CN113913419A - 二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用 - Google Patents

二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用。该方法通过在两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应可以快速的将两条DNA单链连接起来，反应过程无需模板链，只需在DPBS缓冲液和室温下就可进行。并且不需要粘性末端进行碱基互补配对，所以对于短链DNA也是适用的，适用范围更广。此方法很好的克服了通过DNA连接酶的方法构建二价环形结构的不足。

Description

二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及核酸适体及其制备技术领域，特别是涉及一种二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用。
背景技术
核酸适体是通过体外过程SELEX(通过指数富集的配体系统进化)产生的核酸探针，它可以折叠成不同的三级结构来特异性识别一组靶标。因此，适体作为分子探针在癌症的诊断和治疗中受到了广泛的关注。但是天然的核酸容易受到生物介质，尤其是血清的影响很快被降解，这限制了核酸适体在体内的应用。为了提高适体在生物介质中的稳定性，采取了一系列的方法，比如对适体进行化学修饰，选择后修饰和SELEX筛选修饰的寡核苷酸文库是化学修饰产生耐核酸酶适体的传统方法，但是这种修饰会影响适体的特异性和亲和力。
此外，还可通过T4连接酶将两条适体连接起来形成环状适体，以此来增加适体的抗酶切能力，但是这种方法只能连接含有粘性末端的发卡结构，并且不适用短链的发卡结构。如专利CN110354268A-一种核酸适体及其环形二价核酸适体-药物的偶联系统与应用中所提到的利用DNA连接酶的方法构建。该方法需要使用具有特定分子结构的发卡型核酸适体，此外需要具有碱基互补配对的颈环，因为在一定的碱基互补配对作用下，才可以提供足够的力将发夹固定在一起，除此之外还要再末端延伸出一段序列跟另一条核酸适体延伸出的序列形成碱基互补配对。在DNA链满足结构的要求后，加入DNA连接酶的缓冲液，在酶的作用下将两条链连接在一起形成二价环形结构。这种方法具有一定的局限性，它只能用于具有发卡结构的核酸适体的二价环形结构的构建，并且需要延伸出一段粘性末端，而且由于结构特殊性，对于较短的DNA单链不能通过此方法构建二价环形结构。
发明内容
基于以上技术的缺点，本发明的首要目的在于提供一种化学连接方法来形成二价环状DNA链的制备方法，以解决现有技术存在的问题。
二价环状DNA链的制备方法：两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应将两条DNA单链连接起来形成二价环状DNA链；两条DNA单链的序列相同或者不同；每条DNA单链的3’和5’端修饰的基团相同，且能够与另一条DNA单链修饰的基团至少发生下述的任一反应：
叠氮基团和二苯基环辛炔基团的点击化学反应；
叠氮基团和环辛炔基基团的点击化学反应；
叠氮基团和炔基基团的点击化学反应；
马来酰亚胺基基团和呋喃基团的加成反应；
NHS酯基基团和氨基基团的取代反应；
硫代磷酸基团和氯乙酰基基团的SN2反应；
氨基基团和羧基基团的缩合反应。
具体包括：
(1)一条3’和5’端均修饰叠氮基团(-N3)的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰二苯基环辛炔基团(-DBCO)的DNA单链发生点击化学反应；
(2)一条3’和5’端均修饰叠氮基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰环辛炔基基团的DNA单链发生点击化学反应；
(3)一条3’和5’端均修饰叠氮基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰炔基基团的DNA单链发生点击化学反应；
(4)一条3’和5’端均修饰马来酰亚胺基基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰呋喃基团的DNA单链发生加成反应；
(5)一条3’和5’端均修饰NHS酯基基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰氨基基团的DNA单链发生取代反应；
(6)一条3’和5’端均修饰硫代磷酸基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰氯乙酰基基团的DNA单链发生SN2反应；
(7)一条3’和5’端均修饰氨基基团的DNA单链，与另一条3’和5’端均修饰羧基基团的DNA单链发生缩合反应。
所述的制备方法，DNA单链的长度10个碱基-75个碱基。
所述的制备方法，发生反应的两种DNA单链浓度均为2.5μM～50μM；优选2.5μM～10μM。
所述的制备方法，用DPBS做溶剂时，反应温度为-25℃～30℃，优选-20℃～25℃；用水做溶剂时，反应温度为-22～-18℃。
所述的制备方法，反应时间0.5-24h，优选1h-24h。
本发明的第二个目的是提供上述方法制备的二价环状DNA链。
本发明的第三个目的是提供一种二价环状核酸适体。
所述的二价环状核酸适体，由上述的方法制备而成，两条DNA单链均选自以下核酸适体中的任一种，或者两条DNA单链选自以下不同核酸适体中任两种：Sgc8：ATCTAACTGCTGCG CCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA；见SEQ ID NO.1所示；
XQ-2d：ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC；见SEQID NO.2所示；
TD05：AGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTC TCCTCCT；见SEQ ID NO.3所示；
LD201t1：TAGCCAAGGTAACCAGTACAAGGTGCTAAACGTAATG GCTTCGGCTTAC；见SEQ IDNO.4所示；
TE02：TAGGCAGTGGTTTGACGTCCGCATGTTGGGAATAGCCACG CCT，见SEQ ID NO.5所示；。
Sgc8靶向CCRF-CEM细胞(人急性淋巴白血病细胞)、XQ-2d靶向K562细胞(人慢性髓原白血病细胞)、TD05和TE02靶向Ramos细胞(人B淋巴细胞瘤细胞)、LD201t1靶向Jurkat细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞)。
10nt：CGTTAGACGA；见SEQ ID NO.6所示；
20nt：GGTCTCCATGTGTAGAAGAC；见SEQ ID NO.7所示；
50nt：CATGCATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATGCA；见SEQ ID NO.8所示；
75nt：ATGCATAGCATGAGTTCAGTCGTAGTAATGGTCCTTAGTCTTGCTTGGTGTTTCCTGATGGCTCTCATGCTATGC，见SEQ ID NO.9所示。
10nt、20nt、50nt、75nt是指DNA单链的长度分别为10个碱基、20个碱基、50个碱基、75个碱基的随机序列DNA单链，可以验证本发明方法可以适用于不同长度的DNA单链。
例如：可以采用如下组合构建：
(1)
N3-Sgc8-N3：N3-ATCTAACTGCTGCG CCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-N3；
DBCO-Sgc8-DBCO：DBCO-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-DBCO；
(2)
N3-XQ-2d-N3：N3-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-N3；
DBCO-XQ-2d-DBCO：DBCO-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-DBCO；
(3)
N3-TD05-N3：N3-AGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTC TCCTCCT-N3；DBCO-TD05-DBCO：DBCO-AGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCT-DBCO；
(4)N3-LD201t1-N3：
N3-TAGCCAAGGTAACCAGTACAAGGTGCTAAACGTAATG GCTTCGGCTTAC-N3；
DBCO-LD201t1-DBCO：DBCO-TAGCCAAGGTAACCAGTACAAGGTGCTAAACGTAATG GCTTCGGCTTAC-DBCO；
(5)
N3-TE02-N3：N3-TAGGCAGTGGTTTGACGTCCGCATGTTGGGAATAGCCACGCCT-N3；
DBCO-TE02-DBCO：DBCO-TAGGCAGTGGTTTGACGTCCGCATGTTGGGAATAGCCACGCCT-DBCO；
(6)
N3-10 nt-N3：N3-CGTTAGACGA-N3；
DBCO-10nt-DBCO：DBCO-CGTTAGACGA-DBCO；
(7)
N3-20 nt-N3：N3-GGTCTCCATGTGTAGAAGAC-N3；
DBCO-20nt-DBCO：DBCO-GGTCTCCATGTGTAGAAGAC-DBCO；
(8)
N3-50 nt-N3：N3-CATGCATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATGCA-N3；
DBCO-50nt-DBCO：DBCO-CATGCATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATGCA-DBCO；
(9)
N3-75 nt-N3：N3-ATGCATAGCATGAGTTCAGTCGTAGTAATGGTCCTTAGTCTTGCTTGGTGTTTCCTGATGGCTCTCATGCTATGC-N3；
DBCO-75nt-DBCO：DBCO-ATGCATAGCATGAGTTCAGTCGTAGTAATGGTCCTTAGTCT TGCTTGGTGTTTCCTGATGGCTCTCATGCTATGC-DBCO。
还可以是上述任意两种DNA单链组合构建，包括，如：Sgc8+XQ-2d、TD05+LD201t1、Sgc8+LD201t1。
修饰基团连接具体哪一条DNA单链也可以是随机的，只需要保证，每条DNA链的3’和5’端修饰的基团是一样的，且能够与另一条DNA链修饰的基团发生前述的任一反应，反应后能够获得二价环状DNA链。
两条核酸适体组合构建的结构称为二价环状核酸适体，非核酸适体组合构建的结构称为二价环状DNA链。
本发明第四个目的是提供了上述的方法制备而成的二价环状核酸适体的应用，靶向结合一种以上的靶标。
所述的应用，靶向识别病灶靶标并结合T细胞或者药物进行治疗。
本发明还提供了上述方法制备而成的二价环状核酸适体的应用，用于制备靶向一种以上的靶标的制剂。
基于现有技术的局限性，本发明开发了一种无需粘性末端，并且可以用于短链DNA二价环形结构的构建方法。该方法通过在两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应可以快速的将两条DNA单链连接起来，反应过程无需模板链，只需在DPBS缓冲液和室温下就可进行。并且不需要粘性末端进行碱基互补配对，所以对于短链DNA也是适用的，适用范围更广。所以此方法很好的克服了通过DNA连接酶的方法构建二价环形DNA结构的不足。
环形核酸具有遗传信息载体、序列互补的碱基配对能力、增强抗外切酶降解的生物稳定性、改进的热力学稳定性、独特的拓扑结构、可调节的刚度和高效的滚动循环复制等优点，因此在分子克隆、疾病治疗和诊断、纳米生物技术、microRNA调控和工程特殊纳米尺度学科方面具有广泛的应用。此外，环形功能核酸可以很容易地与滚环扩增(RCA)结合进行信号扩增，用于DNA、RNA、蛋白质、小分子甚至细胞的检测，RCA还可用于合成多价分子支架，用于诊断、细胞成像工具和治疗。
附图说明
图1为本发明方法反应原理示意图。
图2为本发明实施例1的溶剂、温度、时间与反应效率关系图。
(a)-20℃时在水和DPBS溶剂中Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
(b)-10℃时在水和DPBS溶剂中Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
(c)0℃时在水和DPBS溶剂中Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
(d)15℃时在水和DPBS溶剂中Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
(e)25℃时在水和DPBS溶剂中Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
(f)反应物浓度为5μM，DPBS作为溶剂，不同反应温度和反应时间Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的产率结果图。
图3为本发明实施例1中反应物浓度与反应效率关系图。
图3.1(a)DPBS作为溶剂，反应温度25℃，反应物浓度50μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.1(b)DPBS作为溶剂，反应温度25℃，反应物浓度20μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.1(c)DPBS作为溶剂，反应温度25℃，反应物浓度10μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.1(d)DPBS作为溶剂，反应温度25℃，反应物浓度2.5μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.2(a)DPBS作为溶剂，反应温度-20℃，反应物浓度50μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.2(b)DPBS作为溶剂，反应温度-20℃，反应物浓度20μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.2(c)DPBS作为溶剂，反应温度-20℃，反应物浓度10μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.2(d)DPBS作为溶剂，反应温度-20℃，反应物浓度2.5μM，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的电泳结果图；
图3.3(a)DPBS作为溶剂，反应温度25℃，不同反应物浓度，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的产率结果图；
图3.3(b)DPBS作为溶剂，反应温度-20℃，不同反应物浓度，不同反应时间，Sgc8和XQ-2d构建的二价环状核酸适体的产率结果图。
图4为本发明实施例1中方法的普适性验证。
图4(a)表示3’和5’端分别标记叠氮基团和3’和5’端分别标记DBCO基团的DNA单链10nt,20nt,50nt,75nt分别在-20℃和25℃条件反应；
图4(b)表示3’和5’端分别标记叠氮基团和3’和5’端分别标记DBCO基团的核酸适体Sgc8,XQ-2d,TD05,LD201t1,TE02分别在-20℃和25℃条件反应；
从左至右每条泳道分别表示：S1:Marker；S2:N3-DNA-N3；S3:DBCO-DNA-DBCO；S4:反应后的混合液。
图5为本发明实施例1中对二价环状DNA结构的验证；
图5中从左至右每条泳道为S1-S5。
图6为质谱表征实施例1制备的各种二价环状DNA。
图7为本发明实施例2中二价环状DNA结构的稳定性示意图；
图7(a)为在10％FBS中测定的稳定性，
图7(b)为在0.25U/μL Exo I中测定的稳定性。
图8为本发明实施例2中二价环状DNA结构与靶标的亲和力示意图。
图9为本发明实施例2中二价环状DNA结构在体内的性能示意图。
图10为本发明实施例2中二价环状DNA结构的应用示意图。
上述附图2和3中提及的反应物浓度均为每种DNA单链在反应体系中的浓度。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
首先选用通过SELEX筛选出来的Sgc8和XQ-2d两条核酸适体对反应条件进行确定，先研究了反应溶剂，温度以及时间对反应效率的影响。
将3’,5’端修饰叠氮基团的Sgc8(100μM,0.5μl)和3’,5’端修饰DBCO基团的XQ-2d(100μM,0.5μl)加入到DPBS溶液(9μl)或者水溶液(9μl)中，使得每种核酸适体链的最终浓度为5μM，然后用涡旋仪混合均匀，分别配制5份在-20℃，-10℃，0℃，15℃，25℃下进行反应，在指定的时间段分别放入新配制的混合液进行反应，最终得到在1h，2h，4h，8h，12h，24h，在-20℃，-10℃，0℃，15℃，25℃温度下，在DPBS溶液或者水溶液中不同的反应产物。反应结果用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，1×TAE，110V，40min)进行验证。实验结果表明，在水溶液中只有温度为-20℃时才会发生反应；其他温度下几乎没有产物生成；但是用DPBS做溶剂时，反应在5种温度下都可以进行，并且产率基本都在80％以上，对于反应时间，1小时就可以达到较高的收率，随着时间延长到24小时，产率提升不大。实验结果如图2所示。
随后验证了反应物浓度对反应效率的影响。每种DNA单链反应物的浓度分别设置为2.5μM，5μM，10μM，20μM，50μM进行验证。将修饰叠氮基团的Sgc8(100μM)和修饰DBCO基团的XQ-2d(100μM)加入到DPBS溶液中，分别配成每种DNA单链反应物浓度为2.5μM，5μM，10μM，20μM，50μM的混合液各10μl，然后分别在25℃和-20℃下反应24h，反应结果用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，1×TAE，110V，40min)进行验证。结果表明，当每种DNA单链反应物浓度为5μM时，反应产率最高，在25℃和-20℃是可分别达到85％，90％。实验结果如图3所示。
在确定反应条件后验证了该方法的普适性，选择了不同碱基个数的DNA单链以及不同的核酸适体进行实验，结果表明此方法可以很好的将两条DNA单链连接起来形成二价环状结构，即使对于只有10个碱基长度的短链也可以达到很高的连接效率。实验结果如图4所示。
然后对形成的二价结构是线性的还是环状的进行了验证。首先将通过反应得到的二价结构进行纯化，得到纯净的二价结构，然后分别与两端修饰叠氮基团的DNA单链以及两端修饰DBCO的DNA单链在相同条件进行反应，若能够继续发生反应，说明二价结构的两端还有能进行反应的叠氮基团或者DBCO基团，则形成的二价结构是线性的；若不能够继续发生反应，说明二价结构的两端没有能够进行反应的基团，则形成的是二价结构是环状的。实验结果如图5所示。此外，对产物也进行了质谱表征。实验结果如图6所示。
实施例2
在确定得到的是二价环状结构后，对二价环状核酸适体的性质进行了研究。首先探究了通过此方法构建的二价环状核酸适体在生物介质中的稳定性。将cy3标记的2μM单链适体与cy3标记的2μM二价环状适体在含有10％FBS的RPMI1640中或者0.25U/μl Exo I中孵育，在指定的时间点将样品在95℃加热5min，使酶变性，然后放在-20℃保存，直到所有的样品都收集完，再将样品融化进行电泳验证其稳定性(8％PAGE，1×TAE，110V，40min)。电泳结果表明，图7(a)中，对于在10％FBS中，单链核酸适体基本上都在8小时左右被降解，甚至时间更短，但是对于二价环状适体在孵育24小时后仍然可以保持稳定，不被降解；图7(b)中，对于在0.25U/μL Exo I中，单链核酸适体基本上都在4小时左右被降解，甚至时间更短，但是对于二价环状适体在孵育24小时后仍然可以保持稳定，不被降解。说明形成环状结构后，核酸适体的稳定性增加了。
然后研究了二价环状适体的亲和力。每个样品取1×105个细胞(CCRF-CEM，K562，Ramos，Jμrkat细胞)用洗涤缓冲液离心洗涤(1000rpm，5min)，然后与250nM cy3标记的单链适体或二价环状适体在200μL的binding buffer中4℃孵育45min，孵育完成后用washingbuffer洗涤两次，收集样品，然后将样品重悬至200μL washing buffer中，用流式细胞仪(BD FACSVerse系统)检测，数据采用Flow Jo软件进行分析。实验结果表明，二价环状适体的结合能力要强于单链适体，如图8所示。
在细胞中验证了二价环状适体的结合能力之后，探究了它能否增强在体内的性能，系统地比较了cy5标记的二价环状适体(cb-Sgc8+XQ-2d)，cy5标记的两条适体单纯的混合(Sgc8+XQ-2d)和cy5标记的对照链(Lib)在CCRF-CEM肿瘤体内的性能，cy5标记的cb-Sgc8+XQ-2d，Sgc8+XQ-2d，lib链由尾静脉注射到CCRF-CEM荷瘤BALB/c-nude小鼠体内，注射1h后在肿瘤部位可见到明显的荧光，随着时间的延长到8h，lib链在肿瘤部位的荧光全部消失，到10h时，Sgc8+XQ-2d在肿瘤部位的荧光也几乎消失，但是cb-Sgc8+XQ-2d在10h时仍然显示出荧光，随后将小鼠解剖，可以明显的看到cb-Sgc8+XQ-2d在肿瘤部位的富集。说明二价环状适体可以更好的识别，富集，保留在肿瘤部位，二价环状适体性能的提高是由于提高了其在血清中的稳定性和对靶细胞更好的结合亲和力。实验结果如图9所示。
此外，还利用这种技术构建了环状双特异性适体，同一个环状结构中的两个单元分别靶向不同的靶标。设计了可分别靶向癌细胞和T细胞的两条适体形成的二价环状适体，通过同时靶向癌细胞和T细胞，可辅助T细胞识别癌细胞，并形成细胞-细胞复合物，然后在肿瘤部位原位激活T细胞来攻击癌细胞，从而实现“先识别再治疗”的T细胞靶向的免疫治疗。先将20万Ramos(或CCRF-CEM)细胞和20万Jurkat细胞分别用Hoechst和Calcein AM进行染色，用DPBS洗涤两次后混在一起，混合均匀后分别与1μM的cb-Lib+Lib和cb-TD05+LD201t1(或cb-Sgc8+LD201t1)在200μL的binding buffer中4℃孵育1h，孵育完成后用washing buffer洗涤两次，收集样品，然后将样品重悬至200μL washing buffer中，用流式细胞仪(BD FACSVerse系统)检测。此外，用Calcein AM对Jurkat细胞进行染色，然后与未染色的Ramos(或CCRF-CEM)按照1:5数量比混合，混合均匀后分别与1μM的cb-lib+Lib和cb-TD05+LD201t1(或cb-Sgc8+LD201t1)在200μL的binding buffer中4℃孵育1h，通过激光共聚焦显微镜进行成像。实验结果如图10所示。
在CCRF-CEM和Jurkat混合细胞中加入cb-Lib+Lib进行孵育后，没有观察两种细胞的连接复合物，但是相比之下加入cb-Sgc8+LD201t1进行孵育后，可以明显的观察到CCRF-CEM和Jurkat两种细胞的连接复合物；同样的在Ramos和Jurkat混合细胞中也观察到同样的结果，加入cb-TD05+LD201t1进行孵育后，可以明显的观察到Ramos和Jurkat两种细胞的连接复合物，但是加入cb-Lib+Lib进行孵育后，并没有观察到两种细胞的连接复合物。以上结果说明，通过将分别靶向癌细胞和T细胞的核酸适体构建成二价环形适体，可以实现将癌细胞与T细胞的空间距离拉近，进而实现原位激活。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点，而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 二价环状DNA链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaggatag ttcggtggct gttcagggtc tcctcct 37
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagccaaggt aaccagtaca aggtgctaaa cgtaatggct tcggcttac 49
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taggcagtgg tttgacgtcc gcatgttggg aatagccacg cct 43
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgttagacga 10
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtctccatg tgtagaagac 20
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catgcatcta actgctgcgc cgccgggaaa atactgtacg gttagatgca 50
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcatagca tgagttcagt cgtagtaatg gtccttagtc ttgcttggtg tttcctgatg 60
gctctcatgc tatgc 75

Claims (10)

1.二价环状DNA链的制备方法，其特征在于，两条DNA单链的两端分别修饰基团，然后通过化学反应将两条DNA单链连接起来形成二价环状DNA链；两条DNA单链的序列相同或者不同；每条DNA单链的3’和5’端修饰的基团相同，且能够与另一条DNA单链修饰的基团至少发生下述的任一反应：
叠氮基团和二苯基环辛炔基团的点击化学反应；
叠氮基团和环辛炔基基团的点击化学反应；
叠氮基团和炔基基团的点击化学反应；
马来酰亚胺基基团和呋喃基团的加成反应；
NHS酯基基团和氨基基团的取代反应；
硫代磷酸基团和氯乙酰基基团的SN2反应；
氨基基团和羧基基团的缩合反应。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，DNA单链的长度为10个碱基-75个碱基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发生反应的两种DNA单链浓度均为2.5μM～50μM；优选2.5μM～10μM。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，用DPBS做溶剂时，反应温度为-25℃～30℃，优选-20℃～25℃；用水做溶剂时，反应温度为-22～-18℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应时间0.5-24h，优选1h-24h。
6.二价环状DNA链，由权利要求1-5任一项所述的方法制备而成。
7.二价环状核酸适体，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法制备而成，两条DNA单链均选自以下核酸适体中的任一种，或者两条DNA单链选自以下不同核酸适体中任两种：
Sgc8：ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA；
XQ-2d：ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATG
GTAGGGTTACTATGAGC；
TD05：AGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCT；
LD201t1：TAGCCAAGGTAACCAGTACAAGGTGCTAAACGTAATG GCTTCGGCTTAC；
TE02：TAGGCAGTGGTTTGACGTCCGCATGTTGGGAATAGCCACG CCT。
8.权利要求7所述的二价环状核酸适体的应用，其特征在于，靶向结合一种以上的靶标。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，靶向识别病灶靶标并结合T细胞或者药物进行治疗。
10.权利要求7所述的二价环状核酸适体的应用，其特征在于，用于制备靶向结合一种以上靶标的制剂。
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