CN113774054B - 一种可利用dna连接酶促进分子内环化的最适dna底物及应用 - Google Patents

一种可利用dna连接酶促进分子内环化的最适dna底物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物及应用，属于DNA合成技术领域。通过使用体外选择技术(SELEX)，从一个随机序列的DNA库中，定向进化出针对T4DNA连接酶的最适DNA分子，能够采用结构安排，有利于分子内环化。本发明成功进化出一条最适底物，允许以极高的收率和选择性，在顺式和反式反应中大规模合成DNA环。此外，反式作用的模板有助于构建连锁DNA双环，可作为滚环扩增的自由模板。与传统的检测方法相比，本发明解决了传统成环过程中因没有明显熵差异不可避免得生成线性连接产物等问题，实现了环状核酸得高产率和高特异性制备。

Description

一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物及应用
技术领域
本发明属于DNA合成领域，具体涉及一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物以及两种反式连接模板及应用。
背景技术
环状核酸(CNAs)是指自然产生或人工产生的具有闭环结构的核酸分子。由于其在流动性、稳定性、拓扑结构和功能等方面的独特特点，在分子克隆、疾病治疗、医学诊断、生物传感、生物化学等领域得到了广泛的应用。CNAs也可被一些聚合酶以滚环方式进行复制，推动了滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)和滚环转录(rolling circletranscription,RCT)作为核酸扩增工具的普及。此外，CNAs可以很容易地与功能性核酸(如适配体、DNA酶、核酶和适体核酶)偶联，产生用于生物分析和生物医学应用的功能体系。
合成环状单链(ss)DNA的常用方法是使用连接酶，包括使用T4 DNA连接酶(T4DL)，在配对DNA短链的帮助下，密封ssDNA中3’-羟基和5’-磷酸端之间的缺口。另一种方法是利用其他连接酶(比如，CircLigase)催化具有末端互补性的ssDNA的末端连接。然而，由于不可避免地同时产生线性连接产物(LLP；两个或多个线性DNA分子的连接)。这是因为分子内环化和分子间连接这两种连接反应之间没有显著的熵差异。优化反应条件(如Mg(II)浓度、温度)和DNA序列设计(如茎长)可以在一定程度上提高产量和选择性，但不能从根本上排除分子间连接，通常需要更长的反应时间(长达数小时)。此外，在连接端附近的碱基对必须仔细设计，以减少尺寸、二级结构和拓扑结构对环化的负面影响。然而，基于CNAs的器件要在纳米尺度上显示复杂、可控和复杂的功能，并真正实现其潜力，需要提供高环化产率和选择性的新方法。
发明内容
本发明为了解决现有的技术问题，利用体外筛选技术获得可特异性作用于T4 DNA连接酶的最适DNA底物，其采用更有利于分子内环化而非分子间连接的结构制备单环DNA，提供一种高产率和高选择性生成CNAs的方法，扩大CNAs在化学生物学、诊断、计算和生物传感领域的实际应用。
本发明为解决上述技术问题，提供了一种与T4 DNA连接酶具有高亲和力的最适DNA底物，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一个反式连接DNA模板，可进行单链DNA文库的环化，包括如SEQID NO.25所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一个反式连接DNA模板，可进行互锁DNA双环D2C(DNA[2]catenanes)的制备，包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。
进一步地，上述技术方案中，所述DNA底物的二级结构包含包含一个单链区域(SS1)、三个短双链(P1、P2和P3)、一个关键发夹环(L1)和一个双链间未配对元件(J2/3)，该结构可以进行高效分子内自环化。
进一步地，上述技术方案中，所述随机DNA文库为任一核苷酸序列，包括SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列。
进一步地，上述技术方案中，所述连接模板将上述筛选得到的DNA底物的P1和P2劈开，以及将两端结合臂的双链分别延长一定核苷酸，优选地，延长至12个核苷酸长度，可极大提高单环的产率。
优选地，将两端结合臂的双链分别延长的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.29和SEQID NO.30所示。
进一步地，上述技术方案中，将SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的两端引入额外的核苷酸，用于增加连接模板的柔性以及形成环状连接模板，可极大提高互锁双环的产率。
优选地，SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的两端引入额外的核苷酸分别如SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32所示。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸D2C可以作为环状模板同时进行滚环扩增反应。
本发明还提供了所述的DNA底物在DNA分子内环化中的应用。
本发明还提供了所述的连接模板在DNA单环和/或互锁双环中的应用。
本发明还提供了所述的连接模板作为环状模板在进行滚环扩增反应中的应用。
所述连接模板可以进行高产率和高选择性的分子内自环化，仅伴随产生极少的线性连接产物。
所述对应环状核酸可以作为RCA扩增模板，扩增速率大约是其复制筛选所用文库(SEQ ID NO.6)速率的2.5倍。
所述DNA底物或连接模板均特异地作用于T4 DNA连接酶，所述DNA底物与T4 DNA连接酶解离常数Kd为300±21nM,与Taq DNA连接酶解离常数Kd为1268±300nM；作为对照，非特异性序列序列(SEQ ID NO.21)与上述两种连接酶的解离常数Kd分别为和550±38nM和630±32nM。
所述连接模板中存在交叉配对“气泡”区域，减弱了互锁作用对phi29DP的限制，可以作为环状模板同时进行滚环扩增反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明经筛选获得了与T4 DNA连接酶具有高亲和力的最适DNA底物，利用其独特的二级结构，设计了两种反式连接模板用于形成CNAs，包括单环和互锁双环。该方法可以有效避免传统方法使用配对短序列的辅助或者其他连接酶(比如，CircLigase)进行连接时产生的线性连接产物，实现对CNAs的高产率和高选择性得制备，在顺式和反式反应中大规模合成DNA环。此外，反式作用的模板有助于构建连锁DNA双环，可作为滚环扩增的自由模板。该方法制备文库单环时，产率和选择性分别可达93％和96％，制备互锁DNA双环时，产率和选择性分别可达90％和92％(连接反应时间均为10min)。与传统的检测方法相比，本发明解决了传统成环过程中因没有明显熵差异不可避免得生成线性连接产物等问题，实现了环状核酸得高产率和高特异性制备。
附图说明
图1为本发明中T4 DNA连接酶的最适底物的筛选策略图。
图2为实施例2所述DNA底物Dsub1的程序预测二级结构图。
图3为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的分子内连接特性测试图；图中，a为Dsub1自环化(针对T4DL)，b为通过模板辅助的Dsub1环化(针对T4DL)，c为Dsub1自环化(针对TaqDL)。
图4为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的结构优化示意图。
图5为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的P1突变。
图6为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的L1-P2突变。
图7为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的SS1-J2/3突变。
图8为实施例3所制备的DNA底物Dsub1-I突变。
图9为实施例3所制备的DNA底物RCA动力学分析。
图10为实施例3所制备的DNA底物Dsub1的亲和力分析。
图11为通过实施例4获得的的反式连接模板Dsub1.T1的文库环化特性；图中，a为Dsub1.T1介导的环化连接示意图，b为时间依赖的DL2连接结果。
图12为通过实施例4获得的的反式连接模板Dsub1.T2的文库环化特性；图中，a为Dsub1.T2介导的环化连接示意图，b为时间依赖的D2C的连接，c为双环D2C的RCA琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，实施例包括最适DNA最适底物的筛选、文库和双环的反式连接等。
表1：本发明中使用的核酸序列
Figure GDA0004164602840000061
Figure GDA0004164602840000071
Figure GDA0004164602840000081
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的RCA缓冲液(10×)：330mM Tris乙酸盐，100mM醋酸镁，660mM醋酸钾，1％ Tween-20，10mM DTT，pH 7.9。
下述实施例中的T4 DNA连接缓冲液(10×)：400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mMDTT，5mM ATP，PH 7.8。
实施例的具体实施步骤如下：
实施例1利用SELEX和高通量测序技术筛选与T4 DNA连接酶具有高亲和力的最适DNA底物，并设计两种反式连接模板的技术路线
(1)特异性识别T4 DNA连接酶的最适底物的体外筛选；(2)最优DNA底物Dsub1的表征。测试最适底物分子内自环化特性，与连接酶的结合能力，分析介导高效分子内自环化的关键碱基，以优化其结构；(3)基于最适底物独特的二级结构，设计了两种反式连接模板，分析其形成单环文库和互锁双环的能力。
实施例2可利用T4 DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物的体外筛选
针对T4 DNA连接酶的最适底物的筛选的具体步骤(图1)，包括蛋白连接底物筛选，RCA扩增以及消解等详细过程，具体操作如下：
(1)筛选：在1.5mL灭菌EP管中加入100μL含10μM DNA文库1和包含ATP的T4 DNA连接酶工作缓冲液，95℃5min变性，冷却至室温后加入T4 DNA连接酶后孵育1h，得环状DNA分子(CTA)。
(2)RCA和消解：步骤(1)所得环状DNA分子(CTA)经标准乙醇沉淀，10％dPAGE纯化后进行滚环扩增反应(RCA)。具体反应条件：50μL RCA缓冲液(包含CTA、5μL 20μM LT1、5μL2.5μMdNTP)，90℃加热5分钟后，冷却至RT 10分钟。随后加入1μL Phi29DNA聚合酶(Phi29DP，10U/L)，30℃孵育5h。最后将混合物65℃加热10分钟，使Phi29DP失活。在上述混合物中加入10μL100μMLT1，10μL10×消解缓冲液，25μL ddH2O，90℃加热5分钟，冷却到RT后加入5μL EcoRV(最终体积:100μL)。反应混合物37℃孵育过夜，90℃灭活10分钟。RCA单体产物经标准乙醇沉淀，10％dPAGE纯化。
(3)步骤(2)回收所得单体DNA，进行环化反应:50μL单体DNA、2μL 100μM LT2、10μLT4 DNA连接酶缓冲液以及33μLddH2O混合后,90℃加热2分钟,室温冷却10分钟加入5μLT4DL(5U/μL)。RT孵育1小时后，得到的CTB分子经标准乙醇沉淀，10％dPAGE纯化。
(4)步骤(3)回收所得CTB用于第二次RCA反应。反应条件与第一个RCA相同，只是将LT1替换为LT2。RCA后的酶切用LT1代替LT2。
(5)重复步骤(1)～(4)至第14轮筛选。
(6)MiSeq(Illumina)测序平台对200pmol第14轮筛选得到的RCA扩增产物进行深度测序。
分析测序结果中占比第一序列的二级机构(通过Mfold程序(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form))，Dsub1的序列如SEQ ID NO.1所示。
预测结果如图2所示，该序列的二级结构包含一个单链区域(SS1)、三个短双链(P1、P2和P3)、一个关键发夹环(L1)和一个双链间未配对元件(J2/3)。。
表2：本发明中通过深度测序获得的出现频率最高的前5条Dapt核酸序列
Figure GDA0004164602840000101
Figure GDA0004164602840000111
实施例3最优DNA底物Dsub1的表征
(1)分析针对T4 DNA连接酶(T4DL)和Taq DNA连接酶(TaqDL)
底物Dsub1的分子内自环化特性
2μL 2μM Dsub1在20μL 1×T4 DNA连接酶缓冲液中90℃变性5分钟，RT冷却10分钟后，1U T4DL加入，RT分别孵育10,30,60,300，600s。反应混合物90℃加热10分钟后，对其进行10％dPAGE分析。
针对TaqDL的分子内的自环化反应类似上述反应，除了以下两点:1)分子内的环化反应在1×Taq DNA连接酶缓冲液中进行；2)反应温度为45℃。
图3a和3b显示针对T4DL，Dsub1在10分钟内单环产物和选择性分别为90％和97％；针对TaqDL，Dsub1在10分钟内单环产物和选择性分别为7％和70％。
(2)分析针对T4DL的DS1辅助下Dsub1的分子内环化特性
2μL 2μM Dsub1,和6μL 2μM DS1在20μL 1×T4 DNA连接酶缓冲液中90℃变性5分钟，RT冷却10分钟后，1U T4DL加入，RT分别孵育10,30,60,300，600s。反应混合物90℃加热10分钟后，对其进行10％dPAGE分析。
图3c显示针对T4DL，Dsub1在10分钟内单环产物和选择性分别为39％和59％；
(3)连接底物Dsub1的碱基突变分析
对于假设的P1，针对G6-C17、A7-T16、C8-G15三个碱基对，改变顺序和替换成A-T碱基对；对于假定的L1-P2：从G32到T41依次5个核苷酸的突变成AAAAA；对于推测的SS1-J2/3:G53、T55以及G54依次突变成A；C47、T49以及C50突变成A。Dsub1-I突变为采用SS1和J2/3之间的强配对双链。
对于假设的P1(图5)：碱基对含量是重要的；对于假定的L1-P2(图6)：G32-T41核苷酸的突变导致了环化产率的显著损失；对于推测的SS1-J2/3(图7)：连接处的核苷酸应该是完全配对的，有4个核苷酸(C47,T49,C50和G53)是高度保守的；图8表明：当Dsub1-I突变为采用SS1和J2/3之间的强双链配对时，产率显著降低。
(4)RCA反应动力学
1)DNA合成反应
1μL 0.4μM环状CDsub1或CDL1与1μL 100μM LT1、5μL 10×RCA缓冲液、5μL 2.5mMdNTPs和10U Phi29DP混合，总体积为50μL。该混合物在30℃下孵育10、30、60、300和600s，然后在90℃下加热10分钟使Phi2DP失活。
2)消解
1μL以上的混合物混合5μL 100μM LT2,2μL 10×快速消化缓冲和9μLddH2O,在90℃加热5分钟,在RT冷却10分钟后，3μL EcoRV(15U/μL)加入,在37℃反应18h。
3)消解产物分析
20μL的酶切产物与20μL 2×dPAGE上样缓冲液混合。然后将混合物置于10％dPAGE凝胶上，用1×SYBRgold荧光染料在4℃下染色10分钟，然后成像。
4)DNA产物长度的计算
使用Image Quant软件估算每个消解混合物中单体DNA带(F72nt)和IC带(F64nt)的荧光强度，并使用FR＝F72nt/F64nt计算荧光比率(FR)。由此，我们可以计算单体DNA的总量:N72nt＝FR×1pmol×50，其中50为体积校正因子。产物长度可以用:(N72nt×72nt)/0.4pmol来估计，其中72nt为单体长度，0.4pmol为CDsub1或CDL1的量。
图9显示通过测定最终RP长度作为时间的函数，我们计算出phi29DP复制CDsub1的速率为1.12±0.03kb min-1，大约是其复制CDL1速率(0.44±0.032kb min-1)的2.5倍。
(4)亲和力分析
结合反应在100μL DNA连接酶缓冲液(40mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10mM DTT,pH7.8)中进行，缓冲液中含有5nM 3’FAM标记的Dsub1和不同浓度的T4DL或TaqDL。RT孵育30分钟后，在激发波长485nm和发射波长520nm的条件下，用酶标仪测量荧光各向异性值。
图10显示T4DL与Dsub1的结合亲和力明显较好，Kd为300±21nM，而与突变Dsub1(MDsub1,L1和J2/3的核苷酸突变为A)的结合亲和力较差，Kd为1268±300nM。作为对照，Dsub1和MDsub1的TaqDL显示出相似的Kd值(分别为550±38nM和630±32nM)。
实施例4构建反式连接模板用于文库单环和互锁双环的制备
(1)反式连接模板的构建
将筛选所得Dsub1的P1和P2上的环断开并将待配对序列延长至左右各12个碱基，得到反式连接模板Dsub1.T1；在Dsub1.T1的基础上两端引入额外的核苷酸，用于增加连接模板的柔性以及形成环状反式连接模板(CDsub1.T2)。
(2)Dsub1.T1介导的文库2DL2的环化
在典型实验中，3μL的1μM Dsub1.T1和1μL 1μM DL2在20μL 1×T4 DNA连接酶缓冲液(pH值7.8)中90℃ 5分钟，RT 10分钟后加入1U T4DL分别孵育10s，30s，60s，300s和600s。在90℃加热10分钟后，反应混合物用15％dPAGE进行分析。
图11显示针对T4DL，Dsub1 10分钟单环产物和选择性分别为93％和96％；
(3)CDsub1.T2介导的D2C的形成
3μL的1μM CDsub1.T2和1μL 1μM LsDNA在20μL 1×T4 DNA连接酶缓冲液(pH值7.8)中90℃ 5分钟，RT 10分钟后加入1U T4DL分别孵育10s，30s，60s，300s和600s。在90℃加热10分钟后，反应混合物用15％dPAGE进行分析。
图12b显示针对T4DL，Dsub1 10分钟单环产物和选择性分别为90％和92％。
(4)基于互锁双环DNA[2]catenanes(D2C)的RCA反应
在一个典型的实验,5μL(10×RCA缓冲液,1μL Phi29DP(10U/μL)5μL的2.5mMdNTP,5μL 3μM D2C-i D2C-ii或D2C-iii，1μL 100μMDP1，DP2或两者(总体积:50μL)混合，90℃加热5分钟，RT冷却10分后加入1Μl phi29DP，30℃反应1h。通过0.6％琼脂糖凝胶电泳分析由此产生的扩增产物。
图12c显示针对T4DL，Dsub1 10分钟单环产物和选择性分别为93％和96％。
SEQUENCE LISTING
<110>  大连理工大学
<120>  一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物及应用
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<213>  Dsub5
<400>  5
atctcgacta gtcaggtgag gagggtactc gaggaacgtc aagtctggtt ggtatatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  6
<211>  72
<212>  DNA
<213>  DL1
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(55)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  6
atctcgacta gtcagnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  7
<211>  49
<212>  DNA
<213>  DL2
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (18)..(37)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  7
atctcgacta gtctcagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncgc gattcggat              49
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  LT1
<400>  8
tagtcgagat atccgagaca                                              20
<210>  9
<211>  20
<212>  DNA
<213>  LT2
<400>  9
tgtctcggat atctcgacta                                              20
<210>  10
<211>  20
<212>  DNA
<213>  DS1
<400>  10
tagtcgagat atccgagaca                                              20
<210>  11
<211>  24
<212>  DNA
<213>  DS3
<400>  11
ttttcagatg atatcaggtc gagt                                         24
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  DP
<400>  12
gactagtcga gatatccgaa t                                            21
<210>  13
<211>  16
<212>  DNA
<213>  DP1
<400>  13
aagtgagata tcccaa                                                  16
<210>  14
<211>  24
<212>  DNA
<213>  DP2
<400>  14
ttttcagatg atatcaggtc gagt                                         24
<210>  15
<211>  72
<212>  DNA
<213>  MDsub1
<400>  15
atctcgacta gtcagtctcc ccagctaaaa aaaaaaaaag ttggggaaaa aaaaaatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  16
<211>  72
<212>  DNA
<213>  SS1-J2/3.M1
<400>  16
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc taggaatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  17
<211>  72
<212>  DNA
<213>  SS1-J2/3.M2
<400>  17
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc taagtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  18
<211>  72
<212>  DNA
<213>  SS1-J2/3.M3
<400>  18
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagggag ttggggaaaa taggtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  19
<211>  72
<212>  DNA
<213>  SS1-J2/3.M4
<400>  19
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc tagatatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  20
<211>  72
<212>  DNA
<213>  Dsub1-I
<400>  20
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc gagatatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  21
<211>  72
<212>  DNA
<213>  P1.M1
<400>  21
atctctttta gtcaaaatcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc taggtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  22
<211>  72
<212>  DNA
<213>  P1.M2
<400>  22
atctccgata gtcatcgtcc ccagctttgt cgccagggag ttggggcatc taggtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  23
<211>  72
<212>  DNA
<213>  L1-P2.M1
<400>  23
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt cgccagaaaa atggggcatc taggtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  24
<211>  72
<212>  DNA
<213>  L1-P2.M2
<400>  24
atctcgacta gtcagtctcc ccagctttgt caaaaaggag ttggggcatc taggtatccg  60
aatgtctcgg at                                                      72
<210>  25
<211>  62
<212>  DNA
<213>  Dsub1.T1
<400>  25
ctgagactag tctccccagc tttgtcgcca gggagttggg gcatctagat atccgaatcg  60
cg                                                                 62
<210>  26
<211>  102
<212>  DNA
<213>  Dsub1.T2
<400>  26
atcatctgaa aaaaaaaaac tgagactagt ctccccagct ttgtcgccag ggagttgggg  60
catctagata tccgaatcgc gaaaaaaaaa actcgacctg at                    102
<210>  27
<211>  49
<212>  DNA
<213>  LsDNA
<400>  27
atctcgacta gtctcagcct tgggatatct cacttatcgc gattcggat              49
<210>  28
<211>  64
<212>  DNA
<213>  IC
<400>  28
ggcgaagaca ggtgcttagt cgaaagatac ctgggggagt attgcggagg aaggttcaga  60
tatc                                                               64
<210>  29
<211>  12
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<400>  29
ctgagactag tc                                                      12
<210>  30
<211>  12
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<400>  30
atccgaatcg cg                                                      12
<210>  31
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<400>  31
atcatctgaa aaaaaaaaa                                               19
<210>  32
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列（Artificial Sequence）
<400>  32
aaaaaaaaaa ctcgacctga t                                            21

Claims (10)

1. 一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的DNA底物，其特征在于，所述DNA底物为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的DNA底物，其特征在于，所述DNA底物的二级结构包含一个单链区域SS1、三个短双链P1、P2和P3、一个关键发夹环L1和一个双链间未配对元件J2/3。
3.一种可利用DNA连接酶对随机DNA文库进行反式连接制备单环的连接模板，其特征在于，所述连接模板为如SEQ ID NO:25所示的核苷酸；
所述随机DNA文库为SEQ ID NO:7所示的核苷酸。
4.一种可利用DNA连接酶与随机DNA文库进行反式连接制备互锁双环的连接模板，其特征在于，所述连接模板为如SEQ ID NO:26所示的核苷酸；
所述随机DNA文库为SEQ ID NO:7所示的核苷酸。
5.根据权利要求3所述的连接模板，其特征在于，所述连接模板是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的P1和P2劈开，以及将两端结合臂的双链分别延长一定核苷酸；
将两端结合臂的双链分别延长的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示。
6.根据权利要求4所述的连接模板，其特征在于，所述连接模板是将如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的两端引入额外的核苷酸；
SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的两端引入额外的核苷酸分别如SEQ ID NO:31和SEQID NO:32所示。
7.权利要求1-2中任一项所述的DNA底物在DNA分子内环化中的应用。
8.权利要求3或5所述的连接模板在制备DNA单环中的应用。
9.权利要求4或6所述的连接模板在制备DNA互锁双环中的应用。
10.权利要求4所述的连接模板作为环状模板在进行滚环扩增反应中的应用。
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