerl 1996 HD110 Crv1Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001 Crv1 Ba4 AAK51084 Bt enlomocidus Nathan et al 2001 HD9 Crv1 Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12 Crv1 Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bl S601 Crv1Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847 CrvlBd CAA86568 Bishop et al 1994 Bt morrisoni Crv1Bd1 AAD10292 Kuo et al Bl wuhanensis 2000 HD525 Crv1 Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt 834 Crv1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 Bt PS158C2 Crv1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003 Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009 Bt Sin vine. NCBl Julio 09 Crv1Bf1 CAC50778 Arnaut et al 2001 Crv1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003 Crv1Bq1 AAO39720 Wang et a! 2002 CrvlCal CAA30396 Bt entomocidus Honee et al 1988 60.5 Crv1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Bt aizawai 7.29 Crv1Ca3 AAA22343 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81 I Crv1Ca4 CAA01886 Van Mellaert el al Bt entomocidus 1990 HD1 10 Crv1Ca5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29 Crv1Ca6 AAF37224 Yu el al 2000 Bt AF-2 Crv1 Ca7 AAG50438 Aixing et al 2000 Bt J8 Crv1 Ca8 AAM00264 Chen et al 2001 Bt C002 Cry1Ca9 AAL79362 ao et al 2003 Bt G10-01A Cn 1Ca10 AAN16462 Lin et al 2003 Bt E05-20a Crv1Ca11 AAX53094 Caí et ai 2005 Bt C-33 Crv1Cb1 M97880 Kalman et al 1993 Bt galleriae H029 Sólo secuencia de ADN Crv1Cb2 AAG35409 Song et al 2000 Bt C001 Crv1Cb3 ACD50894 Huang et al 2008 Bt 087 CrvlCb-like AAX63901 Thammasittirong et al 2005 Bt TA476-1 secuencia insuficiente CrYlDal CAA38099 Hofte et al 1990 Bt aizawai HD68 Crv1Da2 176415 Payne & Sick 1997 Sólo secuencia de ADN Cn 1Db1 CAA80234 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1 Db2 AAK48937 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 CrvlDd ABK35074 Lert iriyawong et al 2006 Bt JC291 Crv1 Ea1 CAA37933 Visser et al 1990 Bt kenyae 4F1 Cry1 Ea2 CAA39609 Bosse et al 1990 Bt kenyae Crv1Ea3 AAA22345 Feitelson 1991 Bt kenyae PS81F Crv1Ea4 AAD04732 Barboza-Corona et al 1998 Bt kenyae LBIT-147 Crv1 Ea5 A15535 Botterman et al 1994 Sólo secuencia de ADN Crv1Ea6 AAL50330 Sun et al 1999 Bt YBT-032 Crv1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 Bt JC190 Crv1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2 Crv1Eb1 AAA22346 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81A2 Crv1Fa1 AAA22348 Chambers et al 1991 Bt aizawai EG6346 Crv1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81 I Crv1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1Fb2 BAA25298 Masuda & Asano 1998 Bt morrisoni INA67 Crv1Fb3 AAF21 67 Song et al 1998 Bt morrisoni Crv1Fb4 AAC 10641 Payne et al 1997 Crv1Fb5 AA013295 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt 012 Crv1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087 Crv1Ga1 CAA80233 Lamber! 1993 Bt BTS0349A Crv1Ga2 CAA70506 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensís Crv1Gb1 AAD10291 Kuo & Chak Bt wuhanensís 1999 HD525 Crv1Gb2 AA013756 Li et al 2000 Bt B-Pr-88 CrvlGc AAQ52381 Baum el al 2003 Crv1Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA Crv1Hb1 AAA79694 oo et al 1995 Bt morrisoni BF190 CtYl H-like AAF01213 Srifah et al 1999 BUC291 secuencia insuficiente Crvilal CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki Crv1 la2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki Crv1 la3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1 Cn/1 la4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88 Crv1la5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61 Crv1 la6 AAC26910 Zhong et al 1998 Bt kurstaki S101 Crv1 la7 AAM73516 Porcar et al 2000 Bt Crylla8 AA 66742 Song et al 2001 Crv1 la9 AAQ08616 Yao et al 2002 Bt Ly30 Crv1 la10 AAP86782 Espíndola et al 2003 Bt thuringiensis Crv1la11 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3 Cn 1 la12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt Crv1la13 ABF83202 artins et al 2006 Bt Crv1la14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt1 1 Cry1la15 FJ617445 Guan Peng et al 2009 Bt E-1B Sin vine. NCBI Julio 2009 Cr 1la16 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1A Sin vine. NCBI Julio 2009 . Q0¡. Bt entomocidus Crv1lb1 AAA821 14 Shin et al l aa5 BP465 Crv1lb2 ABW88019 Guan et al 2007 Bt PP61 Crv1lb3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8 Crvlld AAC62933 Osman et al 1998 B1 C18 Crv1lc2 AAE71691 Osman et al 2001 Crvlldi AAD44366 - Choi 2000 Crv1le1 AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007 CryllM AAQ52382 Baum et al 2003 Crv1l-like AAC31094 Payne et al 1998 secuencia insuficiente Crv1 l-like ABG88859 Un & Fang 2006 Bt Iy4a3 secuencia insuficiente CrvUal AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847 Von Tersen & CrvUbl AAA98959 1994 - Bt EG5092 González CrvUd AAC31092 Payne et al 1998 Crv1Jc2 AAQ52372 Baum et al 2003 CrvUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt Crv1Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190 Crv1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1 Crv1-like AAC31091 Payne et al 1998 secuencia insuficiente Crv2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki Crv2Aa2 AAA83516 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Sólo secuencia de ADN Crv2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 Bt kenyae HD549 Crv2Aa5 CAA 10671 Yu & Pang 999 Bt SL39 Crv2Aa6 CAA 10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71 Crv2Aa7 CAA 10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29 Crv2Aa8 AA013734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66 Crv2Aa9 AA013750 Zhang et al 2000 Crv2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001 Crv2Aa11 AAQ 52384 Baum et al 2003 Crv2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39 Crv2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Crv2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550 Crv2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002 Crv2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30 Crv2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7 Crv2Ab7 AAZ66347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1 Crv2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2 Crv2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6 Crv2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD Crv2Ab11 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt C BL-BT1 Crv2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD Crv2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Ctv2Ab14 ACG76121 Z u et al 2008 Bt Bts Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1 Crv2Ac2 AAG35 10 Song et al 2000 Crv2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003 Crv2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9 Crv2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005 Crv2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis Crv2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1 Crv2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt C BL-BT1 Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ac10 ABN15104 Bai et al 2007 Bt QCL- Crv2Ac11 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt C BL-BT3 Crv2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30 Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10 Crv2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1) Crv2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt C BL-BT2 Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003 Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81 Crv2Aq ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2 Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Sin vine. NCBI Julio 09 Crv2Ah2 ACL80665 Zhang el al 2009 Bt B C-ZQL3 Cry2Ai FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt Sin vine. NCBI Julio 09 Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego CrY3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis Crv3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987 Cn/3Aa4 AAA22542 cPherson et al 1988 Bt tenebrionis Crv3Aa5 AAA50255 Bt morrisoni Donovan et al 1988 EG2158 Crv3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis Crv3Aa7 CAB41411 Zhang el al 1999 Bt 22 Crv3Aa8 AAS79487 Gao y Caí 2004 Bt Y -03 Crv3Aa9 AAW05659 Bulla y Candas 2004 Bt UTD-001 Crv3Aa10 AAU29 1 1 Chen et al 2004 Bt 886 Crv3Aa1 1 AAW82872 Kurt el al 2005 Bt tenebrionis m2 CrY3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis Crv3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolworthi 43F Crv3Ba2 CAA006 5 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208 Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961 Crv3Bb2 . AAA7 198 Donovan et al 1995 Bt EG5144 Crv3Bb3 115475 Peferoen et al 1995 Sólo secuencia de ADN Crv3Ca1 CAA42469 Lambert et al 1992 Bt Kurstaki Btl109P Crv4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt ¡sraelensis Cry4Aa2 BAA00179 Bt ¡sraelensis Sen et al 1988 HD522 Cry4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt ¡sraelensis Crv4A-like AAY96321 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 secuencia insuficiente Bt israelensis 4Q2- Crv4Ba1 CAA30312 Chungjatpornchai et al 1988 72 CrY4Ba2 CAA30114 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis Crv4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis Crv4Ba4 Bt ¡sraelensis BAA00178 Sen et al 1988 HD522 Crv4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt ¡sraelensis Crv4Ba-like ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 secuencia insuficiente Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 Bt HS18-1 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Bt MC28 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv5Aa1 AAA67694 Bt darmstadiensis Narva et al 1994 PS17 Crv5Ab1 AAA67693 Narva et al Bt darmstadiensis 1991 PS17 Crv5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Sólo secuencia de ADN Crv5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366 Crv5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q3 Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bl PS52A1 Crv6Aa2 AAM46849 Bai et al 2001 YBT 1518 Crv6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418 Crv68a1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1 Bt galleriae Crv7Aa1 AAA22351 Lambert et al 1992 PGSI245 Crv7Ab1 AAA21120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511 Bt kumamotoensis Crv7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 1994 867 Crv7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt W2-9 Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Sin vine. NCBI Julio 09 Crv7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola et al 2008 Bt monterrey GM-33 Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122 Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin vine. NCBI Sept 09 Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin vine. NCBI Nov 09 Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis Crv7Ca1 AB 67863 Gao et al 2007 Bl BTH-13 Crv7Da1 ACQ99547 Y¡ et al 2009 Bt LH-2 Crv8Aa1 AAA21117 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis Cry8Ab1 EU044830 Cheng el al 2007 Bt B-JJX Sin vine. NCBI Julio 09 Crv8Ba1 AAA21 118 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002 Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002 Cn 8Ca1 AAA21 1 19 Sato et al. 1995 Bt japonensis Buibui Crv8Ca2 AA 98783 Shu el al 2004 Bt HBF-1 Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Bt FTL-23 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae Crv8Da2 BD133574 Asano el al 2002 Bt Sólo secuencia de ADN Crv8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt Sólo secuencia de ADN Crv8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5 Crv8Ea1 AAQ73470 Fuping el al 2003 Bt 185 Cry8Ea2 EU047597 üu et al 2007 Bt B-DLL Sin vine. NCBI Julio 09 Crv8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 Bt 185 also AAW81032 Crv8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18 Crv8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145 Cry8Ga3 FJ 198072 Xiaodong et al 2008 Bt FCD1 14 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry8la1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry8Ja1 EU625348 Du et al 2008 Bt FPT-2 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry8Ka1 FJ422558 Quezado et al 2008 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae Crv8-like FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis Sólo secuencia de ADN Crv8-like ABS53003 Mangena et al 2007 Bt Crv9Aal CAA41122 Shevelev et al 1991 Bt galleriae Crv9Aa2 CAA41 25 Gleave et al 1992 Bt DSIR517 Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2) Sin vine. NCBI Julio 09 Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Bt T03C001 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv9Aa like AAQ52376 Baum et al 2003 secuencia incompleta Crv9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae Crv9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis Cry9Ca1 CAA85764 Lambert et al 1996 Bt tolworthi Cry9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003 Crv9Da1 BAA19948 Asano 1997 Bt japonensis N141 Crv9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019 Crv9Ea1 BAA34908 idoh & Oyama 1998 Bt aizawai SSK-10 Crv9Ea2 AA012908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv9Ea3 AB 21765 Un el al 2006 Bt lyA Crv9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt y c5-4 Crv9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts Crv9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 1 1 Cry9Ea7 FJ380927 Sun et al 2008 Sin vine. NCBI Julio 09 Cry9Ea8 GQ249292 Su et al 2009 GQ249292 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001 Cry9Eb2 GQ249298 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin vine. NCBI Julio 09 Crv9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae Crv9Edl AAX78440 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019 Cry9Ee1 GQ249296 Su et al 2009 Bt T03B001 Sin vine. NCBI Ago. 09 Crv9-like AAC63366 Wasano et al 1998 Bt galleriae secuencia insuficiente Cry10Aa1 AAA2261 Thorne et al 1986 Bt israelensis Bt israelensis ONR- Crv10Aa2 E00614 Aran & Toomasu 1996 Sólo secuencia de ADN 60A Crv10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv10A-like DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9 secuencia incompleta Crv11Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis Crv11Aa2 AAA22611 Adams et al 1989 Bt israelensis Crv11Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv11Aa-like DQ 166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9 secuencia incompleta Crv11Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367 Crv11Bbl AAC97162 Orduz el al 1998 Bt medellin Crv12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2 Crv13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bl sotto PS80JJ1 Crv15Aa1 AAA22333 Brown & W iteley 1992 Bt t ompsoni Crv16Aa1 CAA63860 Barloy et al 1996 Cb malaysia CH18 Crv17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18 Crv18Aa1 CAA67506 Zhang et al 1997 Paenibacillus popilliae Crv18Ba1 AAF89667 Patel el al 1999 Paenibacillus popilliae Crv18Ca1 AAF89668 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae Crv19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367 Crv19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo Crv20Aa1 AAB93476 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis Crv20Ba1 ACS93601 Noguera 8? Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976 Crv20-like GQ144333 Yi et al 2009 Bt Y-5 Sólo secuencia de ADN Crv21Aa1 I32932 Payne et al 1996 Sólo secuencia de ADN Crv21Aa2 I66477 Feitelson 1997 Sólo secuencia de ADN Crv21 Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis Crv22Aal I34547 Payne et al 1997 Sólo secuencia de ADN Crv22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt Crv22Aa3 ACD93211 Du et al 2008 Bt FZ-4 Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140 Crv22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Binario con Cry37Aa1 Crv24Aa1 AAC61891 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv24Cal CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41 Crv25Aa1 AAC61892 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Crv26Aa1 AAD25075 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B- 166 Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo Crv28Aa1 AAD24189 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1161 Crv28Aa2 AAG00235 Moore y Debro 2000 Bt finitimus Crv29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin Cry30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Ba1 BAD00052 lio et al 2003 Bt entomocidus Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv30Ca2 ACU24781 Sun y Park 2009 Bt jegathesan 367 Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 Sin vine. NCBI Julio09 Crv30Db1 BAE80088 Kishida et al 2006 Bt aizawai BUN1-14 Crv30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1 Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 Sin vine. NCBI Julio09 Crv30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28 Crv30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS18-1 Crv31Aa1 BAB11757 Saito & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-11 Crv31Aa2 AAL87458 Jung y Cote 2000 Bt M15 Cn/31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25 Crv31Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10 Cr¾3lAb1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5 Crv31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29 Crv32Aa1 AAG3671 1 Balasubramanian al 2001 Bt yunnanensis Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt Crv32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt Crv33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota Crv34Aa1 AAG50341 Ellís et al 2001 Bt PS80JJ1 Binario con Cry35Aa1 Crv34Aa2 AAK64560 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binario con Cry35Aa2 Crv34Aa3 AAT29032 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binario con Cry35Aa3 Crv34Aa4 AAT29030 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binario con Cry35Aa4 Crv34Ab1 AAG 1671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binario con Cry35Abi Crv34Ac1 AAG501 18 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binario con Cry35Ac1 Crv34Ac2 AAK64562 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binario con Cry35Ab2 Crv34Ac3 AAT29029 Schnepf et al 2004 Bt KR1369 Binario con Cry35Ab3 Crv34Ba1 AAK64565 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binario con Cry35Ba1 Crv34Ba2 AAT29033 Schnepf et al 2004 . Bt PS201L3 Binario con Cry35Ba2 Crv34Ba3 AAT29031 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2 Binario con Cry35Ba3 Crv35Aa1 AAG50342 Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binario con Cry34Aa1 Crv35Aa2 AAK64561 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binario con Cry34Aa2 Crv35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binario con Cry34Aa3 Crv35Aa4 AAT29025 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binario con Cry34Aa4 Crv35Ab1 AAG41672 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binario con Cry34Ab1 Crv35Ab2 AAK64563 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binario con Cry34Ac2 Crv35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Binario con Cry34Ab3 Crv35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binario con Cry34Ac1 Crv35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binario con Cry34Ba1 Crv35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 Bt PS201 L3 Binario con Cry34Ba2 Crv35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Bt PS201 HH2 Binario con Cry34Ba3 Crv36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt Crv37Aa1 AAF76376 Oonovan et al 2000 Bt Binario con Cry23Aa Crv38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt Crv39Aa1 BAB72016 Ito el al 2001 Bt aizawai Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14 Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin vine. NCBI Julio09 Cn/40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2 Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A 1462 Crv41Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A 1462 Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462 P. lentimorbus Crv43Aa1 BAD15301 Yokoyama y Tanaka 2003 semadara Crv43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae P. lentimorbus Crv43Ba1 BAD15303 Yokoyama y Tanaka 2003 semadara P. lentimorbus Crv43-like BAD15305 Yokoyama y Tanaka 2003 semadara Bt entomocidus Crv44Aa BAD08532 ito et ai 2004 INA288 Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22 Crv46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota Crv46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470 Ctv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt Crv47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890 Crv48Aa CAJ18351 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 binario con 49Aa Crv48Aa2 CAJ86545 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B binario con 49Aa2 Crv48Aa3 CAJ86546 Jones y Berry 2006 Bs NHA15b binario con 49Aa3 Crv48Ab CAJ86548 Jones y Berry 2006 Bs LP1G binario con 49Ab1 Crv48Ab2 CAJ86549 Jones y Berry 2006 Bs 2173 binario con 49Aa4 Crv49Aa CAH 56541 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 binario con 48Aa Crv49Aa2 CAJ86541 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B binario con 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones y Berry 2006 BsNHA15b binario con 48Aa3 Crv49Aa4 CAJ86544 Jones y Berry 2006 Bs 2173 binario con 48Ab2 Crv49Ab1 CAJ86542 Jones y Berry 2006 Bs LP1G binario con 48Ab1 Crv50Aa1 BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto Crv51Aa1 AB114444 Meng et al 2006 Bt F14-1 Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 Sin vine. NCBI Julio09 Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 Sin vine. NCBI Julio09 Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 Sin vine. NCBI Julio09 Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al 2008 Bt C28 Sin vine. NCBI Julio09 Crv54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt MC28 Crv55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41 Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin vine. NCBI Julio09 Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 Sin vine. NCBI Ago.09 Crv57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bl kim Crv58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus Cry59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980 PNAS 93.

V¡p3Aa1 V¡p3Aa AAC37036 Estruc et al 1996 AB88 5389-5394 PNAS 93.

V¡p3Aa2 Vip3Ab AAC37037 Estruch et al 1996 AB424 5389-5394 EUA 6137033 V¡p3Aa3 V¡p3Ac Estruch et al 2000 Oct 2000 W09818932 V¡p3Aa4 EUA 6656908 PS36A Sup AAR81079 Feitelson et al 1998 Bt PS36A (A2.A3) 7 Dic 2003 Mayo 1998 W09818932 EUA 6656908 Vip3Aa5 PS81 F Sup AAR81080 Feitelson et al 1998 Bt PS81 F (A2.A3) 7 Dic 2003 Mayo 1998 W09818932 EUA 6656908 V¡p3Aa6 Jav90 Sup AAR81081 Feitelson et al 1998 Bt (A2.A3) 7 Dic 2003 Mayo 1998 V¡p3Aa7 Vip83 AAK95326 Caí et al 2001 sin publicar Bt YBT-833 Vip3Aa8 Vip3A AAK97481 Loguercio et al 2001 sin publicar Bt HD125 Selvapandiyan Vip3Aa9 VipS CAA76665 2001 sin publicar Bt A13 et al Protein Expr.

Vip3Aa10 V¡p3V AAN60738 Doss et al 2002 Purif. 26. 82- Bt 88 Vip3Aa1 1 Vip3A AAR36859 Liu et al 2003 sin publicar Bt C9 V¡p3Aa12 Vip3A-WB5 AAM22456 Wu y Guan 2003 sin publicar Bt Sheng Wu Gong Cheng Vip3Aa13 Vip3A AAL69542 Chen et al 2002 Xue Bao 18, Bt S184 687-692 Vip3Aa14 Vip AAQ 12340 Polumetla et al 2003 sin publicar Bt tolworthi Vip3Aa15 Vip3A AAP51131 Wu et al 2004 sin publicar BI WB50 FEMS Micro Vip3Aa16 Vip3LB AAW65132 esrati et al 2005 Lett 244, 353- Bt 358 W09957282 EUA 6603063 Vip3Aa17 Jav90 Feitelson et al Javelin 1999 (A2.A3) Ago. 2003 1990 11 Nov 1999 Vip3Aa18 AAX49395 Cai y Xiao 2005 sin publicar Bt 9816C Vip3Aa19 Vip3ALD 'DQ241674 Liu et al 2006 sin publicar Bt AL Vip3Aa19 Vip3A-1 OQ539887 Hart et al 2006 sin publicar Vip3Aa20 Vip3A-2 DQ 539888 Hari et al 2006 sin publicar Vip3Aa21 Vip ;ABD84410 Panbangred 2006 sin publicar Bt aizawai Vip3Aa22 Vip3A-LS1 AAY41427 Lu et al 2005 sin publicar Bt LS1 Vip3Aa23 Vip3A-LS8 ¡AAY41428 Lu et al 2005 sin publicar Bt LS8 Vip3Aa24 ,BI 880913 Song et al 2007 sin publicar Bt WZ-7 Vip3Aa25 EF608501 Hsieh et al 2007 sin publicar Vip3Aa26 EU294496 S en y Guo 2007 sin publicar Bt TF9 Vip3Aa27 EU332167 Shen y Guo 2007 sin publicar Bt 16 Vip3Aa28 FJ494817 Xiumei Yu 2008 sin publicar Bt JF23-8 Vip3Aa29 FJ626674 Xieumei el al 2009 sin publicar Bt JF21-1 Vip3Aa30 FJ626675 Xieumei et al 2009 sin publicar MD2-1 Vip3Aa31 ÍFJ626676 Xieumei et al 2009 sin publicar JF21-1 Vip3Aa32 FJ626677 Xieumei et al 2009 sin publicar MD2-1 W09957282 EUA 6603063 Bt KB59A4 Vip3Ab1 Vip3B AAR40284 Feitelson et al 1999 (A2.A3) Ago 2003 6 11 ov 1999 Vip3Ab2 Vip3D AAY88247 Feng y Shen 2006 sin publicar Bt Solicitud EUA Vip3Ac1 PS49C Narva et al 20040128716 Solicitud EUA Vip3Ad1 PS158C2 Narva et al 20040128716 Vip3Ad2 ISP3B CAI43276 Van Rie et al 2005 sin publicar Bt Vip3Ae1 ISP3C ;CAI43277 Van Ríe et al 2005 sin publicar Bt Vip3Af1 ISP3A ÍCAI43275 Van Rie et al 2005 sin publicar :Bt Vip3Af2 Vip3C ADN08753 Syngenta wd 03/075655 WO Vip3Ag1 Vip3B ADN08758 Syngenta 02/078437 Vip3Ag2 'FJ556803 Audtho et al 2008 Bt Vip3Ah1 Vip3S DQ832323 Li y Shen 2006 sin publicar Bt V¡p3Ba1 AAV70653 ang et al 2004 sin publicar Vip3Bb1 Vip3Z ADN08760 Syngenta )^ n,ce„ Vip3Bb2 EF439819 Akhurst et al 2007

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida CryiC y ADN que codifica una proteína insecticida CryIAb. 2 - Una semilla de una planta de la reivindicación 1. 3. - Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el ADN que codifica una proteína insecticida Cry Ca y ADN que codifica una proteína insecticida CryIAb han sido introgredidos en dicha planta. 4. - Una semilla de una planta de la reivindicación 3. 5. - Un campo de plantas que comprende plantas refugio sin Bt y una pluralidad de plantas transgénicas de la reivindicación 1 , en donde dichas plantas refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 6. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 7. - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 8.- El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas refugio comprenden menos de 10% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 9 - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 10 - El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas refugio están dispuestas en bloques o bandas. 1 1. - Una mezcla de semillas que comprende semillas refugio de plantas refugio sin Bt y una pluralidad de semillas de la reivindicación 7, en donde dichas semillas refugio comprenden menos de 40% del total de semillas de la mezcla. 12. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dichas semillas refugio comprenden menos de 30% del total de semillas de la mezcla. 3. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas refugio comprenden menos de 20% del total de semillas en la mezcla. 14. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas refugio comprenden menos de 10% del total de semillas en la mezcla. 15. - La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dichas semillas refugio comprenden menos de 5% del total de semillas en la mezcla. 16. - Un método para controlar el desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, dicho método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5. 17. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , dicha planta comprende además ADN que codifica una proteína con contenido de toxina núcleo Cry Fa. 18.- Un campo de plantas que comprende plantas refugio sin Bt y una pluralidad de plantas de maíz de la reivindicación 17, en donde dichas plantas refugio comprenden menos de aproximadamente 20% de todas las plantas de cultivo de dicho campo. 19. - Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de la reivindicación 17, en donde dicho campo comprende menos de aproximadamente 0% de plantas refugio. 20. - Un método para controlar el desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 19. 21.- Un composición para controlar plagas de lepidópteros que comprende células que expresan cantidades efectivas tanto de una proteína con contenido de toxina núcleo CryIAb como de una proteína con contenido de una toxina núcleo CryI C. 22 - La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque comprende un huésped transformado para expresar tanto una proteína con contenido de toxina núcleo CryIAb como de una proteína con contenido de una toxina núcleo CryI C, en donde dicho huésped es un microorganismo o una célula vegetal. 23.- Un método controlar plagas de lepidópteros que comprende presentar a dichas plagas o al ambiente de dichas plagas una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 21. 24 - Un campo de la reivindicación 5 o 18, EN donde dichas plantas ocupan más de 10 acres (4.04 ha). 25. - Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3 y 17, en donde dicha planta es seleccionada del grupo que consiste en maíz, soja, caña de azúcar y algodón. 26. -Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3 y 17, en donde dicha planta es una planta de maíz. 27. - Una célula vegetal de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 25 y 26, en donde dicha célula vegetal comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI C y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryIAb, en donde dicha proteína insecticida CryI C es al menos 99% idéntica con la SEQ ID NO. 2, y dicha proteína insecticida CryI D es al menos 99% idéntica con SEQ ID NO: 3. 28.- Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 17, 25 y 26, en donde dicha proteína insecticida Cry C comprende SEQ ID NO: 2; y dicha proteína insecticida CryIAb comprende SEQ ID NO: 3.