CN113943764B - 一种制备双链rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法，主要解决现有双链RNA制备方法步骤繁琐、效率低、成本高昂且难以实现大量制备的问题。针对要制备的双链RNA，先设计一个含有长度为5‑15bp泡状结构的、无启动子的环状双链DNA模板；然后在体系中同时加入上述无启动子环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、RNA酶抑制剂、NTPs和无机焦磷酸酶进行转录，转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处单链DNA的辅助下实现对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的双链RNA单体。本发明实现了双链RNA的一步、高效、大量制备。

Description

一种制备双链RNA的方法
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法。
背景技术
双链RNA（dsRNA）结构在自然界中普遍存在，其常作为长链RNA，如核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）以及类病毒（一种仅由RNA组成的病毒）等的一小部分。长度为几百~几千个碱基对的长双链RNA，如pre-miRNA（其由mRNA的一部分和与其互补的RNA链组成）和双链RNA病毒等也被发现广泛存在。其中最有前景的应用之一是以小干扰RNA（smallinterfering RNAs，siRNAs）为工具来发挥作用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术，其是用于转录后基因调控的有力工具（Nature Genet,2002,32,107-108；EMBO J,2001,20,6877-6888；Proc Natl Acad Sci USA,2002,99,9942-9947.）。近年来RNAi技术被尝试应用于农业（病虫害防治）（Insect Sci,2013,20,4-14；Pest Manag Sci,2016,72,801-809）和水产养殖业（虾病防治）（J Biotechnol,2020,321,48-56；J Virol Methods,2013,188,64-69；IOP Conf Ser Earth Environ Sci,2020,584,012051.）中。但目前dsRNA的大量、高效合成尚未实现，这在很大程度上制约了RNAi农（渔）药、RNAi疫苗的推广使用。因此，亟需建立一种可满足dsRNA高效、低成本、简易制备的方法，以满足科研需求和市场需求。
dsRNA在体内/外均可制备（Anal Bioanal Chem,2018,410,3239-3252）。体内制备（重组过表达）时需要先将用于转录的模板重组到质粒载体当中，然后将其导入大肠杆菌（E.coli）（J. Biotechnol,2020,321,48-56；J Virol Methods,2013,188,64-69；IOP Conf.Ser.Earth Environ Sci,2020,584,012051.）、植物细胞（UK Patent,No.WO2020183416-A1,Sep17,2020）或哺乳动物细胞（Methods Mol Biol,2013,942,291-314.）中进行诱导培养。整个过程需经历表达载体构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化（需去除宿主自身的rRNA等杂质）等诸多步骤，较为繁琐；并且胞内机质复杂，产物易被核酸酶降解的同时生物安全性也难以保证。目前这些体内制备技术尚处于研究阶段，未被用于实际生产。
体外制备方法可分为化学合成和酶法合成（转录）两大类。化学合成法（固相合成）存在合成步骤繁琐（EMBO J,2001,20,6877-6888；Nat Struct Biol,1998,5,203-212；Isr J Chem,2013,53,326-349）、产物纯度较差（Anal Biochem,2001,298,196-206；Chin J Biotech,2018,34,664）、难以实现大量合成、生物安全性较差（使用多种有机试剂）（Chin J Biotech,2018,34,664）等诸多缺陷。相较化学合成而言，酶法因在液相环境中进行而更易于实现大规模生产，且由于在整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更好（Isr J Chem,2013,53,326-349；Chimia,2005,59,812-816）。近些年的研究还表明酶法可满足带修饰RNA的合成，发展前景良好（Org Biomol Chem,2018,16,5800-5807；Molecules,2020,25,5492）。按照模板为线性还是环状，现有dsRNA酶法合成方法可分为线性转录和滚环转录。线性转录可分为两种情况，一种是用两种线性双链DNA模板分别转录出sense链和antisense链，然后退火杂交获得dsRNA（Nucleic Acids Res,2002,30,e46；Nucleic Acids Res,2003,31,e38）；另一种是直接用含有回文序列的线性双链DNA模板制备得到同时含有sense序列和antisense序列的发卡型结构的RNA，再由体内的Dicer酶加工处理得到目标siRNA（Mol Biotechnol,2017,59,73-83）。上述两种方法中所用到的线性双链DNA模板中均包含启动子序列，且为了能高效起始转录，有些模板中启动子下游的最初两个碱基须为GG，要想得到精确的产物，后续需酶切去除多余转录出的CC（Nucleic Acids Res,2003,31,e38）。由此可见上述线性转录法均较繁琐，且效率低下，难以满足实际应用需求。相较线性转录而言，滚环转录的效率要高出许多。现有滚环转录法也可分为两类。一类是直接用一个环状单链DNA（哑铃环（Oligonucleotides,2006,16,353-363）或“Y”型单环（Nano Lett,2018,18,4279-4284））同时转录出sense序列和antisense序列。这种方法虽较简便，但需对模板进行加长设计，这样就会额外转录出无用序列，需后续纯化。还有一类是用两种环状单链DNA分别转录出sense序列和antisense序列，再退火杂交得到目的dsRNA（Sci Rep,2017,7,10005；Adv Sci (Weinh),2017,4,1600523）。采用这种方法时，由于环状单链DNA的转录效率易受模板序列和自身二级结构的影响（J Am Chem Soc,1995,117,7818-7819；Proc Natl Acad Sci USA,2002,99,54-59；Nucl Acids Res,2013,41,2552-2564；Nucl Acids Res,2014,42,10596-10604；Science Advance Today,2015,25226.），可能会发生不对称转录（一个环状单链DNA转录效率高，一个转录效率低），使得产物为dsRNA和ssRNA（单链RNA）的混合物。由此可见现有方法均难以实现dsRNA的大量、高效合成。
发明内容
针对现有双链RNA制备方法步骤繁琐、效率低、成本高昂且难以实现大量制备的问题，本发明提供了一种制备双链RNA的方法，针对要制备的双链RNA，先设计一个含有5-15bp泡状结构（Bubble）的、无启动子的环状双链DNA模板；然后在体系中同时加入上述环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，RNase H则在该模板中泡状结构处未杂交的DNA部分的辅助下及时实现对转录产物的酶切。在RNA聚合酶、核糖核酸酶H和含泡状结构无启动子环状双链DNA模板三者之间的默契配合下实现了目的双链RNA产物的一步、高效、大量制备。该方法非常简便高效，低成本，可操作性较强，适用于工业化大规模生产。
本发明采用的技术方案如下：
一种制备双链RNA的方法，包括以下步骤：
步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板含有不互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；
步骤二，将制备的环状双链DNA模板纯化，去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；
步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为 T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的高效双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处单链DNA的辅助下及时实现对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的目的双链RNA单体。
泡状结构的上、下链的序列相同或不同均可。泡状结构处的上、下链中均应避免形成发卡结构或polyA、polyT等序列。
泡状结构尺寸应在5-15碱基之间，否则会导致双链RNA的产量降低。
不考虑环状双链DNA模板制备的难易程度，所述本发明可制备的双链RNA产物单体的长度为70bp以上；优选70-1000bp，再优选为90-437bp，更优选为96-278bp。
进一步的，当所述环状双链DNA模板长度小于90bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于90bp时，采用一锅法或分步法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘应大于15 nt。设计成环前体线性链时，需避免将断点设计在泡状结构处，否则在制备环状双链DNA模板的退火杂交过程中无法形成Nick（连接酶发挥连接作用所必需的结构）。
进一步的，所述制备环状双链DNA模板的方法，当所述环状双链DNA模板长度为70-90bp时，采用一步法环化制备所述环状单链DNA；当所述环状双链DNA模板长度大于90bp时，设计多段40-90nt的5¢磷酸化的DNA片段和相应的splint，采用一锅法，进行一步或分步连接反应制备环状单链DNA或线性单链DNA。
进一步的，所述退火杂交条件为：先在90℃下保温1-3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min。
进一步的，当使用T4DNA连接酶和相应的T4DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃范围内保温2-24h进行连接；当使用TaqDNA连接酶和相应的TaqDNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
进一步的，当使用T4DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH 7.8@25℃)；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mMKAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1%Triton X-100(pH 7.6@25℃)。
进一步的，所述步骤二的环状双链DNA模板的纯化过程中，用Exo I和Exo III共同酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的所有线性单链DNA，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH(pH 9.5@25℃)，3.35mM MgCl2，0.5mMDTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃)，0.33mM MgCl2。
进一步的，所述步骤三在37℃下恒温反应0.5-72h制备双链RNA。
进一步的，双链RNA的制备过程中，RNA聚合酶的转录反应采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃)，6.0mM MgCl2，10mM DTT，10mM NaCl和2mMspermidine。
有益效果：
本发明制备双链RNA的方法中所用到的转录模板中无需引入启动子序列，因而转录产物中不会引入由启动子转录产生的多余序列，极大方便了后续的产物纯化过程。
双向转录效率相同，避免了非对称转录导致的一条RNA链过量的情况的发生，特别适合制备双链RNA。
相较于现有的双链RNA制备方法，本发明所涉及的制备双链RNA的方法非常简便、易操作，无需严苛条件，仅需扩大反应体系、延长转录时间、供给转录体系充足的NTPs即可实现目的双链RNA产物的大量制备。
利用本方法制备得到的双链RNA本身纯度较高（仅首尾两端的2-8nt为单链RNA），若对产物纯度要求较高，后续可用RNase A/RNase 1/RNase T1等酶切去除首尾两端的单链RNA，用DNase I等DNA酶去除环状双链DNA模板，用抽提醇沉、HPLC等方式对产物进一步纯化。
综上，本发明大大简化了双链RNA的制备流程，具有良好的应用潜力。
附图说明
图1实施例1制备双链RNA的示意图；
图2实施例1环状单链DNA的制备方法示意图；
图3实施例1环状双链DNA模板的制备方法示意图；
图4实施例1用B15制备双链RNA的结果（用T7 RNA聚合酶制备），其中A为B15的序列设计示意图，B为B15在75℃下制备的结果示意图；C为用B15制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图5实施例2用B12制备双链RNA的结果，其中A为B12的序列设计示意图，B为B12在75℃下制备的结果示意图；C为用B12制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图6实施例3用B9制备双链RNA的结果，其中A为B9的序列设计示意图，B为B9在75℃下制备的结果示意图；C为用B9制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图7实施例4用B5制备双链RNA的结果，其中A为B5的序列设计示意图，B为B5在75℃下制备的结果示意图；C为用B5制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图8实施例5用B9T制备双链RNA的结果，其中A为B9T的序列设计示意图，B为B9T在75℃下制备的结果示意图；C为用B9T制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图9实施例6用B5T制备双链RNA的结果，其中A为B5T的序列设计示意图，B为B5T在75℃下制备的结果示意图；C为用B5T制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图10实施例7用环96制备双链RNA的结果，其中A为环96的序列设计示意图，B为环96在65℃下制备的结果示意图；C为用环96制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图11实施例8用环155制备双链RNA的结果，其中A为环155的序列设计示意图，B为环155在65℃下制备的结果示意图；C为用环155制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图12实施例9用环278制备双链RNA的结果，其中A为环278的序列设计示意图，B为环278在65℃下制备的结果示意图；C为用环278制备双链RNA的结果以及对转录产物的酶切验证结果；
图13实施例10用B15制备双链RNA的结果（用SP6 RNA聚合酶制备）。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
下述实施例使用的用于制备环状双链DNA模板的成环前体线性链均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，为人工合成；核糖核酸酶H（RNase H）、10×RNase H buffer、TaqDNA连接酶（Taq Dnl）、10×Taq Dnl buffer、无机焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase,E. coli）、ShortCut RNase III及其对应的10×buffer购自安诺伦（北京）生物科技有限公司（NEW ENGLAND BioLabs）；T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）、SP6 RNA聚合酶（SP6 RNAP）、5×RNAPbuffer、核酸酶抑制剂（RiboLock RNase Inhibitor）、T4多聚磷酸激酶（T4 PNK）、10×T4PNK buffer A、ATP（原液浓度为100mM）、T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、10×T4 Dnl buffer、ExoI、Exo I对应的10×buffer、Exo III、Exo III对应的10× buffer、DNase I、10×DNase Ibuffer（含Mg2+）、NTPs（ATP、UTP、CTP和GTP的统称，原液浓度为100mM）均购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司；核酸染液（Ultra GelRed）购自诺唯赞（南京）生物科技有限公司；其他化学用品购自美国西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich）。
以下实施例是为了证明本发明的方法具有优越性。
实施例1
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
C1-a链（5¢→3¢）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
C1-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATACCGTCACAGTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：6）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
（2）制备环状单链DNA（C1）及线性单链DNA（LA）
C1的制备：
将成环前体线性链（C1-a和C1-b，终浓度为1μM）、splint（Splint C1-ab和SplintC1-ba，终浓度为2μM）、T4 DNA连接酶（T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为1×）混合，37℃下反应12h制备C1。
1×T4 Dnl Buffer的组成：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH7.8@25℃)。
LA的制备：
将前体线性链（A-a和A-b，终浓度为1μM）、splint（Splint A-ab，终浓度为2μM）、T4DNA连接酶（T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为1×）混合，37℃下反应12h制备LA。
1×T4 Dnl Buffer的组成：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH 7.8@25℃)
（3）制备B15（泡状结构长度为15bp的环状双链DNA模板）
先将C1（终浓度为1μM）、LA（终浓度为1.2μM）以及Taq Dnl buffer（终浓度为1×）混的Mix在90℃下保温1~3min，然后以0.1℃/s的速度降温至60℃，再以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min使得C1和LA充分杂交形成nick。将PCR调到75℃下运行，然后在样品中加入Taq Dnl（终浓度为4U/μL）在75℃下连接12h。
1×Taq Dnl Buffer的组成：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1mM NAD，0.1%Triton X-100(pH 7.6@25℃)。
（4）纯化B15
在（3）中制备得到的B15中加入Exo I（终浓度约为1U/μL）、Exo III（终浓度约为4U/μL）及其对应的buffer（各自终浓度均为0.5×）。颠倒混匀并离心后在37℃下过夜酶切，以去除体系中剩余的LA以及splint。
0.5×Exo I buffer的组成为：33.5mM glycine-KOH (pH 9.5@25℃)，3.35mMMgCl2，0.5mM DTT；
0.5×Exo III buffer的组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃)，0.33mM MgCl2。
（5）用B15转录制备双链RNA
转录体系及反应条件（100μL）：[B15]=50 nM，[each NTP]=0.5mM，[T7 RNAP]=2U/μL，[RNase Inhibitor]=2U/μL，[RNAP buffer]=1×，（[RNase H]）=0.25U/μL。在37℃下转录12h，再在70℃下处理10min终止反应。
1×RNAP buffer的组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃)，6mM MgCl2，10mM DTT，10mM NaCl和2mM spermidine。
（6）用ShortCut RNase III酶切转录产物以确认转录产物为双链：
取出10μL转录产物，然后在体系中（总体积为20μL）加入ShortCut RNase III（终浓度为0.2U/μL）、ShortCut Reaction buffer（终浓度为1×）和MnCl2（终浓度为1×）。在37℃下酶切40 min，然后取出部分酶切产物与loading buffer混合（loading buffer中有EDTA，可以螯合掉金属离子，从而终止反应）。
（7）电泳检测
对实验结果进行8%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再用Image Lab软件分析环状双链DNA模板的制备结果、其对应的双链RNA的制备结果（转录结果）以及ShortCutRNase III的转录产物酶切结果。
图4为结果图，其中图4中A为B15的序列设计示意图，其含有一个上、下链序列相同、方向相反的15bp泡状结构；图4中B为B15在75℃下制备的结果示意图；图4中C为用B15制备双链RNA（体系中仅有T7 RNAP或T7 RNAP和RNase H共存）的结果以及ShortCut RNaseIII对转录产物的酶切验证结果，图中的标注“S”指ShortCut RNase III酶切的结果。结果表明当转录体系中仅有T7 RNAP时，转录产物为堵在胶孔处的多聚串联重复序列；当T7RNAP和RNase H共存于转录体系时，转录产物集中分布于一个固定的长度；ShortCut RNaseIII酶切后，上述转录产物均被切短了，长度集中在一小段固定区域，根据该酶的酶切特性（其可将长双链RNA酶切成18-25bp的短双链RNA），可以判定B15的转录产物为我们想要的双链RNA。
实施例2
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
C2-a链（5¢→3¢，同C1-a）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
C2-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATACCGTCAGTCTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：9）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
环状单链DNA（C2）的制备、B12（泡状结构长度为12bp的环状双链DNA模板）的制备及纯化、用B12制备双链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
（2）转录结束后在转录产物中加入A链或C2链的一部分与之杂交，然后加入RNaseH进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：
在10μL转录产物中加入LC2-a（LC1-a）/LA-a（终浓度为0.1μM）和RNase H buffer（终浓度为0.5×），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下保持5min，接着加入RNase H（终浓度为0.25U/μL），在37℃下酶切40min。反应结束后在70℃下处理10min，以灭活RNase H。
图5中C为实验结果，可以看到加入RNase H进行二次酶切后泳道上方的弥散条带减少了，且泳道靠下位置处的短产物量得到了提高。这表明加入的单链DNA并未发挥作用（其若发挥作用，产物会被切成寡核苷酸，而是新加入的RNase H识别了泡状结构处的单链与RNA产物杂交产生的DNA/RNA chimera并进一步发挥了酶切作用。上述结果说明B12的转录产物为双链，不是单链。
实施例3
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
C3-a链（5¢→3¢，同C1-a）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
C3-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATACCGAGTGTCTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：10）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
环状单链DNA（C3）的制备、B9（泡状结构长度为9bp的环状双链DNA模板）的制备及纯化、用B9制备双链RNA的反应体系及条件、B9转录产物的ShortCut RNase III酶切表征实验以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图6中C为实验结果，可以看到结果同图4中C基本一致，因此我们判定B9的转录产物为双链RNA。
实施例4
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
E-a链（5¢→3¢，同C1-a）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
E-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：11）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
环状单链DNA（CE）的制备、B5（泡状结构长度为5bp的环状双链DNA模板）的制备及纯化、用B5制备双链RNA的反应体系及条件、B5转录产物的ShortCut RNase III酶切表征实验以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图7中C为实验结果，可以看到结果同图4中C基本一致，因此我们判定B5的转录产物为双链RNA。但应当注意的是，当泡状结构尺寸为5bp时，可以看到当T7 RNAP和RNase H共存于转录体系时，转录结束后并没有固定长度的短RNA产物出现，只是有弥散条带出现，大部分产物仍集中在胶孔处，说明这么小的泡状结构尺寸限制了RNase H对转录产物的酶切分离，使得产物单体的分离效果不理想。因此在设计转录模板时泡状结构尺寸应≥5bp。
实施例5
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
H2-a链（5¢→3¢，同C1-a）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
H2-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACATTTTTTTTTAGTGTCTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：12）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
环状单链DNA（CH2）的制备、B9T（带有polyT的泡状结构长度为9bp的环状双链DNA模板）的制备及纯化、用B9T制备双链RNA的反应体系及条件、以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
（2）转录结束后在转录产物中加入A链或H2链的一部分与之杂交，然后加入RNaseH进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：
在10μL转录产物中加入LH2-a（LC1-a）/LA-a（终浓度为1μM）和RNase H buffer（终浓度为0.5×），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下处理5min，接着加入RNase H（终浓度为0.25U/μL），在37℃下酶切2h。反应结束后在70℃下处理10min，以灭活RNase H。
图8中C为实验结果，可以看到结果与图5中C类似，在加入RNase H进行二次酶切后泳道上方的弥散条带减少了，且泳道靠下位置处的短产物量得到了极大提高。这表明加入的单链DNA并未发挥作用，说明B9T的转录产物也为双链。但应当注意的是，与B9的转录结果（图6中C）相比，可以看到泡状结构处polyT的存在很大程度上影响了RNase H对转录产物的酶切分离，在设计转录模板时应尽量避免此类特殊序列。
实施例6
（1）原料
A-a链（5¢→3¢）：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA（5¢-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1）；
A-b链（5¢→3¢）：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG（5¢-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2）；
Splint A-ab（5¢→3¢）：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA（长度为20nt，SEQ ID NO：3）；
Splint A-ba（5¢→3¢）：
ACCGGAGTCTGCACAA（长度为16nt，SEQ ID NO：4）；
J2-a链（5¢→3¢，同C1-a）：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5）；
J2-b链（5¢→3¢）：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACATTTTTTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT（5¢-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：13）；
Splint C1-ab（5¢→3¢）：
GTGCAGACTCCGGTGG（长度为16nt，SEQ ID NO：7）；
Splint C1-ba（5¢→3¢）：
CTTTATAAACAACCAG（长度为16nt，SEQ ID NO：8）。
环状单链DNA（CJ2）的制备、B5T（带有polyT的泡状结构长度为5bp的环状双链DNA模板）的制备及纯化、用B5T制备双链RNA的反应体系及条件、以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
（2）转录结束后在转录产物中加入A链或J2链的一部分与之杂交，然后加入RNaseH进行二次酶切以判断转录产物为单/双链的体系及反应条件：
在10μL转录产物中加入LJ2-a（LC1-a）/LA-a（终浓度为1μM）和RNase H buffer（终浓度为0.5×），然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下处理5min，接着加入RNase H（终浓度为0.25U/μL），在37℃下酶切40min。反应结束后在70℃下处理10min，以灭活RNase H。
图9中C为实验结果，可以看到在加入RNase H进行二次酶切后堵在胶孔处的长产物未减少，这表明加入的单链DNA未发挥作用，说明B5T的转录产物也为双链。
实施例7
（1）原料
A链（5¢→3¢）：
CCAGGAATCAGCGGCAAATTCCTCTACTTTCCTCGTCACATCTT（5¢-磷酸化，长度为44nt，SEQID NO：14，下划线处为泡状结构所在位置）；
B链（5¢→3¢）：
CGACTCCTGTACTGACAACACTCTCACACGACACATCCGCGTCACAAAAGGT（5¢-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：15）；
Splint AB（5¢→3¢）：
ACAGGAGTCGAAGATGTGAC（长度为20nt，SEQ ID NO：16）；
Splint BA（5¢→3¢）：
TGATTCCTGGACCTTTTGTG（长度为20nt，SEQ ID NO：17）；
A1链（5¢→3¢）：
AAGATGTGAGCTCCTTTCATCTCCAATTTGCCGCTGATTCCTGG（5¢-磷酸化，长度为44nt，SEQID NO：18，下划线处为泡状结构所在位置）；
B1链（5¢→3¢）：
ACCTTTTGTGACGCGGATGTGTCGTGTGAGAGTGTTGTCAGTACAGGAGTCG（5¢-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：19）；
Splint A1B1（5¢→3¢）：
CACAAAAGGTCCAGGAATCA（长度为20nt，SEQ ID NO：20）；
Splint B1A1（5¢→3¢）：
CTCACATCTTCGACTCCTGT（长度为20nt，SEQ ID NO：21）。
96nt的单环制备方法同实施例1，但96bp的环状双链DNA模板的制备方法与实施例1-6均不同。具体地：将制备好的96nt单环和与其互补链对应的两条短DNA链（A1和B1）退火杂交（退火条件同实施例1）后直接加入Taq Dnl进行连接。96bp的环状双链DNA模板的纯化方法及后续的转录条件同实施例1，此处不再赘述。图10为用长度为96bp的环状双链DNA模板制备双链RNA的结果。结果显示转录产物也为双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例8
（1）原料
A链（5¢→3¢）：
CCAGGAATCAGCGGCAAATTCCTCTACTTTCCTCGTCACATCTT（5¢-磷酸化，长度为44nt，SEQID NO：14，下划线处为泡状结构所在位置）；
B链（5¢→3¢）：
CGACTCCTGTACTGACAACACTCTCACACGACACATCCGCGTCACAAAAGGT（5¢-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：15）；
C链（5¢→3¢）：
GAAGAAACTCATGACATCGAATTGTTGAGCGAAGAATATGACGCCACTCCTTTCATCAA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：22）；
Splint AB（5¢→3¢）：
ACAGGAGTCGAAGATGTGAC（长度为20nt，SEQ ID NO：16）；
Splint BC（5¢→3¢）：
GAGTTTCTTCACCTTTTGTG（长度为20nt，SEQ ID NO：23）；
Splint CA（5¢→3¢）：
TGATTCCTGGTTGATGAAAG（长度为20nt，SEQ ID NO：24）；
A1链（5¢→3¢）：
AAGATGTGAGCTCCTTTCATCTCCAATTTGCCGCTGATTCCTGG（5-磷酸化，长度为44nt，SEQID NO：18，下划线处为泡状结构所在位置）；
B1链（5¢→3¢）：
ACCTTTTGTGACGCGGATGTGTCGTGTGAGAGTGTTGTCAGTACAGGAGTCG（5-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：19）；
C1链（5¢→3¢）：
TTGATGAAAGGAGTGGCGTCATATTCTTCGCTCAACAATTCGATGTCATGAGTTTCTTC（5-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：25）；
Splint A1C1（5→3）：
CTTTCATCAACCAGGAATCA（长度为20nt，SEQ ID NO：26）；
Splint C1B1（5¢→3¢）：
CACAAAAGGTGAAGAAACTC（长度为20nt，SEQ ID NO：27）；
Splint B1A1（5¢→3¢）：
CTCACATCTTCGACTCCTGT（长度为20nt，SEQ ID NO：21）。
155nt的单环制备方法不同于实施例1中的一锅法，采用分步的方式制备。具体地，先制备L-A1B1，再以L-A1B1和C1为原料制备C-A1B1C1（155nt的单环）。
L-A1B1的制备：
将A1和B1（终浓度为4μM）、splint（Splint B1A1，终浓度为6μM）、T4 DNA连接酶（T4Dnl，终浓度为0.25U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为1×）混合，37℃下反应2h。
C-A1B1C1的制备：
将制备好的L-A1B1（终浓度为2μM）、C1（终浓度为2μM）、splint（Splint A1C1和Splint C1B1，终浓度均为3μM）、T4 DNA连接酶（T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL）和对应的T4DNA连接酶缓冲液（终浓度为0.5×）混合，37℃下反应2h。
155bp的环状双链DNA模板的制备方法与实施例7相同。具体地：将制备好的155nt单环和与其互补链对应的三条短DNA链（A、B和C）退火杂交（退火条件同实施例1）后直接加入Taq Dnl进行连接。155bp的环状双链DNA模板的纯化方法及后续的转录条件同实施例1，此处不再赘述。
图11为用长度为155bp的环状双链DNA模板制备双链RNA的结果。结果显示转录产物也为双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例9
（1）原料
B链（5¢→3¢）：
CGACTCCTGTACTGACAACACTCTCACACGACACATCCGCGTCACAAAAGGT（5¢-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：15）；
C链（5¢→3¢）：
GAAGAAACTCATGACATCGAATTGTTGAGCGAAGAATATGACGCCACTCCTTTCATCAA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：22）；
D链（5¢→3¢）：
AATCGGCAGTCCATTCGCAGAAGCAACTGTACTCAAATTCGGTAAACTCCAACGC（5¢-磷酸化，长度为55nt，SEQ ID NO：28，下划线处为泡状结构所在位置）；
E链（5¢→3¢）：
ACTCAGTACGCATACTTCGTCACTGCTGATGACATCAGGGTTGGTTCAATGTCCGCCGA（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：29）；
F链（5¢→3¢）：
CGGCTACCACAACATTTCTACCAAGGATGGTGACTGCGGTTCACTCCTCTTTG（5¢-磷酸化，长度为53nt，SEQ ID NO：30）；
Splint BC（5¢→3¢）：
GAGTTTCTTCACCTTTTGTG（长度为20nt，SEQ ID NO：23）；
Splint CD（5¢→3¢）：
ACTGCCGATTTTGATGAAAG（长度为20nt，SEQ ID NO：31）；
Splint DE（5¢→3¢）：
CGTACTGAGTGCGTTGGAGT（长度为20nt，SEQ ID NO：32）；
Splint EF（5¢→3¢）：
GTGGTAGCCGTCGGCGGACA（长度为20nt，SEQ ID NO：33）；
Splint FB（5¢→3¢）：
ACAGGAGTCGCAAAGAGGAG（长度为20nt，SEQ ID NO：34）；
B1链（5¢→3¢）：
ACCTTTTGTGACGCGGATGTGTCGTGTGAGAGTGTTGTCAGTACAGGAGTCG（5¢-磷酸化，长度为52nt，SEQ ID NO：19）；
C1链（5¢→3¢）：
TTGATGAAAGGAGTGGCGTCATATTCTTCGCTCAACAATTCGATGTCATGAGTTTCTTC
（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：25）；
D1链（5¢→3¢）：
GCGTTGGAGTTTACCGAATTTGAGTTGTCAACGAAGACGCAATGGACTGCCGATT
（5¢-磷酸化，长度为55nt，SEQ ID NO：35，下划线处为泡状结构所在位置）；
E1链（5¢→3¢）：
TCGGCGGACATTGAACCAACCCTGATGTCATCAGCAGTGACGAAGTATGCGTACTGAGT
（5¢-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：36）；
F1链（5¢→3¢）：
CAAAGAGGAGTGAACCGCAGTCACCATCCTTGGTAGAAATGTTGTGGTAGCCG
（5¢-磷酸化，长度为53nt，SEQ ID NO：37）；
Splint C1B1（5¢→3¢）：
CACAAAAGGTGAAGAAACTC（长度为20nt，SEQ ID NO：27）；
Splint D1C1（5¢→3¢）：
CTTTCATCAAAATCGGCAGT（长度为20nt，SEQ ID NO：38）；
Splint E1D1（5¢→3¢）：
ACTCCAACGCACTCAGTACG（长度为20nt，SEQ ID NO：39）；
Splint F1E1（5¢→3¢）：
TGTCCGCCGACGGCTACCAC（长度为20nt，SEQ ID NO：40）；
Splint B1F1（5¢→3¢）：
CTCCTCTTTGCGACTCCTGT（长度为20nt，SEQ ID NO：41）。
278nt的单环制备方法同实施例8，即采用分步的方式制备。具体地，先制备L-B1C1和L-D1E1，再以L-D1E1和F1为原料制备L-D1E1F1，最后以L-B1C1和L-D1E1F1为原料制备C-B1C1D1E1F1（278nt的单环）。
L-B1C1的制备：
将B1和C1（终浓度为4μM）、splint（Splint C1B1，终浓度为6μM）、T4 DNA连接酶（T4Dnl，终浓度为0.25U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为1×）混合，37℃下反应2h。
L-D1E1的制备：
将D1和E1（终浓度为4μM）、splint（Splint E1D1，终浓度为6μM）、T4 DNA连接酶（T4Dnl，终浓度为0.25U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为1×）混合，37℃下反应2h。
L-D1E1F1的制备：
将制备好的L-D1E1（终浓度为2μM）、F1（终浓度为2μM）、splint（Splint F1E1，终浓度为3μM）、T4 DNA连接酶（T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为0.5×）混合，37℃下反应2h。
C-B1C1D1E1F1的制备：
将制备好的L-D1E1F1（终浓度为1μM）和L-B1C1（终浓度为1μM）、splint（SplintD1C1和Splint B1F1，终浓度均为1.5μM）、T4 DNA连接酶（T4 Dnl，终浓度为0.0625U/μL）和对应的T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度为0.25×）混合，37℃下反应2h。
278bp的环状双链DNA模板的制备方法与实施例7和实施例8相同。具体地：将制备好的278nt单环和与其互补链对应的五条短DNA链（B、C、D、E和F）退火杂交（退火条件同实施例1）后直接加入Taq Dnl进行连接。278bp的环状双链DNA模板的纯化方法及后续的转录条件同实施例1，此处不再赘述。图12为用长度为278bp的环状双链DNA模板制备双链RNA的结果。结果显示转录产物也为双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例10
所用的原料，单环、单链及环状双链DNA的制备及纯化方法同实施例1，此处不再赘述。不同之处在于这里用SP6 RNA聚合酶进行转录，转录条件同实施例1。
图13为B15在SP6 RNA聚合酶的作用下制备双链RNA的结果。结果显示转录产物也为双链RNA，表明本方法具有良好的通用性，适用于多种常见的RNA聚合酶。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种制备双链RNA的方法
<141> 2021-11-22
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
actccggtgg aatgaaggac caagtctgtc atgcactgaa atcagtctca ttgctttata 60
a 61
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acaaccagct aagacactgc cataccctgt agaaccgaat ttgtgcag 48
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agctggttgt ttataaagca 20
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
accggagtct gcacaa 16
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttataaagca atgagactga tttcagtgca tgacagactt ggtccttcat tccaccgga 59
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtctgcacaa attcggttct acacccatac cgtcacagtt agctggttgt 50
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtgcagactc cggtgg 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctttataaac aaccag 16
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtctgcacaa attcggttct acacccatac cgtcagtctt agctggttgt 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtctgcacaa attcggttct acacccatac cgagtgtctt agctggttgt 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtctgcacaa attcggttct acacccattg gcagtgtctt agctggttgt 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gtctgcacaa attcggttct acattttttt ttagtgtctt agctggttgt 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtctgcacaa attcggttct acattttttg gcagtgtctt agctggttgt 50
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ccaggaatca gcggcaaatt cctctacttt cctcgtcaca tctt 44
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cgactcctgt actgacaaca ctctcacacg acacatccgc gtcacaaaag gt 52
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
acaggagtcg aagatgtgac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tgattcctgg accttttgtg 20
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aagatgtgag ctcctttcat ctccaatttg ccgctgattc ctgg 44
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accttttgtg acgcggatgt gtcgtgtgag agtgttgtca gtacaggagt cg 52
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cacaaaaggt ccaggaatca 20
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ctcacatctt cgactcctgt 20
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gaagaaactc atgacatcga attgttgagc gaagaatatg acgccactcc tttcatcaa 59
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gagtttcttc accttttgtg 20
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tgattcctgg ttgatgaaag 20
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ttgatgaaag gagtggcgtc atattcttcg ctcaacaatt cgatgtcatg agtttcttc 59
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ctttcatcaa ccaggaatca 20
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cacaaaaggt gaagaaactc 20
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aatcggcagt ccattcgcag aagcaactgt actcaaattc ggtaaactcc aacgc 55
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actcagtacg catacttcgt cactgctgat gacatcaggg ttggttcaat gtccgccga 59
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cggctaccac aacatttcta ccaaggatgg tgactgcggt tcactcctct ttg 53
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actgccgatt ttgatgaaag 20
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cgtactgagt gcgttggagt 20
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gtggtagccg tcggcggaca 20
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acaggagtcg caaagaggag 20
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gcgttggagt ttaccgaatt tgagttgtca acgaagacgc aatggactgc cgatt 55
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tcggcggaca ttgaaccaac cctgatgtca tcagcagtga cgaagtatgc gtactgagt 59
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caaagaggag tgaaccgcag tcaccatcct tggtagaaat gttgtggtag ccg 53
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ctttcatcaa aatcggcagt 20
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actccaacgc actcagtacg 20
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tgtccgccga cggctaccac 20
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ctcctctttg cgactcctgt 20

Claims (10)

1.一种制备双链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板含有非互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；
步骤二，将制备的环状双链DNA模板纯化，去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；
步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行酶切，获得目的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述泡状结构的长度为5-15bp。
3.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为70-1000bp。
4.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为96-278bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于90bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于90bp时，采用一锅法或分步法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于15nt。
6.根据权利要求5所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述退火杂交条件为：先在90℃下保温1-3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20-25℃并保温10min。
7.根据权利要求5所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4DNA连接酶和相应的T4DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用TaqDNA连接酶和相应的TaqDNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
8.根据权利要求7所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mMMgCl2，10mM DTT，500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用TaqDNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1%Triton X-100，pH 7.6@25℃。
9.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述步骤二的双链环状DNA模板的纯化过程中，用ExoI和ExoIII共同酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH，pH9.5@25℃，3.35mM MgCl2，0.5mM DTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl，pH 8.0@30℃；0.33mM MgCl2。
10.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述步骤三在1×RNA聚合酶缓冲液中进行，成分为：40mM Tris-HCl，pH 7.9@25℃，6.0mM MgCl2，10mM DTT，10mMNaCl和2mM spermidine，在37℃下恒温反应0.5-72h制备双链RNA。
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