CN110305860A - 体外筛选环状核酸适配体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种体外筛选环状核酸适配体的方法，包括以下步骤：将环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，获得待筛选的环状DNA分子文库；将待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育；分离并收集筛选后的环状DNA分子文库；进行滚环扩增反应，酶切，形成第一组链状单体；进行自连接，形成环状DNA分子，进行分离和纯化，获得与筛选后环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库；进行滚环扩增反应，进行酶切，形成第二组链状单体；自连接，形成环状DNA分子，分离和纯化，获得扩增的环状DNA分子文库；重复进行步骤S1～S7。该方法能制备高稳定性、高特异性和高亲和力的环状核酸适配体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种体外筛选环状核酸适配体的方法。
背景技术
核酸适配体是一类可以与靶标高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA分子。核酸适配体通常通过指数富集的系统配体进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)体外筛选获得。
SELEX技术的基本步骤包括：体外化学合成一个随机的单链寡核苷酸分子库，该单链寡核苷酸分子库一般包括1012-1016个不同的DNA或RNA分子。将单链寡核苷酸分子库与特定的靶标混合在一定的筛选压力下，分离并收集与靶标结合的核酸分子；以此核酸分子为模板进行PCR扩增，进行下一轮的筛选。经过数轮筛选，能够与靶标结合的核酸分子得到富集，而没有此功能的核酸分子被淘汰。通过这种“试管进化”的方法得到的核酸分子与抗体类似，具备与靶标特异性结合的功能，在药物开发、药物递送、靶向治疗、医疗检测以及诊断等方向有着良好的应用前景。
然而，核酸适配体在生物医疗领域的应用也面临着诸多挑战，其中非常重要的一点即作为核酸类物质，核酸适配体在复杂生物体系(例如血液、生物体内)易被核酸酶降解，未经修饰的核酸适配体在全血中的半衰期不超过2分钟。因此，提高核酸适配体抵抗核酸酶降解的能力，即生物稳定性，对其在生物医疗领域的实际应用至关重要。
目前，通常提高核酸适配体抵抗核酸酶降解的能力的做法是对核酸适配体进行化学修饰。然而，经过化学修饰的核酸适配体生物相容性较差，给核酸适配体在生物医疗领域的应用造成严重阻碍。
由于绝大多数生物体内的核酸酶是以核酸分子端点的外切效应为主，而环状核酸可以巧妙的移除核酸分子的端点，使其在复杂生物体系中的稳定性得到极大的增强。环状核酸适配体不仅可以在复杂生物体系中保持高稳定性，并且具有良好的生物相容性。
发明内容
本发明的目的是提供一种不受核酸酶外切效应影响的体外筛选环状核酸适配体的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种体外筛选环状核酸适配体的方法，所述方法包括以下步骤：
S1.将环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，去除吸附在磁珠上的非特异性环状DNA分子，获得待筛选的环状DNA分子文库；
S2.将步骤S1获得的所述待筛选的环状DNA分子文库与表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育；
S3.分离并收集步骤S2中与所述磁珠结合的环状DNA分子，得到筛后环状DNA分子文库；
S4.以步骤S3收集的所述筛后环状DNA分子文库为模板进行第一次滚环扩增(RCA)反应，之后将所述第一次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第一组链状单体；
S5.将所述第一组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得与筛选后的环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库；
S6.以S5得到的环状DNA分子文库为模板进行第二次滚环扩增反应，之后将所述第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第二组链状单体；
S7.将所述第二组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得筛选后扩增的环状DNA分子文库；
S8.针对步骤S7得到的环状DNA分子文库重复进行步骤S1～S7。
具体地，重复进行步骤S1～S7的次数为2～15次。
更具体地，重复进行步骤S1～S7的次数为7次。
具体地，步骤S8还包括：步骤S1～S7重复进行2～15以后，对所述第二组链状单体进行扩增和测序，并且对所述测序结果进行分析。
更具体地，所述方法还包括：根据所述测序结果的分析，选取富集含量排名靠前的环状DNA分子文库进行实验验证分析。
具体地，在步骤S1中，所述环状DNA分子文库中的每个环状DNA分子的核酸序列中均设计有限制性内切酶的酶切位点。
具体地，在步骤S2中，所述靶标分子为凝血酶；所述生物体系为血清、血浆、全血、细胞液或组织。
更具体地，步骤S4中的第一次滚环扩增反应和步骤S6中的第二次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶均为phi29DNA聚合酶。
更具体地，在步骤S4中，利用限制性内切酶对第一次滚环扩增反应的产物进行酶切，限制性内切酶识别第一次滚环扩增反应的产物的酶切位点，再通过优化酶切的时间，使得产物所有的酶切位点均被切断；在步骤S6中，利用限制性内切酶对第二次滚环扩增反应的产物进行酶切，同样地，第二次滚环扩增反应的产物的酶切位点，再通过优化酶切的时间，使得产物所有的酶切位点均被切断。
更具体地，在步骤S5中，通过控制第一组链状单体在自连接体系中的浓度，以减少链状单体之间发生连接；在步骤S7中，通过控制第二组链状单体在自连接体系中的浓度，以减少链状单体之间发生连接。
更具体地，步骤S5中的所述分离和步骤S7中的所述分离均由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实现。
具体地，步骤S1中的环状DNA分子文库1012～1016个随机序列的DNA分子。
具体地，在步骤S2中，所述靶标分子所在的生物体系的体积为所述待筛选的环状DNA分子文库和所述表面修饰有靶标分子的磁珠的体积之和的5％-90％。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法，利用环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，获得待筛选的环状DNA分子文库，减少步骤S2中与磁珠本身非特异性结合的环状DNA分子；将待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育，使步骤S3获得筛后环状DNA分子文库在后期实际应用的时候保持原有的最佳构型和生物学功能，并且增加环状核酸适配体的选择性，利用滚环扩增技术、限制性内切技术以及单链DNA分子环化技术，对待筛选的环状DNA分子文库进行高效富集，有效避免利用PCR进行扩增时发生的序列选择性扩增而引起的序列富集偏差。此外，利用本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法制备的环状核酸适配体具有高稳定性、高特异性、以及高亲和力。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法，通过SELEX技术直接筛选得到环状核酸适配体，可以充分保证环状核酸适配体与靶标分子结合高亲和力、高特异性和高稳定性的结合。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法能够在复杂生物体系中对环状核酸适配体进行筛选，从而获得高质量的与预设靶标分子特异性结合的环状核酸适配体。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明提供一种体外筛选环状核酸适配体的方法。该方法包括以下步骤：
S1.将环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，去除非特异性吸附在磁珠上的环状DNA分子，获得待筛选的环状DNA分子文库。
S2.将步骤S1获得的所述待筛选的环状DNA分子文库与表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育。
S3.分离并收集步骤S2中与所述磁珠结合的环状DNA分子，得到筛后环状DNA分子文库。
S4.以步骤S3收集的所述筛后环状DNA分子文库为模板进行第一次滚环扩增(RCA)反应，之后将所述第一次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第一组链状单体。
S5.将所述第一组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得与筛选后的环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库。
S6.以S5得到的环状DNA分子文库为模板进行第二次滚环扩增反应，之后将所述第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第二组链状单体；
S7.将所述第二组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得筛选后扩增的环状DNA分子文库；
S8.针对步骤S7得到的环状DNA分子文库重复进行步骤S1～S7。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法，利用环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，获得待筛选的环状DNA分子文库，减少步骤S2中与磁珠本身非特异性结合的环状DNA分子；将待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育，使步骤S3获得筛后环状DNA分子文库在后期实际应用的时候保持原有的最佳构型和生物学功能，并且增加环状核酸适配体的选择性，利用滚环扩增技术、限制性内切技术以及单链DNA分子环化技术，对待筛选的环状DNA分子文库进行高效富集，有效避免利用PCR进行扩增时发生的序列选择性扩增而引起的序列富集偏差。此外，利用本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法制备的环状核酸适配体具有高稳定性、高特异性、以及高亲和力。
在步骤S1中，环状DNA分子文库包括1012～1016个随机序列的DNA分子。该环状DNA分子文库的构建过程大致为，首先通过DNA固相合成仪合成链状的单链DNA序列，这些DNA序列由中间的随机序列(30-50个随机的碱基)以及两端的固定序列组成(15-20个碱基)，其中固定序列用于链状DNA的环化，同时也是滚环扩增引物区和限制性内切区，通过将这些链状的DNA分子进行环化并纯化，进而形成环状DNA分子文库。在步骤S1中，磁珠的浓度约为108个/mL。
在步骤S2中，靶标分子为蛋白分子，蛋白分子可以为凝血酶、甲胎蛋白、或癌胚胎抗原等，生物体系为血清、血浆、全血、细胞液或组织；所述靶标分子所在的生物体系的体积为所述待筛选的环状DNA分子文库和所述表面修饰有靶标分子的磁珠的体积之和的5％-90％，可由靶标分子所在的生物体系确定。
通常重复进行步骤S1～S7的次数可以为2～15次，优选为5～10次，更优选为7次，即可获得高亲和力、高特异性和高稳定性的环状核酸适配体。
在本发明中，步骤S6还包括：步骤S1～S7重复进行2～15次以后，对所述第二组链状单体进行扩增和测序，并且对所述测序结果进行分析。对所述第二组链状单体进行测序的目的是为了分析获得富集含量高的环状核酸适配体，即与靶标分子具有高亲和力和特异性结合的环状核酸适配体。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法还包括：根据所述测序结果的分析，选取富集含量排名靠前的环状DNA分子文库进行实验验证分析，例如对富集含量排名在前5～20位的环状DNA分子文库进行实验验证分析。通过该步骤对获得的环状核酸适配体进行验证，确保该方法的可靠性。
本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法可用于筛选靶标分子为凝血酶的环状核酸适配体；凝血酶来自于血清、血浆、全血、细胞液或组织。很显然地，本发明提供的体外筛选环状核酸适配体的方法也可用于筛选其他靶标分子的环状核酸适配体。
在本发明中，步骤S4中的第一次滚环扩增反应和步骤S6中的第二次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶均可以为phi29DNA聚合酶，利用DNA限制性内切酶对第一次滚环扩增反应和第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切。
在本发明中，在步骤S4中，利用限制性内切酶，例如EcoRV对第一次滚环扩增反应的产物进行酶切，限制性内切酶识别第一次滚环扩增反应的产物的限制性酶切位点，再通过优化酶切的时间，使得产物所有的酶切位点均被切断。在步骤S6中，利用限制性内切酶对第二次滚环扩增反应的产物进行酶切，同样地，第二次滚环扩增反应的产物的酶切位点，再通过优化酶切的时间，使得产物所有的酶切位点均被切断。
在本发明中，在步骤S5中，通过控制第一组链状单体在自连接体系中的浓度，以减少链状单体之间发生连接；在步骤S7中，通过控制第二组链状单体在自连接体系中的浓度，以减少链状单体之间发生连接。自连接体系包括，DNA连接酶，优选为T4DNA连接酶。
步骤S5中的所述第一次分离和步骤S7中的所述第二次分离均由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实现。
实施例1
本实施例提供一种体外筛选环状核酸适配体的方法。该方法包括以下步骤：
S1.将环状DNA分子文库，其中包含1012～1016个随机序列的DNA分子)与磁珠(108个磁珠每毫升)共同孵育，去除非特异性吸附在磁珠上的环状DNA分子，获得待筛选的环状DNA分子文库。
S2.将步骤S1获得的所述待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育。
S3.分离并收集步骤S2中与所述磁珠结合的环状DNA分子，得到筛后环状DNA分子文库。
S4.以步骤S3收集的所述筛后环状DNA分子文库为模板进行第一次滚环扩增(RCA)反应，第一次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，之后将所述第一次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第一组链状单体，即与筛选得到的DNA分子互补的序列。
S5.将所述第一组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得与筛选后的环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库。
S6.以S5得到的环状DNA分子文库为模板进行第二次滚环扩增反应，第二次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，之后将所述第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第二组链状单体，即筛选得到的环状DNA分子文库经过扩增以后对应的线性DNA分子。
S7.将所述第二组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得筛选后扩增的环状DNA分子文库。
S8.针对步骤S7得到的环状DNA分子文库重复进行步骤S1～S7。
S9.在步骤S1～S7重复进行2～15次以后，对所述第二组链状单体进行扩增和测序，并且对所述测序结果进行分析，选取富集含量排名位于前5位的环状DNA分子文库进行实验验证分析。
实施例2
本实施例提供一种体外筛选环状核酸适配体的方法。该方法包括以下步骤：
S1.将环状DNA分子文库，其中随机序列的长度为40个碱基，包含1015个随机序列的DNA分子，与磁珠(108个磁珠每毫升)共同孵育，去除非特异性吸附在磁珠上的环状DNA分子，获得待筛选的环状DNA分子文库。
S2.将步骤S1获得的所述待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有人源α-凝血酶的磁珠、人源α-凝血酶所在血清共同孵育，血清与待筛选的环状DNA分子文库和表面修饰有人源α-凝血酶的磁珠。
S3.分离并收集步骤S2中与所述磁珠特异性结合的环状DNA分子，得到筛后环状DNA分子文库。
S4.以步骤S3收集的所述筛后环状DNA分子文库为模板进行第一次滚环扩增(RCA)反应，第一次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，之后利用限制性内切酶EcoRV在所述第一次滚环扩增反应的产物限制性内切区域进行限制性酶切，形成第一组链状单体，即与筛选得到的DNA分子互补的序列。
S5.将所述第一组链状单体进行自连接，利用一条与链状单体的3′端和5′端互补的序列以及T4DNA连接酶使第一组链状单体进行自连接形成环状DNA分子，之后利用变性聚丙乙烯酰胺凝胶进行分离和纯化，获得与筛选后的环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库。
S6.以S5得到的环状DNA分子文库为模板进行第二次滚环扩增反应，第二次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，之后利用限制性内切酶EcoRV将所述第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第二组链状单体，即筛选得到的环状DNA分子文库经过扩增以后对应的线性DNA分子。
S7.将所述第二组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得筛选后扩增的环状DNA分子文库。
S8.针对步骤S7得到的环状DNA分子文库重复进行步骤S1～S7。
S9.在步骤S1～S7重复进行7次以后，对所述第二组链状单体进行扩增和测序，并且对所述测序结果进行分析，选取富集含量排名位于前5位的环状DNA分子文库进行实验验证分析。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种体外筛选环状核酸适配体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1.将环状DNA分子文库与磁珠共同孵育，去除非特异性吸附在磁珠上的环状DNA分子，获得待筛选的环状DNA分子文库；
S2.将步骤S1获得的所述待筛选的环状DNA分子文库、表面修饰有靶标分子的磁珠、以及所述靶标分子所在的生物体系共同孵育；
S3.分离并收集步骤S2中与所述磁珠结合的环状DNA分子，得到筛后环状DNA分子文库；
S4.以步骤S3收集的所述筛后环状DNA分子文库为模板进行第一次滚环扩增反应，之后将所述第一次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第一组链状单体；
S5.将所述第一组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得与筛选后的环状DNA分子文库互补的环状DNA分子文库；
S6.以S5得到的环状DNA分子文库为模板进行第二次滚环扩增反应，之后将所述第二次滚环扩增反应的产物进行限制性酶切，形成第二组链状单体；
S7.将所述第二组链状单体进行自连接，形成环状DNA分子，之后进行分离和纯化，获得筛选后扩增的环状DNA分子文库；
S8.针对步骤S7得到的环状DNA分子文库重复进行步骤S1～S7。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重复进行步骤S1～S7的次数为2～15次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S8还包括：步骤S1～S7重复进行2～15次以后，对所述第二组链状单体进行扩增和测序，并且对所述测序结果进行分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：根据对所述测序结果的分析，选取富集含量排名靠前的环状DNA分子文库进行实验验证。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述环状DNA分子文库中的每个环状DNA分子的核酸序列中均设计有限制性内切酶的酶切位点。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述靶标分子为凝血酶；所述生物体系为血清、血浆、全血、细胞液或组织。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中的第一次滚环扩增反应和步骤S6中的第二次滚环扩增反应所使用的DNA聚合酶均为phi29 DNA聚合酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中的所述分离和步骤S7中的所述分离均采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中的环状DNA分子文库1012～1016个随机序列的DNA分子。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述靶标分子所在的生物体系的体积为所述待筛选的环状DNA分子文库和所述表面修饰有靶标分子的磁珠的体积之和的5％-90％。
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