CN115806970A - 一种制备单链rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸生物技术领域，为解决现有单链RNA制备方法难以实现工业化生产的问题，提供了一种制备单链RNA的方法。针对目的单链RNA，先设计一个含有错配的、不对称性强的错配序列区域的无启动子环状双链DNA模板，其中一条链为模板链，转录出的RNA包含目的单链RNA；设计并制备辅助链Aid‑DNA，其序列同该错配序列区域处模板链转录出的RNA产物的序列互补。该错配序列区域处错配碱基的存在使得聚合酶从此处顺利、高效起始转录；错配序列区域的不对称性使得聚合酶仅偏好转录一条链；核糖核酸酶H在Aid‑DNA的辅助下可高效截断串联重复转录产物，实现了目的产物的一步、高效、大量制备。

Description

一种制备单链RNA的方法
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备单链RNA的方法。
背景技术
随着人们对RNA研究的不断深入，RNA的一些功能不断被揭示，在医药、食品、纳米材料等领域都显示出极好的发展前景，亟需充足的RNA来满足科研需求和市场需求。但是目前RNA的大量合成还未实现，导致RNA的价格十分昂贵，在很大程度上限制了RNA的研究和应用。
RNA制备方法可分为体外合成和体内合成(重组过表达)两大类，体外合成又可分为化学法合成和酶法合成两大类(Analytical and bioanalytical chemistry,2018,410,3239-3252.)。目前用于体内制备RNA的宿主主要为大肠杆菌(E.coli)，以其作为宿主时生产周期短、产率高。也有利用亲硫菌(R.sulfidophilum)作为宿主的，产物被蛋白污染的程度较低，易纯化。但上述生物制备方法存在诸多问题，如产物易被胞内的RNA酶降解，缺少用于产物亲和纯化的有效tags，并且质粒载体的构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化等诸多步骤使得该方法在实际应用时较为繁琐(Analytical and bioanalyticalchemistry,2018,410,3239-3252.)。化学合成法(固相合成)目前应用良好，特别适用于小分子RNA(如小于25nt)药物，但存在产量低、合成步骤繁琐(有机化学,1994,14,17；Naturestructural biology,1998,5,203-212；Israel Journal of Chemistry,2013,53,326-349.)、纯度差(Analytical biochemistry,2001,298,196-206.)、无法合成长链RNA(CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812-816.)、产品安全性差(使用多种有机试剂)(化学试剂,2000,22,5.)等问题。为了提高化学合成的产率，有研究人员在液相合成方面做了初步探索，但产率仍不尽如人意(陆威,核酸的化学合成研究以及4′-C-羟甲基修饰siRNA的合成及干扰活性测试,华中师范大学硕士学位论文,2014.)。酶法(转录法)是在RNA聚合酶体外转录的基础上发展起来的，相较化学合成而言，这种方法因在液相环境中进行而易于实现大规模生产。酶法可满足较长RNA的合成，并且整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更高，对环境也更加友好(Israel Journal ofChemistry,2013,53,326-349；CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812-816.)。近些年的研究还表明该方法可满足带修饰RNA的合成，具有良好的应用前景(Organic&biomolecular chemistry,2018,16,5800-5807；Molecules,2020,25,5492.)。
按照转录模板为线性还是环状，转录法可分为线性转录和滚环转录，滚环转录又按照转录模板为单链环还是双链环分为单链环转录和双链环转录。线性转录存在转录效率低、产物3′端异质(主要为[N+1]和[N+2]产物(Nucleic acids research,1987,15,8783-8798.))，产生长链副产物(聚合酶结合在产物3′端进行非特异性延伸产生dsRNAs，使用时易引起免疫反应)等问题。在此过程中产物与模板对聚合酶的竞争结合会在一定程度上干扰反应(Gene,1988,72,75-89；Proceedings of the National Academy of Sciences,1994,91,6972-6976.))。且每个产物分子的5′端均带有三磷酸，其不光具有免疫原性(Oligonucleotides,2006,16,353-363.)，还不能被直接应用于连接(环化)反应，后期需进行去磷酸化处理。相较线性转录而言，滚环转录效率有了很大提升，且生成的长串联重复产物中仅第一个产物单元的5′端带有三磷酸，极大降低了免疫原性。单链环虽应用起来简便，但转录效率易受模板序列和二级结构的影响(Journal of the American ChemicalSociety,1995,117,7818-7819；Molecular Therapy-Nucleic Acids,2015,4,e215；生物技术,2016,26,7；Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99,54-59；Nucleic acids research,2013,41,2552-2564.)。使用双链环则不存在上述问题。滚环转录的效率虽高，但其生成的多聚串联重复产物只是半成品，需进行截断处理才能获得目的产物单元，但现有方法(自切割性核酶、脱氧核酶、核糖核酸酶H等)的截断效率较低、精度也较差，产物多为混合物，纯度难以满足要求(ACS nano,2019,13,4603-4612；生物技术通报,2016,32,44-51.)。目前几乎所有转录制备RNA的方法中所用到的模板里均含有启动子序列，这样产物中也会含有源于启动子的多余序列，后期需去除(Kristoffersson,Rollingcircle transcription on smallest size double stranded DNA minicircles,AMaster Thesis of Uppsala University,2010；ACS nano,2019,13,4603-4612.)。且只要启动子处于闭合状态(启动子清空后)其就会招募新的聚合酶起始转录(造成重复起始)，而起始是整个转录过程中的限速步骤，这样势必会拖慢整体的效率(Iscience,2020,23,101445.)。多次起始产生的诸多失败转录产物(abortive transcripts，长度＜8nt)还会造成NTP的浪费。新聚合酶的起始还会干扰已处于延伸状态的聚合酶，从而影响整体的效率(J.Biol.Chem.,2006,281,24441-24448.)。
在聚合酶链式反应(PCR)的基础上，近些年又演变出了聚合酶链式转录(PCT)(Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109,8067-8072；Biochemistry,2017,56,5227-5228；Journal of the American Chemical Society,2017,139,9949-9954.)，其核心是通过酶改性的手段使DNA聚合酶拥有RNA合成能力。该方法虽高效(102-104倍)、可满足多种2′端带修饰RNA的合成，且所用改性聚合酶耐受高温的特性弱化了模板自身复杂结构给转录带来的不利影响，但PCT具有诸多难以克服的缺点，导致该方法尚不能用于实际生产。首先，用这种方法制备出的粗产物为DNA-RNA复合物(RNA产物的5′端带有一段DNA引物)，后期需用DNase纯化，但DNase处理后的产物5′端常会残留一个脱氧核糖核苷酸(5′-terminal dN)，使得产物不纯。其次，由于要借助升温变性循环的方式来实现快速、大量制备，该方法对仪器的温控性能要求较高。再次，改性酶的使用使得产物的忠实性(fidelity)较差。且产物中包含两种RNA，需分离纯化才能使用。由此可见现有方法均无法实现RNA的大量、高效、精确合成。
发明内容
针对现有单链RNA制备方法步骤繁琐、效率低下、成本高昂且难以实现大量制备的问题，本发明提供了一种制备单链RNA的方法。首先，针对要制备的单链RNA，设计一个含有错配、且序列不对称性强的错配序列区域的、无启动子的环状双链DNA模板；然后，设计一条短链DNA(Aid-DNA)作为辅助链；接着，在体系中同时加入上述环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H)、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。在转录过程中RNA聚合酶进行单向滚环转录，RNase H则在Aid-DNA的辅助下及时实现对转录产物的截断。在RNA聚合酶、核糖核酸酶H和Aid-DNA三者之间的默契配合下实现了目的单链RNA产物的一步、高效、大量制备。
本发明采用的技术方案如下：
一种制备单链RNA的方法，包括以下步骤：
步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板中不含启动子序列，由错配序列区域和完全互补序列区域两部分首尾相连构成，所述错配序列区域的长度为5-20bp；错配序列区域和/或完全互补序列区域含有不对称序列，不对称分三种情况：①序列本身不对称；②只在非模板链上引入甲氧基等修饰基团；③长度不对称，即模板链和非模板链的长度不同，须满足至少一种情况；错配序列区域的错配碱基对数占20-100％；将所述环状双链DNA模板中的一条DNA链作为模板链，该模板链转录出的RNA产物含有目的单链RNA的序列；
步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为长度6-20nt的单链DNA，可互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，所述特定部位是指由模板链的错配序列区域转录出的RNA；
步骤三，将制备的环状双链DNA模板纯化，去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；
步骤四，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录和RNase H酶切，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行单向滚环转录，Aid-DNA互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，核糖核酸酶H水解与Aid-DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，从而将含有重复序列的转录产物进行截断，获得目的单链RNA。
错配序列区域的错配数不宜过多，且其中的序列不对称性需强，应避免回文序列以及上、下链序列相似的设计，以抑制编码链的转录。错配碱基数进一步优选为25-60％。
不对称的三种情形，满足一种即可，在不发生冲突的前提下，也可以同时满足两种以上的情形。错配序列区域的不对称性至少为25％以上，优选50-100％，所述不对称性为非回文序列长度与错配序列区域总长的比值。
错配序列区域的尺寸应在5-20bp之间，优选7-15bp，过大或过小都会导致单链RNA的产量降低。
在保证核糖核酸酶H对串联重复产物的截断效率的前提下，Aid-DNA的长度应尽量短，进一步优选6-12nt，以使核糖核酸酶H对产物仅酶切一次后就解离。必要时尝试强化条件，如提高Aid-DNA的浓度、提高核糖核酸酶H的浓度，以及终止反应后补加RNase H延长时间充分酶切等。Aid-DNA可为天然DNA，亦可为修饰DNA。
不考虑环状双链DNA模板制备的难易程度，所述本发明可制备的单链RNA产物单体的长度为50nt以上；优选50-1000nt，再优选为61-118nt。
进一步的，当所述环状双链DNA模板长度小于70bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离错配序列区域的边缘应大于10nt。设计成环前体线性链时，需避免将断点设计在错配序列区域处，否则在制备环状双链DNA模板的退火杂交过程中无法形成Nick(双链连接酶发挥连接作用所必需的结构)。
进一步的，所述制备环状双链DNA模板的方法，当所述环状双链DNA模板长度小于70bp时，采用一段法环化制备所述环状单链DNA；当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，设计多段25-59nt的5′端磷酸化的DNA片段和相应的splint，采用一锅法或分段法制备环状单链DNA。
进一步的，制备所述环状双链DNA模板的过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。
进一步的，制备所述环状双链DNA模板的过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃范围内保温2-24h进行连接。T4 DNA连接酶在4-37℃范围内均能发挥连接作用。制得的双链环状DNA模板的转录效率受到连接温度的影响，在这个温度范围内温度越高模板的转录效率越高，优选16-37℃。
当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。在高温条件下用Taq DNA连接酶制备双链环状DNA模板，以保证错配序列区域处的错配处于打开状态，从而保证高效转录，优选60-80℃。
进一步的，制备所述环状双链DNA模板的过程中，当使用T4 DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH 7.8@25℃)；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1％Triton X-100(pH 7.6@25℃)。
进一步的，所述步骤三的环状双链DNA模板的纯化过程中，用Exo I和Exo III共同酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的所有线性单链DNA。
进一步的，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mMglycine-KOH(pH9.5@25℃)，3.35mM MgCl2，0.5mM DTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃)，0.33mM MgCl2。
进一步的，所述步骤四在37℃下恒温反应0.5-72h制备单链RNA。
进一步的，单链RNA的制备过程中，RNA聚合酶的转录反应采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃),6.0mM MgCl2,10mM DTT,10mM NaCl and 2mMspermidine。
有益效果：
本发明制备单链RNA的方法中所用到的转录模板中没有引入启动子序列，而是使用了含有错配、序列不对称性强的错配序列区域以及该错配序列区域处两端完全互补序列的不对称性来实现对转录方向的控制。启动子序列的缺失一方面降低了聚合酶对模板的结合亲和力，从而有利于启动子清空，这就从根本上提升了转录效率；另一方面，由于双环模板中拓扑限制力的存在，整个转录过程中每个双环模板上始终只有一个聚合酶持续合成RNA，这样就避免了重复起始所带来的一系列问题，如浪费NTP来合成失败转录产物(abortive transcripts)、干扰聚合酶的延伸等。
错配序列区域处错配的存在以及双环模板的高温制备条件使得聚合酶能在此处高效起始转录，并且负超螺旋的存在会在一定程度上缓冲解链所造成的应力，从而有利于聚合酶的延伸(相当于增强了聚合酶的持续合成能力，使其不易从模板上掉落)，这有利于长串联重复产物的生成。
可满足多方需求。对于可允许RNA产物两端不精确的情况，如ribozyme、RNAaptamer等，直接在目的RNA编码模板的两端加上所述错配序列区域即可，Aid-DNA的序列需与该错配序列区域中模板链的转录产物基本互补(等长或者更短)，只要保证转录产物单体两端的多余序列(由所述错配序列区域编码)不会干扰目的产物活性中心的结构和功能即可；对于需要保证RNA产物精确性的情况(不允许在模板中引入多余序列)，可直接在目的RNA编码模板中设计所述错配序列区域，再根据实际的转录结果(转录方向是否正确，是否高效)调整设计。
双链环状DNA模板的使用保证了长串联重复产物只能和短链Aid-DNA杂交，进而实现了RNase H对产物高效且精确的截断。
‘转录’和‘产物截断’的同时进行加速了整个反应的进程。
不同于单链环状DNA，双链环状DNA模板几乎不会与产物杂交，因而可以重复利用。
相较于现有的单链RNA制备方法，本发明所涉及的制备单链RNA的方法非常简便、易操作，无需严苛条件，仅需扩大反应体系、延长转录时间、供给转录体系充足的NTPs即可实现目的单链RNA产物的大量积累。
利用本方法制备得到的单链RNA本身纯度较高(仅末端含少量几个多余核糖核苷酸，也可做到不含多余序列)，若对产物纯度要求较高，后续可用DNase I等DNA酶去除环状双链DNA模板，用抽提醇沉、胶回收、HPLC等方式对产物进一步纯化。
综上，本发明大大简化了单链RNA的制备流程，成本低，实操性强，特别适用于单链RNA的工业化大规模生产。
附图说明
图1实施例1单链RNA的制备方法示意图；
图2实施例1环状单链DNA的制备方法示意图；
图3实施例1环状双链DNA模板的制备方法示意图；
图4实施例1用M4H制备单链RNA的结果；
图5实施例2用M4L制备单链RNA的结果；
图6实施例3用HHRz制备单链RNA的结果；
图7实施例4用SM-HHRz制备单链RNA的结果；
图8实施例5用M4L-1制备单链RNA的结果；
图9实施例6用M4L-2制备单链RNA的结果；
图10实施例7用M4L-3制备单链RNA的结果；
图11实施例8用M4L-4制备单链RNA的结果；
图12实施例9用M4L-5制备单链RNA的结果；
图13实施例10用M4L-6制备单链RNA的结果；
图14实施例11用B15-OMe制备单链RNA的结果；
图15实施例12用M4L-Hairpin制备单链RNA的结果；
图16实施例13用B5-reduce 7A制备单链RNA的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
下述实施例中用于制备环状双链DNA模板的成环前体线性链以及Aid-DNA均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，为人工合成；核糖核酸酶H(RNase H)、10×RNase Hbuffer、Taq DNA连接酶(Taq Dnl)、10×Taq Dnl buffer、无机焦磷酸酶(InorganicPyrophosphatase,E.coli)、ShortCut RNase III及其对应的10×buffer购自安诺伦(北京)生物科技有限公司(NEW ENGLAND BioLabs)；T7 RNA聚合酶(T7RNAP)、5×RNAP buffer、核酸酶抑制剂(RiboLock RNase Inhibitor)、T4多聚磷酸激酶(T4 PNK)、10×T4 PNKbuffer A、ATP(100mM)、T4 DNA连接酶(T4 Dnl)、10×T4 Dnl buffer、Exo I、Exo I对应的10×buffer、Exo III、Exo III对应的10×buffer、DNase I、10×DNase I buffer(含Mg2+)、NTPs(ATP、UTP、CTP和GTP的统称，100mM)均购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司；核酸染液(Ultra GelRed)购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司；其他化学用品购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
以下实施例是为了证明本发明的方法具有可行性和实用性。
实施例1
(1)原料
LA-a链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1)；
LA-b链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2)；
Splint A-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，SEQ ID NO：3)；
Splint A-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，SEQ ID NO：4)；
C4-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：5)；
C4-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACGGTTTGGCTGTGTGTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：6)；
Splint C4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，SEQ ID NO：7)；
Splint C4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，SEQ ID NO：8)；
(2)制备环状单链DNA(C4)
将成环前体线性链(C4-a和C4-b，终浓度为1μM)、splint(Splint C4-ab和SplintC4-ba，终浓度为2μM)、T4 DNA连接酶(T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL)和对应的T4 DNA连接酶缓冲液(终浓度为1×)混合，37℃下反应12h。
1×T4 Dnl Buffer的组成：40mM Tris-HC，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH7.8@25℃)。
(3)制备环状双链DNA模板M4H(错配区域长度为15bp，其中含4个错配碱基)
先将C4(终浓度为1μM)、LA-a和LA-b(终浓度为1.5μM)以及Taq Dnl buffer(终浓度为1×)混的Mix在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至60℃，再以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min使得C4和LA-a、LA-b充分杂交形成nicks。将PCR调到75℃下运行，然后在样品中加入Taq Dnl(终浓度为4U/μL)在75℃下连接2h。
1×Taq Dnl Buffer的组成：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1mM NAD，0.1％Triton X-100(pH 7.6@25℃)。
(4)纯化M4H
在(3)中制备得到的M4H中加入Exo I(终浓度约为1U/μL)、Exo III(终浓度约为4U/μL)及其对应的buffer(各自终浓度均为0.5×)。颠倒混匀并离心后在37℃下酶切2h，以去除体系中线性DNA。
0.5×Exo I buffer的组成为：33.5mM glycine-KOH(pH 9.5@25℃)，3.35mMMgCl2，0.5mM DTT；
0.5×Exo III buffer的组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃)，0.33mM MgCl2。
(5)用M4H转录制备单链RNA
转录体系及反应条件：[M4H]＝50nM，[each NTP]＝0.5mM，[T7 RNAP]＝2U/μL，[RNase Inhibitor]＝2U/μL，[RNAP buffer]＝1×，([RNase H]＝0.25U/μL)。在37℃下转录4h，再在70℃下处理10min终止反应。
1×RNAP buffer的组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃)，6mM MgCl2，10mM DTT，10mM NaCl和2mM spermidine。
(6)用ShortCut RNase III酶切转录产物以确认转录产物为单链
取出一半转录产物，然后在体系中加入ShortCut RNase III(终浓度为0.2U/μL)、ShortCut Reaction buffer(终浓度为1×)和MnCl2(终浓度为1×)。在37℃下酶切40min，然后取出部分酶切产物与上样缓冲液(loading buffer)混合，上样缓冲液中有EDTA，可以螯合掉金属离子(Mn2+)，从而终止反应。
(7)在转录产物中加入A链或C4链(的一部分)与之杂交以明确转录产物为单链RNA的体系及反应条件：
在7μL转录产物中加入LA-a/C4-a(终浓度为1μM)和RNase H buffer(终浓度为0.5×)，然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，最后在37℃下保持5min。
(8)电泳检测
环状双链DNA模板的制备结果、转录结果和ShortCut RNase III的酶切结果用8％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶进行表征，用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测转录产物与短DNA链的杂交结果。再用Image Lab软件分析电泳结果。
图4为实验结果。图4A为M4H的序列设计示意图，模板总长为109bp，其中错配区域的序列本身不对称且含有4个错配碱基；图4B为M4H在75℃下制备的结果；图4C为用M4H制备单链RNA的结果以及ShortCut RNase III对转录产物的酶切验证结果。图中的标注“T”表示体系中仅有T7 RNAP；标注“RT”表示T7 RNAP和RNase H共存；标注“S”指ShortCut RNaseIII酶切。结果表明当转录体系中仅有T7 RNAP时，转录产物大多为堵在胶孔处的多聚串联重复序列，还有少量弥散于泳道上方；当T7 RNAP和RNase H共存于转录体系时，转录产物多分布于泳道中，胶孔中聚集地较少；ShortCut RNase III的酶切产物呈弥散状。根据该酶的酶切特性(其可将长双链RNA酶切成18-25bp的短双链RNA)，转录产物很有可能为单链RNA或者双链RNA和单链RNA的混合物，其具有各种复杂的二级结构，不乏该酶可识别并发挥作用的稳定双链区，因而ShortCut RNase III作用后的产物为各种长度的单、双链RNA，在电泳时弥散分布于泳道；由图4D可知，将转录产物与LA或LC4的一部分(LA-a/C4-a)杂交时，仅LA-a作用后转录产物在泳道中的分布状态发生了变化，且体系中LA-a的量明显减少，进一步说明M4H的转录产物为我们想要的单链RNA。
实施例2
(1)原料
F-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCTTAGTCATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：9)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-a，SEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′，同Splint A-ab)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，SEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′，同Splint A-ba)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，SEQ ID NO：4)；
G4-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt同C4-a，SEQ ID NO：5)；
G4-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAATAACTTAGAATAATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：10)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-ba，SEQ ID NO：8)；
Aid-DNA-M4L(5′→3′)：
ATTATTCTAAGTTAT(长度为15nt，SEQ ID NO：11)。
环状单链DNA(G4)的制备、环状双链DNA模板M4L的制备及纯化、用M4L制备单链RNA的反应体系及条件、ShortCut RNase III酶切转录产物以判断转录产物为单链，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
(2)当转录体系中T7 RNAP、RNase H和Aid-DNA-M4L共存时的转录体系及条件：
[M4L]＝50nM，[each NTP]＝0.5mM，[T7 RNAP]＝2U/μL，[RNase Inhibitor]＝2U/μL，[RNAP buffer]＝1×，[RNase H]＝0.25U/μL，[Aid-DNA-M4L]＝1μM。在37℃下转录4h，再在70℃下处理10min终止反应。
图5为实验结果，图5A为M4L的序列设计示意图，错配区域长度为12bp，错配区域的序列本身不对称且含有4个错配碱基。5B-5C的分析方法同实施例一，此处不再赘述。由5C的结果可知M4L的转录产物也为单链RNA；5D的结果表明，在短Aid-DNA链(Aid-DNA-M4L)的辅助下，RNase H对串联重复产物实现了高效截断(见泳道4，生成的产物单元集中于泳道中的一个小区域)，说明本发明所提出的‘转录-产物截断’一步进行的单链RNA生产方法实操性强，可用于实际生产。
实施例3
(1)原料
C-HHRz-A链(5′→3′)：
CCTGGATTCCACTGCATAACTTAGAATAATGCAGGTACAT(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：12)；
C-HHRz-B链(5′→3′)：
CCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGT(5′-磷酸化，长度为44nt，SEQID NO：13)；
Splint C-HHRz-AB(5′→3′)：
TCAGCTGGATGTACCT(长度为16nt，SEQ ID NO：14)；
Splint C-HHRz-BA(5′→3′)：
AATCCAGGACGCACCG(长度为16nt，SEQ ID NO：15)；
T-HHRz-A链(5′→3′)：
AGCGCGTTTCGTCCTATTTGGGACT(5′-磷酸化，长度为25nt，SEQ ID NO：16)；
T-HHRz-B(5′→3′)：
CATCAGCTGGATGTACCTGCACTACTCTTAGTCATGCAGTGGAATCCAGGACGCACCGA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：17)；
Aid-DNA-HHRz(5′→3′)：
ACTACTCTTAGTCAT(长度为15nt，SEQ ID NO：18)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(C-HHRz)的制备、环状双链DNA模板HHRz的制备及纯化、用HHRz制备单链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。
图6A为HHRz的序列设计示意图，错配区域长度为12bp，其中含4个错配碱基，错配区域的序列本身不对称。图6B为实验结果，由于本实施例中由双环模板HHRz编码的目的RNA为自切割性核酶，所以转录结束后泳道中的产物为固定长度的产物单体；DNA链的命名中的“C”和“T”分别为“coding”和“template”的缩写，代表编码链和模板链。可以看到只有T-HHRz-A与转录产物杂交后产物条带出现了上移，且其几乎全被消耗(起码在泳道中不可见)，因此我们判定HHRz的转录产物为目的单链RNA。
实施例4
(1)原料
C-SM-HHRz链(5′→3′)：
GAAACGCGCTTATAACTTAGAATAATGCAGGTACATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGAC(5′-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：19)；
Splint C-SM-HHRz(5′→3′)：
CGCGTTTCGTCCTATT(长度为16nt，SEQ ID NO：20)；
T-SM-HHRz链(5′→3′)：
AGCTGGATGTACCTGCACTACTCTTAGTCATAAGCGCGTTTCGTCCTATTTGGGACTCATC(5′-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：21)；
Splint T-SM-HHRz(5′→3′)：
ATCCAGCTGATGAGTC(长度为16nt，SEQ ID NO：22)；
Aid-DNA-SM-HHRz(同Aid-DNA-HHRz，5′→3′)：
ACTACTCTTAGTCAT(长度为15nt，SEQ ID NO：18)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(SM-T-HHRz)的制备、环状双链DNA模板SM-HHRz的制备及纯化、用SM-HHRz制备单链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。
图7A为SM-HHRz的序列设计示意图，错配区域长度为12bp，其中含4个错配碱基，错配区域的序列本身不对称。图7B为实验结果，可以看到只有T-SM-HHRz与转录产物杂交后产物在泳道中的分布状态出现了变化，且其被大量消耗，说明转录产物也为单链RNA，表明本方法具有良好通用性。
实施例5
(1)原料
F-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCTTAGTCATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：9)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-a，SEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，同Splint A-ab，SEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，同Splint A-ba，SEQ ID NO：4)；
G4-1-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a链，SEQ ID NO：5)；
G4-1-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAATAAGTTAAAATTATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：23)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-ba，SEQ ID NO：8)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)；
H2C(5′→3′)：
CTTGGTCCTTCATTCCAC(长度为18nt，SEQ ID NO：25)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(G4-1)的制备、环状双链DNA模板M4L-1的制备及纯化、用M4L-1制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。若反应体系中有H2D或H2C辅助时其浓度为10μM，以保证RNase H充分酶切单链RNA转录产物。
图8A为环状双链DNA模板M4L和M4L-1的错配比较示意图，与M4L相比M4L-1的错配碱基数增加至7个，错配区域的长度为12bp保持不变，错配率为58.3％。
图8B为实验结果，可以看到当转录体系中有H2D存在时，泳道中有短链产物出现；与此同时，当体系中无H2D或H2C存在时，泳道中也有短链产物出现(集中在一个区域)。我们分析这两种转录产物分别是单链RNA和双链RNA。说明错配区域处的错配数不宜过多，否则转录产物中不仅含有单链RNA，还混杂着双链RNA副产物。
实施例6
(1)原料
F-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCTTAGTCATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：9)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-aSEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，同Splint A-ab，SEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，同Splint A-baSEQ ID NO：4)；
G4-2-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a链，SEQ ID NO：5)；
G4-2-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAATATGATTATAATATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：26)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-baSEQ ID NO：8)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)；
H2C(5′→3′)：
CTTGGTCCTTCATTCCAC(长度为18nt，SEQ ID NO：25)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(G4-2)的制备、环状双链DNA模板M4L-2的制备及纯化、用M4L-2制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。若反应体系中有H2D/H2C辅助时其浓度为10μM，以保证RNase H充分酶切单链RNA转录产物。
图9A为环状双链DNA模板M4L和M4L-2的错配比较示意图，与M4L相比M4L-2的错配碱基数增加至12个，为完全错配。图9B为实验结果，可以看到当错配区域处的错配比例为100％时，会造成RNA聚合酶的双向转录。
实施例7
(1)原料
F-3-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCTTAGAAATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：27)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-aSEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，同Splint A-abSEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，同Splint A-baSEQ ID NO：4)；
G4-3-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a链，SEQ ID NO：5)；
G4-3-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAATCTCTTAGAATAATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：28)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-baSEQ ID NO：8)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)；
H2C(5′→3′)：
CTTGGTCCTTCATTCCAC(长度为18nt，SEQ ID NO：25)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(G4-3)的制备、环状双链DNA模板M4L-3的制备及纯化、用M4L-3制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。若反应体系中有H2D/H2C辅助时其浓度为10μM，以保证RNase H充分酶切单链RNA转录产物。
图10A为环状双链DNA模板M4L-3和M4L的错配区域比较示意图，与M4L相比，M4L-3的错配碱基数保持不变，但降低了错配序列的不对称性，M4L的不对称性为83.3％，M4L-3的不对称性为50％。不对称性的计算方法为：非回文序列长度与序列总长的比值。以M4L为例，其错配区域总长为12bp，回文序列占2bp，非回文序列占10bp，故不对称性为(10/12)％，为83.3％。
图10B为实验结果，可以看到在H2C的作用下泳道中仅有很少量的短链产物出现，大部分产物都堵在胶孔处，说明大部分产物为双链RNA。也就是说错配区域处的序列不对称性要足够强才能保证聚合酶在转录时具有较高偏好性(产生单链RNA)。
实施例8
(1)原料
F-4-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCGTTTAAATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：29)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-a，SEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，同Splint A-ab，SEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，同Splint A-baSEQ ID NO：4)；
G4-4-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a链，SEQ ID NO：5)；
G4-4-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAATCTAATCGAATAATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：30)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-baSEQ ID NO：8)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)；
H2C(5′→3′)：
CTTGGTCCTTCATTCCAC(长度为18nt，SEQ ID NO：25)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(G4-4)的制备、环状双链DNA模板M4L-4的制备及纯化、用M4L-4制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。若反应体系中有H2D/H2C辅助时其浓度为10μM，以保证RNase H充分酶切单链RNA转录产物。
图11A为环状双链DNA模板M4L-4和M4L的错配区域的比较示意图，M4L-4的错配碱基数保持不变，但降低了错配序列的不对称性，M4L的不对称性为83.3％，M4L-4的不对称性为25％。图11B为实验结果，其与图10B类似。进一步说明错配区域处的序列不对称性不宜过低，否则转录产物中双链RNA副产物占绝大多数。
实施例9
(1)原料
Lα-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：31)；
Lα-b链(5′→3′)：
GAATTAATACGACTCACTATAGGTTCCCTCCTGATGAGTCGTGAGACGAAACACTTTGA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：32)；
Splintα-ab(5′→3′)：
ATTTGAATTCTTATAAAGCA(长度为20nt，SEQ ID NO：33)；
Splintα-ba(5′→3′)：
TTCCACCGGATCAAAGTGTT(长度为20nt，SEQ ID NO：34)；
Lβ-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a，SEQ ID NO：5)；
Lβ-b链(5′→3′)：
TCAAAGTGTTTCGTCTCACGACTCATCAGGAGGGAACTTGAGGAGAGCCATTTGAATTC
(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：35)；
Splintβ-ab(5′→3′)：
TGCTTTATAAGAATTCAAAT(长度为20nt，SEQ ID NO：36)；
Splintβ-ba(5′→3′)：
AACACTTTGATCCGGTGGAA(长度为20nt，SEQ ID NO：37)；
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(C-β)的制备、环状双链DNA模板M4L-5的制备及纯化、用M4L-5制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。
图12A为环状双链DNA模板M4L-5中错配区域的序列设计示意图，错配区域长度为19bp，其中含9个错配。图12B为实验结果，说明转录产物也为单链RNA，表明本方法具有良好通用性。
实施例10
(1)原料
Lα-a-1链(5′→3′)：
GACGAAACACTTTGATCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGT(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：38)；
Lα-b-1链(5′→3′)：
CTCATTGCTTTATAAGAATTAATAGAACTCTCTATAGGCTTCTTACTGATGAGTCGTGA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：39)；
Splintα-ab-1(5′→3′)：
GTTTCGTCTCACGACT(长度为16nt，SEQ ID NO：40)；
Splintα-ba-1(5′→3′)：
GCAATGAGACTGATTT(长度为16nt，SEQ ID NO：41)；
Lβ-a-1链(5′→3′)：
ACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGATCAAAGTGTTTCGTC(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：42)；
Lβ-b-1链(5′→3′)：
TCACGACTCATCAGGAGGGAAACTGCAGAGAGTTCTCAGAATTCTTATAAAGCAATGAG(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：43)；
Splintβ-ab-1(5′→3′)：
AGTCGTGAGACGAAAC(长度为16nt，SEQ ID NO：44)；
Splintβ-ba-1(5′→3′)：
AAATCAGTCTCATTGC(长度为16nt，SEQ ID NO：45)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)；
H2C(5′→3′)：
CTTGGTCCTTCATTCCAC(长度为18nt，SEQ ID NO：25)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(C-α-1)的制备、环状双链DNA模板M4L-6的制备及纯化、用M4L-6制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。
图13A为环状双链DNA模板M4L-6中错配区域的序列设计示意图，错配区域长度为19bp，其中含6个错配。图13B为实验结果，说明转录产物也为单链RNA，表明本方法具有良好通用性。
实施例11
(1)原料
LA-a链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，SEQ ID NO：1)；
LA-b链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：2)；
LA-b-1链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：46)；
Splint A-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，SEQ ID NO：3)；
Splint A-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，SEQ ID NO：4)；
B15-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a，SEQ ID NO：5)；
B15-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATACCGTCACAGTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：47)；
Splint B15-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint B15-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-ba，SEQ ID NO：8)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(B15)的制备、环状双链DNA模板B15-OMe的制备及纯化、用B15-OMe制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。电泳表征用的是10％PAGE。
图14A为环状双链DNA模板B15-OMe中错配区域的序列设计示意图，错配区域长度为15bp，全为错配，含2个2′-OMe修饰的核糖核苷酸。图14B和图14C为实验结果，可以看到错配区域不含甲氧基修饰时转录产物与单链DNA(模板链或编码链的一部分)杂交后转录产物在泳道中的分布状态未发生变化，并且单链DNA未被消耗(图14B)，说明此时转录产物为双链，也就是说错配区域为连续错配时不能保证单向转录；而当在错配区域引入两个2′-甲氧基修饰的核糖核苷酸，以增加模板链和编码链在此处的差异性后，转录产物与L-B15杂交后其在泳道中的分布状态发生了明显变化(呈弥散状)，且L-B15被明显消耗(图14C)，说明此时转录产物为单链RNA(由L-B15编码)。
实施例12
(1)原料
F-a链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAACTACTCTTAGTCATTGTAGAACCGAATTTGTGCAG(5′-磷酸化，长度为48nt，SEQ ID NO：9)；
F-b链(5′→3′)：
ACTCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为61nt，同LA-a，SEQ ID NO：1)；
Splint F-ab(5′→3′)：
AGCTGGTTGTTTATAAAGCA(长度为20nt，同Splint A-ab，SEQ ID NO：3)；
Splint F-ba(5′→3′)：
ACCGGAGTCTGCACAA(长度为16nt，同Splint A-ba，SEQ ID NO：4)；
G4-5-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a链，SEQ ID NO：5)；
G4-5-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACAGCGAAGCAGAATAATTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：48)；
Splint G4-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint G4-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-ba，SEQ ID NO：8)；
H2D(5′→3′)：
GTGGAATGAAGGACCAAG(长度为18nt，SEQ ID NO：24)。
环状单链DNA(G4-5)的制备、环状双链DNA模板M4L-Hairpin的制备及纯化、用M4L-Hairpin制备单链RNA的反应体系以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。
图15A为环状双链DNA模板M4L-Hairpin中错配区域的序列设计示意图，错配区域长度为15bp，其中含有7个错配碱基，可形成一个茎长为2bp，环部大小为3nt的小发卡。图15B为实验结果，可以看到在短Aid-DNA链(H2D)的辅助下，RNase H对串联重复产物实现了高效截断，生成的产物单元集中于泳道中的一个小区域，说明在错配区域引入小发卡等二级机构来增加模板链和编码链之间的差异有助于迫使T7 RNAP进行单向转录，并且证明本发明所提出的‘转录-产物截断’一步进行的单链RNA生产方法实用性强。
实施例13
(1)原料
L-reduce 7A-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，同Lα-a，SEQ ID NO：31)；
L-reduce 7A-b链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGAACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：49)；
L-reduce 7A-b-1链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAAGACACTGCCATACCCTGTAGACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为49nt，SEQ ID NO：50)；
Splint-reduce 7A-ab(5′→3′)：
CCACCGGAGTCTGCAC(长度为16nt，SEQ ID NO：51)；
Splint-reduce 7A-ba(5′→3′)：
CTGGTTGTTTATAAAG(长度为16nt，SEQ ID NO：52)；
B5-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C4-a，SEQ ID NO：5)；
B5-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCCATTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：53)；
Splint B5-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，同Splint C4-ab，SEQ ID NO：7)；
Splint B5-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，同Splint C4-ba，SEQ ID NO：8)。
(2)制备方法及结果
环状单链DNA(B5)的制备、环状双链DNA模板B5-reduce 7A的制备及纯化、用B5-reduce 7A制备单链RNA的反应体系及条件以及电泳检测制备结果的条件同实施例1和实施例2，此处不再赘述。电泳表征用的是10％PAGE。
图16A为环状双链DNA模板B5-reduce 7A中错配区域的序列设计示意图，错配区域长度为5bp，全为错配，bubble下游编码链的第7位去掉了一个碱基A，这样在模板链的对应位置就凸出了一个碱基，目的是阻止聚合酶结合在此处，并阻止聚合酶在滑移时顺利通过此处，以防止反向转录的发生，从而保证单向转录。图16B和图16C为实验结果，可以看到当错配区域为连续错配时转录产物与单链DNA(模板链或编码链的一部分)杂交后转录产物在泳道中的分布状态未发生变化，并且单链DNA未被消耗(图16B)，说明此时转录产物为双链，进一步说明错配区域为连续错配时不能控制单向转录；而当在错配区域下游的编码链上加上或者去掉部分碱基，以增加模板链和编码链在此处的差异性，进而增加聚合酶结合在此处的难度后(也增加了聚合酶滑移通过此处的难度)，转录产物与L-B5-a杂交后其在泳道中的分布状态发生了明显变化(弥散在整个泳道上部)，且L-B5-a被明显消耗(图16C)，说明此时转录产物为单链RNA(由L-B5编码)。
综上，本发明所述方法可在不依赖启动子的情况下实现对转录方向的控制，通过‘转录’与‘产物截断’一步进行的方式可实现单链RNA的高效制备，具有广阔的应用前景。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备单链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板中不含启动子序列，由错配序列区域和完全互补序列区域两部分以首尾相连构成，所述错配序列区域为含有错配碱基的一段序列，其长度为5-20bp；错配序列区域和/或完全互补序列区域含有不对称序列，不对称分三种情况：①序列本身不对称；②只在非模板链上引入修饰基团；③模板链和非模板链的长度不同，所设计模板须满足至少一种情况；错配序列区域的错配碱基对数占20-100％；将所述环状双链DNA模板中的一条DNA链作为模板链，该模板链转录出的RNA产物含有目的单链RNA的序列；
步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为长度6-20nt的单链DNA，所述Aid-DNA可互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，所述特定部位是指由所述模板链的错配序列区域处转录出的RNA部分；
步骤三，纯化所制备的环状双链DNA模板，以去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；
步骤四，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录和RNase H酶切，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行单向滚环转录，Aid-DNA互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA-RNA双链部分，核糖核酸酶H水解与Aid-DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，从而将含有重复序列的RNA产物进行截断，获得目的单链RNA。
2.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述目的单链RNA的长度为50-2000nt。
3.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的碱基错配数占比为25-60％。
4.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的不对称性为25-100％，所述不对称性为非回文序列长度与错配序列区域总长的比值。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于等于70bp时，采用一段法设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离错配序列区域的边缘大于10nt。
6.根据权利要求5所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板的过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。
7.根据权利要求5所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板的过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4 DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
8.根据权利要求7所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，当使用T4 DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mMMgCl2，10mM DTT，500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1％Triton X-100，pH 7.6@25℃。
9.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，步骤三所述双链环状DNA模板的纯化过程中，用Exo I和Exo III共同酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA。
10.根据权利要求9所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH，pH 9.5@25℃，3.35mM MgCl2，0.5mM DTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl，pH 8.0@30℃，0.33mM MgCl2。
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