JP2022536907A

JP2022536907A - 連結された標的捕捉

Info

Publication number: JP2022536907A
Application number: JP2021573547A
Authority: JP
Inventors: ペルジョール; マルツィアーリアンドレア
Original assignee: エヌキャンジェノミクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2022-08-22
Also published as: EP3980556A1; US20220228206A1; CN114072522A; EP3980556A4; CA3140171A1; WO2020251968A1

Abstract

本発明は、概して、連結された標的捕捉プローブを使用して、ゲノム編集の効率および特異性を評価することに関する。

Description

関連出願
この出願は、２０１９年６月１０日に出願された米国仮出願第６２／８５９，４８６号の優先権および利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、核酸の捕捉、増幅、および配列決定に関する。

より強力でユーザーフレンドリーなゲノム編集ツールの出現により、遺伝性疾患の治療、病気の根絶、収穫量／耐性の向上、および生物を改変するその他の潜在的な利点の可能性の新しい世界が開かれてきた。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）および関連する酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ［ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｌｉｋｅｎｕｃｌｅａｓｅｓ］（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを含む系は、特定の標的配列でのＤＮＡの二本鎖切断の導入を可能にし、これは、切断点での所望の配列の挿入を含む標的変異を可能にすることができる。

これらのツールの有効性を証明し、一般的な使用への受け入れを促進するために、挿入された配列の組込み率の評価を含め、それらの効率および特異性を評価する必要がある。非特異的な切断および挿入の分析も重要である。

本発明は、前述のゲノム編集ツールのいずれかの組込み率および非特異的効果を評価するための方法を提供する。挿入された二本鎖タグ配列は、成功率を評価するために濃縮および定量化することができる。非特異的な（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）組込みのモニタリングおよび標的上の（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）組込みの定量化の組み合わせは、ゲノム編集系を評価するための強力なツールを提供する。

特定の実施形態では、本発明は、様々なゲノム編集ツールを使用して挿入された二本鎖タグを標的とするプローブを用いた連結された標的捕捉技術の方法を提供する。二本鎖切断を検出するための標的捕捉は、溶液中で、または液滴ベースの方法を使用して行うことができる。ユニバーサルプライマーおよび標的特異的プローブを含む連結された標的捕捉プローブが使用され、ユニバーサルプライマーの結合を可能にするために標的特異的プローブが結合することを必要とする条件下で反応が起こる。分析するゲノム編集法を使用してタグ配列を組込みした後、ユニバーサルプライミング部位を備えたデュプレックスアダプター（ｄｕｐｌｅｘａｄａｐｔｅｒ）を、改変されたＤＮＡの末端にライゲーションすることができる。標的特異的プローブは、タグ配列、二本鎖切断点に隣接するゲノムＤＮＡ配列、またはその両方に相補的であってもよい。この不均一に組込みされた（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ＤＮＡｅＮｒｉｃｈｍｅｎｔ、または本明細書に記載するＨＩＤＮ－Ｓｅｑプロセスにより、タグ配列またはタグおよび隣接する配列の濃縮が可能になり、組込み率に関するデータが提供されるだけでなく、非特異的組込みが識別され、ＤＮＡ編集パフォーマンスの包括的な評価が提供される。タグ配列の濃縮により、望ましくない非特異的な部位を含むすべての組込み部位の測定が可能になり、タグ配列に対してのみ設計されたプローブが使用される。一方、所望の組込み部位の濃縮により、特定の部位での組込み率の測定が可能になり、予想されるゲノムＤＮＡ組込み部位に対して設計されたプローブが使用される。

複数の結合工程が必要なため、従来の単一結合ターゲットキャプチャー（ｓｉｎｇｌｅｂｉｎｄｉｎｇｔａｒｇｅｔｃａｐｔｕｒｅ）技術よりも特異性が向上する。連結されたプローブの結合後、結合したユニバーサルプライマーは、鎖置換ポリメラーゼ（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用して伸長され、標的鎖のコピーを生成する。これは、ユニバーサルプライマーを使用したＰＣＲを使用して増幅することができる。連結された捕捉プローブは、より高い特異性および二重情報が必要なＤＮＡの両方のセンス（ｓｅｎｓｅ）に使用することができる。以下で説明するように、複数のリンカータイプが可能である。本発明の溶液ベースの標的捕捉方法と同様に、液滴でのマルチプレックスＰＣＲに限定されるのではなく、ユーザーが液滴でのＤＮＡ組込み分析のための標的捕捉を行うことを可能にする液滴ベースの方法を提供する。

二本鎖固有分子識別子［ｄｕｐｌｅｘｕｎｉｑｕｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ］（ＵＭＩ）を含むバーコードを使用して、増幅または濃縮された配列にタグ付けし、分析される二本鎖ＤＮＡの開始分子情報とともにセンス情報を保持することができる。したがって、配列決定の結果は、正確な組込み率の評価のために、個々の開始分子に起因する可能性がある。

図１は、二本鎖核酸の連結された標的捕捉の例示的な方法を示す。図２は、連結された標的捕捉核酸の増幅方法を示す。図３Ａおよび３Ｂは、本発明の液滴ベースの標的捕捉方法の工程を示す。図４は、例示的なタグ配列の組込みおよび誘導されたＤＮＡの二本鎖切断を示す。図５は、ＨＩＤＮ－Ｓｅｑおよびタグ配列に特異的な連結された標的捕捉プローブを使用する例示的なオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）発見ワークフローを示す。図６は、ＨＩＤＮ－Ｓｅｑおよびタグ配列および切断点に隣接するゲノムＤＮＡ領域に特異的な連結された標的捕捉プローブを使用する例示的なオフターゲットおよび隣接発見ワークフローを示す。図７は、ＨＩＤＮ－Ｓｅｑおよびタグ配列および切断点に隣接するゲノムＤＮＡ領域に特異的な連結された標的捕捉プローブセットを使用する、例示的な組み合わされたワークフローを示す。図８は、ＨＩＤＮ－Ｓｅｑおよびタグ配列および切断点に隣接するゲノムＤＮＡ領域に特異的な連結された標的捕捉プローブセットを使用し、単一のチューブで実行される、例示的な組み合わされたワークフローを示す。図９は、バーコーディングＰＣＲおよび定量化および配列決定を伴うＨＩＤＮ－Ｓｅｑを使用する例示的なワークフローを示す。図１０は、実施例１の実験的概要を示す。図１１は、実施例１のゼロ、一方、または両方の読み取りにおいて、意図されたタグ配列を含むＳＩ、Ｓ２、およびＳ３クラスターの数および割合を示す。図１２は、ゲノム内の塩基数をプロットしたゲノム全体のＵＭＩカバー度、および実施例１のＳＩ、Ｓ２、およびＳ３グループの最小ＵＭＩカバー度を示す。図１３は、スパイクされたサンプルについてＨＩＤＮ－Ｓｅｑで決定された実施例２のオンターゲットフラクションを示す。

本発明は、概して、特にゲノム編集系の効率および特異性の分析のための、ＤＮＡにおける二本鎖切断の標的化された捕捉および分析のための方法に関する。連結された標的捕捉技術が使用され、ここでユニバーサルプライマーおよび標的特異的プローブを含む連結された標的捕捉プローブが使用され、ユニバーサルプライマーの結合を可能にするために標的特異的プローブが結合することを必要とする条件下で反応が起こる。ユニバーサルプライミング部位は、ゲノムＤＮＡの編集後（たとえば、切断および配列挿入）の断片の端にライゲーションすることができる。次に、連結された標的捕捉プローブの標的特異的部分は、ＤＮＡの標的切断点、挿入されたタグ配列、または２つの組み合わせに特異的になるように設計することができる。タグ配列を単独で、または標的部位とともに濃縮することにより、組込み率および非特異的な組込みに関する情報を得ることができる。その情報は、ゲノム編集の急成長している分野での既存のおよび将来の技術を評価するために不可欠である。連結された標的捕捉、ならびに結合分子（ｌｉｎｋｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）を使用する関連する増幅および配列決定技術は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開番号第２０１９０１０６７２９号に記載されているように本明細書で企図されている。タグ配列は、評価用に特別に設計されている場合もあれば、ゲノム修飾での使用を目的とした機能配列である場合もある。タグ配列を標的とする標的特異的プローブは、ゲノム編集技術の一般的な性能を評価するため、または特定のインサートを使用して特定の修飾の性能を評価するために、任意の配列（評価特異的タグまたはゲノムＤＮＡインサート）に結合するように設計することができる。

本明細書に記載の系および方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導型改変ヌクレアーゼ［ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ］（ＲＧＥＮ）に依存するものを含む任意のそのような技術を分析する際に使用することができる。プログラム可能なヌクレアーゼおよびそれらの使用は、たとえば、ＺｈａｎｇＦ，ＷｅｎＹ，ＧｕｏＸ（２０１４）． ”ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”に記載されている。

ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ．２３（Ｒｌ）：Ｒ４０－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｕｌ２５；ＬｅｄｆｏｒｄＨ（Ｍａｒｃｈ２０１６）． ”ＣＲＩＳＰＲ：ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｓｊｕｓｔｔｈｅｂｅｇｉｎｎｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ．５３１（７５９３）：１５６－９．

ｄｏｉ：１０．１０３８／５３１１５６ａ；ＨｓｕＰＤ，ＬａｎｄｅｒＥＳ，ＺｈａｎｇＦ（Ｊｕｎｅ２０１４）． ”ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｃｅｌｌ．１５７（６）：１２６２－７８．

ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０５．０１０；ＢｏｃｈＪ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１１）． ”ＴＡＬＥｓｏｆｇｅｎｏｍｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２９（２）：１３５－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ７６７；ＷｏｏｄＡＪ，ＬｏＴＷ，ＺｅｉｔｌｅｒＢ，ＰｉｃｋｌｅＣＳ，ＲａｌｓｔｏｎＥＪ，ＬｅｅＡＨ，ＡｍｏｒａＲ，ＭｉｌｌｅｒＪＣ，ＬｅｕｎｇＥ，ＭｅｎｇＸ，ＺｈａｎｇＬ，ＲｅｂａｒＥＪ，ＧｒｅｇｏｒｙＰＤ，ＵｍｏｖＦＤ，ＭｅｙｅｒＢＪ（Ｊｕｌｙ２０１１）． ”ＴａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇａｃｒｏｓｓｓｐｅｃｉｅｓｕｓｉｎｇＺＦＮｓａｎｄＴＡＬＥＮｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３３（６０４０）：３０７．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０７７７３；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ（２０１１）． ”Ｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｗｉｔｈｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｍｅｒｉｃａ．１８８（４）：７７３－７８２．

ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１１．１３１４３３；Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，＆Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．（２０１０）． ”ＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇｗｉｔｈＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＺｉｎｃＦｉｎｇｅｒＮｕｃｌｅａｓｅｓ”．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ．１１（９）：６３６－６４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ２８４２、そのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

二本鎖切断を同定し、ゲノム編集ツールを評価するための既存の技術は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８２２，４０７号および第９，８５０，４８４号に記載されている。そして、本明細書に記載のバックエンド配列決定および分析技術は、二本鎖切断および挿入効率の分析のために本明細書に記載の連結された標的捕捉方法と共に使用してもよい。

例示的な二本鎖切断およびタグ挿入を図４に示す。議論された方法のいずれか（たとえば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、およびＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）を二本鎖切断を導入するために使用することができる。切断後、設計されたタグ配列は、図４に示されるように組込みすることができる。タグ組込みは、参照により本明細書に組み込まれる、ＴｓａｉＳ．Ｑ．，ＺｈｅｎｇＺ．，ＮｇｕｙｅｎＮ．Ｔ．，ＦｉｅｂｅｒｓＭ．，ＴｏｐｋａｒＶ．Ｖ．，ｅｔａｌ．（２０１５）ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑｅｎａｂｌｅｓｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３３：１８７－１９７に記載されているような方法によって達成され得る。タグの修飾（両端の５’リン酸および２ホスホロチオエート結合等）を使用して、タグの組込み率を高めることができる。

不完全な切断および組込みを想定すると、一部の標的断片は切断されないかタグ配列の組込みに成功し、一部はタグ配列の組込みに成功し、一部のタグ配列は標的外（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）部位に組込みされる。次に、本明細書に記載されている連結された標的捕捉（ＦＴＣ）技術を使用して、それらの結果の割合を決定することができる。

特定の実施形態では、図５に示されるように、ユニバーサルプライマーに連結されたタグ特異的プローブを有する連結された標的捕捉プローブが使用される。プローブの結合および増幅の前に、ユニバーサルプライミング部位を含むアダプターをサンプル断片にライゲーションし、それによってユニバーサルプライマーの標的部位を提供する。ライゲーションされたアダプターは、固有分子識別子［ｕｎｉｑｕｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ］（ＵＭＩ）または他のバーコード配列を含んでもよく、後でこれらのバーコード配列を使用して、配列が最終的に派生した元の分子を判別することができる。このような情報を使用して、個々の分子のコンセンサス配列を決定し、切断および標的上の（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）および非特異的な（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）組込み率のより正確な定量化を提供することができる。バーコードは、センス固有のタグ情報を保持するために、ｙアダプターのステム部分またはｙアダプターの非相補部分に含めることができる。同様に、ユニバーサルプライミング部位は、アダプターのステムまたはｙ部分に配置することができる。特定の実施形態では、改善された機能のために、連結された標的捕捉プローブの標的部位をより近くに配置するために、ステム位置が好ましい。そのような実施形態では、センス固有のタグ情報が失われているにもかかわらず、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／２３９，１００号で論じられているように、エラー低減の利点が依然として達成されている。

タグ濃縮によるオフターゲット検出の場合、標的固有のプローブは、挿入された配列に優先的に結合する。以下に記載する連結された標的捕捉技術を使用すると、増幅は、連結されたプローブの両方が断片に沿って互いに比較的近接して結合する場合にのみ行われる。連結されたプローブは、別のユニバーサルＰＣＲプライミング配列（ライゲーションされたアダプターの部位とは異なる）を含むことができるため、連結されたプローブを使用した増幅の数サイクル後に、サンプルのインデックス作成が行われ、従来のユニバーサルＰＣＲプライマーを使用したより安定した増幅を使用して、シーケンスライブラリを作成することができる。タグに特異的な連結されたプローブは、タグとライゲーションされたユニバーサルプライミング部位との間に隣接するゲノムＤＮＡ配列とともに、任意のタグ配列を捕捉して増幅する必要がある。したがって、配列決定およびその後の分析を通じて、正しい部位に組込まれたタグ、オフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）に組込まれたタグ、および組込まれていないタグの比較数を評価することができ、それにより、有望なゲノム編集ツールで使用されている切断および組込み技術の特異性および効率の評価を提供する。

オフターゲット発見は、図６に示すように、隣接配列の濃縮と組み合わせることができる。連結された標的捕捉および増幅技術は、図５に示すものと同様に実行されるが、異なるプローブ依存プライマー（ＰＤＰ）が使用される。両方のＰＤＰは、ライゲーションされたアダプター配列に相補的なユニバーサルプライマーを含むが、標的特異的プローブは異なる標的に優先的に結合する。一方の標的特異的プローブはタグ特異的配列に結合し、もう一方は目的の組込み部位に隣接するゲノムＤＮＡの一部に結合する。結果として得られる配列捕捉は、組込まれていないタグおよび非特異的組込みを除外し、正しく組込まれた標的のみを捕捉する必要がある。特定の実施形態では、標的特異的プローブとのミスマッチは許容することができ、それにより、数ヌクレオチドによってオフターゲットになるか、さもなければ切断点で意図しない変化を引き起こし得る組込みエラーを捕捉することができる。

切断点に隣接するゲノムＤＮＡの両側を標的とする標的特異的プローブを含むＰＤＰを使用することもできる。これにより、目的の切断点を含むすべてのゲノムフ断片を捕捉することができる。捕捉された分子は、タグ配列が正常に組込まれたゲノムＤＮＡ、ならびに切断されなかった、または組込みされずに修復されたゲノムＤＮＡが含まれている必要がある。したがって、二本鎖切断および配列組込み効率は、試験されているゲノム編集ツールについて評価することができる。

図７に示すように、これらの方法を組み合わせることができ、ここでアダプターを断片にライゲーションし、タグインサートおよび切断点に隣接するゲノムＤＮＡ配列の両方の両端を標的とするプローブを使用する。事前増幅は、組込み率を測定するためにそのようなアッセイで使用することができる。このようなアッセイは、非特異的な（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）組込み率および標的上の（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）組込み率を同時に提供し、単一のアッセイで完全なゲノム編集性能評価を提供する。図８に示すように、ワークフローの複雑さを軽減するために、組み合わせたアッセイを単一のチューブで実行することができる。

バックエンド分析を用いた例示的な方法を図９に示す。図４に示すように標的切断およびタグ配列の組込みの後、アダプターをタグ挿入ゲノムＤＮＡの末端にライゲーションする。アダプターは、プライミング部位および任意のバーコードを含む。アダプターに特異的なプライマーを使用した前増幅（Ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を任意選択で使用することができる。標的捕捉は、図５～８を参照して説明したように、連結された標的捕捉プローブを使用して行われる。バーコーディングＰＣＲが使用され、続いてＤＮＡの定量および配列決定が行われる。配列分析を任意選択で使用して、次に各固有識別分子（ｕｎｉｑｕｅｌｙ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）のコンセンサス配列を決定することができる。次に、生の配列決定データまたは折りたたまれた読み取り（ｃｏｌｌａｐｓｅｄｒｅａｄｓ）を分析して、使用する連結された標的捕捉プローブに応じて、標的切断点で修飾されていないゲノムＤＮＡ、組込まれていないタグ配列、標的上の（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）組込み、および／または非特異的な（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）組込みの相対量を決定することができる。任意の配列決定技術、ならびに既知の配列分析／比較技術またはソフトウェアを使用することができる。

連結された標的捕捉方法は、標的とされたＤＮＡの配列決定のための目的のゲノム領域の溶液ベースの捕捉を含む場合がある。図１および２は、溶液ベースの標的捕捉の例示的な方法を示す。ユニバーサルプライミング部位および任意のバーコード（センス特異的な場合がある）は、抽出されたＤＮＡにライゲーションされる。次に、ライゲーションされたＤＮＡ産物は変性され、標的特異的プローブに連結されたユニバーサルプライマーを含む連結された標的捕捉プローブと結合する。標的の捕捉は、標的プローブの結合により局所濃度が高くない限り、ユニバーサルプライマーが単独で結合できない温度で行われる。次に、鎖置換ポリメラーゼ（たとえば、Ｔａｑ、ＢＳＴ、ｐｈｉ２９、ＳＤ）を使用して、標的に結合した連結されたプローブを伸長する。図１および２の黒いひし形によって示されるように、標的プローブは伸長からブロックされ、その結果、伸長は結合したユニバーサルプライマーに沿ってのみ起こり、標的プライマーに連結されたままである結合した標的核酸鎖をコピーする。次に、いくつかの連結されたＰＣＲ伸長サイクルを使用して、標的配列を増幅することができる。次に、連結された標的捕捉プローブ由来のユニバーサルプライミング部位に対応するユニバーサルプライマーを使用してＰＣＲを実行し、標的核酸の一方または両方の鎖を増幅することができる。このＰＣＲ工程は、精製工程を必要とせずに同じ反応で行うことができる。次に、増幅された標的配列を上記のように配列決定することができる。ギャップは許容されるが、反対方向に使用する場合、連結された捕捉プローブ間にギャップは必要ない。捕捉プローブは、ユニバーサルプライマーを事前に作成された捕捉プローブに結合することにより、ユニバーサル５’－リンカーを使用して作成することができる。捕捉プローブは、クリック化学または以下に記載する他の手段によって結合することができる。

一部の実施形態では、核酸は、より小さな核酸断片に断片化または分解され得る。アダプターのライゲーションの前に達成されるより短い断片は、連結されたプローブがまたがるのに必要な距離を短くするのに役立ち、それによって結合および濃縮効率を高めることができる。ゲノム核酸を含む核酸は、機械的断片化、化学的断片化、および酵素的断片化等の様々な方法のいずれかを使用して断片化することができる。核酸断片化の方法は当技術分野で知られており、ＤＮａｓｅ消化、超音波処理、機械的切断（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｈｅａｒｉｎｇ）等を含むが、これらに限定されない（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ， ”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，１９８９，２．ｓｕｐ．ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ， ”ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ－ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＰａｒｔｓＩａｎｄＩＩ）”，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃ．Ｐ．Ｏｒｄａｈｌｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９７６，３：２９８５－２９９９；Ｐ．Ｊ．Ｏｅｆｎｅｒｅｔａｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９６，２４：３８７９－３８８９；Ｙ．Ｒ．Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎｅｔａｌ，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．，１９９８，８：８４８－８５５）。米国特許公開第２００５／０１１２５９０号は、当技術分野で知られている断片化の様々な方法の一般的な概要を提供している。

本明細書で説明される標的捕捉技術に使用されるプローブ依存性プライマーは、標的特異的ＤＮＡプローブの５’末端（たとえば、タグ挿入配列の一部または切断点でのゲノムＤＮＡ配列の隣接部分に相補的）をユニバーサルプライマーの５’末端まで連結することができる。ＤＮＡプローブは、その３’末端に逆位ｄＴ、Ｃ３スペーサー、または他のブロッキング部分を含んでもよく、断片内の相補的な標的配列に結合するＤＮＡプローブによって標的核酸断片に近接させられた、続いて結合されるユニバーサルプライマーの伸長を支持するＤＮＡプローブの伸長を防ぐ。プライマーおよびプローブは別々に合成し、以下で説明する技術を使用して連結することができる。

連結された標的捕捉プローブには標的特異的配列が好ましいが、特定の実施形態では、ユニバーサルプライマーの５’末端（以下で説明するように任意のバーコードを有する）は、任意のタンパク質、核酸、または核酸中の特定の標的配列または標的特徴に対する結合親和性を示す他の分子からなってもよいプローブ分子の５’末端に付着させることができる。プローブ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合プローブであってもよく、たとえば、クリック化学、ビオチン／ストレプトアビジン結合、または誘導体、たとえばデュアルビオチンおよびストレプトアビジン、ＰＥＧ、免疫ＰＣＲ化学、たとえば金ナノ粒子、化学的架橋または融合タンパク質、またはタンパク質／抗体のＤＮＡプライマー配列への直接結合を使用して一緒に連結される前に、プライマー（たとえば、ユニバーサルプライマー）とは別に合成または単離することができる。連結方法については、以下で詳しく説明する。

例示的なＤＮＡまたはＲＮＡ結合プローブは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を標的とするためのＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含んでもよい。ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬエフェクター、または他の配列特異的結合タンパク質を改変し、ユニバーサルアダプターまたはプライマーに連結して、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を標的とするプローブ依存性プライマーまたはアダプターを作成することができる。メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）または抗体（メチル化ＤＮＡ免疫沈降で使用される）は、メチル化配列を標的とするアダプターまたはプライマーに連結することができる。本系および方法で使用するために、標的特異的プローブは、組込みされたタグの所望の部分またはゲノムＤＮＡ配列に隣接する切断点に優先的に結合する必要があるだけである。特定の実施形態では、タグは、特定のプローブを使用して標的化可能な特徴（たとえば、メチル化された配列）を含んでもよい。

プローブ依存性プライマーは、ユニバーサルプライマーと標的特異的プローブをリンク修飾で連結することで作成することができる。プローブは、リンク修飾で直接合成することができる。アレイ合成プローブのようにこれが不可能な場合は、ＰＣＲによってリンカー修飾を添加することができる。プローブは、カラムベースの合成で大量に作成するのではなく、シリコンチップ上でアレイに合成してから増幅することができる。標的配列決定およびユニバーサルプライミング部位を含むアレイベースのプローブは、リンク修飾を含むユニバーサルプライマーによって増幅することができる。アレイベースのオリゴは、たとえば合成後のＰＣＲによって５’リンカー修飾を加えることにより、連結された標的捕捉プローブに変換することができる。３’ブロッカーは、擦り切れたプライマーの末端に置換することができる。増幅後、修飾されたプローブをユニバーサルプライマーに連結させ、プローブ依存性プライマーとして使用することができる。

特定の実施形態では、結合分子は、ストレプトアビジン分子であってもよく、そして連結される断片は、ビオチン化核酸を含んでもよい。連結されたプライマーが増幅によって連結された核酸断片を作成するために使用される実施形態では、プライマーはビオチン化され、ストレプトアビジン分子上で一緒に結合されてもよい。たとえば、４つの断片を四量体ストレプトアビジンで結合することができる。たとえば、コンカテマーの形成により、４つ以上の分子が結合する可能性がある。本発明の特定の方法では、２つ以上の核酸断片は、クリック化学反応を介して連結することができる。何章によって本明細書に組み込まれるＫｏｌｂ，ｅｔａｌ，ＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＤｉｖｅｒｓｅＣｈｅｍｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎｆｒｏｍａＦｅｗＧｏｏｄＲｅａｃｔｉｏｎｓ，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ．２００１Ｊｕｎ１；４０（１１）：２００４－２０２1を参照されたい。

たとえば、結合分子、およびいくつかの既知のナノ粒子は、単一の結合分子内の数百または数千の断片を含む多数の断片および／またはＤＮＡ結合タンパク質を連結することができる。結合ナノ粒子の一例は、それらの表面上にチオールでキャップされた合成ＤＮＡ配列で修飾されたコロイド金を含む多価ＤＮＡ金ナノ粒子であってもよい。参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｒｋｉｎ，ｅｔａｌ，１９９６，ＡＤＮＡ－ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｔｉｏｎａｌｌｙａｓｓｅｍｂｌｉｎｇｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｔｏｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３８２：６０７－６０９を参照されたい。表面ＤＮＡ配列は、所望のテンプレート分子配列に相補的であってもよく、またはユニバーサルプライマーを含んでもよい。

結合分子はまた、核酸断片を分離するのに役立ち得る。好ましい実施形態では、断片は、それらの間の結合を防ぐように配向されている。リンカーが断片の空間的な分離および配向を制御することで、断片間の折りたたみおよび結合を回避および防止することができる。

一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または修飾されたＰＥＧであってもよく、たとえばＤＢＣＯ－ＰＥＧ４またはＰＥＧ－１１等の修飾ＰＥＧを使用して、２つのアダプターまたは核酸を結合することができる。別の例では、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）修飾ＰＥＧを使用して２つのアダプターを結合する。たとえば、Ｓｃｈｌｉｎｇｍａｎ，ｅｔａｋ，ＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓＢ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ８３（２０１１）９１－９５を参照されたい。任意のオリゴヌクレオチドまたは他の分子を使用して、アダプターまたは核酸を結合することができる。

一部の実施形態において、アプタマーは、２つのプローブを結合するために使用される。アプタマーは、プライマー、タンパク質、または核酸等の様々な分子標的に結合するように設計することができる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法によって設計または選択することができる。アプタマーは、標的分子に特異的に結合する核酸高分子である。すべての核酸と同様に、特定の核酸リガンド、すなわちアプタマーは、通常１５～４０ヌクレオチド長のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）の線形配列によって記述することができる。一部の好ましい実施形態では、アプタマーは、逆塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄｂａｓｅ）または修飾塩基（ｍｏｄｉｆｉｅｄｂａｓｅ）を含んでもよい。一部の実施形態では、アプタマーまたは修飾されたアプタマーは、少なくとも１つの逆塩基または修飾された塩基を含む。

リンカーは、逆塩基で構成されていてもよく、または少なくとも１つの逆塩基を含み得ることを理解されたい。逆塩基または修飾塩基は、任意の営利団体を通じて取得できる。逆塩基または修飾塩基は、開発され、市販されている。逆塩基または修飾塩基は、他の分子に組み込むことができる。たとえば、２－アミノプリンはオリゴヌクレオチドで置換することができる。２－アミノプリンは、ＤＮＡの構造およびダイナミクスをモニタリングするためのプローブとして有用な蛍光塩基である。２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）は修飾された塩基であり、ｄＴと塩基対を形成すると、３つの水素結合を形成し、短いオリゴのＴｍを増加させることができる。５－ブロモデオキシウリジンは、光反応性のハロゲン化塩基であり、オリゴヌクレオチドに組み込んで、ＵＶ光に曝露されるとＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に架橋することができる。逆塩基または修飾塩基の他の例は、デオキシウリジン（ｄＵ）、逆ｄＴ、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、５－メチルデオキシシチジン、または２’－デオキシイノシン（ｄＩ）を含む。鋳型核酸を連結する際に、任意の逆塩基または修飾塩基を使用することができることを理解されたい。

好ましい実施形態では、リンカーは、２つのプライマーまたは２つの核酸断片を結合するための分子を含む。リンカーは、単一の分子であっても、複数の分子であってもよい。リンカーは、いくつかの逆塩基または修飾塩基、あるいは完全に逆塩基または修飾塩基を含んでもよい。リンカーは、ワトソンクリック塩基および逆塩基または修飾塩基の両方を含んでもよい。

本発明では、任意のスペーサー分子または結合分子を使用することができることを理解されたい。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサー分子は、脂質またはオリゴ糖、あるいはオリゴ糖および脂質であってもよい。米国特許５，１２２，４５０号を参照されたい。この例では、分子は、好ましくは脂質分子であり、より好ましくは、少なくとも２つの疎水性ポリアルキレン鎖を有するグリセリドまたはホスファチドである。

リンカーは、任意の数のアダプター、プライマー、および断片のコピーで構成されていてもよい。リンカーは、２つの同一のアームを含む場合があり、ここで各アームは、結合分子、増幅プライマー、シーケンシングプライマー、アダプター、および断片で構成されている。リンカーは、３つまたは４つのアームなど、任意の数のアームを連結することができる。本発明の一部の態様では、核酸鋳型は、スペーサー分子によって連結されていることを理解されたい。本発明におけるリンカーは、２つの断片またはプライマーを結合するための任意の分子または方法であってもよい。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール、またはＤＢＣＯ－ＰＥＧ４またはＰＥＧ－１１等の修飾ＰＥＧが使用される。一部の実施形態では、リンカーは脂質または炭化水素である。一部の実施形態では、タンパク質は、アダプターまたは核酸に結合することができる。一部の実施形態では、オリゴ糖は、プライマーまたは核酸を連結する。一部の実施形態では、アプタマーは、プライマーまたは核酸を連結する。断片が連結されると、コピーは同相になるように配向され、その間の結合を防ぐ。

特定の実施形態では、リンカーは、抗体であってもよい。抗体は、単量体、二量体または五量体であってもよい。２つのプライマーまたは核酸を結合するための任意の抗体を使用することができることを理解されたい。たとえば、ヌクレオシドは、タンパク質に結合することによって免疫原性にすることができることが当技術分野で知られている。Ｖｏｉｄ，ＢＳ（１９７９），ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ７，１９３－２０４を参照されたい。さらに、修飾された核酸に結合するように抗体を調製することができる。ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１２，Ｉｓｓｕｅ３を参照されたい。

リンカーは、増幅中に複合体に付着したままになる場合がある。一部の実施形態では、リンカーは、増幅の前に除去される。一部の実施形態では、リンカーは、結合分子に結合され、次いで、結合分子は、増幅プライマーに結合される。リンカーが除去されると、結合分子または結合プライマーが露出する。露出した結合分子も固体支持体に付着し、アーチが形成される。リンカーは、溶媒での洗浄、熱の適用、ｐＨの変更、洗剤または界面活性剤での洗浄などを含む、当技術分野での任意の既知の方法によって除去することができる。

本発明の方法は、二本鎖分子を捕捉するために、任意選択でユニバーサルリンクプライマーを使用する、液滴ベースの標的捕捉を含む。米国特許公開第２０１９０１０６７２９号に記載されているが、そこに記載され、図１および２に示されている連結された標的捕捉プローブを使用する液滴ベースの方法。ユニバーサルプライマーおよび任意のバーコード（センス特異的であってもよい）を、抽出されたＤＮＡ（たとえば、セルフリーのＤＮＡ）に連結する。エマルジョンは、二重鋳型分子、および標的特異的プローブに連結されたユニバーサルプライマーを含む標的捕捉プローブを使用して、上記のように作成される。上記のように、標的捕捉は、標的プローブの結合により局所濃度が高く、捕捉プローブがそれ自体の伸長を阻止されない限り、ユニバーサルプライマーが単独で結合できない温度で行われるが、エマルジョンに含まれるユニバーサルプライマーおよび連結ユニバーサルプライマーを使用して標的核酸を増幅し、標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む連結二本鎖分子を生成することができるようなユニバーサルプライミング部位を含む。標的捕捉のみを行うために、ユニバーサルリンカーを省略することができる。次に、エマルジョンを破壊し、連結していない鋳型を酵素的に消化して、連結した二本鎖分子のみを残して、クラスターをシードするか、または上記のように配列決定することができる。

図３Ａおよび３Ｂは、本発明の液滴ベースの標的捕捉方法の追加の詳細を提供する。図３Ａの工程０は、ユニバーサルプライミング部位を有する二重鋳型分子を示し、それに連結された任意のバーコードが、連結されたユニバーサルプライマーおよび標的捕捉プローブを有する液滴にロードされる。鋳型ＤＮＡは液滴内で変性し、標的捕捉プローブは、標的プローブも結合しない限り、ユニバーサルプライマーが単独で結合しない温度で、変性した鋳型鎖に結合する。ユニバーサルプライマーは、次に捕捉された標的にのみ結合する。鎖置換ポリメラーゼによる伸長は、捕捉された標的上でのみ発生する。次に、図３Ｂに移動して、所望の標的捕捉プローブおよびプライマーが消耗するまで、伸長サイクルが実行される（たとえば、４～６サイクル）。得られた伸長産物は、ユニバーサルリンクプライマーを使用して増幅され、鎖特異的バーコードを有する連結された二重鎖分子を生成する。溶液ベースの方法と同様に、反対方向にある場合、連結された捕捉プローブ間にギャップは必要ない。連結された捕捉プローブは、ユニバーサルリンカーを省略して標的捕捉のみを行う場合、一方向または両方向で使用することができる。従来のポリメラーゼは、液滴内の鎖置換ポリメラーゼと混合して、方法の様々な伸長および増幅工程を行うことができる。

実施例１：Ｃａｓ９細胞株のＨＩＤＮ－Ｓｅｑ
Ｃａｓ９細胞株を使用して、対照として１つの群の細胞にインサートを追加し、所望の挿入切断点を標的とする誘導ＲＮＡとともにインサートを添加した。次に、上記のＨＩＤＮ－Ｓｅｑを、両方の細胞群のＤＮＡに対して行った。実験（ｇＲＮＡ＋インサート）群の場合、アダプターライゲーション後のＰＣＲ増幅なしで（すなわち、図９に示すように、ライゲーションから連結された標的捕捉増幅に直接）、上記のように連結された標的捕捉を待った。実験の概要を図１０に示す。ここで、ＳＩは対照ＤＮＡ（ｇＲＮＡが追加されていない）で行われたＨＩＤＮ－Ｓｅｑを表し、Ｓ２は上記のように連結された標的捕捉を使用したＨＩＤＮ－Ｓｅｑを表す。Ｓ３は、記載したように連結された標的捕捉が伴うが、アダプターライゲーション後のＰＣＲ増幅がないＨＩＤＮ－Ｓｅｑを表す。３つのサンプルすべてについて、約１００万のクラスターが配列決定された。結果を図１１および１２に示す。

図１１は、ゼロ、１つ、または両方の読み取りでタグ配列を含むＳ１、Ｓ２、およびＳ３クラスターの数および割合を示す。示されているように、各サンプルのクラスターの９９％以上には、予想されるタグ配列（編集距離４以内）の読み取りが少なくとも１つ含まれている。これは、本質的に無駄な読み取りがなかったことを意味する。

図１２は、ゲノム内の塩基数およびＳ１、Ｓ２、およびＳ３群の最小ＵＭＩカバー範囲をプロットした、ゲノム全体のＵＭＩカバー範囲を示す。ＳＩ（タグのみ）群のカバー範囲ははるかに低く、最大カバー範囲は２０未満であった。これは、ｇＲＮＡがない場合に予想されるように、低い組込み率で発生した切断部位はごくわずかであることを示す。ただし、Ｓ２およびＳ３群は、特定の領域ではるかに高いカバー範囲を示しており、複数の部位での顕著な組込みを示唆している。

Ｓ２およびＳ３群のオフターゲット部位の配列決定結果を以下の表に示す。ＳＩ（タグのみ）群はｇＲＮＡと一致しなかったが、Ｓ２およびＳ３群は上位５０のカバー範囲領域のそれぞれでｇＲＮＡ配列が見出された。それぞれの上位２０を表に示す。標的配列には下線を引いている。

実験で使用した二本鎖タグ配列は次のとおりである：
ＢＧＴａｇｖｌ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）：
／５Ｐｈｏｓ／Ｃ＊Ａ＊ＧＴＧＴＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴＡＴＣＡ＊Ｇ＊Ｃ
ＢＧＴａｇｖｌ配列（逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ），ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）：
／５Ｐｈｏｓ／Ｇ＊Ｃ＊ＴＧＡＴＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＣＡＣ＊Ｔ＊Ｇ

フォワードプローブ（Ｔｍ＝６９．１℃）配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）は以下のとおりであった：
ＣＡ＋ＧＴ＋ＧＴＴＴＡ＋ＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧ

リバースプローブ（Ｔｍ＝６９．３℃）配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）は以下のとおりであった：
Ｇ＋ＣＴ＋ＧＡＴＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＡ

タグ配列は、順方向および逆方向に連結された標的捕捉プローブの結合を可能にするのに十分高い融解温度を有するように選択された。プローブ配列は、タグ配列に対して高い特異性を有して選択されたが、オーバーラップ温度は低くなっている（たとえば、６０℃未満）。ロックト核酸（ＬＮＡ’ｓ、ＬＮＡ塩基の前に「＋」で示されている）を使用して、目的のプローブ融解温度を達成した。

実施例２：タグの濃縮
タグ配列を含むゲノムＤＮＡを様々な量でゲノムＤＮＡにスパイクし、タグ特異的プローブを備えたフォワードおよびリバースプローブを使用してサンプルをＨＩＤＮ－Ｓｅｑに供した（図５を参照）。図１３に示すように、タグ配列を含む配列読み取りの割合は、１Ｅ５および１Ｅ６の両方のタグスパイクレベルで９９．８％より大きい。連結された標的捕捉がライゲーションアダプターからのインサート全体を増幅するため、タグの隣接配列が回復した。

参照による組み込み
特許、特許出願、特許刊行物、ジャーナル、本、論文、ウェブコンテンツ等の他の文書の参照および引用が、この開示を通してなされてきた。そのようなすべての文書は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。

Claims

二本鎖ＤＮＡ挿入を検出するための方法であって、以下を含む方法：
複数の二本鎖核酸断片の一つまたは複数が、挿入部位に挿入されたタグ配列を含む、前記複数の二本鎖核酸断片上にユニバーサルプライミング部位（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｉｎｇｓｉｔｅ）をライゲーションする工程；
複数の連結された二本鎖核酸断片を変性させて、ユニバーサルプライミング部位を含む一本鎖核酸断片を作成する工程；
前記一本鎖核酸断片を、前記タグ配列の一つまたは複数および前記挿入部位の３’側または５’側に近接する配列の少なくとも一部に対する親和性を有する標的プローブ、ユニバーサルプライマーに連結された標的プローブを含む複数の連結された捕捉プローブに曝露する工程であって、ここで該曝露する工程は、該ユニバーサルプライマーが前記ユニバーサルプライミング部位に結合することを可能にするために、標的核酸配列への該標的プローブの結合を必要とする条件下で起こる、工程；
ユニバーサルプライマーを伸長して、前記挿入部位または前記タグ領域のコピーを作成する工程；および
前記挿入部位の前記タグ配列の存在を決定するために前記コピーの配列決定をする工程。
前記挿入部位の３’側または５’側に近接する配列は、前記挿入部位にまたがらない、請求項１に記載の方法。
前記挿入部位の３’側または５’側に近接する配列は、前記挿入部位の１５０ヌクレオチド以内にある、請求項１に記載の方法。
前記複数の連結された捕捉プローブは、前記タグ配列の少なくとも一部に対する親和性を有する標的プローブ、および前記挿入部位の３’側または５’側に近接する前記配列の少なくとも一部に対する親和性を有する標的プローブを含む、請求項１に記載の方法。
ゲノム編集ツールを使用して前記タグ配列を前記挿入部位に挿入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ゲノム編集ツールは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）および関連する酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ［ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｌｉｋｅｎｕｃｌｅａｓｅｓ］（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
前記ゲノム編集ツールの組込み率（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｒａｔｅ）を決定するために、前記挿入部位に前記タグ配列を含む配列の量を、前記タグ配列が挿入されていない前記挿入部位を含む配列の量と比較することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
前記ゲノム編集ツールの非特異的な（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）組込み率を決定するために、前記挿入部位に前記タグ配列を含む配列の量を、前記挿入部位の標的外に（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）挿入された前記タグ配列を含む配列の量と比較することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
前記タグ配列と前記プローブ配列との間の融解温度は、前記連結された捕捉プローブの結合を可能にするのに十分である、請求項１に記載の方法。
前記ライゲーションする工程は、前記複数の二本鎖核酸断片上に固有のバーコードをライゲーションすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記固有のバーコードは、センス特異的（ｓｅｎｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃ）である、請求項１０に記載の方法。
結合分子（ｌｉｎｋｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）を使用して前記標的プローブと前記ユニバーサルプライマーを一緒に結合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
クリック化学を使用して前記標的プローブと前記ユニバーサルプライマーを一緒に連結する、請求項１２に記載の方法。
前記配列決定をする工程の前に、目的のゲノム領域を増幅するために前記曝露する工程および前記伸長する工程を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記配列決定をする工程の前に、連結されていないユニバーサルプライマーを使用して前記目的のゲノム領域を増幅することをさらに含む、請求項１または１４に記載の方法。
ＰＣＲ増幅および前記ユニバーサルプライミング部位に相補的なユニバーサルプライマーを使用して前記目的のゲノム領域を増幅することをさらに含む、請求項１または１４に記載の方法。
ライゲーションの前に前記二本鎖核酸断片を切断する（ｓｈｅａｒ）、請求項１に記載の方法。