MX2012007122A - Uso de v1p3ab en combinacion con cry1ca para el manejo de insectos resistentes. - Google Patents

Uso de v1p3ab en combinacion con cry1ca para el manejo de insectos resistentes.

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Abstract

La presente invención incluye métodos y plantas para controlar insectos lepidópteros, tal como el gusano devastador de otoño; dichas plantas comprenden una proteína insecticida V1p3Ab y una proteína insecticida Cry1Ca, y varias combinaciones de otras proteínas que comprenden este par de proteínas, para demorar o prevenir el desarrollo de resistencia en los insectos.

Description

USO DE V1P3AB EN COMBINACION CON CRY1CA PARA EL MANEJO DE INSECTOS RESISTENTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los humanos cultivan maíz para aplicaciones de alimentación y energía. Los humanos cultivan también muchos otros cultivos incluyendo soja y algodón. Los insectos comen y dañan las plantas y por lo tanto arruinan estos esfuerzos humanos. Se han gastado billones de dólares cada año para controlar plagas de insectos y se pierden billones adicionales por los daños que inflingen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas principales para controlar las plagas de insectos pero los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis ( Bt ), han tenido un importante rol en estas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a los insectos a través de transformación con genes de proteínas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna e intensificado la importancia y valor de la proteínas insecticidas y sus genes.
Se han usado varias proteínas Bt para crear plantas transgénicas resistentes a los insectos que han sido registradas y comercializadas exitosamente hasta el presente. Estas incluyen CrylAb, CrylAc, Cry1F y Cry3Bb en maíz, CrylAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa.
Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una proteína única excepto en casos en los cuales se desea un espectro insecticida combinado de dos proteínas (por ejemplo, CrylAb y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a plagas de lepidópteros y gusanos de la raíz respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las convierte en útiles como herramienta para demorar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo CrylAc y Cry2Ab en algodón combinado para controlar la resistencia del gusano de la hoja de tabaco). Ver también la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2009/0313717, que se relaciona con la proteína Cry2 más una Víp3Aa, Cry1F, o Cry1A para el control de Helicoverpa zea o armigerain. La WO 2009/132850 se refiere a Cry1F o Cry1A y Vip3Aa para controlar Spodoptera frugiperda. La Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2008/0311096 se refiere en parte a Cry 1 Ab para controlar ECB resistente a Cry 1 F.
Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a los insectos que han conducido a una rápida y amplia adopción de esta teenología dan también lugar a la preocupación de que la población de plagas desarrolle resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para preservar la utilidad de los rasgos de resistencia al insecto basado en Bt que incluyen desplegar proteínas a dosis elevadas en combinación con un refugio, y alternando con, o co-desplegando diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), “B.t. Resistance Management,” Nature Biotechnol. 16:144-146).
Las proteínas seleccionadas para ser usadas en una pila para el control de resistencia de los insectos (IRM) necesitan ejercer su efecto insecticida independientemente de modo que la resistencia desarrollada para una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, que no exista resistencia cruzada de las proteínas9. Si, por ejemplo, una población de plagas que es resistente a la “Proteína A” es sensible a “Proteína B”, se llegaría a la conclusión de que no hay resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería eficaz para demorar la resistencia a la Proteína A solamente.
En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, pueden efectuarse verificaciones basadas en otras características que se presumen relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad de la unión intermediada por receptor en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no exhibirán resistencia cruzada (van Mellaert etal. 1999). El factor predisponente principal de la falta de resistencia cruzada inherente en esta modalidad es que la proteínas insecticidas no compiten para receptores en una especie de insectos sensibles.
En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si ese receptor muta en ese insecto de manera de que una de las toxinas no se unen ya a ese receptor que por lo tanto ya no hay más insecticida contra el insecto, se puede dar el caso de que el insecto sea también resistente a la segunda toxina (la cual se unirá competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es de resistencia cruzada a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser una indicación de que el insecto no sería simultáneamente resistente a esas dos toxinas.
Por ejemplo, la proteína CrylFa es útil para controlar muchas especies de plagas de lepidópteros que incluyen el gorgojo del maíz Europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) y el gusano devastador del otoño (FAW; Spodoptera frugiperda), y es activa contra el gorgojo de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis). La proteína CrylFa producida en plantas de maíz transgénico que contienen el efecto TC1507, es responsable del rasgo de resistencia del insecto que lidera la industria para el control FAW. CrylFa está también además desplegado en Herculex®, SmartStax™, y los productos WideStrike™.
Toxinas Cry adicionales se enumeran en el sitio de la red del comité de nomenclatura oficial de B.t. (Crickmore et al:, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Corrientemente hay casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt adicionales y toxinas VIP y similares. Muchos del grupo numérico tienen subgrupos de letra mayúscula y los grupos de letra mayúscula tienen subgrupos de letra minúscula (por ejemplo, Cry1 tiene A-L, y Cry1A tiene a-i).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte al uso de una proteína Vip3Ab en combinación con una proteína CrylCa. Las plantas (y las tierras con dichas plantas) que producen a ambas proteínas están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que Vip3Ab no compite con CrylCa para los sitios de unión en el intestino del gusano devastador ( Spodoptera frugiperda ; FAW).
La presente invención se refiere tambien en parte a pilas triples o “pirámides" de tres (o más) toxinas donde Vip3Ab y CrylCa son el par de base. En algunas modalidades de pirámide preferidas la combinación de las toxinas seleccionadas provee acción de no resistencia cruzada contra FAW. Algunas combinaciones de pirámides “de tres sitios de acción” preferidas incluyen el presente para de base de proteínas más CrylFa, CryIDa, CrylBe, o Cry1E como la tercera proteína para direccionar a FAW. Estas triples pilas particulares proveerían, de acuerdo con la presente invención, ventajosa y sorprendentemente tres sitios de acción contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requisito de terrenos de refugio.
Pueden agregarse también toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, si CrylFa o CrylBe son apiladas con el presente par de proteínas (tanto CrylFa como CrylBe son ambas activas contra ambos FAW y el gorgojo del maíz Europeo (ECB)), agregando dos proteínas adicionales a esa triple pila donde las dos proteínas agregadas van a ECB, proveerían tres sitios de acción contra FAW, y tres sitios de acción contra ECB. Estas dos proteínas agregadas (la cuarta y quinta proteína) podrían estar seleccionadas del grupo que consiste en Cry2A, Cryll, DIG-3, y CrylAb. Esto daría como resultado una pila de cinco proteínas que tiene tres sitios y acción contra dos insectos (ECB y FAW).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una curva de respuesta a la dosis para el desplazamiento de CrylCa 125l radiorotulada fluoresceina-5-maleimida tripsina-truncada en BBMV’s de larvas de S. frugiperda (FAW).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte al descubrimiento sorprendente de que Vip3Ab y CrylCa no compiten para unión una con la otra en el intestino de los gusanos devastadores del otoño (FAW; Spodoptera frugiperda). Por lo tanto, la proteína Vip3Ab puede usarse en combinación con una proteína CrylCa en maíz transgenico (y otras plantas, por ejemplo, algodón y soja) para demorar o evitar que FAW desarrolle resistencia a cualquiera de estas proteínas solas. El presente par de proteínas puede ser eficaz para proteger plantas (tales como plantas de maíz y/o plantas de soja) contra el daño causado por el gusano devastador del otoño resistente a Cry. Es decir, un uso de la presente invención es el de proteger al maíz y otras especies de plantas económicamente importantes del daño y de la pérdida de rendimiento causada por poblaciones del gusano devastador del otoño que podrían desarrollar resistencia a Vip3Ab o CrylCa.
La presente invención se refiere por lo tanto a una pila de control de resistencia de los insectos (IRM) que comprende Vip3Ab y CrylCa para evitar o mitigar el desarrollo de resistencia por FAW a cualquiera o ambas proteínas.
La presente invención provee composiciones para controlar plagas de lepidópteros que comprenden células que producen proteína insecticida Vip3Ab y una proteína insecticida CrylCa.
La invención comprende además un hospedero transformado para producir ambas proteínas Vip3Ab insecticidas y una proteína insecticida CrylCa, donde dicho hospedero es un microorganismo o una célula vegetal. Los presentes polinucleótidos están preferiblemente en una construcción genética bajo el control de promotores que no son Bacillus-thuríngiensis. Los presentes polinucleótidos pueden comprender el uso de codones para realzar la expresión en una planta.
Adicionalmente hay un propósito adicional de que la invención provea un método para controlar plagas de lepidópteros que comprende poner en contacto dichas plagas o el ambiente donde están dichas plantas con una cantidad eficaz de una composición que contiene una proteína que contiene toxina de núcleo Vip3Ab y que contiene además una proteína que contiene toxina de núcleo CrylCa.
Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen expresable en la planta que codifica una proteína insecticida CrylCa y un gen expresable en plantas que codifica una proteína insecticida Vip3Ab, y una semilla de dicha planta.
Otra modalidad de la invención comprende una planta de maíz donde un gen expresable en plantas que codifica una proteína insecticida CrylCa y un gen expresable en planta que codifica una proteína insecticida Vip3Ab han sido introgresadas dentro de dicha planta de maíz y semilla de dicha planta.
Tal como se describen en los Ejemplo, estudios de unión de receptor competitivo usando proteínas CrylCa radiorotulada muestran que la proteína CrylCa no compite para unión en tejidos FAW a los cuales se une Vip3Ab. Estos resultados indican también que la combinación de las proteínas Vip3Ab y CrylCa puede ser un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en las poblaciones de FAW a cualquiera de estas proteínas. Por lo tanto, basado en parte en los datos que se describen aquí, se cree que la coproducción (apilamiento) de las proteínas CrylCa y Vip3Ab puede usarse para producir una pila de IRM de dosis elevada para FAW.
Otras proteínas pueden ser agregadas a este par. Por ejemplo, la presente invención se refiere también en parte a pilas triples o “pirámides” de tres (o más) toxinas, con Vip3Ab y CrylCa como par de base. En algunas modalidades de pirámide preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios separados de acción contra FAW. Dichas combinaciones de pirámide de “tres sitios de acción” preferidas incluyen el presente par de base de proteínas más CrylFa, CryIDa, CrylBe, o Cry1E como tercera proteína para direccionarla a FAW. Mediante “tres sitios de acción”, se indica cualquiera de las proteínas determinadas que no causan resistencia cruzada entre sí. Estas tres pilas particulares proveerían de acuerdo con la presente invención ventajosamente y sorprendentemente tres sitios de acción contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar los requisitos para terreno de refugio.
Con relación a algunas modalidades específicas de la presente invención, hemos demostrado que una población FAW resistente a la actividad insecticida de la proteína CrylFa no es resistente a la actividad insecticida de la proteína Vip3Ab o a la actividad insecticida de la proteína CrylCa. Hemos demostrado que CrylCa no compite para los sitios de unión con CrylFa y que Vip3Ab no compite para los sitios de unión con CrylFa en el intestino de FAW. Ver, USSN 61/284.281 (presentado el 16 de Diciembre del 2009) con referencia a CrylFa y CrylCa, y la solicitud PCT presentada concurrentemente titulada "USO COMBINADO DE Vip3Ab Y CRYIFa PARA EL MANEJO DE INSECTOS RESISTENTES ") Por lo tanto, los presentes pares de toxinas Cry1 Fa más Vip3Ab y CrylFa más CrylCa proveen acción de resistencia no cruzada contra FAW. La incapacidad de Vip3Ab1 para competir para la unión de CrylCa en el intestino de FAW demuestra que estas tres toxinas proteínas (CrylFa, Vip3Ab, y CrylCa) representan una pirámide de triple pila de toxinas Cry que proveen tres interacciones de sitio objetivo separado dentro del intestino de FAW. Estas pilas triples proveerían de acuerdo con la presente invención en forma ventajosa y sorprendente acción de resistencia no entrecruzada contra FAW. Además, mediante la demostración de que estas tres proteínas no compiten entre sí, un experto en la teenica reconocerá que esto puede ayudar o reducir o eliminar el requisito para terrenos de refugio. Con el beneficio de esta descripción, las plantas que expresan la triple combinación de CrylFa, Vip3Ab y CrylCa, serán útiles para demorar o prevenir el desarrollo de la resistencia en FAW para la combinación individual de estas proteínas.
También pueden agregarse toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, si CrylFa o CrylBe están apiladas con el presente par de proteínas (ambas CrylFa y CrylBe son ambas activas contra ambos FAW y el gorgojo del maíz Europeo (ECB)), agregando dos proteínas adicionales a este triple pila donde las dos proteínas agregadas hacen diana en ECB, proporcionaría tres sitios de acción contra FAW, y tres sitios de acción contra ECB. Estas dos proteínas agregadas (la cuarta y quinta proteína) podrían seleccionarse del grupo que consiste en Cry2A, Cryll, DIG-3 (ver Solicitud de Patente Norteamericana serie No. 61/284.278 (presentada el 16 de Diciembre del 2009) y US 201000269223), y CrylAb. Esto daría como resultado una pila de cinco proteínas que tiene tres sitios de acción contra dos insectos (ECB y FAW) Por lo tanto, una opción de desplegamiento es el uso del presente par de proteínas en combinación con una tercera toxina/gen y el uso de esta pila triple para mitigar el desarrollo de la resistencia en FAW a cualquiera de estas toxinas. Por consiguiente la presente invención se refiere también en parte a pilas triples o “pirámides” de tres (o más) toxinas. En algunas modalidades de pirámide preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios de acción separados contra FAW.
Incluidas entre estas opciones de desplegamiento de la presente invención estarían el uso de dos, tres o más proteínas de las presentes proteínas en regiones de desarrollo de cultivos donde FAW puede desarrollar poblaciones resistentes.
Siendo CrylFa activo contra FAW y ECB, Vip3Ab más CrylCa más CrylFa proveería, de acuerdo con la presente invención en forma ventajosa y sorprendente tres sitios de acción contra FAW. Esto puede reducir o eliminar el requisito de terrenos de refugio.
CrylFa es desplegado en los productos Herculex®, SmartStax™, y WidesStrike™. El par de genes presente (Vip3Ab y CrylCa) podría combinarse en, por ejemplo, un producto CrylFa tal como Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™. Por consiguiente, el presente par de proteínas podría ser significativo para reducir la presión de selección en estas y otras proteínas. El presente par de proteínas podría usarse por lo tanto tal como en las combinaciones de tres genes para plantas de maíz y otras (algodón y soja por ejemplo).
Tal como se discutió anteriormente, las toxinas/genes adicionales podrían agregarse también de acuerdo con la presente invención. Para el uso de Cry1E (para controlar FAW), ver la Solicitud de Patente Norteamericana Acta No. 61/284.278 (presentada el 16 de Diciembre del 2009).
Las plantas (y los terrenos en los que se plantan dichas plantas) que producen cualquiera de las presentes combinaciones de proteínas están incluidos dentro del alcance de la presente invención. Pueden agregarse también toxinas/genes, pero las pilas particulares discutidas anteriormente proveen en forma ventajosa y sorprendente, sitios de acción múltiples contra FAW y/o ECB. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requisito de terreno de refugio. Un campo plantado así de más de 10 acres (-4.047 ha) se incluye por lo tanto dentro de la presente invención.
GENBANK puede usarse también para obtener la secuencia para cualquiera de los genes y proteínas descritos o mencionados aquí. Ver Apéndice A, siguiente. Las secuencias relevantes son también obtenibles en las patentes. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5.188.960 y la Patente Norteamericana No. 5.827.514 describen proteínas que contienen toxina de núcleo CrylFa que son apropiadas para usadas para llevar a cabo la presente invención. La Patente Norteamericana No. 6.218.188 describe secuencias de ADN optimizadas en plantas que codifican las proteínas que contienen la toxina de núcleo CrylFa que son apropiadas para ser usadas en la presente invención. La USSN 61/284.275 (presentada el 16 de Diciembre del 2009) provee ciertas proteínas CrylCa truncadas que pueden usarse de acuerdo con la presente invención.
Las combinaciones de proteínas descritas aquí pueden usarse para controlar plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo mariposas y polillas se alimentan principalmente del nectar de las flores y son un efector significativo de polinización. Casi todas las larvas de lepidópteros, por ejemplo, orugas, se alimentan de plantas y muchas constituyen plagas importantes. Las orugas se alimentan sobre o en el interior del follaje o en las raíces o tallos de una planta, privando a la planta de nutrientes y destruyendo a menudo la estructura de soporte físico de la planta. Adicionalmente las orugas se alimentan de frutos, telas y granos almacenados y harinas, arruinando estos productos para la venta o disminuyendo gravemente su valor. Tal como se usa aquí, la referencia a plagas de lepidópteros se refiere a varias etapas de vida de la plaga incluyendo las etapas larvales.
Algunas toxinas quiméricas de la presente invención comprenden una porción de toxina de núcleo N-terminal completa de una toxina Bt y, en cierto punto pasando el final de la porción de toxina de núcleo, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina N-terminal, insecticidamente activa de una toxina Bt se denomina la toxina de “núcleo”. La transición de este segmento de toxina de núcleo hasta el segmento de protoxina heteróloga puede ocurrir en aproximadamente la conexión de toxina/protoxina o en forma alternativa una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina de núcleo), puede ser retenida, con lo cual la transición de la porción de protoxina heteróloga ocurre cadena abajo.
Como ejemplo, una toxina quimerica de la presente invención es una porción de toxina de núcleo total de CrylCa (aproximadamente los primeros 600 amino ácidos) y/o una protoxina heteróloga (los amino ácidos restantes para el C-terminal). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CrylAb. En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CrylAb.
Un experto en la téenica apreciará que las toxinas Bt, incluso dentro de cierta clase tal como CrylCa, variarán hasta cierto grado de longitud y de localización precisa de la transición desde la porción de la toxina de núcleo hasta la porción de protoxina. Típicamente, las toxinas CrylCa son de aproximadamente 1150 hasta aproximadamente 1200 amino ácidos de longitud. La transición desde la porción de toxina a porción de protoxina ocurrirá típicamente entre aproximadamente 50% hasta aproximadamente 60% de la toxina de longitud total. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la expansión total de esta porción de toxina de núcleo N-terminal. Por lo tanto la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud total de la proteína de toxinas Cry1 Bt. Esto será típicamente por lo menos aproximadamente 590 amino ácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la expansión completa de la porción de protoxina CrylAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina de núcleo hasta el C-terminal de la molécula.
Genes v toxinas Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solamente las secuencias de longitud total descritas sino también los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión que retienen la actividad plaguicida característica de las toxinas que se ejemplifican específicamente aquí. Tal como se usa aquí los términos “variantes” o “variaciones” de genes se refieren a secuencias nucleotídicas que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad plaguicida. Tal como se usa aquí el término “toxinas equivalentes” se refiere a toxinas que tienen la misma actividad biológica o esencialmente una misma actividad biológica contra las plagas que constituyen el objetivo, como las toxinas reivindicadas.
Tal como se usan aquí, los límites representan aproximadamente 95% (Vip3Ab's y CrylCa's), 78% (Vip3Ab’s y CrylC's), y 45% (CryTs) de identidad de secuencia, por “Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuríngiensís Pesticidal Crystal Proteins,” N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology y Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes pueden aplicarse también a las toxinas de núcleo únicamente.
Resultará aparente para un experto en la téenica que los genes que codifican toxinas activas pueden ser identificados y pueden obtenerse a partir de varios medios. Los genes o porciones de genes específicos ejemplificados aquí pueden obtenerse a partir de aislaciones depositadas en un depósito de cultivo. Estos genes o porciones o variantes de los mismos, pueden construirse también sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden construirse rápidamente usando téenicas convencionales para preparar mutaciones puntuales. Asimismo, los fragmentos de estos genes pueden efectuarse usando exonucleasas o endonucleasas, comercialmente obtenibles, de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, las enzimas tales como Bal31 o la mutagénesis dirigida al sitio pueden usarse para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos pueden obtenerse también usando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas pueden usarse para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteínas.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Asimismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes pueden codificar las secuencias de amino ácido descritas aquí. Está dentro de la experiencia de una persona experta en la materia crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente la misma, toxinas. Estas secuencias variantes de ADN están dentro del alcance de la presente invención. Tal como se usa aquí, la referencia a “esencialmente la misma” secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de amino ácido, que no afectan materialmente la actividad insecticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen actividad insecticida se incluyen tambien en esta definición.
Otro método para identificar los genes que codifican las porciones de toxinas y genes útiles de acuerdo con la presente invención es a través del uso de sondas oligonucleotídicas. Estas sondas son secuencias nucleotídicas detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de un rótulo apropiado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes tal como se describe en la Solicitud Internacional No. WO93/16094. Tal como es bien conocido en la materia, si la sonda molecular y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando un fuerte enlace entre las dos moléculas, puede asumirse razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología sustancial. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones rigurosas mediante téenicas bien conocidas en la materia tal como se describió, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de combinaciones de concentraciones y temperaturas son las siguientes (en orden de rigurosidad creciente): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de la sonda provee un medio para determinar de manera conocida si ocurrió la hibridación. Dicho análisis de sonda provee un método rápido para identificar los genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos nucleotídicos que se usan como sonda de acuerdo con la invención pueden sintetizarse usando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias nucleotídicas pueden usarse tambien como iniciadores de PCR para amplificar los genes de la presente invención.
Toxinas Variantes Ciertas toxinas de la presente invención han sido ejemplificadas específicamente aquí. Debido a que estas toxinas son simplemente ejemplos de las toxinas de la presente invención, será fácilmente aparente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias nucleotídicas que codifican para toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad insecticida o simular de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de amino ácido con una toxina ejemplificada. Esta homología de amino ácido será típicamente de más de 75%, preferiblemente más de 90% y más preferiblemente más de 95%. La homología de amíno ácido será más elevada en regiones críticas de la toxina que cuentan para la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de configuración tridimensional que finalmente es responsable de la actividad biológica. En este sentido, ciertas sustituciones de amino ácidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de amino ácido conservadora que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los amino ácidos pueden colocarse en las clases siguientes: no-polar, polar no cargado, básico y ácido. Las sustituciones conservadoras en las cuales un amino ácido de una clase reemplazado con otro amino ácido del mismo tipo, entran dentro del alcance de la presente invención con la condición de que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación se provee un listado de ejemplos de amino ácido que pertenecen a cada clase.
En algunos casos, pueden efectuarse sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no deben apartarse significativamente de la actividad biológica de la toxina.
Hospederos Recombinantes Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de hospederos microbianos o de plantas. La expresión del gen toxina da como resultado, directamente o indirectamente la producción intracelular y mantenimiento del insecticida. La transferencia conyugal y la transferencia recombinante pueden usarse para crear una cepa Bt que expresa a ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos hospederos pueden transformarse también con uno o ambos genes de toxina y usarse luego para llevar a cabo el efecto sinérgico. Con hospederos microbianos apropiados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse al sitio de la plaga, en el cual proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que hospeda el gen de toxina puede tratarse bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la celula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada luego al ambiente de la plaga que constituye el objetivo.
Cuando el gen de toxina Bt es introducido a través de un vector apropiado dentro de un hospedero microbiano y dicho hospedero es aplicado al ambiente en estado vivo, es esencial que se usen ciertos microbios hospedero. Se seleccionan microorganismos hospederos que se sabe que ocupan la “citoesfera” (filoplano, filoesfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir exitosamente en el ambiente particular (cultivos y hábitat de otros insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, que provean un mantenimiento estable y expresión del gen que expresa el insecticida polipeptídico y convenientemente que provean protección mejorada del insecticida desde la degradación e inactivación ambiental.
Se conoce una gran cantidad de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de plantas) y/o la rizoesfera (el suelo que rodea las raíces de plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de interés particular los microorganismos tales como bacteriales tales como los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes ; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo de los generos Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Son particularmente interesantes las especies bacterianas de fitoesfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de la fitoesfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. Son de interés particular los microorganismos pigmentados.
Se encuentran disponibles una amplia variedad de métodos para introducir el gen Bt que codifica una toxina dentro de un microorganismo hospedero bajo condiciones que permiten un mantenimiento y expresión estable del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia y se han descrito por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5.135.867, que se incorpora aquí como referencia.
Tratamiento de celulas Bacillus thuringiensis o células recombinantes que expresan las toxinas Bt pueden tratarse para prolongar la actividad de toxinas y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se forma comprende la toxina o toxinas Bt dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protegerá la toxina cuando se aplica la microcápsula al ambiente de la plaga que constituye el objetivo. Las células hospederas apropiadas pueden incluir procariotos o bien eucariotos, que normalmente están limitados a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores tales como mamíferos. Sin embargo, podrían usarse organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores, donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad en un mamífero hospedero. Como hospederos de interés particulares están los procariotos y los ecuariotos inferiores tales como hongos.
La célula estará usualmente intacta y tendrá sustancialmente la forma proliferativa cuando se trata, en vez de una forma de espora, aunque en algunos casos pueden emplearse esporas.
El tratamiento de la célula microbiana por ejemplo, un microbio que contiene un gen o genes de toxina B.t puede ser de medios físicos o químicos, o puede ser una combinación de medios químicos yo físicos, con la condición de que la téenica no afecte perjudicialmente las propiedades de la toxina y disminuye la capacidad celular de protección de la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes particularmente halógenos de número atómico 17-80. Más particularmente puede usarse yodo bajo condiciones leves y por un período de tiempo suficiente para lograr los resultados deseados. Otras teenicas apropiadas incluyen el tratamiento con aldehidos tales como glutaraldehído anti-infecciosos tales como cloruro de cefiran y cloruro de cetilpirídinio, alcoholes tales como ¡sopropilo y etanol; varios fijadores histológicos tales como yodo de Lugo, fijador de Bouin, varios ácidos y fijador de Helly (Ver: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman y Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula, cuando la célula es administrada al ambiente hospedero. Ejemplos de medios físicos son radiación de longitud de onda corta tal como radiación gamma, y radiación X, congelación, irradiación de UV, liofilización y similares. Los métodos de tratamiento de células microbianas se describieron en las Pat. Norteamericanas Nos. 4.695.455 y 4.695.462, que se incorporan aquí como referencia.
Las células tienen generalmente estabilidad estructural realzada lo cual, mejora la resistencia a las condiciones del medio ambiente. Cuando el insecticida está en una proforma, el método de tratamiento de células debería seleccionarse de modo de no inhibir el procesamiento de la proforma a la forma madura del insecticida mediante el patógeno de plaga que constituye el objetivo. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará proteínas y podrá inhibir el procesamiento de la proforma de un polipéptido insecticida. El método de tratamiento debería retener por lo menos una porción sustancial de la bio-disponibilidad o bioactividad de la toxina.
Las características de interés particular para seleccionar una célula hospedero con el propósito de producción incluyen facilidad de introducir el gen o genes de B.t dentro del hospedero, disponibilidad de sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad del pesticida en el hospedero y presencia de capacidades genéticas auxiliares. Características de interés para ser usadas como microcápsula insecticida incluyen cualidades protectoras para el insecticida tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en ambientes acuosos; falta de toxicidad de mamífero, atracción a plagas para ingestión; facilidad de eliminar y fijarse sin deteriorar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manipulación, economía, estabilidad de almacenamiento, y similares.
Crecimiento de células El hospedero celular que contiene el gen o genes insecticidas B.t. puede cultivarse en cualquier medio nutriente conveniente donde la construcción de ADN provee una ventaja selectiva, proporcionando un medio de selección de manera que sustancialmente todas o la totalidad de la célula retengan el gen B.t. Estas células pueden ser luego cosechadas de acuerdo con las formas convencionales. Alternativamente las células pueden tratarse antes de cosecharlas.
Las células B.t. que producen las toxinas de la invención pueden cultivarse usando medios y téenicas de fermentación convencionales. Al completarse el ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser cosechadas separando primero las esporas de B.t. y los cristales del caldo de fermentación por medios bien conocidos en la materia. Las esporas de B.t. y los cristales recuperados pueden formularse en un polvo humectable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de surfactantes, dispersantes, portadores inertes y otros componentes para facilitar la manipulación y aplicación para plagas particulares que constituyen el objetivo. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación son bien conocidos en la materia.
Formulaciones Los granulados de cebo formulados que contienen atractivos y esporas, cristales y toxinas de las aislaciones de B.t o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles a partir de las aislaciones de B.t. descritas aquí, puede aplicarse al suelo. Los productos formulados pueden aplicarse también como recubrimiento de semillas o tratamiento de raíces o para tratamiento total de plantas en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Los tratamientos de plantas y suelo de las células B.t pueden emplearse como polvos humectables granulados o polvillos, mezclándolos con varios materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (tusa de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nueces y similares. Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes, esparcidores-aglutinantes, agentes estabilizadores, otros aditivos insecticidas, o surfactantes. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o de base no acuosa y pueden emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, surfactantes, emulsionables, dispersables o polímeros.
Tal como apreciarán los expertos en la materia, la concentración insecticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o si debe usarse directamente. El insecticida estará presente en aproximadamente 1% en peso y puede ser de 100% en peso. Las formulaciones en seco tendrán desde aproximadamente 1-95% en peso del insecticida mientras que las formulaciones líquidas generalmente serán de desde aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 104 celulas/mg. Estas formulaciones se administrarán a aproximadamente 50 mg (líquido o seco) hasta 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones pueden aplicarse al ambiente de la plaga de lepidópteros, por ejemplo, al follaje o suelo, rociando, espolvoreando, regando o similares.
Transformación de Planta Un hospedero recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican las proteínas de toxinas B.t que se describen aquí pueden insertarse en celulas de plantas usando una variedad de téenicas que son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas se encuentran disponibles para preparación para la inserción de genes extraños dentro de plantas superiores. Los vectores comprenden por ejemplo, pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC184, ínter alia. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de toxina Bt puede insertarse dentro del vector en un sitio de restricción apropiado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. La célula de E. coli son cultivadas en un medio nutriente apropiado y luego son cosechadas y lisadas. Se recupera el plásmido. Los análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos biológicos bioquímicos y/o moleculares se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser disociada y unida a la secuencia de ADN siguiente. Cada secuencia de plásmido puede ser clonada en el mismo o en otros plásmidos. Dependiendo de los métodos de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la transformación de la célula de planta, entonces por lo menos el límite derecho, pero a menudo el límite derecho y el izquierdo del ADN T de plásmido Ti o R¡ debe ser conectado como la región flanqueadora de los genes que pueden insertarse. El uso de T-ADN para la transformación de células de plantas ha sido intensamente investigado y descrito suficientemente en EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fralcy etal., (1986), y An etal., (1985), y está bien establecido en la téenica.
Una vez integrado el ADN insertado en el genoma de planta, es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador seleccionable que confiere a las células de plantas trasformadas, resistencia a un biocida o a un antibiótico tal como Bialaphos, Kanamycin, G418, Bleomycin, o Hygromycin, ínter alia. El marcador individualmente empleado debería permitir por lo tanto la selección de células trasformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado.
Se encuentra disponible una gran cantidad de técnicas para insertar ADN dentro de una célula hospedero de planta. Estas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como también otros métodos posibles. Si se usa Agrobacteria para la transformación, el ADN que debe insertarse debe ser clonado en plásmidos especiales, es decir, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios puede estar integrados en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a las secuencias en el T-ADN. El plásmido Ti o Ri comprende tambien la región vir necesaria para la transformación del T-ADN. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacteria. El vector intermedio puede ser transferido a Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones límite de T— ADN Derecha e Izquierda. Pueden transformarse directamente en Agrobacteria (Holsters et al., 1978). El Agrobacterium usado como célula hospedero comprende un plásmido portador de una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia de T-ADN dentro de la célula de planta. Puede estar contenida la T-ADN adicional. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células de planta. Los explantos de plantas pueden cultivarse ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Pueden regenerarse plantas enteras a partir de un material de planta infectada (por ejemplo, pedazos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas así obtenidas pueden ser luego ensayadas para determinar la presencia del ADN insertado. No hay demandas especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos comunes tales como por ejemplo derivados de pUC.
Las células transformadas se desarrollan en el Interior de plantas de manera usual. Pueden formarse células germinales y transmitir los rasgos transformados a plantas de progenie. Dichas plantas pueden cultivarse de manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes donde el uso de codones ha sido optimizado para plantas. Ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5.380.831, que se incorpora aquí como referencia. Aunque algunas toxinas truncadas han sido ejemplificadas aquí, es bien conocido en la téenica B.t. que las toxinas de tipo de 130 kDa (longitud total) tienen una mita N-terminal que es la toxina de núcleo, y una mitad C-terminal que es la protoxina de “cola.” Por lo tanto, las “colas” apropiadas pueden usarse con toxinas truncadas/núcleo de la presente invención. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6.218.188 y Patente Norteamericana No. 6.673.990. Además, los métodos para crear genes sintéticos Bt para ser usados en plantas son conocidos en la materia (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta preferida transformada es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en plantas que codifica una proteína Vip3Ab, y que comprende además un segundo gen expresable en plantas que codifica una proteína CrylCa.
La transferencia (o introgresión) de los rasgos determinados Vip3Ab - y CrylCa en linajes de maíz endógamos pueden lograrse mediante cría de selección recurrente, por ejemplo, por retrocruzamiento. En este caso, un progenitor recurrente deseado es cruzado primero con un dador endógamos (el progenitor no recurrente) que es portador del gen o genes apropiados para los rasgos determinados por Vip3Ab - y Cry1C. La progenie de esta cruza es luego emparejada nuevamente con el progenitor recurrente seguido de selección en la progenie resultante para los rasgos deseados transferidos desde el progenitor no recurrente. Después de tres, preferiblemente cuatro, o más preferiblemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el progenitor recurrente con selección para los rasgos deseados, la progenie será heterocigota para lugares controladores de los rasgos que deben ser transferidos, pero será como el progenitor recurrente para la mayoría o caso todos los otros genes (ver por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory y Technique, 360-376).
Estrategias de Manipulación de Resistencia de Insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, señalan estrategias de dos toxinas, denominado también “piramidación" o “apilamiento” para manipulación de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
En su sitio de la red, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proveer refugios no transgenicos (es decir, no B.t.) (una sección de cultivos no Bt / maíz) para uso con cultivos transgénicos productores de una proteína Bt única contra plagas que constituyen el objetivo.
"Los requisitos estructurales específicos para Bt protegido contra el gorgojo del maíz (CrylAb o Cry1F) productos de maíz de la manera siguiente: Refugios Estructurados: 20% de maíz Bt no-Lepidóptero refugio en Corn Belt; 50% de Bt no-Lepidóptero refugio en Cotton Belt Bloques Interno (es decir, dentro del campo Bt) Externo (es decir, campos separados entre ½ milla (¼ de milla si es posible) del campo Bt para maximizar el emparejamiento aleatorio) Faja en campo Las fajas deben ser de por lo menos 4 hileras de amplitud (preferiblemente 6 hileras) para reducir los efectos del movimiento larval.
Además, la National Corn Growers Association, en su sitio de la red: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) provee tambien guias similares con respecto a los requisitos del refugio Por ejemplo “Requisitos de la oruga del maíz IRM: -Plante por lo menos 20% de sus terrenos con maíz para refugio de híbridos -En regiones productoras de algodón el refugio debe ser del 50%, -Debe plantarse dentro de 1/2 milla del refugio de híbridos.
-El refugio puede plantarse en fajas, dentro del campo de Bt; las fajas del refujio deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho -El refugio puede tratarse con insecticidas convencionales únicamente si se alcanzan los umbrales económicos para el insecto que constituye el objetivo -Insecticidas rociables a base de Bt no pueden usarse en el refugio de maíz.” -Debe plantarse un refugio apropiado en cada granja con maíz Bt” Tal como ha sido manifestado por Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo) apilamiento o piramidación de dos proteínas diferentes, cada una eficaz contra las plagas que constituyen el objetivo y con muy poca o ninguna resistencia cruzada pueden permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para un apilamiento exitoso, el tamaño de un refugio de menos de 10% de refugio, puede proveer una manipulación de resistencia comparable a aproximadamente 50% de refugio para un rasgo único (no piramidado). Para productos de maíz Bt piramidados corrientemente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos requiere plantar un refugio significativamente menos estructurado (generalmente 5%) de maíz no-Bt que para productos de rasgo único (generalmente 20%).
Existen varias formas de proveer efectos IRM de un refugio, que incluyen varios patrones de plantado geométrico en los campos (tal como se mencionó anteriormente) y en mezclas de semillas en bolsas tal como fue discutido adicionalmente por Roush et al. ( supra ), y en la Patente Norteamericana No. 6.551.962.
Los porcentajes anteriores o las relaciones de refugio similares pueden usarse para los presentes apilamientos o pirámides dobles o triples. Para apilamientos triples con tres sitios de acción contra una plaga de un solo objetivo, un éxito sería refugio 0 (o menos de 5% de refugio, por ejemplo). Esto es particularmente cierto para terreno comercial - de menos de 10 acres (-4.047 ha).
Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisionales, y publicaciones a las que se hacen mención o cita aquí se incorporan como referencia en su totalidad hasta el grado de que no sean inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta memoria.
A menos que se indique específicamente o que se indique lo contrario, los términos “un”, “una”, y “el” significan “por lo menos uno” tal como se usa aquí.
A continuación se proveen ejemplos que ilustran procedimientos para llevar a cabo la invención. Estos ejemplos no deben considerarse limitativos. Todos los porcentajes se dan en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes se dan en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas se dan en grados Celsius.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Producción v procesamiento de tripsina de proteínas Vip3Ab v CrvICa Los genes que codifican las protoxinas CrylCa y Vip3Ab1 se expresaron en las cepas de expresión de Pseudomonas fluorescens y las proteínas de longitud total fueron aisladas como cuerpos de inclusión insolubles. Los cuerpos de inclusión lavados fueron solubilizados mediante agitación a 37 °C en buffer que contenía 20 mM de CAPS, pH 11 , + 10 mM de DDT, + 0.1% de 2-mercaptoetanol, durante 2 horas. La solución fue centrifugada a 27.000 x g durante 10 min. a 37 °C y el sobrenadante se trató con 0,5% (p/v) de tripsina tratada con TCPK (Sigma). Esta solución se incubó mezclando durante una hora adicional a temperatura ambiente, se filtró, y luego se cargó sobre una columna Pharmacia Mono Q 1010 equilibrada con 20 mM de CAPS a pH 10.5. Después de lavar la columna cargada con dos volúmenes de columna de buffer, la toxina truncada fue eluída usando un gradiente lineal de 0 a 0.5 M de NaCI en 20 mM de CAPS en 15 volúmenes de columna a régimen de fluidez de 1,0 ml/min. La proteínas Cry truncadas de tripsina purificada se eluyeron a aproximadamente 0.2-0.3 M de NaCI. La pureza de las proteínas se verificó mediante SDS PAGE y con visualización usando tinte azul brillante de Coomassie. En algunos casos, las fracciones combinadas de la toxina purificada se concentraron y cargaron sobre una columna Superóse 6 (1.6 cm de dia., 60 cm de long), y luego se purificaron por cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones que comprendían un solo pico de peso molecular monomérico se combinaron y concentraron, lo cual dio como resultado una preparación más de 95% homogénea para una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 60.000 kDa.
El procesamiento de Vip3Ab1 se logró de manera similar a partir de la proteína de 85 kDa de longitud total, purificada (DIG-307). La proteína (12 mg) fue dializada en buffer de fosfato de sodio de 50 mM, pH 8.4, luego procesada mediante agregado de 1 mg de tripsina sólida y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se cargó sobre una columna de intercambio de MonoQ anión (1 cm de diámetro., 10 cm. de long), y se eluyó con un gradiente lineal de NaCI de desde 0 a 500 mM en 20 mM de buffer de fosfato de sodio, pH 8.4 sobre 7 volúmenes de columna. La elusión de la proteína fue monitoreada por SDS-PAGE. La banda procesada principal tenía un peso molecular de 65 kDa, determinada por SDS-PAGE usando patrones de peso molecular para comparación.
EJEMPLO 2 Yodación de proteína de toxina de núcleo CrvICa Trabajos previos indicaron que CrylCa eran muy difícil de radiorotular usando metodos tradicionales, aunque en unos pocos casos selectos sería radiorotulado y funcionaría bien en un ensayo de unión de receptor. Decidimos radiorotular CrylCa usando fluoresceína -5-maleimida 125l radiorotulada, que es un método que ha funcionado para radiorotular activamente CrylFa (Prov. 69919). La yodación de fluroesceina-5- malemida y la subsiguiente conjugación de este químico radiorotulado con CrylCa da como resultado radiorotulación de la proteína específica de cisteína. Dicho procedimiento de radiorotulación es por lo tanto altamente específico en los residuos que deben ser rotulados. El segmento de toxina de núcleos CrylCa (residuos 29-619) contiene dos residuos amino ácido cisteína, en posiciones 210 y 438. Palmer et al. (1997) ha demostrado que los anillos fenilo de fluoresceína-5-maleímida pueden ser radio-yodados y luego pueden reaccionar con proteínas que contienen grupos sulfhidrilo (por ejemplo, provistos por residuos cisteína libres), lo cual da como resultado la alquilación de las cisteínas libres en la proteína, y por lo tanto provee una proteína radio activamente rotulada. La toxina de núcleo CrylCa tripsina-truncada contiene dos residuos cisteína y por lo tanto provee un sustrato para alquilación y radiorotulación de la proteína en estos dos sitios (específicos).
Se disolvió Fluoresceina-5-maleimida (F5-M) a 10 mM en DMSO (sulfóxido de dimetilo), luego se diluyó a 1 mM en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS; 20 mM de fosfato de sodio, 0.15 M de NaCI, pH7.5), determinado por el coeficiente de extinción molar de F 5-M (68.000 M-1cm-1). A una solución de 100 mL de PBS que contenía dos Granos de Yodación Pierce (Thermo Fisher Scientific), 1,0 mCi de Na125l se agregaron atrás de la protección de plomo. La solución se dejó mezclar a temperatura ambiente durante 5 min, y luego se agregaron 10 pL de la solución de 1 mM F 5-M. Después de reaccionar durante 10 min, la solución fue removida de la reacción de yodación con pipeta y se agregaron a la solución 2 mg de proteína de toxina de núcleo CrylCa de tripsina truncada altamente purificada en PBS. La proteína fue incubada a 4o con la solución F 5-M yodada durante 48 hrs, cuando terminó la reacción mediante agregado de b-mercaptoetanol hasta una concentración final de 14 mM. La mezcla de reacción se agregó a una columna de centrifugación Zebra™ (Invitrogen) equilibrada en 20 mM de CAPS, 150 mM de KCI, pH9, y se centrifugó a 1500 x g durante 2 min para separar el tinte yodado no reaccionado de la proteína. La proteína de toxina de núcleo de fluoresceina-CrylCa radiorotulada, se contó en un contador gamma para determinar su radioactividad específica, asumiendo una recuperación del 80% de la proteína de toxina ingresada.
La actividad específica de la proteína de toxina de núcleo CrylCa fue de aproximadamente 6.8 pCi/pg de proteína. La proteína radiorotulada se caracterizó también por SDS-PAGE y se visualizó mediante fósforo-formación de imagen para validar que la radioactividad medida fue asociada covalentemente con la proteína de toxina de núcleo CrylCa. Se formaron imágenes con los geles SDS-PAGE teñidos con commassie envolviéndolos en una película Mylar™ (12 mm de espesor) y exponiéndolos bajo un fosfor-tamiz de almacenamiento de Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. Las placas fueron reveladas usando un fosfor-imagen Molecular Dynamics Storm 820 y la imagen fue analizada usando software ImageQuant™. Fue detectable cierta actividad en la región de gel muy por debajo de la bajada de proteína de toxina de núcleo CrylCa (es decir, fragmentos más pequeños que los de la proteína de toxina de núcleo CrylCa a aproximadamente 10 kDa de tamaño y menos). Estos contaminantes radioactivos representan probablemente pequeños péptidos asociados probablemente a la proteína de CrylCa truncada debido a la acción de la tripsina que se usó para disociar la proteína a su estructura de núcleo.
EJEMPLO 3 Ensayos de unión competitiva para BBMVs de S. fruaiperda con proteínas de toxina de núcleo de CrylCa v Vip3Ab.
Los ensayos de unión de competición homólogos y heterólogos se llevaron a cabo usando 150 mg/mL de proteína BBMV y 2 nM de la proteína de toxina de núcleo CrylCa 125l-radiorotulada. Las concentraciones de la proteína de toxina de núcleo CrylCa no radiorotulada competitiva homologa, agregadas a la mezcla de reacción fueron 0.1, 1, 10, 100, y 1000 nM. La proteína Vip3Ab truncada de tripsina heteróloga se ensayó a 10 y 1.000 nM y se agregaron proteínas al mismo tiempo que la proteína de toxina de núcleo CrylCa radioactiva para asegurar una verdadera competición de unión. Las incubaciones de llevaron a cabo durante 1 hora a 28° y la cantidad de proteína de toxina de núcleo CrylCa 125l-radiorotulada no unida al BBMV (es decir no unida a una proteína de insecto receptora) se separó de la proteína unida mediante centrifugación de la mezcla de BBMV a 16.000 x g durante 8 min, y se removió el sobrenadante del granulado resultante. El granulado se lavó tres veces con buffer de unión enfriado con hielo (PBS; 11.9 mM Na2HP04, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH7.4 más 0.1% de albúmina de suero bovino; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para remover completamente cualquier CryCa 125l radiorotulado no adherido remanente. El fondo del tubo de centrifugación se cortó y el granulado de proteína contenido dentro de esta sección se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 100 mm y se contó en un contador gamma durante 10 minutos para obtener la cantidad de radioactividad unida contenida en la fracción granulada. La cantidad de radioactividad en la fracción de proteína unida provee lina indicación de la cantidad de proteína Cry unida al receptor insecto (unión total). La unión específica fue representada por el recuento obtenido en el granulo en presencia de 1.000 nM de proteína de toxina de núcleo CrylCa no radiorotulada. La cantidad de CrylCa radiorotulada específicamente unida a BBMV (unión específica) se midió restando el nivel de unió total de una unión específica. Cien por ciento de la unión total se consideró que era la cantidad total de unión en ausencia de cualquier proteína de toxina de núcleo CrylFa competidora. Los datos se expresan como porcentaje de 125l CrylCa específica unida versus concentración de ligando competitivo no radiorulado.
EJEMPLO 4 Compendio de los Resultados Los resultados (Figura 1) muestran que la proteína CrylCa no rotulada homologa desplazó eficazmente la proteína de toxina de núcleo CrylCa radiorotulada de unirse específicamente a las proteínas BBMV de manera dependiente a la dosis. Vip3Ab no desplazó proteína de toxina de núcleo CrylCa 125l-rotulada unida, de sus proteínas receptoras en cualquiera de las concentraciones mostradas (10 o 1.000 nM). La concentración más elevada de Vip3Ab ensayada (1.000 nM) representa una concentración de 500-veces más que la CrylCa radiorotulada usada en el ensayo, lo cual demuestra que V¡p3Ab no compite eficazmente con la unión de CrylCa radiorotulada en S. frugiperda BBMV.
La Figura 1 es una curva de respuesta a la dosis para el desplazamiento de CrylCa 125l radiorotulada fluoresceina-5-maleimida tripsina-truncada en BBMV’s de larvas de S. frugiperda (FAW). La figura muestra la capacidad de CrylCa no rotulada (·) para desplazar CrylCa rotulada de manera dependiente de la dosis en un rango de desde 0.1 a 1.000 nM. El diagrama gráfica el porcentaje de CrylCa rotulado unida específicamente (unión total menos unión no específica) versus la concentración de los ligandos no radiorotulados agregados. Se muestra la incapacidad de Vip3Ab1 no radiorotulado (A) a 10 y 1.000 nM para desplazar la CrylCa radiorotulada unida específicamente.
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APÉNDICE A Listado de endotoxinas - delta del sitio en la web Crickmore et al. 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kurstaki HD1 Cry1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1 Cry1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715 Bt kurstaki NRD- Cry1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 12 Cry1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1 Cry1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7 Bt aizawai Cry1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 HD133 Cry1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1 Secuencia de Crv1Ab11 112419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 ADN solamente Cry1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93 Cry1Ab13 AAN76494 Tan et al 2002 Bt c005 Meza-Basso &_ Crv1Ab14 AAG16877 nnn Chilean Bt Theoduloz ¿UUU Nativo Crv1Ab15 AAO13302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-11 Crv1Ab17 AAT46415 Huang et al 2004 Bt WB9 Crv1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt Crv1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2 Crv1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BÍC008 Crv1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 Bt IS5056 Crv1Ab22 ABW87320 Wu y Feng 2008 BÍS2491 Ab CrylAb- AAK14336 Nagarathinam et al 2001 secuencia similar Bt kunthala RX24 incierta Crv1 Ab¬ AAK14337 similar Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 secuencia incierta Crv1 Absimilar AAK14338 Nagarathinam et al 2001 secuencia Bt kunthala RX27 incierta CrylAb- secuencia ABG88858 Lin et al 2006 similar Bt Iy4a3 insuficiente Cry1Ac1 AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73 Cry1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae Cry1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A Cry1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A1 Bt kurstaki Crv1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 PS81GG Bt kurstaki NRD- Cry1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 12 Cry1Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73 Cry1Ac8 AAC44841 Omoloet al 1997 Bt kurstaki HD73 Cry1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732 Bt kurstaki YBT- CrylAdO CAA05505 Sun 1997 1520 Makhdoom & ._ Cry1Ac11 CAA10270 Q Riazuddin Secuencia de Crv1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 ADN solamente Cry1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1 Cry1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30 Cry1Ac15 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Crv1lc2 AAE71691 Osman et al 2001 Crylldl AAD44366 Choi 2000 Cryllel AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007 Cryllfl AAQ52382 Baum et al 2003 Cryll- 1998 secuencia AAC31094 Payne et al similar insuficiente Cryll- 2006 secuencia ABG88859 Lin & Fang Bt Iy4a3 similar insuficiente Cry1Ja1 AAA22341 Donovan 1994 Bt EG5847 Von Tersch & Crv1Jb1 AAA98959 1994 Bt EG5092 González CryU d AAC31092 Payne et al 1998 CrvUc2 AAQ52372 Baum et al 2003 CryUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt Bt morrisoni Cry1Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 BF190 Crv1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1 secuencia similar AAC31091 Payne et al 1998 insuficiente Cry2Aa1 AAA22335 Donovan et al 1989 Bt kurstaki Cry2Aa2 AAA83516 Widner & Whitelcy 1989 Bt kurstaki HD1 Secuencia de Cry2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto ADN solamente Bt kenyae Cry2Aa4 AAC04867 Misra et al 1998 HD549 Cry2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39 Cry2Aa6 CAA10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71 Crv2Aa7 CAA10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29 Crv2Aa8 AA013734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66 Cry2Aa9 AAO13750 Zhang et al 2000 Cry2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001 Cry2Aa11 AAQ52384 Baum et al 2003 Cry2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39 Cry2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Cry2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550 Cry2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1 Cry2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002 Cry2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Cry2Ab5 AAQ04609 Yao etal 2001 Bt Iy30 Cry2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7 Crv2Ab7 AAZ66347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1 Cry2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2 Crv2Ab9 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6 Cry2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD Cry2Abt1 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD Cry2Ab 3 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Cry2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1 Crv2Ac2 AAG35410 Song et al 2000 Cry2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003 Cry2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9 Crv2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005 Crv2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis Crv2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Crv2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Crv2Ac10 ABN15104 Ba¡ et al 2007 Crv2Ac11 CAM83895 Saleem et al 2007 Crv2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Crv2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Crv2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Crv2Ad4 CA 32331 Saleem et al 2007 Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 9 Crv2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003 Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81 Crv2Aq ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2 Sin enlace NCBI Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Julio 09 Crv2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3 Sin enlace NCBI Cry2A¡ FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt Julio 09 Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego Crv3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis Crv3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987 Crv3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis Bt morrisoni Crv3Aa5 AAA50255 Donovan et al 1988 EG2158 Crv3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis Crv3Aa7 CAB41411 Zhang et al 1999 Bt 22 Crv3Aa8 AAS79487 Gao y Cai 2004 Bt YM-03 Crv3Aa9 AAW05659 Bulla y Candas 2004 Bt UTD-001 Crv3Aa10 AAU29411 Chen et al 2004 Bt 886 Bt tenebrionis Crv3Aa11 AAW82872 Kurt et al 2005 Mm2 Crv3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis Crv3Ba1 CAA34983 Sick etal 1990 Bttolworthi 43F Crv3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208 Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961 Crv3Bb2 AAA74198 Donovan et al 1995 Bt EG5144 Secuencia de Crv3Bb3 115475 Peferoen et al 1995 ADN solamente Bt kurstaki Crv3Ca1 CAA42469 Lamber† et al 1992 Btl109P Crv4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis Bt israelensis Crv4Aa2 BAA00179 Sen et al 1988 HD522 Crv4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv4A- secuencia AAY96321 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 similar insuficiente Chungjatpornchai Q0Q Bt israelensis Cry4Ba1 CAA30312 et al 1988 4Q2-72 Crv4Ba2 CAA30114 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis Crv4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis Bt israelensis Crv4Ba4 BAA00178 Sen et al 1988 HD522 Crv4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv4Ba- i et al 2005 secuencia ABC47686 Mahalakshm Bt LDC-9 similar insuficiente Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 Sin enlace NCBI Bt HS18-1 Julio 09 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Sin enlace NCBI Bt Ywc2-8 Julio 09 Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Sin enlace NCBI Bt MC28 Julio 09 Bt Crv5Aa1 AAA67694 Narva et al 1994 darmstadiensis PS17 Bt Cry5Ab1 AAA67693 Narva et al 1991 darmstadiensis PS17 Crv5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Secuencia de ADN solamente Crv5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366 Foncerrada Crv5Ba1 AAA68598 ‘1997 Bt PS86Q3 Narva Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1 Cry6Aa2 AAM46849 Ba¡ et al 2001 YBT 1518 Crv6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418 Crv6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1 Cry7Aa1 AAA22351 Lambert et al 1 QQ9 Bt galleriae PGSI245 Crv7Ab1 AAA21120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511 Bt Crv7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 1994 kumamotoensis 867 Crv7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9 Sin enlace NCBI Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Julio 09 Crv7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola et al 2008 Bt monterrcy GM-33 Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122 Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin enlace NCBI Sept 09 Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin enlace NCBI Nov 09 Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis Cry7Ca1 ABR67863 Gao et at 2007 Bt BTH-13 Crv7Da1 ACQ99547 Yi et al 2009 Bt LH-2 Crv8Aa1 AAA21117 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX Sin enlace NCBI Julio 09 Crv8Ba1 AAA21118 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002 Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002 Crv8Ca1 AAA21119 Sato et al. 1995 Bt japonensis Buibui Crv8Ca2 AAR98783 Shu etal 2004 Bt HBF-1 Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Sin enlace NCBI Bt FTL-23 Julio 09 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Shevelev et al 1991 Bt galleriae Crv9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517 Sin enlace NCBI Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2) Julio 09 Sin enlace NCBI Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Bt T03C001 Julio 09 secuencia Slr AAQ52376 Baum et al 2003 incompleta Crv9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae Crv9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al2004 Bt japonensis Crv9Ca1 CAA85764 Lambert e† al 1996 Bttolworthi Crv9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003 Bt japonensls Crv9Da1 BAA19948 Asano 1997 N141 Cry9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis Sin enlace NCBI Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001 Julio 09 Sin enlace NCBI Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001 Julio 09 Bt kurstaki Crv9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005 DP1019 Bt aizawai SSK· Crv9Ea1 BAA34908 Midoh & Oyama 1998 10 Crv9Ea2 AAO12908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv9Ea3 ABM21765 Lin et al 2006 Bt lyA Crv9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts Crv9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 11 Sin enlace NCBI Cry9Ea7 FJ380927 Sun etal 2008 Julio 09 Sin enlace NCBI Cry9Ea8 GQ249292 Su et al 2009 GQ249292 Julio 09 Crv9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001 Sin enlace NCBI Cry9Eb2 GQ249298 Su et al 2009 Bt T03B001 Julio 09 Crv9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae Bt kurstaki Crv9Ed1 AAX78440 Flannagan & Abad 2005 DP1019 Cry9Ee1 GQ249296 Su et al Sin enlace NCBI 2009 Bt T03B001 Agosto 09 Crv9- secuencia AAC63366 Wasano et al 1998 similar Bt galleriae insuficiente Cry10Aa1 AAA22614 Thorne et al 1986 Bt ¡sraelensis Bt ¡sraelensis Secuencia de Crv10Aa2 E00614 Aran & Toomasu 1996 ONR-60A ADN solamente Crv10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt ¡sraelensis CrylOA- 2006 secuencia DQ167578 Mahalakshmi et al Bt LDC-9 similar incompleta Crv11Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt ¡sraelensis Crv11Aa2 AAA22611 Adams et al 1989 Bt ¡sraelensis Crv11 Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt ¡sraelensis CryHAa- secuencia DQ166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9 similar incompleta Bt jegathesan Crv11Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 367 Crv11Bb1 AAC97162 Orduz et al 1998 Bt medellin Crv12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2 Crv13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1 Crv15Aa1 AAA22333 Brown & Whitelcy 1992 Bt thompsoni Cb malaysia Crv16Aa1 CAA63860 Barloy et al 1996 CH18 Cb malaysia Cry17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998 CH18 Paenibacillus Cry18Aa1 CAA67506 Zhang et al 1997 popilliae Paenibacillus Crv18Ba1 AAF89667 Patel et al 1999 popilliae Paenibacillus Cry18Ca1 AAF89668 Patel et al 1999 popilliae Bt jegathesan Crv19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 367 Crv19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo Crv20Aa1 AAB93476 Lee & Gilí 1997 Bt fukuokaensis Bt higo LBIT- Crv20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 976 Crv20- GQ144333 Yi et al 2009 Rt Y- Secuencia de similar Bt Y ? ADN solamente Secuencia de Crv21Aa1 132932 Payne et al 1996 ADN solamente Secuencia de Crv21 Aa2 I66477 Feitelson 1997 ADN solamente Crv21Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis Secuencia de Crv22Aa1 I34547 Payne et al 1997 ADN solamente Cry22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt Crv22Aa3 ACD93211 Du et al 2008 Bt FZ-4 Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140 Crv22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt Binario con Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Cry37Aa1 Crv24Aa1 AAC61891 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41 Crv25Aa1 AAC61892 Kawalek y Gill 1998 Bt jegathesan Wojciechowska et 1 ggg Bt finitimus B- Crv26Aa1 AAD25075 al 1166 Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo Wojciechowska et . us B-Crv28Aa1 AAD24189 QQQ Bt finitim al 1999 1161 Crv28Aa2 AAG00235 Moore y Debro 2000 Bt finitimus Crv29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Bt jegathesan Crv30Ca2 ACU24781 Sun y Park 2009 367 Sin enlace NCBI Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 Julio 09 Bt aizawai Crv3QDb1 BAE80088 Kishida et al 2006 BUN1-14 Crv30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1 Sin enlace NCBI Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 Julio 09 Crv30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28 Crv30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS18-1 Crv31 Aa1 BAB11757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-11 Crv31 Aa2 AAL87458 Jung y Cote 2000 Bt M15 Crv31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25 Crv31 Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10 Crv31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5 Crv31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29 Balasubramanian Crv32Aa1 AAG36711 Bt yunnanensis et al Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 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Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Cry34Aa3 Binario con Cry35Aa4 AAT29025 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Cry34Aa4 Binario con Cry35Ab1 AAG41672 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Cry34Ab1 Binario con Cry35Ab2 AAK64563 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Cry34Ac2 Binario con Cry35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Cry34Ab3 Binario con Cry35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Cry34Ac1 Binario con Cry35Bai AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Cry34Ba1 Binario con Cry35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 Bt PS201L3 Cry34Ba2 Binario con Cry35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2 Cry34Ba3 Cry36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt Binario con Cry37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Cry23Aa Crv38Aal AAK64559 Rupar et al 2000 Bt Crv39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Ba1 BAC 77648 Ito et al 2003 Bun1-14 Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin enlace NCBI Julio 09 Crv40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2 Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv41Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv43Aa1 Yokoyama BAD15301 P. lentimorbus Tanaka y2003 semadara Crv43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae Yokoyama Crv43Ba1 BAD15303 P. lentimorbus Tanaka y2003 semadara Crv43- Yokoyama BAD15305 P. lentimorbus similar Tanaka y2003 semadara Crv44Aa BAD08532 Ito et al 2004 Bt entomocidus INA288 Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89— T— 34— 22 Crv46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota Crv46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470 Crv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt Crv47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890 Cry48Aa CAJ18351 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 Binario con 49Aa Crv48Aa2 CAJ86545 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B Binario con 49Aa2 Crv48Aa3 CAJ86546 Jones y Berry 2006 Bs NHA15b Binario con 49Aa3 Cry48Ab CAJ86548 Jones y Berry 2006 Bs LP1G Binario con 49Ab1 Cry48Ab2 CAJ86549 Jones y Berry 2006 Bs 2173 Binario con 49Aa4 Cry49Aa CAH56541 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 Binario con 48Aa Cry49Aa2 CAJ86541 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B Binario con 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones y Berry 2006 BsNHA15b Binario con 48Aa3 Cry49Aa4 CAJ86544 Jones y Berry 2006 Bs 2173 Binario con 48Ab2 Cry49Ab1 CAJ86542 Jones y Berry 2006 Binario con Bs LP1G 48Ab1 Crv50Aa1 BAE86999 Ohgushi etal 2006 Bt sotto Cry51Aa1 AB114444 Meng et al 2006 Bt F14-1 Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 Sin enlace NCBI Julio 09 Sin enlace NCBI Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 Julio 09 Cry53Aa1 EF633476 Song et al Sin enlace NCBI 2007 Bt Y41 Julio 09 Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al No NCBI link 2008 Bt MC28 Julio 09 Crv54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt MC28 Crv55Aa1 ABW88931 Guo etal 2008 YBT 1518 Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41 Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2— 8 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al Sin enlace NCBI 2009 Bt G7-1 Agosto 09 Crv57Aa1 ANC87261 Noguera & I barra 2009 Bt kim Crv58Aa1 ANC87260 Noguera & I barra 2009 Bt entomocidus Crv59Aa1 ACR43758 Noguera & I barra 2009 Bt kim LBIT-980 Estruch PNAS 93.
Vip3Aa1 Vip3Aa AAC37036 1996 AB88 et al 5389-5394 Vip3Aa2 Vip3Ab AAC37037 Estruch PNAS 93. 1996 AB424 - et al 5389-5394 ?IIA Estruch Vip3Aa3 Vip3Ac 2000 6137033 et al Oct 2000 EUA PS36A Feitelson j ¡W0981893 .1 QQR Vip3Aa4 AAR81079 !6656908 Bt PS36A Sup et al 1998 >2(A2,A3) 7 Dic 2003 'Mayo 1998 EUA 'PS81F W0981893 ¡Feitelson Vip3Aa5 AAR81080 11998 '6656908 Bt PS81F Sup et al !2(A2,A3) 7 ' Dic 2003 .Mayo 1998 EUA W0981893 Feitelson i Vip3Aa6 Jav90 Sup AAR81081 1998 6656908 Bt et al 2(A2,A3) 7.
Dic 2003 'Mayo 1998 no Bt YBT- Vip3Aa7 Vip83 AAK95326 Cai et al 2001 publicado 833 Vip3Aa8 Vip3A AAK97481 Lo9uercio ?nni no Bt HD125 - et al publicado Selvapan . ino Vip3Aa9 VipS CAA76665 diyan et |2001 i Bt A13 'publicado al Protein Vip3Aa1 Vip3V AAN60738 Doss et al 2002 Expr. Purif. Bt 0 26. 82-88 Vip3Aa1 Vip3A 1 AAR36859 Liu et al 2003 |n° publicado Vip3Aa1 Vip3A- no y 2003 Bt 2 WB5 publicado Sheng Wu Gong Vip3Aa1 Cheng Xue Vip3A AAL69542 Chen et 2002 Bt S184 3 - al Bao 18, I i !687-692 V¡P3Aa1 Vip [ño |Bt AAQ 12340 Polumetla 9hh 4 ^ et al !¿uu,í ¡publicado Itolworthi ViP3Aa1 Vip3A AAP51131 Wu et al !2004 !n° . . Bt WB50 publicado FEMS Vip3Aa1 Vjp3LB Mesrati et ¡ AAW65132 2005 Micro Lett R. 244, 353- 358 EUA W0995728 avelin av90 Feitelson . !6603063 ;2(A2,A3) i Vip3Aa iggg1 J ! 1990 7 et al Ago 2003 11Nov 1999 Vip3Aa1 , ¡no AAX49395 2005 Bt 9816C Xiao publicado 8 no Vip3Aa1 Vjp3A|_Q DQ241674 Liu et al 2006 Bt AL publicado no Vip3Aa1 n|r3A_| DQ539887 Hart et al 2006 publicado 9 no Vip3Aa2 \/¡p3A— 2 DQ539888 Hart et al 2006 publicado 0 Panbangr 0Q6 no Vip3Aa2 v· Bt aizawai ABD84410 ed publicado 1 no Vip3Aa2 Vip3A- AAY41427 Lu et al 2005 Bt LS1 publicado 2 LS1 no Vip3Aa2 Vip3A- AAY4 428 Lu et al 2005 !Bt LS8 publicado 3 LS8 Vip3Aa2 Song et 2007 no BtWZ-7 Bl 880913 al publicado 4 2 Hsieh et no Vip3Aa EF608501 2007 al publicado 5 Sh no V _ , ¡ ¡ ¡ Vip3Aa3 FJ626676 2009 et al publicado 1 Vip3Aa3 Xieumei 2009 no MD2-1 FJ626677 et al publicado 2 ¡EUA Bt ¡W0995728 Feitelson 6603063 KB59A4- ;2(A2,A3) Vip3Ab1 Vip3B AAR40284 1999 et al Ago 2003 ,6 ,11Nov 1999 Feng no AAY88247 ¡Bt Vip3Ab2 Vip3D Shen publicado Solicitud Narva et EUA Vip3Ac1 PS49C al 200401287 16 Solicitud Narva et EUA Vip3Ad1 PS158C2 al 200401287 16 l l , ¡ i l Vip3Ag1 Vip3B WO ADN08758 Syngenta . 02/078437 Vip3Ag2 FJ556803 Audth0 et 2008 Bt al no Vip3Ah1 Vip3S DQ832323 Li y Shen Í2006 publicado no Vip3Ba1 AAV70653 Rang et 2004 - al publicado Vip3Bb1 Vip3Z WO ADN08760 Syngenta 03/075655 Vip3Bb2 EF439819 Akhurst 2007 et al

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteina insecticida Vip3Ab y ADN que codifica una proteína insecticida CrylCa.
2. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta comprende también ADN que codifica una tercera proteína insecticida, estando dicha tercera proteína seleccionada del grupo que consiste en CrylFa, CryIDa, CrylBe, y Cry1E.
3. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha tercera proteína está seleccionada del grupo que consiste en CrylFa y CrylBe, la planta comprende además ADN que codifica una cuarta y una quinta proteína insecticida seleccionadas del grupo que consiste en Cry2A, Cryll, DIG-3, y CrylAb.
4. Una semilla de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.
5. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no-Bt y una pluralidad de plantas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de toda la cosecha de plantas en dicho campo.
6. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 30% de toda la cosecha de plantas en dicho campo.
7. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 20% de toda la cosecha de plantas en dicho campo.
8. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 10% de toda la cosecha de plantas en dicho campo.
9. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos de 5% de toda la cosecha de plantas en dicho campo.
10. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están en bloques o fajas.
11. Una mezcla de semillas que comprende semillas de plantas de refugio no-Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.
12. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.
13. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.
14. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.
15. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.
16. Un metodo para manejar el desarrollo de la resistencia a una proteína Cry por un insecto, en donde dicho método comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5.
17. El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-10, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 10 acres (~4.047 ha).
18. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque dicha planta está seleccionada del grupo que consiste en maíz, soja y algodón.
19. La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.
20. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque dicha planta comprende también ADN que codifica una proteína insecticida CrylFa.
21. Una célula vegetal de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha célula vegetal comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida Vip3Ab y dicho ADN codifica dicha proteína insecticida CrylCa, en donde dicha proteína insecticida Vip3Ab es por lo menos 99% identica con SEQ ID NO:1, y dicha proteína insecticida CrylCa es por lo menos 99% idéntica con SEQ ID NO: 2.
22. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque dicha proteína insecticida Vip3Ab comprende SEQ ID NO:1, y dicha proteína insecticida CrylCa comprende SEQ ID NO:2.
23. Un método para producir la célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 21.
24. Un método para controlar un insecto gusano cogollero del otoño poniendo en contacto dicho insecto con una proteína insecticida Vip3Ab y una proteína insecticida CrylCa.
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