ES2691803T3 - Composiciones y procedimientos para la producción y administración de ARN - Google Patents

Abstract

Un terminador transcripcional que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un primer terminador de la transcripción, un segundo terminador de la transcripción, un tercer terminador de la transcripción y un cuarto terminador de la transcripción que forman una estructura secundaria que comprende cuatro horquillas de tamaño mediano, y en el que el primer terminador de la transcripción comprende la SEQ ID NO: 9, el segundo terminador de la transcripción comprende la SEQ ID NO: 5, el tercer terminador de la transcripción comprende la SEQ ID NO: 6 o 7, y el cuarto terminador de la transcripción comprende la SEQ ID NO: 5.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y procedimientos para la produccion y administracion de ARN

Esta solicitud contiene una lista de secuencias, presentada junto con la presente electronicamente a traves del sitio web de EFS, que contiene el archivo llamado "P34118WO00_59609_2014_03_10_v2ST25.txt" que tiene un tamano de 11.512 bytes (medido en Windows XP), que se creo el 10 de marzo de 2014.

Antecedentes

Campo

Se proporcionan construcciones de vectores utiles para la expresion in vitro e in vivo de ARN. Tambien se proporcionan sistemas de expresion celular para producir ARN y protema in vivo. Tambien se proporcionan procedimientos y composiciones para proporcionar ARNbc transcrito in vivo a organismos diana.

Descripcion de la tecnica relacionada

Las plantas transgenicas y las secuencias que regulan la expresion de un transgen en una planta son bien conocidas e incluyen secuencias terminadoras tanscripcionales. Por ejemplo, la patente EP 2 530 159 A1, Wilson y col., 1995 (PAPnAs, vol. 92, 8793-8797) y Lesnik, 2001 (Nucleic Acids Research, vol. 29, 3583-3594) desvelan cada una sistemas de expresion que comprenden secuencias terminadoras. Ademas, la publicacion de Unniraman, 2001 (Journal of Biological Chemistry, vol. 276, 41850-41855 ) desvela un algoritmo para la prediccion de senales de terminacion de transcripcion intrmseca en eubacterias. Los vectores tambien estan disponibles en el mercado los cuales comprenden secuencias terminadoras transcripcionales (por ejemplo, las secuencias t0 y T1 como se describe en QIAexpress System, Qiagen, 2003, 1, 15).

Los cultivos comerciales son a menudo los objetivos del ataque de virus o plagas como insectos o nematodos. La infestacion de plagas y la infeccion viral pueden tener un efecto negativo significativo sobre el rendimiento del cultivo. Los plaguicidas qmmicos han sido muy efectivos en la erradicacion de infestaciones de plagas; sin embargo, existen desventajas en el uso de plaguicidas qmmicos. Los agentes qmmicos plaguicidas no son selectivos y pueden ejercer un efecto sobre los insectos beneficiosos y otros organismos asf como en la plaga diana. Los agentes qmmicos plaguicidas persisten en el medio ambiente y, en general, se metabolizan lentamente, en todo caso. Se acumulan en la cadena alimentaria, y particularmente en las especies depredadoras mas altas, en las que pueden afirmar efectos negativos. Las acumulaciones de agentes qmmicos plaguicidas tambien dan como resultado el desarrollo de resistencia a los agentes. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos alternativos para controlar o erradicar la infestacion de insectos sobre o en las plantas; procedimientos que son selectivos, ambientalmente inertes, no persistentes, biodegradables y que encajan bien en los esquemas de manejo de resistencia a plagas.

Se ha demostrado que las moleculas de ARN bicatenario (ARNbc) median en la inhibicion de genes espedficos dirigidos a diversos organismos a traves de un mecanismo conocido como ARN de interferencia (ARNi). El ARNi utiliza rutas celulares endogenas mediante las cuales un ARN bicatenario, que comprende secuencias de nucleotidos complementarias que se corresponden sustancialmente con el sentido y el antisentido de una secuencia diana, media la degradacion del ARNm de interes o la traduccion disminuida de la protema del molde del ARNm. Las protemas efectoras de la ruta de ARNi incluyen el complejo de protema Dicer que genera pequenos ARN de interferencia (ARNip) a partir del ARNbc original y el complejo de silenciamiento inducido por aRn (RISC) que usa gmas de ARNip para reconocer y degradar o bloquear la traduccion de los ARNm correspondientes. Solo se afectan trascritos complementarios a los ARNip, y, por lo tanto, la cafda de la expresion del ARNm suele ser espedfica de la secuencia. El efecto de silenciamiento genico del ARNi puede persistir durante dfas y, en condiciones experimentales, en algunos casos puede llevar a una disminucion de la abundancia del transcrito dirigido del 90 % o mas, con la consiguiente disminucion de los niveles de la protema correspondiente. Los niveles de protema tambien pueden perturbarse bloqueando la traduccion sin afectar significativamente los niveles del transcrito de ARNm.

Si bien las moleculas de ARNbc son prometedoras como una alternativa selectiva y ambientalmente inerte a los agentes qmmicos plaguicidas para controlar o erradicar la infestacion de plagas de las plantas, las restricciones en la cantidad de ARNbc que pueden producirse mediante los procedimientos de expresion tradicionales in vitro e in vivo y los costos asociados con el ARNbc de produccion y purificacion presentan una barrera para su uso para controlar la infestacion de plagas y enfermedades en plantas de cultivo. Por lo tanto, existe la necesidad de medios eficientes y rentables para producir cantidades a escala comercial de ARNbc.

Sumario

La presente invencion proporciona un terminador transcripcional que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende un primer terminador de la transcripcion, un segundo terminador de la transcripcion, un tercer terminador de la transcripcion y un cuarto terminador de la transcripcion que forman una estructura secundaria que comprende cuatro horquillas de tamano mediano, y en la que el primer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 9, el segundo terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5, el tercer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 6 o 7, y el cuarto terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO:

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La presente solicitud tambien proporciona una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende:

(a) un promotor;

(b) una primera secuencia de acido nucleico posicionada transcripcionalmente corriente abajo del promotor, en la que la primera secuencia de acido nucleico codifica un ARNbc o una protema; y

(c) una segunda secuencia de acido nucleico, posicionada 3' a la primera secuencia de acido nucleico, en la que la segunda secuencia de acido nucleico comprende un primer terminador de la transcripcion, un segundo terminador de la transcripcion, un tercer terminador de la transcripcion y un cuarto terminador de la transcripcion que forman una estructura secundaria que comprende cuatro horquillas de tamano mediano, en la que el primer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 9, el segundo terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5, el tercer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 6 o 7, y el cuarto terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5; y

en la que la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico estan unidas de forma operacional al promotor, y en la que el promotor y las secuencias terminadoras de la transcripcion estan en combinacion funcional.

En una realizacion adicional, la presente invencion tambien proporciona un procedimiento para mejorar la produccion de ARN o protemas que comprende proporcionar la construccion de expresion obtenida por ingeniena descrita anteriormente para una celula huesped bacteriana, fungica o vegetal.

En una realizacion relacionada, la presente invencion proporciona un vector que comprende la construccion de expresion obtenida por ingeniena descrita anteriormente, en el que el vector es un vector plasmfdico.

La invencion proporciona ademas una celula huesped bacteriana que comprende el vector descrito anteriormente.

Como alternativa, la invencion proporciona un sistema de cultivo celular para la smtesis in vivo de ARNbc que comprende la celula huesped bacteriana de la reivindicacion 11 o 12 y un medio de crecimiento, en el que el medio de crecimiento comprende preferentemente 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % > de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, (NH^So4 50mM, KH2PO410 mM, Na2HPO4 40 mM, MgSO4 2 mM.

En un aspecto separado, la invencion proporciona una composicion para controlar una infestacion de plagas de invertebrados o para inhibir la propagacion de una enfermedad viral en una poblacion de plantas que comprende:

(a) la celula huesped bacteriana descrita anteriormente, en la que la celula huesped bacteriana esta muerta y no esta lisada; o

(b) un lisado de la celula huesped bacteriana descrita anteriormente.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un procedimiento para controlar una infestacion de plagas de invertebrados o para inhibir la propagacion de una enfermedad viral en una poblacion de plantas que comprende aplicar la composicion anterior a una planta.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1A representa una representacion esquematica de una construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena que comprende en una direccion de 5' a 3', un promotor unido de forma operacional a un

fragmento de ADN sentido, una region de codificacion de bucle, un fragmento de ADN antisentido

complementario, un primer terminador transcripcional y un segundo terminador transcripcional.

La Figura 1B representa una representacion esquematica de una construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena que comprende en una direccion de 5' a 3', un promotor unido de forma operacional a un

fragmento de ADN antisentido, una region de codificacion de bucle, un fragmento de ADN de sentido

complementario, un primer terminador transcripcional y un segundo terminador transcripcional.

La Figura 2A representa una representacion esquematica del vector pCPB-hp.

La Figura 2B representa una representacion esquematica del vector pCPB-hp + 2T.

La Figura 2C muestra un mapa parcial del vector pCPB-hp + 2T.

La Figura 3A es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total aislado de 20 ul del cultivo desarrollado durante una noche a 37 °C (calles izquierdas) o a 25 °C (calles derechas). Las calles marcadas con un "1" muestran el ARN total aislado de pUC19/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con un "2" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con un "3" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp + 2T/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con un "4" muestran el ARN total aislado de las pUC19/bacterias HT115 (DE3) + pLac-T7. Las calles marcadas con un "5" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp/bacterias HT115 (DE3) + pLac-T7. Las calles marcadas con un "6" muestran el ARN total aislado de las pCPB-hp + 2T/bacterias HT115 (DE3) + pLac-T7.

La Figura 3B es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total tratado con ARNasa A aislado de 20 ul de cultivo desarrollado durante una noche a 37 °C (calles izquierdas) o a 25 °C (calles derechas). Las calles marcadas con un "1" muestran el ARN total aislado de pUC19/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con

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un "2" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con un "3" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp + 2T/bacterias HT115 (DE3). Las calles marcadas con un "4" muestran el ARN total aislado de las pUC19/bacterias HT115 (DE3) + pLac-T7. Las calles marcadas con un "5" muestran el ARN total aislado de pCPB-hp/bacterias HT115 (DE3) + pLac-T7. Las calles marcadas con un "6" muestran el ARN total aislado de las pCPB-hp + 2T/bacterias Ht115 (DE3) + pLac-T7.

La Figura 4 es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN bacteriano total sin induccion en la calle 1 y ARN bacteriano total con induccion en la calle 2. M: marcador.

La Figura 5 es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN transcrito con bacterias (calles 5-8) y ARN transcrito in vitro (calles 9 y 10) sin digestion con ARNasa A. La lmea 4 muestra un marcador de tamano. La lmea 5 muestra una dilucion de 10 veces del ARN purificado por SNAP modificado. La lmea 6 muestra una dilucion de 50 veces del ARN purificado por SNAP modificado. La lmea 7 muestra una dilucion de 10 veces del ARN purificado por SNAP modificado y filtrado por centrifugacion de 30 K. La lmea 8 muestra una dilucion de 50 veces del ARN purificado por SNAP modificado y filtrado por centrifugacion de 30 K. La lmea 9 muestra una dilucion de 100 veces del ARN transcrito in vitro a partir del vector pCPB-hp + 2T linealizado. La lmea 10 muestra una dilucion de 500 veces del ARN transcrito in vitro a partir del vector pCPB-hp + 2T linealizado.

La Figura 5B es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra los resultados de la digestion con ARNasa A de ARN transcrito con bacterias (calles 5-8) y ARN transcrito in vitro (calles 9 y 10). La lmea 4 muestra un marcador de tamano. La lmea 5 muestra una dilucion de 10 veces del ARN purificado por SNAP modificado. La lmea 6 muestra una dilucion de 50 veces del ARN purificado por SNAP modificado. La lmea 7 muestra una dilucion de 10 veces del ARN purificado por SNAP modificado y filtrado por centrifugacion de 30 K. La lmea 8 muestra una dilucion de 50 veces del ARN purificado por SNAP modificado y filtrado por centrifugacion de 30 K. La lmea 9 muestra una dilucion de 100 veces del ARN transcrito in vitro a partir del vector pCPB-hp + 2T linealizado. La lmea 10 muestra una dilucion de 500 veces del ARN transcrito in vitro a partir del vector pCPB-hp + 2T linealizado.

La Figura 6 muestra micrograffas de celulas de E. coli despues de la incubacion a 37, 51, 62 o 72 °C durante 30 minutos.

La Figura 7A es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total aislado de las bacterias pDV49 cultivadas en medio de induccion automatica (AIM) (calle 5), Super Broth + medio AIM (calle 6) o plasmido + medio AIM (calle 7). La lmea 4 muestra un marcador de tamano. Las bandas de ARNbc DV49 estan indicadas por la flecha.

La Figura 7B es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total aislado de las bacterias pCPB-hp + 2T cultivadas en Super Broth + el medio (calle 5). La lmea 4 muestra un marcador de tamano. La banda de ARNbc CPB esta indicada por la flecha.

La Figura 8 se representa una representacion esquematica del vector pDV49 + 2T.

La Figura 9 representa una representacion esquematica de un vector plasmfdico que comprende un fragmento de ADN sentido y un fragmento de ADN antisentido complementario insertado entre el extremo 3' de un promotor y un sitio de reconocimiento de nucleasa. La expresion de la nucleasa linealiza el vector.

La Figura 10 es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total aislado de E. coli que contienen vectores de expresion de ARN con diferentes terminadores o combinaciones de terminadores. Un marcador de tamano se muestra en la calle "M". La calle 1 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-PET/bacterias HT115 (DE3). La calle 2 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-PTH1/bacterias HT115 (DE3). La calle 3 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-PTH2/bacterias HT115 (DE3). La calle 4 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-BT1/bacterias hT115 (DE3). La calle 5 muestra el ArN aislado del terminador pUC19- BT2/bacterias HT115 (DE3). La calle 6 muestra el ArN aislado del terminador pUC19-CJ/bacterias HT115 (DE3). La calle 7 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-B1002/bacterias hT115 (DE3). La calle 8 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-B1006/bacterias HT115 (DE3). La calle 9 muestra el ARN aislado del terminador pUC19-PTH + PET/bacterias HT115 (DE3).

La Figura 11 representa las estructuras secundarias formadas por los terminadores PTH + PET (SEQ ID NO. 13); CJ (SEQ ID NO. 10); rrn BT2 (SEQ ID NO. 9); rrnBT1 (SEQ ID NO. 8); PTH (SEQ ID NO. 7); PET (SEQ ID NO. 13); B1006 (SEQ ID NO. 12) y B1002 (SEQ ID NO. 11)segun se determina usando CLC Main Workbench (version 6.8.4). La energfa libre de las estructuras secundarias mostradas se puede encontrar en la Tabla 5.

La Figura 12 describe las estructuras secundarias formadas por horquillas de ARN de diferentes tamanos y terminadores de PTH + PET segun se determina usando CLC Main Workbench (version 6.8.4). La Figura 12A muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN de 27 ameros y el terminador PTH + PET. La Figura 12B muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN de 240 ameros y el terminador PTH + PET. La Figura 12C muestra la estructura secundaria formada por la horquilla de ARN de 280 ameros y el terminador PTH + PET. La estructura formada por el terminador PTH + PET esta rodeada por un cffculo.

La Figura 13 es un grafico que muestra el rendimiento de ARN obtenido de cada una de las construcciones de expresion de la horquilla de ARN de 27 ameros/el terminador de PTH + PET; la horquilla de ARN de 240 ameros/el terminador de PTH + PET; la horquilla de ARN de 280 ameros/el terminador de PTH + PET. La Figura 14 es una fotograffa de un gel de agarosa que muestra el ARN total aislado de celulas de E. coli que contienen vectores de expresion de ARN con diferentes numeros y combinaciones de terminadores. La calle 1 muestra el ARN total aislado del terminador pUC19-PTH + PET 2/bacterias HT115 (DE3). La calle 2 muestra el ARN total aislado del terminador pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET 4/bacterias HT115 (DE3). La calle 3 muestra el ARN total aislado del terminador pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET 4/bacterias HT115 (DE3). La calle 4 muestra el ARN total aislado del terminador pUC19-rrn BT2+PTH+PET 3/bacterias HT115 (DE3).

La Figura 15 representa las estructuras secundarias formadas por diferentes numeros y combinaciones de terminadores segun se determina usando CLC Main Workbench (version 6.8.4). La Figura 15A muestra la estructura secundaria formada por 2 terminadores, PTH + PET. La Figura 15B muestra la estructura secundaria formada por 4 terminadores, rrn BT2 + PET + PTH + PET. La Figura 15C muestra la estructura secundaria 5 formada por 4 terminadores, PET + rrn BT2 + PTH + PET. La Figura 15D muestra la estructura secundaria

formada por 3 terminadores, rrn BT2 + PTH + PET. Las estructuras de horquilla de tamano mediano formadas por las combinaciones de terminadores estan rodeadas por un drculo.

La Figura 16 es una fotograffa de un gel SDS-PAGE que muestra la protema total aislada de celulas BL21 (DE3) que contienen vectores de expresion con diferentes numeros y combinaciones de terminadores. La protema 10 expresada, Protien A, tiene un peso molecular de 21k. Un marcador de tamano se muestra en la calle "M". La

calle "A" contiene protema aislada de celulas que contienen la construccion de expresion del terminador pUC + PET. La calle "B" contiene protema aislada de celulas que contienen la construccion de expresion del terminador pUC + rrn BT2. La calle "C" contiene protema aislada de celulas que contienen la construccion de expresion del terminador pUC + PTH +PET. La calle "D" contiene protema aislada de celulas que contienen la cosntruccion de 15 expresion terminador pUC + rrn BT2 + PET + PTH + PET.

La Figura 17 representa las estructuras secundarias formadas por terminadores obtenidos por ingeniena segun se determina usando CLC Main Workbench (version 6.8.4). La Figura 17A muestra la estructura secundaria formada por 4 terminadores, rrn BT2 + PET + Pth + PET (SEQ ID NO. 18). La Figura 17B muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 21. La Figura 17C muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 20 22. La Figura 17D muestra la estructura secundaria formada por la SEQ ID 23.

Descripcion detallada

La siguiente es una descripcion detallada de la invencion proporcionada para ayudar a los expertos en la tecnica a practicar la presente invencion.

A. Definiciones

25 A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica. Cuando se proporciona un termino en singular, el plural de ese termino tambien se contempla a menos que se indique lo contrario. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de acido nucleico en el texto de esta memoria descriptiva se dan en la direccion 5' a 3' con respecto al promotor.

30 En la descripcion que sigue, un numero de terminos se usan ampliamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprension de las presentes realizaciones.

Como se usa en el presente documento, "un" o "una" pueden significar uno o mas de uno.

Como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" indica que un valor incluye la variacion inherente del error para el procedimiento que se esta empleando para determinar un valor, o la variacion que existe 35 entre los experimentos.

Se entendera que, aunque los terminos "primero", "segundo", etc. se pueden usar en el presente documento para describir diversos elementos, estos elementos no deben estar limitados por estos terminos. Estos terminos solo se usan para distinguir un elemento de otro.

Como se usa en el presente documento, el termino "acido nucleico" o la expresion "molecula de acido nucleico" se 40 refiere a un polfmero de una cadena o dos cadenas de bases de desoxirribonucleotido o ribonucleotido. Las moleculas de acido nucleico pueden estar compuestas de monomeros que son nucleotidos de origen natural (como el ADN y el ARN), o analogos de nucleotidos de origen natural (por ejemplo, formas enantiomericas de nucleotidos de origen natural), o una combinacion de ambos. Los nucleotidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azucar y/o en los restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones del azucar incluyen, por 45 ejemplo, el reemplazo de uno o mas grupos hidroxilo con halogenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azucares pueden funcionalizarse como eteres o esteres. Ademas, todo el resto de azucar puede reemplazarse con estructuras estericamente y electronicamente similares, como aza-azucares y analogos de azucares carbodclicos. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterodclicos bien conocidos. Los monomeros de acido nucleico pueden estar unidos por 50 enlaces fosfodiester o analogos de dichos enlaces. Los analogos de los enlaces fosfodiester incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.

Una "molecula de acido nucleico aislada" es una molecula de acido nucleico que no esta integrada en el ADN genomico de un organismo. Por ejemplo, una molecula de ADN que codifica un receptor que se ha separado del ADN genomico de una celula es una molecula de ADN aislada. Otro ejemplo no limitante de una molecula de acido 55 nucleico aislada es una molecula de acido nucleico sintetizada qmmicamente que no esta integrada en el genoma de un organismo. Otro ejemplo no limitante de una molecula de acido nucleico aislada es una molecula de acido nucleico que se ha aislado de una especie particular que es mas pequena que la molecula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

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El termino "vector" se refiere a una molecula de ADN usada como vehmulo para transportar artificialmente material genetico extrano a una celula huesped, en la que se puede replicar y/o expresar. La secuencia de ADN de un vector generalmente comprende un inserto (transgen) y una secuencia mas grande que sirve como "estructura". La estructura del vector puede contener uno o mas sitios de reconocimiento de endonucleasas de restriccion que permiten la insercion de una molecula de acido nucleico en una forma determinable sin perdida de una funcion biologica esencial del vector, secuencias de nucleotidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificacion y seleccion de celulas transducidas con el vector, y un origen de replicacion. Los vectores de expresion (construcciones de expresion) generalmente tienen una secuencia promotora que impulsa la expresion del transgen en la celula huesped. Ejemplos de vectores adecuados para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones incluyen, pero sin limitacion, plasmidos, cosmidos, plastomas, cromosomas artificiales y bacteriofagos.

El 'termino "promotor" o "secuencia promotora" se pueden usar de manera intercambiable y se refieren a una secuencia de ADN que, cuando esta ligada a una secuencia de nucleotidos de interes, es capaz de controlar la transcripcion de la secuencia de nucleotidos de interes en el ARN. El termino "promotor" y "secuencia promotora" incluyen un promotor mmimo que es una secuencia de ADN corta que comprende una caja TATA y otras secuencias de ADN que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripcion o estan involucrados en la union de factores proteicos que controlan la efectividad de la iniciacion de la transcripcion en respuesta a las condiciones fisiologicas. Los promotores pueden ser homologos, procedentes en su totalidad de un gen nativo de la celula huesped, o heterologos, procedentes en su totalidad o en parte de otro organismo, o estar compuestos por diferentes elementos procedentes de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o estar compuestos por segmentos de ADN sintetico. Como se usa en el presente documento, un promotor puede ser un promotor constitutivamente activo o un promotor regulado. En algunas realizaciones, el promotor puede ser reprimible. En otras realizaciones, el promotor puede ser inducible.

Cuando la expresion de una secuencia de nucleotidos se coloca bajo el control de un promotor, se dice que dicha secuencia de nucleotidos esta "unida de forma operacional" al promotor. De forma similar, un elemento regulador y un promotor central estan "unidos de forma operacional" si el elemento regulador modula la actividad del promotor central.

El termino "celula huesped" se refiere a cualquier celula capaz de replicar y/o transcribir un vector disenado de acuerdo con las presentes realizaciones. Las celulas huesped para su uso en las presentes realizaciones pueden ser celulas procarioticas, tales como E. coli, o celulas eucariotas tales como celulas de hongos, plantas, insectos, anfibios, aves o mairnferos. La insercion de un vector en la celula diana generalmente se llama transformacion para celulas bacterianas, transfeccion para celulas eucariotas, aunque la insercion de un vector viral a menudo se llama transduccion.

El termino "expresion" o "expresion genica" se refiere a la biosmtesis de un producto genico. Por ejemplo, en el caso de un ARN funcional, la expresion genica implica la transcripcion del gen en ARN.

Como se usa en el presente documento, la expresion "inhibicion de la expresion genica" o "inhibicion de la expresion de un gen diana" o "supresion de genes" o "supresion de un gen diana" se refiere a la ausencia (o reduccion observable) en el nivel de protema y/o producto de ARNm del gen diana.

Como se usa en el presente documento, la expresion "transcripcion de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripcion catalizada por una polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN procedente del procesamiento posterior a la transcripcion del transcrito primario y se denomina ARN maduro.

Como se usa en el presente documento, el termino "ARN sentido" se refiere a un transcrito de ARN correspondiente a una secuencia o segmento que, cuando es producido por el organismo diana, esta en forma de un ARNm que puede traducirse en protema por el organismo diana. En algunas realizaciones, el organismo diana es una plaga.

Como se usa en el presente documento, el termino "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un ARNm que normalmente se produce en una celula de un organismo diana. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen espedfico, es decir, en la secuencia no codificante 5', la secuencia no traducida 3', los intrones o la secuencia codificante. En algunas realizaciones, el organismo diana es una plaga.

El termino "secuencia de referenda" se refiere a una secuencia usada como base para una comparacion de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mas grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud completa proporcionada en una lista de secuencias o puede comprender una secuencia genica completa. En general, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 nucleotidos, frecuentemente de al menos 25 nucleotidos, y con frecuencia de al menos 50 nucleotidos.

Como se usa en el presente documento, el termino "secuencia diana" se refiere a una secuencia de nucleotidos de un gen dirigido a la supresion, que corresponde a una region formadora duplex de un ARNbc. En este contexto, el termino "gen" significa una region localizable de secuencia genomica, correspondiente a una unidad de herencia,

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que incluye regiones reguladoras, regiones transcritas y/u otras regiones de secuencia funcional. Dependiendo de las circunstancias, el termino secuencia diana puede referirse a la secuencia de nucleotidos de longitud completa del gen dirigido a la supresion o la secuencia de nucleotidos de una porcion de un gen dirigido a la supresion.

Una primera secuencia de nucleotidos cuando se observa en la direccion 5' a 3' se dice que es un "complemento de", o "complementaria a", una segunda secuencia de nucleotidos de referencia observada en la direccion 3' a 5' si la secuencia del primer nucleotido es el complemento inverso de la secuencia de nucleotidos de referencia. Para la ilustracion, la secuencia de nucleotidos "CATTAG" corresponde a una secuencia de referencia "CATTAG" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTAATC". Se dice que las moleculas de la secuencia de acido nucleico muestran una "complementariedad completa" "cuando cada nucleotido de una de las secuencias lefdas 5' a 3' es complementario a cada nucleotido de la otra secuencia cuando se lee 3' a 5'.

Como se usa en el presente documento, "bucle" se refiere a una estructura formada por una sola cadena de un acido nucleico, en la que las regiones complementarias que flanquean una region nucleotfdica monocatenaria particular se hibridan de manera que la region nucleotfdica monocatenaria entre las regiones complementarias se excluye de la formacion duplex o apareamiento de bases de Watson-Crick. Un bucle es una region de nucleotidos de una sola cadena de cualquier longitud.

Como se usa en el presente documento, el termino "identidad de secuencia", "similitud de secuencia" u "homologfa" se usa para describir relaciones de secuencia entre dos o mas secuencias de nucleotidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de manera optima en una ventana de comparacion, de manera que la porcion de la secuencia en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones o eliminaciones) para una alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se produce la base de acido nucleico o el residuo de aminoacido identico en ambas secuencias para obtener el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Una secuencia que es identica en cada posicion en comparacion con una secuencia de referencia se dice que es identica a la secuencia de referencia y viceversa.

Como se usa en el presente documento, una "ventana de comparacion" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, mas generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias se alinean de manera optima. La ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para una alineacion optima de las dos secuencias. Los expertos en la tecnica deben consultar los procedimientos detallados usados para la alineacion de secuencias en el paquete de software de Wisconsin Genetics version 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, EE. UU.) o consultar Ausubel y col. (1998) para un analisis detallado del analisis de secuencia.

Como se usa en el presente documento, la expresion "procedente de" se refiere a una secuencia de nucleotidos espedfica que se puede obtener de una fuente o especie espedfica, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie espedfica.

El termino "endonucleasa" o "endonucleasa de restriccion" se refiere a las enzimas que escinden el enlace fosfodiester dentro de una cadena de polinucleotidos.

El termino "meganucleasa" se refiere a las endodeoxirribonucleasas caracterizadas por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN de doble cadena de 12 a 40 pares de bases), y que, como resultado del tamano de su sitio de reconocimiento, generalmente se producen rara vez, o nunca, en un determinado genoma. Ejemplos de meganucleasas incluyen, pero sin limitacion, I-Anil, I-Scel, I-CeuI, Pl-PspI, Pl-Sce, I-ScelV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII.

El termino "nucleasa efectora TAL" (TALEN) se refiere a una nucleasa que comprende un dominio de union a ADN efector TAL fusionado a un dominio nucleasa. Los dominios de union al ADN del efector TAL pueden obtenerse por ingeniena para unirse a una diana deseada y fusionarse a un dominio de nucleasa, tal como el dominio de la nucleasa Fok1, para obtener una protema de fusion nucleasa del dominio efector TAL.

El termino "nucleasa con dedo de zinc" (ZFN) se refiere a una nucleasa que comprende un dominio de union a ADN con dedo de zinc fusionado a un dominio de nucleasa, tal como el dominio de nucleasa Fok1. Los dominios de dedos de zinc se pueden obtener por ingeniena para dirigirse a secuencias de ADN deseadas y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc se dirijan a secuencias unicas dentro de genomas complejos.

El termino "escision" se refiere a la rotura de la estructura covalente de una molecula de polinucleotido, tal como una molecula de ADN.

Como se usa en el presente documento, el termino "plaga" se refiere a insectos, aracnidos, crustaceos, hongos,

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bacterias, virus, nematodos, gusanos pianos, gusanos redondos, gusanos alfiler, anquilostomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, mosquitos, pulgas, garrapatas, acaros y piojos y similares que dominan el ambiente humano y que pueden ingerir o ponerse en contacto con una o mas celulas, tejidos o fluidos producidos por un huesped de plaga o simbionte.

Como se usa en el presente documento, la expresion "resistencia a la plaga" se refiere a la capacidad de un huesped de la plaga, o simbionte para resistir el ataque de una plaga que tipicamente es capaz de infligir dano o perdida al huesped de la plaga o simbionte. Como se describe en el presente documento, dicha resistencia a la plaga se puede conseguir proporcionando a una superficie de un huesped de la plaga o simbionte una molecula de ARNbc comprendida en parte de un segmento de ARN que es identico a un segmento de ARN correspondiente codificado a partir de una secuencia de ADN dentro de una plaga que prefiere alimentarse de la plaga huesped o simbionte. La expresion del gen dentro de la plaga diana es suprimida por el ARNbc, y la supresion de la expresion del gen en la plaga diana da como resultado que el huesped de la plaga o simbionte sea resistente a la plaga.

B. Produccion de ARN

La presente divulgacion se refiere a composiciones y procedimientos para la produccion y entrega eficientes y rentables de una molecula de ARN transcrita. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita codifica una protema. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita codifica un ARN regulador. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita es ARNbc. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita comprende segmentos orientados en sentido y orientados antisentido que forman una molecula de ARN (ARNbc) estabilizada, al menos parcialmente bicatenaria, capaz de suprimir un gen diana. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita codifica una protema. En algunas realizaciones, la molecula de ARN transcrita es un ARN regulador.

ARNbc

Varias realizaciones descritas en el presente documento se refieren a vectores y sistemas para la produccion in vivo o in vitro de una molecula de ARN que comprende un primer segmento de ARN unido a un segundo segmento de ARN sustancialmente complementario por un tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmentos de ARN se encuentran dentro de la longitud de la molecula de ARN y son repeticiones sustancialmente invertidas entre sf, de modo que la complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos para hibridarse in vivo e in vitro para formar un tallo de ARN bicatenario unido en un extremo de cada uno de los segmentos primero y segundo por el tercer segmento de ARN, que forma un bucle de una sola cadena. El primer y el segundo segmentos corresponden al sentido y antisentido, respectivamente, de una secuencia que muestra una identidad sustancial con una secuencia de nucleotidos dirigida a la supresion. En algunas realizaciones, la molecula de ARN incluye ademas al menos una segunda region de formacion de bucle troncal que suprime al menos una segunda secuencia diana.

En algunas realizaciones, la longitud de la cadena codificante del duplex de ARN puede ser al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900 o mas nucleotidos. De forma similar, en algunas realizaciones, la longitud de la cadena no codificante del duplex de ARN puede ser al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900 o mas nucleotidos. Las cadenas codificantes y no codificantes del duplex de ARN no necesitan ser perfectamente complementarias, y el ARN bicatenario puede contener regiones internas no complementarias. Las cadenas codificantes y no codificantes solo necesitan duplicar o ser sustancialmente complementarias para recocer en condiciones biologicas. En algunas realizaciones, cuando se forma un ARN bicatenario a partir de un apareamiento de bases complementarias de las cadenas codificantes y no codificantes, el duplex resultante tiene extremos romos. En otras realizaciones, cuando se forma un ARN bicatenario a partir de un apareamiento de bases complementarias de las cadenas codificantes y no codificantes, el ARNbc tiene una estructura asimetrica. En algunas realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 5' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas nucleotidos en la cadena codificante. En otras realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 5' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas nucleotidos en la cadena no codificante. En otras realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 3' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas nucleotidos en la cadena codificante. En otras realizaciones, el ARNbc tiene un saliente 3' de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas nucleotidos en la cadena no codificante.

El tercer segmento de ARN puede comprender cualquier secuencia de nucleotidos que facilite o permita que el primer segmento de ARN y el segundo segmento de ARN se hibriden y formen ARNbc. El tercer segmento de ARN puede comprender una secuencia de nucleotidos de al menos aproximadamente 1-5 nucleotidos de longitud, 5-10 nucleotidos de longitud, 10-15 nucleotidos de longitud, 15-20 nucleotidos de longitud, 20-25 nucleotidos de longitud, 25-30 nucleotidos de longitud, 30-35 nucleotidos de longitud, 35-40 nucleotidos de longitud, 40-45 nucleotidos de longitud, 45-50 nucleotidos de longitud, 50-55 nucleotidos de longitud, 55-60 nucleotidos de longitud, 60-65 nucleotidos de longitud, 65-70 nucleotidos de longitud, 70-75 nucleotidos de longitud, 75-80 nucleotidos de longitud, 80-85 nucleotidos de longitud, 85-90 nucleotidos de longitud, 90-95 nucleotidos de longitud, 95-100 nucleotidos de longitud, 100-150 nucleotidos de longitud, 150-200 nucleotidos de longitud, 200-250 nucleotidos de longitud, 250-400

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nucleotidos de longitud, o al menos aproximadamente 400-500 nucleotidos de longitud. Una diversidad de diferentes secuencias pueden servir como la secuencia de bucle. Ejemplos de secuencias de bucle espedficas que se ha demostrado que funcionan en los ARNhc incluyen UUCAaGaGA, CCACACC, AAGCUU, CTCGAG, CcACC y UUCG. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN corresponde sustancialmente a una secuencia sentido o antisentido de un segmento del gen dirigido a la supresion. Por ejemplo, el tercer segmento de ARN puede comprender una secuencia de nucleotidos correspondiente a la de sentido o antisentido de nucleotidos localizados en un extremo distal del segmento de gen dirigido por los segmentos de ARN primero y segundo autocomplementarios. En otras realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN corresponde sustancialmente a una secuencia sentido o antisentido de un segmento de un gen no dirigido. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN se obtiene de la secuencia de nucleotidos de una region de bucle de un microARN (ARNmi). En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN se obtiene de la secuencia de nucleotidos de una region de bucle de un microARN nativo (ARNmi) del organismo diana. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN es una secuencia de nucleotidos obtenida por ingeniena. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos obtenida por ingeniena del tercer segmento de ARN se obtiene de una secuencia de nucleotidos de un gen nativo alterando el contenido de GC. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos del tercer segmento de ARN codifica un aptamero.

Cualquier gen puede ser dirigido a la supresion por una molecula de ARNbc producida de acuerdo con las presentes realizaciones. La inhibicion de un gen diana que usa una molecula de ARNbc como se describe en el presente documento es espedfica de la secuencia, ya que las secuencias de nucleotidos correspondientes a una region formadora duplex del ARNbc estan dirigidas a la inhibicion mediada por ARNi. La region de formacion de duplex del ARNbc puede corresponder a la secuencia de nucleotidos de longitud completa del producto de transcripcion primario o el ARNm completamente procesado del gen diana o la region de formacion de duplex del ARNbc puede corresponder a una porcion del producto de transcripcion primario o el ARNm completamente procesado del gen diana. Una secuencia de nucleotidos de un gen dirigido a la supresion, que corresponde a una region de formacion duplex del ARNbc puede denominarse la "secuencia diana". La region de formacion duplex del ARNbc puede corresponder a una porcion de un gen diana que tiene al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75. 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, o 1.000 nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, la region de formacion duplex del ARNbc puede corresponder a mas de aproximadamente 20-25 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 25-50 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 50-75 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 75-100 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 100-125 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 125-150 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 150-175 nucleotidos del gen diana, o una secuencia de mas de aproximadamente 175-200 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 200-250 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 250-275 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 275-300 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 300-325 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 325-350 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 350-400 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 400-450 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 450-500 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 500-550 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 550-600 nucleotidos del gen diana, mas de aproximadamente 600-700 nucleotidos del gen diana, o mas de aproximadamente 700-1.000 nucleotidos del gen diana,dependiendo del tamano del gen diana. La longitud de la region de formacion duplex puede depender de la longitud de las moleculas de ARNbc capaces de ser captadas por el organismo diana, por ejemplo, un insecto, y la longitud del ARNbc capaz de procesarse dentro de una celula de un organismo diana en fragmentos que dirigen la interferencia por ARN. La longitud de la region de formacion duplex tambien puede verse influenciada por el procedimiento de smtesis de ARNbc.

En algunas realizaciones, una region de formacion duplex de una molecula de ARNbc tiene una complementariedad perfecta (100 %) con una secuencia diana. Sin embargo, no se requiere la identidad de secuencia absoluta entre la region de formacion duplex de una molecula de ARNbc y la secuencia diana. Se toleran las variaciones de secuencia que podnan esperarse debido a mutacion genetica, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva y se puede usar ARNbc que contiene una secuencia de nucleotidos formadora de duplex con inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales unicas relativas a la secuencia diana para inhibir un gen diana. Las secuencias de nucleotidos de una region de formacion de duplex de un ARNbc como se describe en el presente documento y la porcion correspondiente del gen diana pueden ser sustancialmente complementarias, por ejemplo, las secuencias pueden compartir al menos aproximadamente el 80 % de identidad, al menos aproximadamente el 90 % de identidad, al menos aproximadamente el 95 % de identidad, al menos aproximadamente el 96 % de identidad, al menos aproximadamente el 97 % de identidad, al menos aproximadamente el 98 % de identidad, o al menos aproximadamente el 99 % de identidad, a lo largo de la secuencia a la que se dirige. La region de formacion duplex de un ARNbc como se describe en el presente documento tambien se puede definir funcionalmente como una secuencia de nucleotidos que es capaz de hibridar con una porcion del transcrito del gen diana. El aumento de la longitud puede compensar una menor homologfa entre una region de formacion de duplex de una molecula de ARNbc y su secuencia diana. La longitud de las secuencias de nucleotidos identicas puede ser al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos aproximadamente 1000 bases.

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Una region de formacion duplex de una molecula de ARNbc puede disenarse contra cualquier secuencia diana, incluyendo una o mas secuencias diana seleccionadas de entre un gen nativo de una plaga o patogeno. La secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de un organismo eucariotico o un organismo no eucariotico. Una secuencia diana puede incluir cualquier secuencia de cualquier especie, que incluyen, pero sin limitacion, bacterias; virus; hongos; plantas, incluyendo monocotiledoneas y dicotiledoneas, tales como plantas de cultivo, plantas ornamentales y plantas no domesticadas o silvestres; invertebrados tales como artropodos, anelidos, nematodos y moluscos; y vertebrados como los anfibios, peces, aves o mairnferos.

La secuencia diana puede ser una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (como una secuencia reguladora no codificante), o ambas. Ejemplos no limitantes de una secuencia diana no traducible (no codificante) incluyen: regiones no traducidas 5', promotores, potenciadores u otras regiones transcripcionales no codificantes, regiones no traducidas 3', terminadores e intrones. Las secuencias diana tambien pueden incluir genes que codifican microARNs, pequenos ARN de interferencia, componentes de ARN de ribosomas o ribozimas, ARN pequeno nucleolar y otros ARN no codificantes (vease, por ejemplo, secuencias de ARN no codificantes proporcionadas publicamente en rfam.wustl.edu; Erdmann y col. (2001) Nucleic Acids Res., 29:189-193; Gottesman (20O5) Trends Genet., 21:399-404; Griffiths-Jones y col. (2005) Nucleic Acids Res., 33:121-124). Ejemplos no limitantes de una secuencia diana traducible (codificante) incluyen: genes que codifican factores de transcripcion, genes que codifican receptores, genes que codifican hormonas, genes constitutivos y genes que codifican enzimas de la biosmtesis o catabolismo de moleculas de interes (como, pero sin limitacion, aminoacidos, acidos grasos y otros lfpidos, azucares y otros carbohidratos, polfmeros biologicos y metabolitos secundarios, incluidos alcaloides, terpenoides, policetidos, peptidos no ribosomicos y metabolitos secundarios de origen biosintetico mixto). Ademas, las secuencias de nucleotidos diana se pueden determinar a partir de cualquier gen de plantas, insectos, virus, bacterias u hongos cuya funcion se ha establecido a partir de la literatura. Se contempla que se pueden emplear varios criterios en la seleccion de genes dirigidos. Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos diana pueden determinarse a partir de genes que desempenan funciones importantes en la viabilidad, el crecimiento, el desarrollo, la reproduccion y la infectividad. Estos genes pueden ser identificados por mutaciones de inactivacion letales en Drosophila, C. elegans, u otros organismos. El gen tambien puede ser uno cuyo producto proteico tenga una velocidad de renovacion rapida, de modo que la inhibicion del ARNbc dara como resultado una disminucion rapida en los niveles de protema. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequena cafda en el nivel de expresion da como resultado efectos perjudiciales para el organismo.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen nativo de un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de cualquier especie de insecto que cause danos a las plantas de cultivo y perdidas de rendimiento posteriores (una plaga de insectos). Ejemplos no limitantes de plagas de insectos incluyen: pulgon de la hoja del mafz, cogollero del mafz, cogollero del mafz africano, gusano de la mazorca de mafz, chicharrita del mafz, minador de la mancha del mafz, gusano de la rafz del mafz del oeste, gusano de la rafz del mafz del norte, gusano de la rafz del mafz mexicano, gusano de la rafz del mafz del sur, oruga cortadora, gusano de la semilla del mafz, gusano del alambre, gusano del tallo del trigo, escarabajo del pepino manchado, chinche verde, chinche marron, pulgon de la soja y barrenador del tallo de la soja. Los genes en el insecto pueden dirigirse a las etapas de madurez (adulto), inmadura (larva) o huevo. En algunas realizaciones, el gen dirigido a la supresion, puede codificar una protema esencial, cuya funcion predicha se selecciona de entre el grupo que consiste en formacion muscular, formacion de hormonas juveniles, regulacion de hormonas juveniles, regulacion y transporte de iones, smtesis de enzimas digestivas, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosmtesis de aminoacidos, degradacion de aminoacidos, formacion de espermatozoides, smtesis de feromonas, deteccion de feromonas, formacion de antenas, formacion de alas, formacion de piernas, desarrollo y diferenciacion, formacion de huevos, maduracion larvaria, formacion de enzimas digestivas, smtesis de hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmision, division celular, metabolismo energetico, respiracion y apoptosis. Cuando la secuencia diana se obtiene de un gen esencial para la viabilidad o infectividad del insecto, su regulacion por disminucion da como resultado una capacidad reducida del insecto para sobrevivir e infectar a su huesped. Por lo tanto, dicha regulacion por disminucion produce un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad de mantenimiento y la infectividad del insecto, ya que evita o reduce la capacidad del insecto para alimentarse y sobrevivir de los nutrientes obtenidos de las celulas huesped. En virtud de esta reduccion en la viabilidad e infectividad del insecto, se facilita la resistencia y/o la tolerancia potenciada a la infeccion por un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto proteico tiene una velocidad de renovacion rapida, de modo que la inhibicion del ARNbc dara como resultado una disminucion rapida en los niveles de protema. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequena cafda en el nivel de expresion da como resultado efectos perjudiciales para el insecto.

En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que se expresa en el intestino del insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que comparte homologfas sustanciales con las secuencias de nucleotidos de los genes conocidos expresados en el intestino que codifican componentes proteicos del proton de membrana plasmatica V-ATPasa (Dow y col., 1997, J. Exp. Biol., 200:237-245; Dow, Bioenerg. Biomemb., 1999, 31:75-83). Este complejo de protemas es el unico energizante del transporte de iones epiteliales y es responsable de la alcalinizacion de la luz del intestino medio. La V-ATPasa tambien se expresa en el tubulo de Malpighi, una extension del intestino posterior del insecto que funciona en el equilibrio de lfquidos y en la desintoxicacion de compuestos extranos de manera analoga a un organo renal de un mai^ero.

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En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que esta involucrado en el crecimiento, desarrollo y reproduccion de un insecto. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que codifica el gen CHD3. El gen CHD3 en Drosophila melanogaster codifica una protema con actividad de helicasa del ADN dependiente de ATP que esta involucrada en el ensamblaje/desensamblaje de la cromatina en el nucleo. Se han encontrado secuencias similares en diversos organismos como Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen que codifica el gen de la 13-tubulina. La familia de genes de la beta-tubulina codifica protemas asociadas a microtubulos que son un componente del citoesqueleto celular. Las secuencias relacionadas se encuentran en organismos tan diversos como Caenorhabditis elegans y Manduca Sexta.

En algunas realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de una plaga de nematodos. Ejemplos no limitantes de plagas de nematodos incluyen: nematodo formador de agallas de Columbia, nematodo formador de agallas del norte, nematodo formador de agallas del sur, nematodo formador de agallas, nematodo formador de agallas falso, nematodo del quiste del mafz, nematodo del quiste de la soja, nematodo del quiste de la patata, nematodo del quiste de la remolacha azucarera, nematodo de picadura, nematodo de anillo, nematodo espiral, nematodo de lanza, nematodo de daga, nematodo de aguja, nematodo de la lesion, nematodo de la rafz corta, nematodo de acrobacia, nematodo de oro y nematodo de la pochedumbre de las patatas. En algunas realizaciones, el gen dirigido a la supresion, puede codificar una protema esencial, cuya funcion predicha se selecciona de entre el grupo que consiste en formacion muscular, regulacion y transporte de iones, smtesis de enzimas digestivas, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosmtesis de aminoacidos, degradacion de aminoacidos, formacion de espermatozoides, desarrollo y diferenciacion, formacion de huevos, formacion de enzimas digestivas, neurotransmision, division celular, metabolismo energetico, respiracion y apoptosis. Cuando la secuencia diana se obtiene de un gen esencial para la viabilidad o infectividad del nematodo, su regulacion por disminucion da como resultado una capacidad reducida del nematodo para sobrevivir e infectar a su huesped. Por lo tanto, dicha regulacion por disminucion produce un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad de mantenimiento y la infectividad del nematodo, ya que evita o reduce la capacidad del nematodo para alimentarse y sobrevivir de los nutrientes obtenidos de las celulas huesped. En virtud de esta reduccion en la viabilidad e infectividad del nematodo, se facilita la resistencia y/o la tolerancia potenciada a la infeccion por un nematodo. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto proteico tiene una velocidad de renovacion rapida, de modo que la inhibicion del ARNbc dara como resultado una disminucion rapida en los niveles de protema. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequena cafda en el nivel de expresion da como resultado efectos perjudiciales para el nematodo.

En algunas realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de un hongo. Ejemplos no limitantes de hongos incluyen: Macrophomina phaseolini, Puccinia sorghi, Ustilago maydis, Exserohilum pedicellatum, Fusarium verticillioides, Fusarium verticillioides y Sphacelotheca reiliana. En algunas realizaciones, el gen dirigido a la supresion, puede codificar una protema esencial, cuya funcion predicha se selecciona de entre el grupo que consiste en division celular, metabolismo energetico, formacion de la pared celular, formacion de esporas, formacion de hifas y smtesis de enzimas digestivas. Cuando la secuencia diana se obtiene de un gen esencial para la viabilidad o infectividad del hongo, su regulacion por disminucion da como resultado una capacidad reducida del hongo para sobrevivir e infectar a su huesped. Por lo tanto, dicha regulacion por disminucion produce un "efecto perjudicial" sobre la viabilidad de mantenimiento y la infectividad del hongo, ya que evita o reduce la capacidad del hongo para alimentarse y sobrevivir de los nutrientes obtenidos de las celulas huesped. En virtud de esta reduccion en la viabilidad y la infectividad del hongo, se facilita la resistencia y/o la tolerancia potenciada a la infeccion por un hongo. En algunas realizaciones, la secuencia diana se selecciona de un gen cuyo producto proteico tiene una velocidad de renovacion rapida, de modo que la inhibicion del ARNbc dara como resultado una disminucion rapida en los niveles de protema. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequena cafda en el nivel de expresion da como resultado efectos perjudiciales para el hongo.

En determinadas realizaciones, puede ser deseable que un ARNbc inhiba la expresion de un gen dirigido en mas de una especie. En algunas realizaciones, puede ser deseable inhibir la expresion de un gen dirigido en dos o mas especies de insectos, por ejemplo, especies de gusanos de la rafz del mafz. En dichas realizaciones, una secuencia diana puede seleccionarse de un gen o una porcion de un gen que esta altamente conservado en todas las especies seleccionadas. Por ejemplo, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen o una porcion de un gen que tenga al menos aproximadamente el 80 % de identidad, al menos aproximadamente el 85 % de identidad, al menos aproximadamente el 90 % de identidad, al menos aproximadamente el 95 % de identidad, al menos aproximadamente el 96 % de identidad, al menos aproximadamente el 97 % de identidad, al menos aproximadamente el 98 % de identidad, o al menos aproximadamente el 99 % de identidad, en todas las especies seleccionadas.

En determinadas realizaciones, puede ser deseable que un ARNbc muestre actividad espedfica de la especie. En algunas realizaciones, una secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo o una porcion de un gen nativo de la especie dirigida que tiene un bajo grado de identidad de secuencia con genes correspondientes en otras especies. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen o una porcion de un gen en el que el grado de identidad de secuencia con genes correspondientes en otras especies es inferior a aproximadamente el 80 %. En otras realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen o una porcion de un gen en el que el grado de identidad de secuencia con genes correspondientes en otras especies es inferior a aproximadamente el

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70 %. En otras realizaciones, la secuencia diana puede seleccionarse de un gen o una porcion de un gen en el que el grado de identidad de secuencia con genes correspondientes en otras especies es inferior a aproximadamente el 60 %. En determinadas realizaciones, una secuencia diana se selecciona de un gen o una porcion de un gen que se conserva pobremente entre especies de insectos individuales, o entre insectos y otros organismos. En algunas realizaciones, una secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de la especie dirigida que no tiene homologos conocidos en otros organismos. En algunas realizaciones, una secuencia diana puede seleccionarse de un gen nativo de la especie dirigida que no tiene homologos conocidos en una planta o un animal vertebrado.

Vectores y expresion

Varias realizaciones descritas en el presente documento se refieren a una construccion de expresion obtenida por ingeniena para la transcripcion in vivo e in vitro de ARN que comprende un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, el ARN puede ser ARNbc. En otras realizaciones, el ARN puede codificar una protema o ser un ARN regulador. Las construcciones de expresion obtenidas por ingeniena descritas en el presente documento pueden, ventajosamente, formar parte de un vector replicable. En las realizaciones descritas en el presente documento, la eficiencia de la produccion de ARN a partir de la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena se mejora evitando o minimizando la transcripcion no deseada de ARN de la estructura del vector. Se contemplan varias formas de evitar o minimizar la transcripcion no deseada de la estructura del vector y pueden usarse independientemente o en combinacion. En algunas realizaciones, dos o mas secuencias de terminacion transcripcional estan unidas de forma operacional al promotor corriente abajo del extremo 3' del elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, una secuencia de acido nucleico que forma una estructura secundaria que comprende dos o mas horquillas adyacentes de tamano mediano esta unida de forma operacional al promotor corriente abajo del extremo 3' del elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, uno o mas sitios de restriccion, que preferentemente no se encuentran en el genoma del huesped, se proporcionan 3' al elemento de codificacion de ARN. La escision en la restriccion evita la transcripcion no deseada corriente abajo del sitio de corte. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleotidos sintetica que codifica un transcrito de ARN que puede formar una o mas estructuras de bucle troncal a traves del apareamiento de bases complementarias esta unida de forma operacional al promotor corriente abajo del extremo 3' del elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleotidos que codifica uno o mas sitios de union para una protema de union a ADNbc se proporciona 3' al elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende una senal de terminacion dependiente de Rho. En algunas realizaciones, el tamano de la estructura del vector se reduce para minimizar la transcripcion no deseada.

En las realizaciones descritas en el presente documento, la construccion de expresion obtenida por ingeniena comprende un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc, que comprende: una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es sustancialmente identica a una secuencia diana; una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos orientada en sentido; y una secuencia de nucleotidos flanqueada por las secuencias sentido y antisentido complementarias, que codifica uno o mas nucleotidos que estan excluidos de la formacion duplex de las regiones complementarias en el transcrito de ARN. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc, que comprende en una direccion de 5' a 3': una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es sustancialmente identica a una secuencia diana; una secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc; y una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos orientada en sentido. En otras realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc, que comprende en una direccion de 5' a 3': una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana; una secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc; y una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos orientada en antisentido. La orientacion de la secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc puede ser en sentido o antisentido. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc es sustancialmente identica a una porcion de una secuencia sentido o antisentido de un gen dirigido a la supresion por la molecula de ARNbc. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc es sustancialmente identica a una porcion de una secuencia sentido o antisentido de un gen diferente al gen dirigido a la supresion por la molecula de ARNbc. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc es una secuencia de nucleotidos obtenida por ingeniena. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos que codifica una region de bucle de una molecula de ARNbc codifica un aptamero.

En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc que comprende, en una direccion de 5' a 3', una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es sustancialmente identica a una secuencia de nucleotidos de al menos un porcion de un gen diana y una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es mas corta que la secuencia de nucleotidos orientada en sentido y es sustancialmente complementaria al extremo 5' de la secuencia de nucleotidos orientada en sentido. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN

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obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc que comprende, en una direccion de 5' a 3', una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es sustancialmente identica a una secuencia de nucleotidos de una porcion de un gen diana y una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido mas larga, que es sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleotidos de al menos una porcion del gen diana, y que comprende en su extremo 3', una secuencia de nucleotidos que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos orientada en sentido. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc que comprende, en una direccion de 5' a 3', una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es sustancialmente complementaria a al menos una porcion de una secuencia de nucleotidos de un gen diana y una secuencia de nucleotidos orientada en sentido, que es mas corta que la secuencia de nucleotidos orientada en antisentido y que es sustancialmente complementaria al extremo 5' de la secuencia de nucleotidos orientada en antisentido. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARNbc que comprende, en una direccion de 5' a 3', una secuencia de nucleotidos orientada en antisentido, que es sustancialmente complementaria a una porcion de una secuencia de nucleotidos de un gen diana y una secuencia de nucleotidos orientada en sentido mas larga, que es sustancialmente identica a al menos una porcion del gen diana, y comprende en su extremo 3', una secuencia de nucleotidos que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleotidos orientada en antisentido.

En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de protemas.

En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende, un promotor unido de forma operacional a un elemento de codificacion de ARN regulador. En algunas realizaciones, el ARN regulador se selecciona de entre el grupo que consiste en un ARN antisentido, un ARN CRISPR, un ARN largo no codificante, un microARN, un ARN de interaccion a piwi, un pequeno ARN interferente y un ARN de accion trans.

El promotor usado en la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede seleccionarse sobre la base de la naturaleza del sistema de expresion en el que se espera que funcione la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena (por ejemplo, una celula huesped procariota o eucariota). El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor de bacteriofagos, por ejemplo, T7, T3, SV40 o SP6, en la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena, ya que proporcionan un alto nivel de transcripcion que depende solo de la union de la ARN polimerasa adecuada. Cuando la celula huesped no expresa la ARN polimerasa adecuada, se puede proporcionar un transgen que codifica una polimerasa T7, T3, SV40 o SP6 unida de forma operacional a un promotor reconocido por la celula huesped en el mismo vector o en un vector diferente al de la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena. El promotor reconocido por la celula huesped puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivamente activo. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor singenico, que es reconocido por las polimerasas expresadas por el genoma del huesped, en la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena. Ejemplos de promotores adecuados para su uso con huespedes bacterianos incluyen, pero sin limitacion, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptofano (trp), promotor de operon lactosa (lac), promotor lacUV5, promotor trc y promotor tac. En algunas realizaciones, el promotor usado en la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede ser un promotor de ARN Pol I, ARN Pol II o ARN Pol III. En determinadas realizaciones, el promotor usado en la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede ser un promotor Pol III. Ejemplos de promotores Pol III incluyen, pero sin limitacion, promotor U6, promotor ARNt, promotor LTR retroviral, promotor VA1 de adenovirus, promotor de ARN 5Sr, promotor de ARN 7SK, promotor de ARN 7SL y promotor de ARN HI. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor reconocido por levadura, por ejemplo el promotor ADR1, el promotor del factor a de tipo silvestre o el promotor hfbrido ADH2/GAPD, en la construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena.

En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede comprender ademas opcionalmente secuencias de nucleotidos adicionales que afectan ventajosamente a la transcripcion del elemento de codificacion de ARN y/o la estabilidad de un trascrito resultante. Por ejemplo, la construccion de expresion de ARN obtenida puede comprender ademas una o mas secuencias potenciadoras o de poliadenilacion.

Dos mecanismos principales, denominados terminacion independiente de Rho y terminacion dependiente de Rho, median la terminacion transcripcional en procariotas, tales como E. coli. Las senales de terminacion independientes de Rho, como las secuencias de terminacion transcripcionales que se analizan a continuacion, no requieren un factor de terminacion de la transcripcion extnnseco, como la formacion de una estructura de bucle troncal en el ARN transcrito de estas secuencias junto con una serie de restos de uridina (U) promueve la liberacion de la cadena de ARN del complejo de transcripcion. La terminacion dependiente de Rho, por otra parte, requiere un factor de terminacion de la transcripcion llamado Rho y elementos de accion cis en el ARNm. El sitio de union inicial para Rho, el sitio de utilizacion (rut) de Rho, es una region monocatenaria prolongada (~70 nucleotidos, a veces 80-100 nucleotidos) caracterizada por un alto contenido de citidina/baja guanosina y una estructura secundaria relativamente pequena en el ARN que se sintetiza, corriente arriba de la secuencia terminadora real. Cuando se encuentra un sitio de pausa de la polimerasa, se produce la terminacion y la transcripcion se libera por la actividad helicasa de Rho.

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En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende una senal de terminacion dependiente de Rho. En algunas realizaciones, la senal de terminacion dependiente de Rho se localiza en una region de formacion de bucle de un transcrito de ARNbc. En otras realizaciones, la senal de terminacion dependiente de Rho esta localizada en una secuencia sentido o antisentido de una region de formacion duplex de un transcrito de ARNbc. Las secuencias de acido nucleico que codifican senales de terminacion dependientes de Rho son conocidas en la tecnica y tambien pueden identificarse en genes terminados dependientes de Rho. En algunas realizaciones, se puede proporcionar una senal de terminacion dependiente de Rho junto con una o mas de una secuencia de terminacion independiente de Rho, una secuencia de nucleotidos sintetica que codifica un transcrito de ARN que forma un bucle troncal, un sitio de union para una protema de union a ADN, y un sitio de endonucleasa de restriccion espedfico del sitio como se describe a continuacion. Una construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena que comprende una senal de terminacion dependiente de Rho puede expresarse en una celula huesped que expresa los factores de transaccion de Rho (una lmea celular Rho+).

En algunas realizaciones, la eficiencia de la transcripcion del ARN a partir de la construccion de expresion obtenida por ingeniena puede mejorarse proporcionando una secuencia de acido nucleico que forma una estructura secundaria que comprende dos o mas horquillas en una posicion 3' hasta el final del elemento de codificacion del ARN. Sin desear quedar ligado a teona alguna, la estructura secundaria desestabiliza el complejo de elongacion de la transcripcion y lleva a que la polimerasa se disocie del molde de ADN, minimizando asf la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional y aumentando la transcripcion del ARN deseado. En consecuencia, puede proporcionarse una secuencia de terminacion que forma una estructura secundaria que comprende dos o mas horquillas adyacentes. En general, una horquilla puede estar formada por una secuencia de nucleotidos palindromica que puede plegarse sobre sf misma para formar una region de tallo pareada cuyos brazos estan conectados por un bucle de una sola cadena. En algunas realizaciones, la secuencia de terminacion comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas horquillas adyacentes. En algunas realizaciones, las horquillas adyacentes estan separadas por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleotidos desapareados. En algunas realizaciones, un tallo de horquilla comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas pares de bases de longitud. En determinadas realizaciones, un tallo de horquilla tiene una longitud de 12 a 30 pares de bases. En determinadas realizaciones, la secuencia de terminacion comprende dos o mas horquillas de tamano mediano que tienen una region de tallo que comprende aproximadamente de 9 a 25 pares de bases. En algunas realizaciones, la horquilla comprende una region de formacion de bucle de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos. En algunas realizaciones, la region de formacion de bucle comprende 4-8 nucleotidos. Sin desear quedar ligado a teona alguna, la estabilidad de la estructura secundaria puede correlacionarse con la eficiencia de terminacion. La estabilidad de la horquilla esta determinada por su longitud, el numero de desapareamientos o protuberancias que contiene y la composicion base de la region apareada. Los apareamientos entre guanina y citosina tienen tres enlaces de hidrogeno y son mas estables en comparacion con los apareamientos de adenina-timina, que tienen solo dos. El contenido de G/C de una secuencia de nucleotidos palindromica formadora de horquilla puede ser de al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o mas. En algunas realizaciones, el contenido de G/C de una secuencia de nucleotidos palindromica formadora de horquilla es al menos del 80 %. En algunas realizaciones, la secuencia de terminacion se obtiene de una o mas secuencias terminadoras transcripcionales de origen procariota, eucariota o fago. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleotidos que codifica una serie de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas adeninas (A) se proporciona 3' a la secuencia de terminacion.

En algunas realizaciones, la eficiencia de la transcripcion de ARN a partir de la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede mejorarse proporcionando dos o mas secuencias de terminacion de la transcripcion en tandem en una posicion 3' hasta el final del elemento de codificacion de ARN. Vease la Figura 1. En algunas realizaciones, la eficiencia de la transcripcion de ARN a partir de la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena puede mejorarse proporcionando tres, cuatro, cinco o mas secuencias de terminacion de la transcripcion en tandem en una posicion 3' hasta el final del elemento de codificacion de ARN. Una secuencia de terminacion transcripcional puede ser cualquier secuencia de nucleotidos, que cuando se coloca transcripcionalmente corriente abajo de una secuencia de nucleotidos que codifica un marco de lectura abierto, provoca el final de la transcripcion del marco de lectura abierto. Dichas secuencias son conocidas en la tecnica y pueden ser de origen procariota, eucariota o fago. Ejemplos de secuencias terminadoras incluyen, pero sin limitacion, terminador PTH, terminador pET-T7, terminador T3-T9, terminador pBR322-P4, terminador del virus vesicular del estoma, terminador rrnB-T1, terminador rrnC, terminador transcripcional TTadc, y secuencias de terminacion reconocidas por levadura, tales como el terminador de la transcripcion Mata (factor a), la secuencia de terminacion de la transcripcion del factor a nativo, la secuencia de terminacion de la transcripcion ADR1, la secuencia de terminacion de la transcripcion ADH2 y la secuencia de terminacion de la transcripcion GAPD. Se puede encontrar una lista no exhaustiva de secuencias terminadoras transcripcionales en el registro iGEM, que esta disponible en:
http://partsregistry.org/Terminators/Catalog. La primera secuencia del terminador transcripcional de una serie de 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas puede colocarse directamente 3' al nucleotido final del elemento de codificacion de ARNbc o a una distancia de al menos 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-1.000 o mas nucleotidos 3' al nucleotido final del elemento de codificacion de ARNbc. El numero de nucleotidos entre las secuencias terminadoras transcripcionales en tandem puede variar, por ejemplo, las secuencias terminadoras transcripcionales pueden estar separadas por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1015, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 o mas nucleotidos. En algunas realizaciones, las secuencias

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terminadoras transcripcionales pueden seleccionarse basandose en su estructura secundaria predicha como se determina mediante un algoritmo de prediccion de estructura. Los programas de prediccion estructural son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, CLC Main Workbench.

Las secuencias de terminacion transcripcionales pueden ser espedficas de la polimerasa o no espedficas, sin embargo, los terminadores transcripcionales seleccionados para su uso en las presentes realizaciones deben formar una "combinacion funcional" con el promotor seleccionado, lo que significa que la secuencia del terminador debe ser capaz de terminar la transcripcion por el tipo de ARN polimerasa que se inicia en el promotor. Por ejemplo, un promotor eucariotico ARN pol II y terminadores eucarioticos ARN pol II, un promotor T7 y terminadores T7, un promotor T3 y terminadores T3, un promotor reconocido por levadura y secuencias de terminacion reconocidas por levadura, etc., generalmente formanan una combinacion funcional. El numero y la identidad de las secuencias de terminacion transcripcionales usadas tambien pueden seleccionarse basandose en la eficiencia con la que la transcripcion se termina a partir de un promotor dado. Por ejemplo, se pueden proporcionar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas secuencias terminadoras transcripcionales homologas o heterologas transcripcionalmente corriente abajo del elemento de codificacion de ARN para conseguir una eficiencia de terminacion de al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % a partir de un promotor dado.

Varias realizaciones se refieren una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende un promotor y dos o mas terminadores transcripcionales en combinacion funcional para una terminacion eficiente de la transcripcion. En algunas realizaciones, un promotor T7, un terminador pTh y un terminador pET-T7 forman una combinacion funcional. En algunas realizaciones, un promotor T7, un terminador rrn BT2, un terminador PET, un terminador PTH y un terminador pET-T7 forman una combinacion funcional. En algunas realizaciones, las secuencias terminadoras se modifican para eliminar la secuencia que no forma horquilla. En algunas realizaciones, las secuencias terminadoras se modifican para eliminar los desapareamientos en la region del tallo de las horquillas. En algunas realizaciones, las secuencias terminadoras se modifican para aumentar el contenido de GC de las horquillas. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion dependientes de Rho y una o mas secuencias de terminacion independientes de Rho. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion dependientes de Rho y un represor TrpR. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion independientes de Rho y un represor TrpR. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion dependientes de Rho y un represor TyrR. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion independientes de Rho y un represor TyrR. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion pendientes de Rho y un represor Lacl. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3, o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una o mas senales de terminacion inpendientes de Rho y un represor Lacl. En algunas realizaciones, un promotor T7, un promotor T5, un promotor T3 o un promotor SP6 forman una combinacion funcional con una secuencia de terminacion sintetica que forma una estructura secundaria que comprende dos o mas horquillas adyacentes de tamano mediano.

Un mecanismo de regulacion de la terminacion de la transcripcion, conocido como terminacion intrmseca, implica la formacion de una estructura de bucle de horquilla en una cadena de ARN durante la transcripcion, que desestabiliza el complejo de elongacion de la transcripcion (que implica interacciones entre el molde, la transcripcion y la ARN polimerasa) y lleva a que la polimerasa se disocia del molde de ADN. En consecuencia, una secuencia de nucleotidos sintetica puede disenarse para codificar un transcrito de ARN que forma una o mas estructuras de bucle de horquilla, que promueven la terminacion de la transcripcion. En varias realizaciones descritas en el presente documento, la eficiencia de la transcripcion de ARN se mejora proporcionando una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN que forma una estructura secundaria que comprende una o mas horquillas transcripcionalmente corriente abajo de un elemento de codificacion de ARN. En general, una horquilla puede estar formada por una secuencia de nucleotidos palindromica que puede plegarse sobre sf misma para formar una region de tallo pareada cuyos brazos estan conectados por un bucle de una sola cadena. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos sintetica codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas horquillas de ARN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos sintetica codifica una secuencia poli-T 3' a una secuencia de nucleotidos palindromica formadora de horquilla. La estabilidad de la horquilla se puede correlacionar con la eficiencia de terminacion, y la estabilidad de la horquilla se determina por su longitud, el numero de desapareamientos o protuberancias que contiene y la composicion base de la region apareada. Los apareamientos entre guanina y citosina tienen tres enlaces de hidrogeno y son mas estables en comparacion con los apareamientos de adenina-uracilo, que tienen solo dos. En algunas realizaciones, un tallo codificado por la secuencia de nucleotidos sintetica tiene una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas pares de bases. En determinadas realizaciones, un tallo codificado por la secuencia de nucleotidos sintetica tiene una longitud de 12 a 30 pares de bases. En determinadas realizaciones, una horquilla es una horquilla de tamano mediano que tiene una

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region de tallo que comprende aproximadamente de 9 a 25 pares de bases. Una region de formacion de bucle puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos. En algunas realizaciones, la region de formacion de bucle comprende 4-8 nucleotidos. En determinadas realizaciones, la region de formacion de bucle comprende 4 nucleotidos. El contenido de G/C de una secuencia de nucleotidos palindromica formadora de horquilla puede ser de al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o mas. En algunas realizaciones, el contenido de G/C de una secuencia de nucleotidos palindromica formadora de horquilla es al menos del 80 %. En algunas realizaciones, se puede proporcionar una secuencia de nucleotidos sintetica que codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas horquillas de ARN transcripcionalmente corriente abajo de un elemento de codificacion de ARNbc junto con una o mas secuencias terminadoras transcripcionales de origen procariota, eucariota o fago. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleotidos que codifica una serie de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas uracilos (U) se proporciona 3' a una secuencia de codificacion de horquilla.

Se cree que la pausa de la polimerasa durante la elongacion es un componente importante de la terminacion tanto dependiente de Rho como independiente de Rho. Las protemas de union al ADN pueden actuar como impedimentos que hacen que el complejo de elongacion de la transcripcion se bloquee, lo que promueve la terminacion transcripcional. En varias realizaciones, se promueve una terminacion transcripcional eficiente proporcionando uno o mas sitios de union para una protema de union a ADN 3' al extremo del elemento de codificacion de ARN. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o mas sitios de union para una protema de union al ADN proximal a una secuencia de terminacion de la transcripcion, de manera que se mejora la eficacia de la terminacion. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o mas sitios de union para una protema de union al ADN proximal a una secuencia de nucleotidos sintetica que codifica nucleotidos que forman un bucle de horquilla. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o mas sitios de union para una protema de union al ADN proximal a una sitio de terminacion dependiente de Rho. Se puede usar cualquier protema de union al ADN que, cuando se acompleja con el ADN, cause la pausa del complejo de elongacion de la transcripcion y la desestabilizacion de la burbuja de transcripcion. Por ejemplo, se pueden usar uno o mas sitios de union para el represor TrpR, el represor LacI o el represor TyrR. Otros ejemplos de protemas de union al ADN que pueden actuar como represores transcripcionales incluyen PRH, Eve, Kruppel, TGIF, Mad, IRF-2, RP58, E2F-6, MeCP2 y MBD2. Cuando la celula huesped no expresa una protema endogena de union al ADN, puede proporcionarse una secuencia de nucleotidos que codifica la protema de union al ADN en un vector que comprende la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena o puede proporcionarse en un vector diferente y puede expresarse bajo el control de un promotor reconocido por la celula huesped o un promotor de fagos, tales como T7, T3 o SP6. En varias realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende uno o mas sitios de restriccion de endonucleasas espedficas del sitio, que no se encuentran en el genoma de la celula huesped, 3' del elemento de codificacion de aRn, de manera que la expresion de la endonucleasa espedfica del sitio en una celula huesped evita la transcripcion no deseada de la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena corriente abajo del sitio de restriccion al escindir la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena sin alterar el genoma de la celula huesped. Vease, por ejemplo, la Figura 8. La endonucleasa espedfica del sitio puede ser una meganucleasa, una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora TAL (TALEN). Ejemplos de meganucleasas incluyen, pero sin limitacion, I-Anil, I-Scel, I-CeuI, Pl-PspI, Pl-Sce, I-ScelV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I- PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII. Una secuencia de nucleotidos que codifica la endonucleasa espedfica del sitio puede proporcionarse en un vector que comprende la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena o puede proporcionarse en un vector diferente. En algunas realizaciones, se puede proporcionar una secuencia de nucleotidos que codifica una endonucleasa espedfica del sitio en un vector que codifica una ARN polimerasa, por ejemplo, T7, T3, SV40 o SP6 polimerasa, y puede, opcionalmente, unirse de forma operacional a un promotor reconocido por una celula huesped. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende uno o mas sitios 3' de escision de endonucleasas espedficas de sitio de una o mas secuencias de terminacion. En algunas realizaciones, la construccion de expresion de ARN obtenida por ingeniena comprende uno o mas sitios de restriccion ZFN, sitios de restriccion TALEN o sitios de restriccion de meganucleasas seleccionados de entre el grupo que consiste en I-Anil, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZel, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII, 3' de una o mas secuencias de terminacion de la transcripcion seleccionadas de entre el grupo que consiste en el terminador PTH, terminador pET- T7, terminador T3-T9, terminador pBR322-P4, terminador del virus vesicular del estoma, terminador rrnB-TI, terminador rrnC, terminador transcripcional TTadc, terminador de la transcripcion Mata (factor a), la secuencia de terminacion de la transcripcion del factor a nativo, la secuencia de terminacion de la transcripcion ADR1, la secuencia de terminacion de la transcripcion ADH2 y la secuencia de terminacion de la transcripcion GAPD.

Las construcciones de expresion de ARN obtenidas por ingeniena como se describen en el presente documento, como los que se exponen en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20, pueden construirse a partir de elementos de secuencia de componentes e incorporarse en un vector adecuado usando tecnicas convencionales de ADN recombinante bien conocidas en la tecnica. Hay muchos vectores disponibles para este fin, y la seleccion del vector adecuado dependera principalmente del tamano del acido nucleico que se va a insertar en el vector y la celula huesped particular que se transformara con el vector. Ejemplos de vectores adecuados para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones incluyen, pero sin limitacion, plasmidos, cosmidos, plastomas, cromosomas bacterianos artificiales, cromosomas de levadura artificial y bacteriofagos. La estructura del vector puede contener diversos componentes dependiendo de la funcion del vector (amplificacion de ADN o expresion de ADN) y la celula huesped

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particular con la que es compatible. Por ejemplo, la estructura del vector puede contener uno o mas sitios de reconocimiento de endonucleasas de restriccion que permiten la insercion de una molecula de acido nucleico en una forma determinable sin perdida de una funcion biologica esencial del vector, secuencias de nucleotidos que codifican un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibioticos, que es adecuado para su uso en la identificacion y seleccion de celulas transducidas con el vector, una secuencia promotora que impulsa la expresion del transgen en la celula huesped y un origen de replicacion. Ejemplos de vectores bacterianos disponibles incluyen, pero sin limitacion, vectores pUC19, pUC18, pBluescript, pDEST, pBAD, pGEM, pGEX, pACYC184 y pBR322.

En algunas realizaciones, el tamano de la estructura del vector se minimiza para reducir la cantidad de molde disponible para la transcripcion no deseada. En algunas realizaciones, un vector mmimo adecuado para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones no comprende uno o mas de marcadores seleccionables basados en protemas, tales como marcadores de resistencia a antibioticos, espaciador no esencial y secuencias de basura que no codifican una funcion definida. En algunas realizaciones, un vector mmimo adecuado para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones consiste esencialmente en un sitio de clonacion multiple, un gen marcador seleccionable y un origen de replicacion. Un vector mmimo adecuado para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones puede ser inferior a 3 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,7 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,6 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,5 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,4 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,3 kb. En algunas realizaciones, el vector es

inferior a 2,2 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 2,1 kb. En algunas realizaciones, el vector es

inferior a 2,0 kb. En algunas realizaciones, el vector es inferior a 1,9 kb. En algunas realizaciones, una o mas

construcciones de expresion de ARN obtenidas por ingeniena y/o uno o mas elementos de codificacion de ARN se

clonan en el vector mmimo para conseguir un tamano mmimo de al menos 3kb.

Las moleculas de ARN codificadas por las construcciones de expresion obtenidas por ingeniena descritas en el presente documento pueden sintetizarse in vitro o in vivo en una celula huesped. La aRn polimerasa endogena de la celula huesped puede mediar la transcripcion in vivo, o la ARN polimerasa clonada, como, la ARN polimerasa del bacteriofago (por ejemplo, T3, T7, SV40, SP6), se puede usar para la transcripcion in vivo o in vitro.

Uno o mas vectores que comprenden una construccion de expresion obtenida por ingeniena como se describe anteriormente pueden introducirse en una amplia diversidad de huespedes de microorganismos procarioticos y eucarioticos para producir las moleculas de ARN. Varias realizaciones descritas en el presente documento se refieren a una celula huesped que expresa ARN a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de una secuencia no funcional. Las celulas huesped adecuadas incluyen, pero sin limitacion, hongos, hongos filamentosos, levaduras, algas y bacterias. Para evitar la degradacion de las moleculas de ARNbc transcritas en la celula huesped, se puede usar un huesped deficiente en ARNasa III.

En algunas realizaciones, la celula huesped es una celula eucariota. Las celulas huesped eucariotas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, celulas de hongos, celulas de algas, celulas de insectos y celulas de plantas. Las celulas huesped de hongos adecuadas incluyen, pero sin limitacion, celulas de levadura y celulas de hongos filamentosos.

En una realizacion, la celula huesped del hongo es una levadura. En una realizacion, la levadura es de uno de los generos: Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces y Yarrowia. En algunas realizaciones, la celula de levadura es Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, o Yarrowia lipolytica.

En otras realizaciones, la celula huesped es una celula procariotica. Las celulas procarioticas adecuadas incluyen celulas bacterianas gram positivas, gram negativas y gram variables. Las celulas huesped procarioticas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, especies de: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmun, Streptomyces, Streptococcus, Synnecoccus, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana no es patogena para los seres humanos.

En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Bacillus, por ejemplo, B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Clostridium, por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, y C. beijerinckii. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Corynebacterium, por ejemplo, C. glutamicum y C. acetoacidophilum. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Escherichia, por ejemplo, E. coli. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana

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es una cepa de E. coli deficiente en ARNasa III, por ejemplo, E. coli HT115 (DE3). En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Erwinia, por ejemplo, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata y E. terreus. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Pantoea, por ejemplo, P. citrea y P. agglomerans. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Pseudomonas, por ejemplo, P. pudita, P. mevalonii y P. sp. D-0110. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Streptococcus, por ejemplo, S. equisimiles, S. pyogenes, y S. uberis. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Streptomyces, por ejemplo, S. ambofaciens, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, y S. lividans. En algunas realizaciones, la celula huesped bacteriana es de la especie Zymomonas, por ejemplo, Z. mobilis y Z. lipolytica.

En algunas realizaciones, microorganismos, como bacterias, algas y hongos, que se sabe que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las rafces de la planta) de una amplia diversidad de cultivos importantes pueden ser celulas huesped deseables para la produccion y entrega de ARNbc. Para evitar la degradacion de las moleculas de ARNbc transcritas en los microorganismos huesped, se puede usar un huesped deficiente en ARNasa III. De particular interes son los microorganismos, como bacterias, por ejemplo, los generos Bacillus (incluidas las especies y subespecies B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis y B. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ejemplo, generos Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. De particular interes son las especies bacterianas de la fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de la fitosfera como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans.

Varias realizaciones se refieren a un sistema de expresion celular para producir ARNbc con una eficiencia transcripcional mejorada a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para producir ARNbc cultivando celulas huesped que comprenden una construccion de expresion obtenida por ingeniena como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la celula huesped expresa ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la celula huesped expresa ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la celula huesped expresa ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende la SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones, la celula huesped expresa ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende la SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones, la celula huesped expresa ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, la celula huesped es una celula bacteriana, por ejemplo, una celula de E. coli, que es deficiente en RNAsa III.

Los procedimientos de empleo de tecnologfas de ADN recombinante para preparar una construccion de ADN recombinante y un vector que codifica una molecula de ARN de interes, y para transformar y generar celulas huesped que transcriben la molecula de ARN estan facilmente disponibles en la tecnica.

C. Aplicacion de ARNbc

Varias realizaciones se refieren a composiciones y procedimientos para entregar ARNbc transcrito a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de una secuencia no funcional como se describe anteriormente para un organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc se sintetiza in vitro a partir de la construccion de expresion obtenida por ingeniena y se proporciona al organismo diana. En otras realizaciones, el ARNbc proporcionado al organismo diana se transcribe en una celula huesped (in vivo) a partir de la construccion de expresion obtenida por ingeniena.

Determinadas realizaciones se refieren a un procedimiento para entregar ARNbc a un organismo diana que comprende expresar el ARNbc de una construccion de expresion obtenida por ingeniena como se describio anteriormente en una celula huesped y proporcionar el ARNbc transcrito de la celula huesped al organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc transcrito de la celula huesped se afsla de la celula huesped y se purifica antes de proporcionarse al organismo diana. Por ejemplo, el ARNbc puede purificarse a partir de un lisado de celulas huesped mediante extraccion con un disolvente o resina, precipitacion, electroforesis, cromatograffa o una combinacion de los mismos. Como alternativa, el ARNbc puede usarse con una purificacion minima o sin purificacion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una celula huesped que comprende ARNbc transcrito a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena o un lisado preparado a partir de la celula huesped que expresa ARNbc se proporciona al organismo diana. En algunas realizaciones, el ARNbc suprime un gen esencial del organismo diana. En otras realizaciones, el ARNbc suprime un gen esencial de una plaga o patogeno del organismo

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diana. Por ejemplo, el ARNbc puede suprimir un gen viral.

Como se ha descrito anteriormente, una celula huesped, como una bacteria o levadura, puede obtenerse por ingeniena para producir ARNbc a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena como se describe en el presente documento. Estas celulas huesped pueden ser ingeridas por una plaga de insectos u otro organismo dirigido. Cuando se toma, el ARNbc puede iniciar una respuesta de ARNi, lo que lleva a la degradacion del ARNm diana y el que el ARNm diana codifica una protema esencial, debilitando o matando al organismo que se alimenta. Como se muestra en el Ejemplo 3, las moleculas de ARNbc transcritas in vitro de alimentacion que comprenden secuencias de ARN del escarabajo de patata de Colorado (CPB), moleculas de ARNbc transcritas con bacterias que comprenden secuencias de ARN de cBp, o bacterias que expresan ARNbc que comprenden secuencias de ARN de CPB transcritas de una construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena a larvas de CPB, todas dan como resultado la muerte o inhibicion del desarrollo y diferenciacion de las larvas que ingieren las composiciones de ARNbc. Todas las preparaciones de ARNbc de CPB mostraron una actividad significativa contra las larvas de CPB, con la concentracion mas baja (0,00002 mg/ml) de la preparacion de bacterias que expresan ARNbc de CPB que inhibe el 87,5 % de los crecimientos de CPB. La actividad de las bacterias que expresan ARNbc en la inhibicion del crecimiento y desarrollo del organismo diana indica que las celulas huesped obtenidas por ingeniena para expresar de manera eficiente el ARNbc tal como se describe en el presente documento pueden proporcionarse directamente a un organismo diana, por ejemplo, mediante la alimentacion, para suprimir la actividad de un gen diana sin la necesidad de etapas de purificacion de ARN adicionales.

La celula huesped, que en muchas aplicaciones es una celula bacteriana, de levadura o de algas, debe matarse preferentemente antes de ser suministrada a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. Por ejemplo, cuando se usa una bacteria que expresa ARNbc como un plaguicida biologico u otra aplicacion en la que se usa una celula huesped que expresa ARNbc obtenido por ingeniena en un entorno en el que es probable el contacto con seres humanos u otros mairnferos. Las celulas huesped que expresan ARNbc pueden destruirse por cualquier medio que no de como resultado una degradacion significativa del ARNbc. Por ejemplo, las celulas huesped pueden destruirse por tratamiento termico, por tratamiento qmmico, por ejemplo, tratamiento con fenol o formaldehndo, o por ruptura mecanica. En algunas realizaciones, las celulas huesped se destruyen sin lisis significativa. En algunas realizaciones, las celulas huesped, por ejemplo, las celulas bacterianas, se calientan a una temperatura suficiente para destruir las celulas sin causar lisis. Por ejemplo, las celulas huesped pueden calentarse a una temperatura de al menos 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C, 70 °C, 71 °C, 72 °C, 73 °C, 74 °C, o al menos 75 °C.

En algunas realizaciones, la celula huesped que expresa ARNbc obtenido por ingeniena se lisa y el lisado celular se proporciona a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. Las celulas huesped que expresan ARNbc pueden ser lisadas por cualquier medio que no de como resultado una degradacion significativa del ARNbc. Por ejemplo, las celulas huesped pueden lisarse por congelacion y descongelacion, por tratamiento con un producto qmmico, por ejemplo un detergente, tolueno o hidroxido de sodio, por tratamiento enzimatico o por ruptura mecanica, por ejemplo, por homogeneizacion. En algunas realizaciones, el lisado bruto se proporciona a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana. En otras realizaciones, se proporciona un lisado parcialmente purificado o un ARNbc expresado en celulas huesped aislado a un organismo diana o a una fuente de alimento de un organismo diana.

Otra realizacion se refiere a procedimientos y composiciones para evitar o inhibir una enfermedad viral en un organismo diana, por ejemplo, un mamffero, un ave, un artropodo o un pez. Ejemplos espedficos de organismos diana incluyen, pero sin limitacion, cerdos, vacas, bisontes, caballos, cabras, pollos, codornices, patos, gansos, pavos, camarones, langostinos, langosta, cangrejo, abejas, salmon, tilapia, lubina, carpa y el bagre. En una realizacion, un ARNbc que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN de un gen viral se administra a un organismo diana, de modo que la expresion del gen viral dirigido se silencia. En una realizacion, una composicion de ARNbc antiviral se incorpora en una fuente de alimento o se aplica a la superficie de una fuente de alimento, por ejemplo, una planta de cultivo, para el consumo por un organismo diana. En un aspecto, la composicion antiviral de ARNbc comprende moleculas de ARNbc transcritas a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional como se describe anteriormente. En otro aspecto, la composicion anti-viral de ARNbc comprende celulas huesped que expresan ARNbc destruidas como se describe anteriormente o un lisado de las mismas. En algunas realizaciones, una celula bacteriana destruida por calor no lisada que comprende una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional como se describe anteriormente se alimenta a un organismo diana seleccionado de entre el grupo que consiste en mamfferos, aves, artropodos o peces. En una realizacion, el organismo diana es un camaron o langostino y la construccion de expresion obtenida por ingeniena codifica un ARNbc que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria de al menos una parte de una transcripto de ARN de un gen del virus del smdrome de la mancha blanca, el baculovirus de Monodon, el virus de la necrosis de la glandula del intestino medio baculoviral, el virus de la necrosis hematopoyetica, el virus de la cabeza amarilla, el virus del smdrome de Taura, el virus de la mionecrosis infecciosa, el nodavirus Macrobrachium rosenbergii, el virus Laem-Singh o el virus Mourilyan. En una realizacion, el organismo diana es un pez y la construccion de expresion obtenida por ingeniena codifica un ARNbc que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN de un gen del virus de la necrosis hematopoyetica epizootica, el iridovirus de la dorada roja, el virus del

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herpes de Koi, el virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa, el virus de la septicemia hemorragica viral, la viremia de primavera del virus de la carpa, el virus de la anemia infecciosa del salmon, o el virus de la necrosis nerviosa viral.

Varias realizaciones se refieren a composiciones y procedimientos para controlar infestaciones de plagas de invertebrados. En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de entrega para el suministro de composiciones plaguicidas de ARNbc a plagas de invertebrados a traves de su exposicion a una dieta que contiene las composiciones plaguicidas de ARNbc. En una realizacion, las composiciones plaguicidas de ARNbc se incorporan a una fuente de alimento de la plaga o se aplican a la superficie de una fuente de alimento de la plaga, por ejemplo, una planta de cultivo, para el consumo de una plaga de invertebrados. En un aspecto, las composiciones plaguicidas de ARNbc comprenden moleculas de ARNbc purificadas transcritas a partir de una construccion de expresion obtenida por ingeniena o para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional como se describe anteriormente. En otro aspecto, las composiciones plaguicidas de ARNbc comprenden las celulas huesped destruidas y no lisadas que expresan ARNbc como se describio anteriormente. En otro aspecto, las composiciones plaguicidas de ARNbc comprenden el lisado no purificado o mmimamente purificado de celulas huesped que expresan ARNbc como se describio anteriormente. Las composiciones, ademas del ARNbc, las celulas huesped o el lisado, pueden contener excipientes, diluyentes o vehmulos adicionales.

Otra realizacion se refiere a procedimientos y composiciones para inhibir la propagacion de una enfermedad viral en una poblacion de plantas, por ejemplo, plantas de cultivo. Los virus de plantas generalmente se transmiten a una planta por un vector artropodo o nematodo. Por lo tanto, la infeccion de una planta por un virus puede inhibirse suprimiendo la expresion genica viral en el vector artropodo o nematodo. Por lo tanto, se proporcionan composiciones y procedimientos para inhibir la expresion genica viral en un vector artropodo o nematodo. Una realizacion se refiere a un procedimiento que comprende administrar un ARNbc, en el que el ARNbc comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN de un gen del virus de la planta, a un vector artropodo o nematodo, de modo que la expresion del gen viral dirigido se silencia. El transcrito de ARN dirigido puede ser de un virus del mosaico Abutilon, un virus del mosaico de la yuca africana, un virus del mosaico de la alfalfa, un virus del mosaico Arabis, un virus del mosaico suave de la cebada, un virus de la enana amarilla de la cebada, un virus del mosaico amarillo de la cebada, un virus de la parte superior de la remolacha, un virus de los amarillos del oeste de la remolacha, un virus del mosaico dorado de la jud^a, un virus del rizado de la hoja de la remolacha, un virus de la vena amarilla necrotica de la remolacha, un virus transmitido por el suelo de la remolacha, un virus del amarillo oeste de la remolacha, un virus del mosaico Brome, un begomovirus del mosaico de la yuca, un virus del mosaico de la coliflor, un virus del mosaico del pepino, un virus de la necrosis del pepino, un virus de los amarillos transmitido por el afido de Cucurbit, un virus del brote hinchado del cacao, un virus del raquitismo de la vid, un virus asociados con el enrollamiento de la vid, un virus A de la vid, un virus B de la vid, un virus de la mancha anular del cacahuete, un virus de la mancha amarilla del iris, un virus del mosaico de la hierba Johnson, un virus infeccioso de la lechuga amarillo, un virus del mosaico de la lechuga, un virus del pardeamiento temprano del guisante, un virus de la mancha anular de la pimienta, un virus del enrollamiento de la patata, un virus de la fregona de la patata, un virus enano de arroz, un virus de la acrobacia irregular del arroz, un virus del mosaico del trigo transmitido por el suelo, un virus del mosaico de la jud^a del sur, un virus de la mancha anular latente de la fresa, un virus del moteado plumoso de la batata, un virus del mosaico del tabaco, un virus cascabel del tabaco, un virus de la mancha anular del tabaco, un virus del anillo negro del tomate, un virus de la mancha clorotica del tomate, un virus del mosaico dorado del tomate, un virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, un virus del marchitamiento manchado del tomate, un virus del mosaico de tabaco de terciopelo o un virus del mosaico de la raya del trigo. En una realizacion, una composicion de ARNbc antiviral se incorpora en una fuente de alimento o se aplica a la superficie de una fuente de alimento, por ejemplo, una planta de cultivo, para el consumo por un vector viral. En un aspecto, la composicion anti-viral de ARNbc comprende moleculas de ARNbc purificadas transcritas de una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional como se describe anteriormente. En otro aspecto, la composicion anti-viral de ARNbc comprende celulas huesped destruidas y no lisadas que expresan ARNbc como se describio anteriormente. En otro aspecto, la composicion antiviral de ARNbc comprende el lisado no purificado o mmimamente purificado de celulas huesped que expresan ARNbc como se describio anteriormente. El vector artropodo puede ser un vector insecto, por ejemplo, pulgones, escarabajos, chicharras, chicharritas, cochinillas, amidos, acaros, trips y moscas blancas. Las composiciones, ademas del ARNbc, las celulas huesped o el lisado, pueden contener excipientes, diluyentes o vehmulos adicionales. Las composiciones que comprenden un microorganismo destruido por calor que expresa ARNbc o un lisado del mismo deben ser lo suficientemente estables de modo que el ARNbc permanezca sin degradar y sea capaz de mediar el ARNi incluso cuando se expone a condiciones ambientales externas durante un penodo de tiempo, que puede ser un penodo de dfas o semanas.

En las realizaciones descritas en el presente documento, el ARNbc puede expresarse por microorganismos que comprenden una construccion de expresion obtenida por ingeniena para minimizar la transcripcion improductiva de la secuencia no funcional como se describio anteriormente y los microorganismos o un lisado de los mismos pueden aplicarse sobre una superficie de una planta o semilla o introducirse en una semilla, rafz, tallo u hoja por un medio ffsico, como una inyeccion, o en el caso de una semilla por imbibicion. Por ejemplo, la entrega de microorganismos que comprenden una construccion de expresion obtenida por ingeniena como se describe en el presente documento a las superficies de una planta puede ser a traves de una aplicacion de pulverizacion. En una realizacion, una

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bacteria o levadura obtenida por ingeniena para producir y acumular ARNbc puede cultivarse y los productos del cultivo, como una bacteria o levadura destruida por calor o un lisado de las mismas, puede formularse como una composicion compatible con las practicas agncolas comunes. La naturaleza de cualquier excipiente y la forma ffsica de la composicion pueden variar dependiendo de la naturaleza del sustrato tratado. Por ejemplo, la composicion puede ser un lfquido que se cepilla o pulveriza o se imprime en el sustrato a tratar, o un revestimiento o polvo que se aplica al sustrato a tratar. Por lo tanto, en una realizacion, la composicion esta en forma de un revestimiento sobre una superficie adecuada que se adhiere, y con el tiempo es ingerida por un organismo diana, como un insecto o nematodo, que entra en contacto con el revestimiento.

Las formulaciones de pulverizacion para plantas de cultivo pueden incluir adherentes y humectantes adecuados para una cobertura foliar eficiente, asf como protectores contra la radiacion UV para proteger a los ARNbc de los danos causados por la radiacion UV. Por ejemplo, podna ser deseable tener una formulacion de un microorganismo destruido por calor que ayudana a dispersar el microorganismo en una pelmula sobre la superficie de la hoja, o mover el microorganismo eliminado por calor a los espacios intercelulares de la hoja, y/o que proporcionana cierta capacidad para que el microorganismo se adhiera a la hoja en condiciones ambientales humedas (resistencia a la lluvia). Dichos aditivos son de uso comun en la industria de los bioinsecticidas y son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Analogamente, las formulaciones para la aplicacion al suelo pueden incluir formulaciones granulares que sirven como cebo para las larvas de plagas de insectos del suelo, como el gusano de la rafz del mafz. Dichas aplicaciones podnan combinarse con otras aplicaciones de insecticidas, de base biologica o no, para potenciar la proteccion de las plantas frente al dano por alimentacion de insectos. Por ejemplo, cuando las protemas de Bacillus thuringiensis (Bt) se proporcionan en la dieta de las plagas de insectos, un modo de accion para controlar la plaga de insectos. Por lo tanto, varias realizaciones se refieren a combinaciones sinergicas de las composiciones de ARNbc y procedimientos descritos en el presente documento con procedimientos y composiciones de Bt, que incluyen formulaciones topicas y enfoques transgenicos para controlar la infestacion de insectos.

Ejemplos de plantas a las que se pueden aplicar los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, alfalfa, aneth, manzana, albaricoque, alcachofa, rucula, esparragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, remolacha, mora, arandano azul, brecol, coles de Bruselas, repollo, colza, melon cantaluope, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cftricos, clementina, cafe, mafz, algodon, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, porongo, uva, pomelo, miel, jmama, kiwi, lechuga, puerro, limon, lima, pino Loblolly, mango, melon, seta, nueces, avena, okra, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, guisante, melocoton, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, pina, platano, ciruela, granada, alamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiata, achicoria, rabano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, zapallo, fresa, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, batata, estoraque, mandarina, te, tabaco, tomate, cesped, vid, sandfa, trigo, name y calabacm.

Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento pueden aplicarse a cualquier planta monocotiledonea o dicotiledonea, o pueden aplicarse a traves de formulaciones farmaceuticamente aceptables para animales vertebrados o invertebrados con el fin de proporcionar algun nivel de reduccion de la expresion del gen diana. La inhibicion de la expresion del gen diana se puede cuantificar midiendo el ARN diana endogeno o la protema producida por la traduccion del ARN diana y las consecuencias de la inhibicion se pueden confirmar mediante el examen del fenotipo exterior de la celula u organismo diana. Las tecnicas para cuantificar ARN y protemas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, la expresion del gen diana se inhibe en al menos un 10 %, en al menos un 33 %, en al menos un 50 % o en al menos un 80 %. En algunas realizaciones, la expresion del gen diana se inhibe en al menos un 90 %, en al menos un 95 %, o en al menos un 99 % dentro de las celulas del organismo dirigido, por lo que se produce una inhibicion significativa. Puede decirse que se produce una inhibicion significativa cuando la administracion de un ARNbc a un organismo diana da como resultado un fenotipo detectable (por ejemplo, el cese del crecimiento larvario, la paralisis o la mortalidad, etc.) o una disminucion detectable en el ARN y/o protema endogena correspondiente al gen diana. Mientras que en algunas realizaciones, la inhibicion se produce en sustancialmente todas las celulas del organismo diana, en algunas realizaciones, la inhibicion puede producirse solo en un subconjunto de celulas que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen dirigido desempena una funcion esencial en las celulas del tracto alimentario de un insecto, la inhibicion del gen dirigido dentro de estas celulas es suficiente para ejercer un efecto perjudicial deseado sobre el insecto.

Ejemplo 1

Diseno del vector de produccion de ARNbc

Se selecciono una secuencia diana, los nucleotidos 30-309 de la SEQ ID NO 1, del ortologo supuesto del escarabajo de la patata de Colorado (CPB) del coatomero de COPI.

SEQ ID NO 1:

> Ld_F38E11.5 ortologo supuesto de coatomero de COPI; Alias Ld248; 14810:1.379

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CGTAAC CGCGGTTTGTTTC CAC CCTGAACTACCTGTGGCTCT CACAGG CAGCGAAGATGG TACCGTTAGAGTTTGG CATA C GAATACACACAGATTAGAGAATTGTTTGAATTATG GGTT CGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGTATGA CGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATG GATG CCAG TGGCGGTAAAATAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGC TAATTTGAAGG CGCT GC CAGAAGG TGGAGAAATAAGAGATGGGGAG CGTTTACCTGTCTCTGTAAAAGATATGGG

AGCATG TGAAATATACCC T

Se diseno un elemento de codificacion de ARNbc que contiene una secuencia sentido (nucleotidos 4-283 de la SEQ ID NO 2), que corresponde a la secuencia diana del coatomero CPB COPI, una secuencia de codificacion de 150 nucleotidos en bucle (nucleotidos 284-433 de la SEQ ID NO 2) y una secuencia antisentido (nucleotidos 434-713 de la SEQ ID NO 2) que es el complemento inverso de la secuencia diana del coatomero CPB COPI.

SEQ ID NO 2

GGGTACCTGTGGCTCTCACAGGCAGCGAAGATGGTACCGTTAGAGTTTGGCATACGAATACACACAGATTAGAGA

ATTGTTTGAATTATGGGTTCGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGT

ATGACGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATGGATGCCAGTGGCGGTAAAA

TAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGCTAATTTGAAGGCGCTGCCAGAAGGaagtactgcgatcgcgt

taacgctttatcacgataccttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccact

cgatcactactctcacacgaccgattaactcctcatccacgcggccgcctgcaggagcCCTTCTGGCAGCGCCTT

CAAATTAGCTTGTTGTAATTCCGAGTGCCTTGCCCAAATTATTTTACCGCCACTGGCATCCATACTAACTGCCGG

TTCTTCTCTTCCAACTTTCACTAATATACTGCCCTCGTCATACCCCAGAGAAACATTATTCGAACCCTTCAAGCA

ACAAATGGTCCACACTCTCTCGAACCCATAATTCAAACAATTCTCTAATCTGTGTGTATTCGTATGCCAAACTCT

AACGGTACCATCTTCGCTGCCTGTGAGAGCCACAGGTA

Se construyeron dos vectores de plasmidos para producir ARNbc de CPB usando el vector de clonacion pUC19, que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, un fragmento N-terminal del gen lac Z de E. coli, un sitio de clonacion multiple y un origen de replicacion. El vector CPB-hp se construyo de tal manera que un promotor T7 esta unido de forma operacional a la region de codificacion de ARNbc de la SEQ ID NO 2. Vease la Figura 2A, que muestra un mapa esquematico del vector pCPB-hp. Para evitar o minimizar la translectura de regiones no codificantes de ARNbc por la ARN polimerasa T7 y la produccion de ARNmc inutil a partir de la estructura del plasmido, se construyo el vector pCPB-hp + 2T colocando dos secuencias de terinadores T7 (terminador PTH y terminador pET- T7) en el extremo 3' de la region de codificacion ARNbc. Vease las Figuras 2B y 2C, que muestra mapas esquematicos del vector pCPB-hp + 2T.

La cepa de E. coli HT115 (DE3) se compro en el Centro de Genetica Caenorhabditis, Universidad de Minnesota (el genotipo de HT115 (DE3) es: F-, mcrA, mcrB, IN (rrnD-rrnE) 1, lisogeno rnc14::Tn10 (DE3): promotor de lavUV5 -T7 polimerasa (RNAasa III menos)). Las celulas de E. coli HT115 (DE3) se transformaron con pUC19 (control), pCPB- hp o pCPB-hp + 2T y se cultivaron durante una noche a 37 °C o 25 °C. El ARN total se aislo a partir de 20 ul de cultivo y se ejecuto directamente en un gel de agarosa (Figura 3A, calles marcadas 1 (pUC19), 2 (pCPB-hp) y 3 (pCPB-hp + 2T)) o se trato con ARNasa antes de ejecutarse en un gel de agarosa (Figura 3B, calles marcadas 1 (pUC19), 2 (pCPB-hp), y 3 (pCPB-hp + 2T)).

Las celulas de E. coli HT115 (DE3) tambien se transformaron con dos plasmidos, uno que lleva un molde de ARNbc (pUC19 (control), pCPB-hp o pCPB-hp + 2T) y el otro que lleva la ARN polimerasa T7 bajo el control de un elemento inducible (polimerasa T7 inducible por IPTG). Las celulas transformadas se cultivaron durante una noche a 37 °C o 25 °C. El ARN total se aislo a partir de 20 ul de cultivo y se ejecuto directamente en un gel de agarosa (Figura 3A, calles marcadas 4 (pUC19 & pLac-T7), 5 (pCPB-hp & pLac-T7), y 6 (pCPB-hp + 2T & pLac-T7) o se trato con ARNasa antes de ejecutarse en un gel de agarosa (Figura 3B, calles marcadas con 4 (pUC19 & pLac-T7), 5 (pCPB- hp & pLac-T7), y 6 (pCPB-hp + 2T & pLac-T7)).

Como se muestra en la Figura 3A y Figura 3B, las celulas transformadas cultivadas a 37 °C produjeron mas ARN que las celulas cultivadas a 25 °C, el rendimiento de ARNbc mejoro mediante la expresion de la polimerasa T7 en las celulas huesped, y la inclusion de dos secuencias terminadoras 3' en el molde de ARNbc dio como resultado aumentos adicionales en el rendimiento de ARNbc. Se observo un rendimiento de 30-50 mg/l de ARNbc a partir de celulas de E. coli que expresan ARN polimerasa de T7 y la construccion de ARNbc de pCPB-hp + 2T. (Datos no mostrados).

Ejemplo 2

Produccion in vivo de ARNbc del escarabajo de la patata de Colorado (CPB)

1. Transformacion

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Los plasmidos pCPB-hp + 2T y pLac-T7 se transformaron en la cepa HT115 (DE3) de E. coli como se describe en el Ejemplo 1. Despues de la transformacion, las celulas de E. coli se colocaron en placas y se seleccionaron colonias individuals.

2. Condicion de cultivo

Las colonias individuales se cultivaron 6-8 horas a 37 °C en 3 ml de medio LB que contema 100 pg/ml de ampicilina y 12,5 pg/ml de tetraciclina para producir un cultivo de semilla. Para inducir la expresion de ARNbc, se inocularon 200 ul del cultivo de semilla en un matraz de 250 ml con medio de induccion automatico de 50 ml (AIM) (Studier, Protein Expression y Purification 41 (2005) 207-234) que contema 100 ug/ml de ampicilina y 12,5 ug/ml de tetraciclina y luego se incubo. Las celulas se recogieron por centrifugacion a 6000 g durante 10 minutos a 4 °C.

3. Purificacion de ARN

El ARN bacteriano se purifico usando un procedimiento adaptado del protocolo SNAP de Stead (Stead y col., Nucleic Acids Res. 2012 Nov 1; 40(20):e156) con modificacion del tampon de extraccion de ARN como se describe a continuacion. Un mililitro de cultivo bacteriano (~108 celulas) se centrifugo a 16.000 g durante 30 s y se elimino el sobrenadante. El sedimento celular se almaceno en hielo seco hasta que estuvo listo para la extraccion. Los sedimentos celulares se resuspendieron luego en 100 pl de solucion de extraccion de ARN modificada [EDTA 18 mM, 0,025 % de SDS, TCEP 5 mM, 95 % de formamida (grado de ARN)] mediante agitacion vigorosa con formacion de vortice. El 1 % de 2-mercaptoetanol utilizado en la solucion de extraccion de ARN del protocolo SNAP de Stead se reemplazo con TCEP 5 mM porque el TCEP tiene una toxicidad mucho menor en comparacion con el 2- mercaptoetanol y una eficacia igual con el 2-mercaptoetanol (datos no mostrados).

Despues de la resuspension en una solucion de extraccion de ARN modificada, las celulas se lisaron incubando la muestra a 95 °C en un bano de agua durante 7 minutos. Los residuos celulares se sedimentaron centrifugando la muestra caliente a 16.000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se transfirio cuidadosamente a un tubo nuevo sin alterar el sedimento.

El ARN total aislado de las celulas pCPB-hp+2T de E. Coli no inducidas (Figura 4, calle 1) e inducidas (Figura 4, calle 2) se diluyo con H2O y se ejecutaron en un gel de agarosa. Como se muestra en la Figura 4, se observo una banda correspondiente al ARNbc de CPB en las celulas pCPB-hp+2T de E. Coli inducidas pero no en las celulas pCPB-hp + 2T de E. Coli no inducidas.

Ejemplo 3

Comparacion de ARN transcrito in vivo e in vitro

El plasmido pCPB-hp + 2T se linealizo y se uso como molde para la transcripcion in vitro de ARN. El ARN transcrito in vitro (Figura 5A, calles 9 y 10) se ejecuto en un gel de agarosa junto con ARN transcrito con bacterias purificado de acuerdo con el protocolo SNAP modificado descrito en el Ejemplo 1 y se diluyo directamente en H2O (Figura 5A, calles 5 y 6) o se filtro con una membrana de corte molecular 30K (Amicon) para eliminar reactivos como EDTA, SDS, TCEP y formamida, antes de diluir con H2O (Figura 5A, calles 5 y 6) para determinar el tamano de los transcritos de ARN. Se observo que el ARN transcrito in vivo es mas grande que el ARN transcrito con bacterias (vease la Figura 5A).

El ARN transcrito in vitro e in vivo (con bacterias) se incubo con la ARNasa A, que digiere el ARN monocatenario pero no bicatenario. Como se muestra en la Figura 5B, despues de la digestion con ARNasa A, el tamano de los productos de transcripcion de ARN in vivo (calles 5-8) e in vitro (calles 9 y 10) son identicos. Esto indico que el aumento de tamano del ARN transcrito in vitro se debfa a la presencia del bucle de horquilla de una sola cadena; que se elimina en la celula bacteriana por procesamiento de aRn.

Ejemplo 4

Destruccion por calor de E. coli

Se determino experimentalmente el intervalo de temperatura para celulas de E. coli HT115 (DE3) que se destruyen por calor sin lisis celular. Las celulas de E. coli HT115 (DE3) se incubaron a diferentes temperaturas de 37 °C a 72 °C durante 30 minutos. Las celulas tratadas con calor se examinaron luego al microscopio para determinar si se habfa producido la lisis y se extendieron en placas de LB y se incubaron durante una noche para determinar la capacidad de supervivencia despues del tratamiento termico. Como se muestra en la Tabla 1, el calentamiento a temperaturas de 59 °C y mas destruyo a todas las celulas, sin embargo, no se observo lisis celular para ninguna de las temperaturas probadas, hasta 72 °C (vease la Figura 6).

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TABLA 1: Lisis celular y capacidad de supervivencia despues del tratamiento termico

37 °C 51 °C 54 °C 59 °C 62 °C 67 °C 69 °C

Lisis celular de baja DO (microscopio)

- - - - - - -

Supervivencia celular de baja DO (placa LB)

+ + - - - - -

Lisis celular de alta DO (microscopio)

- - - - - - -

Supervivencia celular de alta DO (placa LB)

+ + < 10 % - - - -

Todas las celulas fueron tratadas durante 30 minutos a diferentes temperaturas. La DO baja es DO600" 0,2 y la DO alta es DO6qq"2.

Ejemplo 5

Optimizacion del rendimiento de ARNbc bacteriano-medio del crecimiento

Tres medios ricos, medios de induccion automatica (AIM) (Studier, Protein Expression y Purification 41 (2005) 207234), Super Broth (Atlas, RM Handbook of microbiological media. 1997. CRC Press, Nueva York, EE.UU.) + el medio y el plasmido + el medio AIM, se probaron para determinar si el rendimiento de la produccion de ARN bacteriano podna mejorarse mediante la eleccion de los medios.

El medio de induccion automatica (AIM) contiene: 1 % de NZ-amina AS, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucosa, 0,2% de alfa-lactosa, (NH4)2SO4 25mM, KH2PO4 5mM, Na2HPO4 20 mM, MgSO4 1mM.

Super Broth + el medio AIM contiene: 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa-lactosa, (NH4)2SO4 50mM, KH2PO4 10mM, Na2HPO4 40 mM, MgSO4 2mM.

El plasmido + el medio AIM contiene: plasmido + el medio (Thomson Instrument Co.), (NH4)2SO4 25mM, KH2PO4 5mM, Na2HPO4 20 mM, MgSO4 1mM y 0,5 % de glicerol, 0,05% de glucosa, 0,2 % de alfa-lactosa para la induccion automatica.

Se prepararon cultivos de semillas de celulas DV49 de E. coli HT115 (DE3) de acuerdo con las condiciones de cultivo descritas en el Ejemplo 2. Los 3 medios de produccion diferentes se inocularon con cantidades identicas de cultivo de semilla y se incubaron de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 2. Despues de 16 horas de cultivo en matraz, las celulas se recogieron para la prueba de rendimiento.

Las celulas DV49 cultivadas en AIM produjeron 40 mg/l de ARN. Las celulas DV49 cultivadas en Super Broth + el medio produjeron 207 mg/l de ARN. Las celulas DV49 cultivadas en el plasmido + el medio AIM produjeron 96 mg/l de ARN. Sobre la base del rendimiento del ARN de DV49 bacteriano de 3 medios, Super broth + dio el mayor rendimiento del producto diana. Vease la Figura 7A.

El efecto de Super broth + el medio sobre la produccion de ARNbc de CPB se probo como se describio anteriormente. Las celulas pCPB-hp + 2T de E. coli HT115 (DE3) cultivadas en Super Broth + el medio produjeron 66 mg/l de ARN. Vease la Figura 7B. El rendimiento en Super broth + el medio es una mejora sobre otros medios probados.

Ejemplo 6

Bioeficacia del ARNbc en el escarabajo de la patata de Colorado

Como se describio anteriormente, se produjeron tres muestras de ARNbc, pCPB-hp + 2T de E. coli HT115 (DE3) destruidas por calor no lisadas, ARNbc de CBP transcrito con bacterias purificado y ARNbc de CPB transcrito in vitro, para probar la bioeficacia de las preparaciones de ARNbc frente al escarabajo de la patata de Colorado (CPB), Leptinotarsa decemlineata.

Los bioensayos con las larvas de CPB se realizaron usando una dieta artificial de 13,2 g/l de agar (Serva 11393), 140,3 g/l de premezcla de Bio-Serve (F9380B), 5 ml/l de KOH (18,3 % p/p) y 1,25 ml/l de formalina (37 %). La dieta se dispenso en alfcuotas de 200 ul en placas de 96 pocillos y se seco brevemente antes de la aplicacion de la muestra. Veinte (20) ul de alfcuotas de la muestra de prueba (pCPB-hp + 2T de E. coliHT115 (DE3) destruidas por calor y no lisadas), ARNbc de CPB transcrito con bacterias purificado, o ARNbc de CBP transcrito in vitro se aplicaron por pocillo, con agua esteril que sirve como control sin tratar (UTC). Las placas se dejaron secar antes de

anadir las larvas. Se anadio una larva de CPB neonato por pocillo con un pincel fino. Las placas se sellaron luego con mylar y se ventilaron usando un alfiler de insecto. Se probaron treinta y dos larvas (32) por tratamiento.

Las placas de bioensayo se incubaron a 27 °C, 60 % de humedad relativa (HR), en completa oscuridad durante 1012 dfas. Las placas se punturaron luego para determinar la mortalidad (Tabla 2) y el retraso en el crecimiento 5 larvario (Tabla 3). Los datos se analizaron usando el software estadfstico JMP©4 (SAS Institute, 1995) y se realizo un ANOVA factorial completo con una prueba de Dunnet para buscar los efectos del tratamiento en comparacion con el control no tratado (P <0,05). Se realizo una prueba post hoc de Tukey-Kramer para comparar todos los pares de los tratamientos (P <0,05).

Como se muestra en las Tablas 2 y 3, todas las preparaciones de ARNbc de CPB mostraron una actividad 10 significativa contra el escarabajo de la patata de Colorado. Por ejemplo, el 87,5 % de los crecimientos de escarabajos se inhibieron a la concentracion mas baja de E. coli no lisada destruida por calor probada (0,00002 mg/ml).

TABLA 2: Bioensayo de mortalidad de ARNbc de CPB

Tratamiento Sting

Conc. de ARNbc (mg/ml) Media Desv. estandar EEM P> |t| (Neg) Agrupacion de t Contaminacion

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,00002 87,50 10,21 5,10 *** A 0

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,0001 100,00 0,00 0,00 *** A 0

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,0005 100,00 0,00 0,00 *** A 0

ARNbc bacteriano

0,00002 62,50 10,21 5,10 *** B 0

ARNbc bacteriano

0,0001 93,75 12,50 6,25 *** A 0

ARNbc bacteriano

0,0005 100,00 0,00 0,00 *** A 0

ARNbc transcrito in vitro

0,00002 43,75 21,65 10,83 *** C 0

ARNbc transcrito in vitro

0,0001 93,30 7,77 3,88 *** A 0

ARNbc transcrito in vitro

0,0005 96,88 6,25 3,13 *** A 0

dH20

0 6,25 7,22 3,61 D 0

Tratam. por calor de E.coli no inducida {60 C; 30 min}

0 9,38 18,75 9,38 D 0

TABLA 3: Bioensayo del retraso en el crecimiento del ARNbc de CPB

Tratamiento Sting

Cono (mg/ml) Media Desv. estandar EEM P>|t| (Neg) Agrupacion de t Contaminacion

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,00002 2,33 1,15 0,67 *** AB 0

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,0001 0

Tratam. por calor de E.coli {60 C; 30 min}

0,0005 0

ARNbc bacteriano

0,00002 0,25 0,50 0,25 D 0

ARNbc bacteriano

0,0001 1,00 CD 0

ARNbc bacteriano

0,0005 0

5

10

15

20

25

(continuacion)

Tratamiento Sting

Cono (mg/ml) Media Desv. estandar EEM P>|t| (Neg) Agrupacion de t Contaminacion

ARNbc transcrito in vitro

0,00002 1,75 0,50 0,25 *** BC 0

ARNbc transcrito in vitro

0,0001 3,00 0,00 0,00 *** A 0

ARNbc transcrito in vitro

0,0005 2,00 *** ABC 0

dH20

0 0,00 0,00 0,00 D 0

Tratam. por calor de E.coli no inducida {60 C; 30 min}

0 0,00 0,00 0,00 D 0

Ejemplo 7

Bioeficacia del ARNbc de DV49

Se construyo un plasmido pUC estructurado con un promotor T7 que impulsa la expresion de DV49 antisentido + el bucle+ el terminador PTH de DV49 de sentido + el terminador pET-T7. Vease la Figura 8. La secuencia de nucleotidos de la construccion de expresion de DV49 se proporciona en la SEQ ID NO. 4.

SEQ ID NO 4:

TAAT ACGACTCACT AT AGGGATCCATGAT ATCGT GAACAT CATCTACATTCAAAT TCTT AT GAGCTTTCTTAAGGGCATCTGCAGCATTTTTCATAGAATCTAAT ACAGC A GTATTT GTGCTAGCT CCTT CGAGGGCTTCCCTCTGCATTT CAAT AGTTGTAAGGGT TCCATCTATTTGTAGTTGGGTCTTTTCCAATCGTTTCTTCTTTTTGAGGGCTTGGAG TGCAACT CTTTT ATTTTTCGACGCATTTTTCTTTGCaagtactgcgatcgcgttaacgctttatcacgat accttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccactcgatcactactctcacacgaccgattaactcct catccacgcggccgcctgcaggagcGCAAAGAAAAATGCGTCGAAAAATAAAAGAGTTGCAC TCCAAGCCCTCAAAAAGAAGAAACGATTGGAAAAGACCCAACT AC AAAT AGATG GAACCCTT AC AACT ATT GAAAT GC AGAGGGAAGCCCTCGAAGG AGCT AGCACAA ATACTGCTGTATTAGATTCTATGAAAAATGCTGCAGATGCCCTTAAGAAAGCTCA TAAGAATTT GAAT GT AGATGATGTT CACGAT ATCATGGATAagcttgccatctgttttcttgcaag atcagctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgga

Los nucleotidos 1-17 codifican el promotor T7; los nucleotidos 21-260 codifican una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleotidos diana de un gen del gusano de la rafz del mafz (Diabrotica virgifera); los nucleotidos 261-410 codifican una region de formacion de bucle; los nucleotidos 411-650 codifican una secuencia sentido que es sustancialmente identica a una secuencia de nucleotidos diana de un gen de un gusano de la rafz del mafz (Diabrotica virgifera); los nucleotidos 659-668 codifican el teminador PTH; Los nucleotidos 681-764 codifican el terminador pET-T7.

Las celulas de E. coli HT115 (DE3) se transforman con dos plasmidos, uno que lleva la construccion de expresion del ARNbc de DV49 y el otro que lleva la ARN polimerasa T7 bajo el control de un elemento inducible (polimerasa T7 inducible por IPTG). Las celulas se cultivan a una densidad celular deseada y se determina el rendimiento del ARNbc. Las celulas que expresan el ARNbc de DV49 se calientan a una temperatura de al menos 59 °C durante 30 minutos para destruir las celulas. Las celulas que expresan el ARNbc de DV49 se titulan para proporcionar composiciones que tienen concentraciones crecientes de ARNbc, por ejemplo, 0,00002, 0,001 y 0,005 mg/ml, y las composiciones que contienen las celulas de expresion de ARNbc de DV49 destruidas por calor o celulas de control de E. coli HT115 (DE3) destruidas por calor se proporcionan en la dieta de larvas del gusano de la rafz de mafz. Se evalua la mortalidad y la morbilidad de las larvas y se determina la masa de las larvas supervivientes. La muerte, el retraso en el crecimiento u otra inhibicion de las larvas del gusano de la rafz del mafz despues de la ingestion de celulas de expresion de ARNbc DV49 destruidas por calor en comparacion con las celulas de control indican que la ingesta de celulas de expresion de ARNbc de DV49 destruidas por calor es efectiva para controlar las infestaciones de gusanos de la rafz del mafz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 8

Bioeficacia de las bacterias lisadas frente a las no lisadas

Se prepara un cultivo de pCPB-hp + 2T de E. coli HT115 (DE3) y las celulas se destruyen por calor como se describe en el Ejemplo 4. Una almuota de las celulas pCPB-hp + 2T de E. coli HT115 (DE3) destruidas por calor se lisan luego por medios qmmicos, enzimaticos, de congelacion y descongelacion o mecanicos para producir un lisado celular. Luego se purifica parcialmente una almuota del lisado celular mediante centrifugacion para eliminar los residuos celulares. Tres muestras, las celulas pCPB-hp + 2T de E. coli HT115 (DE3) destruidas por calor no lisadas, el lisado celular no purificado y el lisado celular parcialmente purificado se prueban luego para determinar la bioeficacia frente al escarabajo de la patata de Colorado (CPB), Leptinotarsa decemlineata como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Las almuotas de las tres muestras se someten adicionalmente a diferentes preparaciones, como liofilizacion o congelacion, y temperaturas, como la temperatura ambiente, 4 °C y 0 °C, para aumentar el tiempo y la bioeficacia de las muestras sometidas a las diversas preparaciones, y las condiciones de almacenamiento se determinan realizando bioensayos como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Se comparan la bioeficacia de las diferentes preparaciones de muestra y se selecciona una preparacion que muestra un alto grado de bioeficacia y estabilidad.

Ejemplo 9

Optimizacion del rendimiento de ARNbc- numero y combinacion de terminadores

Se construye un vector plasirndico para la produccion eficiente de ARNbc insertando en una posicion 3' de una secuencia de codificacion de ARNbc, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de terminacion transcripcional que se seleccionan cada una, independientemente, de entre un grupo que consiste en: terminador PTH, terminador pET-T7, terminador T3-T9, terminador pBR322-P4, terminador del virus vesicular del estoma, terminador rrnB-TI, terminador rrnC, terminador TTadc transcripcional tal que las secuencias terminadoras transcripcionales formen una combinacion funcional con el promotor.

Las celulas huesped se transforman con los vectores obtenidos por ingeniena y se induce la transcripcion de la secuencia de codificacion de ARNbc del promotor. Se determina la eficiencia de terminacion de cada numero y combinacion de las secuencias de terminacion transcripcionales. Se selecciona un numero mmimo y una combinacion de secuencias de terminacion que muestran la mayor eficiencia de terminacion, ya que una alta eficiencia de terminacion minimiza la translectura no productiva de la secuencia del vector y mejora el rendimiento del ARNbc en comparacion con la baja eficiencia de terminacion.

Ejemplo 10

Optimizacion del rendimiento de ARNbc-tamano del plasmido

Se construye un vector plasirndico para la produccion eficiente de ARNbc insertando una construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena, que comprende un promotor, un elemento de codificacion de ARNbc y dos o mas secuencias de terminacion, en un vector de plasmido mmimo que no contiene un marcador seleccionable basado en protemas y/o secuencias espaciadoras no esenciales. Cuando el tamano esperado del vector que contiene la construccion de expresion de ARNbc obtenida por ingeniena disminuye a un tamano mmimo para la replicacion eficaz del plasmido, se insertan en el vector una o mas construcciones de expresion de ARNbc obtenidas por ingeniena adicionales o elementos de codificacion de ARNbc en el vector para conseguir un tamano mmimo para la replicacion eficaz del vector de expresion resultante. Las celulas huesped se transforman con el vector de expresion ARNbc. Si es necesario, un vector que codifica una ARN polimerasa que impulsa la transcripcion del ARNbc desde el vector de expresion ARNbc se cotransforma. La estructura minima del vector proporciona un molde reducido para la translectura no productiva de la secuencia no codificante de ARNbc, mejorando el rendimiento del ARNbc en comparacion con un plasmido con un mayor porcentaje de estructura del vector.

Ejemplo 11

Optimizacion del rendimiento de ARNbc-molde linealizado

Se construye un vector plasirndico para la produccion eficiente de ARNbc insertando un sitio de restriccion para una endonucleasa que no corta el genoma de la celula huesped (por ejemplo, I-Sce1, que no tiene ningun sitio en el genoma de E. coli, un sitio de restriccion ZFN, o un sitio de restriccion TALEN) en una posicion que es 3' a una secuencia de codificacion de ARNbc que esta unida de forma operacional a un promotor. Vease, por ejemplo, la Figura 9. Las celulas huesped se cotransforman con el vector de produccion de endonucleasa + ARNbc y un vector que codifica una endonucleasa que reconoce el sitio de restriccion. En algunos casos, la expresion de la endonucleasa es inducible y la endonucleasa puede codificarse en un vector que codifica ademas una ARN polimerasa que impulsa la produccion de ARNbc. La expresion de la endonucleasa linealiza el vector de produccion de ARNbc, eliminando asf la translectura no productiva de la secuencia del vector y mejorando el rendimiento de ARNbc en comparacion con un plasmido no linealizado.

Ejemplo 12

Qptimizacion del rendimiento de ARN-comparacion de combinaciones de terminador

Se realizo una comparacion del rendimiento de produccion de ARN con diferentes terminadores clonados en el mismo plasmido de expresion.

5 1. Diseno del vector de produccion de ARN

Se construyeron nueve vectores plasmfdicos con diferentes terminadores o combinaciones de terminadores usando el vector de clonacion pUC19, que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, un fragmento N-terminal del gen lac Z de E. coli, un sitio de clonacion multiple y un origen de replicacion. Las secuencias del terminador como se muestra en la Tabla 4 a continuacion se clonaron en el vector pUCl9 corriente abajo del promotor T7 para producir 9 10 vectores diferentes que tienen diferentes terminadores o combinaciones de terminadores. Se inserto una secuencia de ADN (SEQ ID NO 2) que codifica la CPB-hp en el vector corriente abajo del promotor T7 y corriente arriba de la secuencia del terminador.

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un terminador transcripcional que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende un primer terminador de la transcripcion, un segundo terminador de la transcripcion, un tercer terminador de la transcripcion y un cuarto terminador de la transcripcion que forman una estructura secundaria que comprende cuatro horquillas de tamano mediano, y en el que el primer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 9, el segundo terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5, el tercer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 6 o 7, y el cuarto terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5.
2. 2. El terminador transcripcional de la reivindicacion 1, en el que las horquillas:

   (a) estan separadas por una region espaciadora que comprende 10 o menos nucleotidos; o

   (b) cada una comprende una region troncal con menos de 3 nucleotidos sin emparejamiento.
3. 3. El terminador transcripcional de la reivindicacion 1, en el que la secuencia de acido nucleico se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18 y 21.
4. 4. Una construccion de expresion obtenida por ingeniena que comprende:

   a. un promotor;

   b. una primera secuencia de acido nucleico posicionada transcripcionalmente corriente abajo del promotor, en la que la primera secuencia de acido nucleico codifica un ARNbc o una protema; y

   c. una segunda secuencia de acido nucleico, posicionada 3' a la primera secuencia de acido nucleico, en la que la segunda secuencia de acido nucleico comprende un primer terminador de la transcripcion, un segundo terminador de la transcripcion, un tercer terminador de la transcripcion y un cuarto terminador de la transcripcion que forman una estructura secundaria que comprende cuatro horquillas de tamano mediano, en la que el primer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 9, el segundo terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5, el tercer terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 6 o 7, y el cuarto terminador de la transcripcion comprende la SEQ ID NO: 5; y

   en la que la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico estan unidas de forma operacional al promotor, y en la que el promotor y las secuencias terminadoras de la transcripcion estan en combinacion funcional.
5. 5. La construccion de expresion obtenida por ingeniena de la reivindicacion 4, en la que la segunda secuencia de acido nucleico se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18 y 21.
6. 6. La construccion de expresion obtenida por ingeniena de la reivindicacion 4 o 5, en la que el promotor en un promotor bacteriofago, o en la que el promotor se selecciona de entre un grupo que consiste en SV40, SP6, T5, promotor de p-lactamasa, promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptofano (trp), promotor de operon lactosa (lac), promotor lacUV5, promotor trc y promotor tac.
7. 7. La construccion de expresion obtenida por ingeniena de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que la primera secuencia de acido nucleico se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 14, 15 y 20.
8. 8. Un procedimiento para mejorar la produccion de ARN o protemas que comprende proporcionar la construccion de expresion obtenida por ingeniena de cualquiera de las reivindicaciones 4-7 a una celula huesped bacteriana, fungica o vegetal.
9. 9. El procedimiento para mejorar la produccion de ARN o protemas de la reivindicacion 8, en el que la celula huesped es una celula de E. coli HT115 (DE3) o una celula BL21(DE3).
10. 10. Un vector que comprende la construccion de expresion obtenida por ingeniena de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que el vector es un vector plasirndico.
11. 11. Una celula huesped bacteriana que comprende el vector de la reivindicacion 10.
12. 12. La celula huesped bacteriana de la reivindicacion 11, en la que la celula huesped bacteriana no expresa la ARNasa A o en la que la celula huesped bacteriana es una celula de E. coli.
13. 13. Un sistema de cultivo celular para la smtesis in vivo de ARNbc que comprende la celula huesped bacteriana de la reivindicacion 11 o 12 y un medio de crecimiento, en el que el medio de crecimiento comprende preferentemente 3,2 % de triptona, 2 % de extracto de levadura, 0,5 % > de NaCl, 1 % de glicerol, 0,1 % de glucosa, 0,4 % de alfa- lactosa, (NH4)2SO4 50mM, KH2PO410 mM, Na2HPO4 40 mM, MgSO4 2 mM.
14. 14. Una composicion para controlar una infestacion de plagas de invertebrados o para inhibir la propagacion de una enfermedad viral en una poblacion de plantas que comprende:

    (a) la celula huesped bacteriana de la reivindicacion 11, en la que la celula huesped bacteriana esta muerta y no esta lisada; o

    (b) un lisado de la celula huesped bacteriana de la reivindicacion 11.
15. 15. Un procedimiento para controlar una infestacion de plagas de invertebrados o para inhibir la propagacion de una 5 enfermedad viral en una poblacion de plantas que comprende aplicar la composicion de la reivindicacion 14 a una planta.

    imagen1

    SENTIDO

    PROMOTOR

    imagen2

    TERMINADOR TERMINADOR

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    imagen6

    imagen7

    BUCLE DE HORQUILLA

    BUGLE DE HORQUILLA

    iAGA^MTTGTTi'aMifAiv-KiTCGA^AGAGTGibGACCALiTGiiGCiiGMGbGi'iCGMTMTGiiTCiCTGGGGTrtiGAC

    16593 AS

    GAGGGCAGTATATTAGTGMA^TGGAAGaGMGMCCGGCAGTTAGTATGGATGCCAGTGGCGGTAAMTSATTTGGGCAAGGCA

    BUCLE DE HORQUILLA

    T0533AS

    CTCGGftMTACMCAAGCTMTTTGAA&GCGCTGCCAGAAGGAagtactgcgatcgcgttaacgctttatcacgataccttctac

    BUCLE DE HORQUILLA

    3EG ID NO 3

    T 6593 AS

    TMTACGAGTCACTATAGGGTACCTGTGGCTCTCACAGGC.AGCGMG.ATGSTACCGTTAGAG-TTGGCATACGMTACACACAGA

    T6593 AS

    G GCA

    CC

    AA

    GCC

    GC

    CT

    MCI

    CA

    AA

    O

    GC

    CA

    ACC

    CAG

    GAAA

    AT

    T65933

    nr

    ;J^CCCTtCAAGCAACAAATGGTCCACACTCTCTCGAACCCATMtTCAMCMTTCTCTAATCTGTGtGTATTCGTATGCCAM

    Hind111

    T6593S

    TERMINADOR PTH

    740

    CTCTAACGG'i;ACCATClTCGCTGCCTGTGAGAGCCACAGGxA%cttgccatctgttt:cttgcaagatcagctgagcaataact

    B80

    sET-77 700

    800 820 840 ,

    aa cataaccccttggggcct ctaaacaggtc t ta aggag t ttt tt orct caaaagagaaacta ta t ccccraaaaaacat^ toacr caa

    .............FIG.2C.................

    acatatcactaacaacstcaacactcatcactctccracgacatccactccra btctcacaccraccqattaactcctcatcc

    T6593 S

    T6593S

    imagen8

    imagen9

    O/N a 37C

    O/Na 25C

    FIG.

    +ARNasa A:

    FIG. 36

    imagen10

    FIG. 4

    imagen11

    -ARNasa A

    imagen12

    +ARNasa A

    imagen13

    imagen14

    imagen15

    BANDA

    DIANA

    ARNbc DV 49 BACTERIANO

    imagen16

    BANDA

    DIANA

    ARNbc CPB BACTERIANO
16. 4. MARCADOR 4. MARCADOR

    5: AIM(MEDIO DE INDUCCION AUTOMATICO){RENDIMIENTO 40mg/l) 6: SUPER BROTH + EL MEDIO (RENDIMIENTO 207mg/l)

    6: SUPER BROTH + EL MEDIO (RENDIMIENTO 207mg/l)

    7: PLASMIDO + EL MEDIO (RENDIMIENTO 96mg/l)

    imagen17

    imagen18

    imagen19

    PRUEBA DE TRANSCRIPCI6N IN VIVO CON T7 RNAP

    SITIO I-Seel

    cn

    co

    imagen20

    VENTAJAS:

    - TERMINACION COMPLETA DE LA TRANSCRIPCION

    - EXTREMOS 5' y 3' DEL PRODUCTO ARN DEFINIDOS

    - TRANSCRIPCI6N A PARTIR DE UN MOLDE LINEAL FRENTE AL PLASMIDO SUPERENROLLADO

    TZRNAPHScel {IN VIVO)

    F/G.

    imagen21

    1. pUC CON TERMINADOR PET
17. 2. pUC CON TERMINADOR PTH1
18. 3. pUC CON TERMINADOR PTH2
19. 4. pUC CON TERMINADOR BT1
20. 5. pUC CON TERMINADOR BT2
21. 6. pUC CON TERMINADOR CJ
22. 7. pUC CON TERMINADOR B1002
23. 8. pUC CON TERMINADOR B1006
24. 9. pUC CON TERMINADOR PTH v PET

    imagen22

    cn

    cn

    imagen23

    ESTRUCTURA SECUNDARIA: AG = 18,5KCAL/MOL

    imagen24

    imagen25

    RENDIMIENTO DE ARNbc (mg/l)

    LONGITUD DE SECUENCIA FRENTE A CONCENTRACldN DE ARN

    imagen26

    LONGITUD DE SECUENCIA

    fig a

    imagen27

    imagen28

    imagen29

    rrn B i 2+PET + PiH+PET

    3 HORQUILLAS ADYACENTES

    DETAMANO MED ANO

    imagen30

    CD

    CO

    imagen31

    imagen32

    imagen33

    imagen34

    imagen35

    imagen36

    imagen37

    imagen38