KR101953994B1 - 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도 - Google Patents

쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도에 관한 것이다. 본원에 따른 쿠커르비타신(Cucurbitacin)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머는 높은 정확도와 민감성으로 해양생물 등의 생물자원로부터 쿠커르비타신을 함유하고 있는 다양한 종을 확인할 수 있어 치료제로서 다양한 유용성을 갖는 쿠커르비타신의 의약제로 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도 {Nucleic acids aptamer binding specifically to cucurbitacin}
본원은 쿠커르비타신에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도에 관한 것이다.
쿠커르비타신(또는 쿠쿠르비타신, Cucurbitacin)은 쿠커비투과(Cucurbitaceae) 및 다른 여러 식물 군 유래의 triterpenes의 일종으로 A부터 T까지 약 20여 개의 변종이 존재한다. 쿠커르비타신은 항암, 항염증, 항응고, 항당뇨, 항동맥경화 등의 뛰어난 약리적 잠재력을 갖고 있어 유용성이 매우 크다 (Kaushik et al., Pharmacogn Rev. 2015 Jan-Jun; 9(17): 12-18). 예를 들면 쿠커르비타신 I의 경우 HeLa cell(자궁경부암세포), KB cell(상피암세포)에 대해 강한 세포독성을 갖으며 에를리히 복수암(Ehrlich ascites carcinoma) 종양세포에 대한 강한 억제력을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Kaushik et al.,ibid).
쿠커르비타신은 육상식물뿐만 아니라 일부 해양 조개(shell-less marine mollusks)에서도 존재한다고 알려져 있지만 육상 식물 외 해양 동식물 유래의 쿠커르비타신의 존재에 대해서 연구된 바가 거의 없다.
따라서 해양을 포함한 생물자원으로부터 쿠커르비타신을 함유하고 있는 종들을 발굴하고 이를 토대로 기능성 물질인 쿠커르비타신을 추출, 확보하는 기술 개발이 절실하다.
최근 검출 기술로서 널리 사용되는 것이 앱타머(Aptamer) 기반 기술이다. 앱타머는 특정 표적물질에 대해 높은 친화도와 선택성을 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA이다. 앱타머는 질병 진단, 바이오센서, 유해 미생물 검출 등을 위한 센서 분야에서 주로 이용되는 항체에 비해 표적물질에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하여 실온에서 장기간 보존이 가능하다. 또한 화학적 변형이 용이하여 동물에게 항원을 주입하여 항체를 얻어낼 필요가 없고, 변성이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 가능한 여러 장점을 가진다.
앱타머 기술을 이용한 유용물질 검출 기술로는 한국 등록특허 1258600호를 들 수 있다. 상기 특허는 대표적 항생제인 암피실린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것으로, SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 무작위 ssDNA 라이브러리로부터 암피실린(ampicillin)에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 앱타머를 개시한다.
하지만 쿠커르비타신을 검출할 수 있는 특허앱타머 기술의 국내 및 국외 출원은 전무하며, 항암, 항염증 등에 약리적 효과가 있는 쿠커르비타신을 표적물질로하는 핵산 앱타머의 개발이 필요하다.
본원은 쿠커르비타신(Cucurbitacin)에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열을 갖는, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 앱타머가 인식하는 쿠커르비타신은 19-(10→9β)-abeo-10α-lanost-5-ene 고리 및 도 1의 A에 기재된 탄소원자 번호를 기준으로 탄소원자(1,2) 및 (5,6)번에 이중결합 및 상기 고리에 -H, -CH3 측쇄를 갖는 구조를 포함하며, 따라서 이러한 구조를 포함하는 다양한 종류의 쿠커르비타신, 특히 쿠커르비타신 B, E, I, J, K, L 또는 S 형을 특이적으로 인식할 수 있다.
다른 구현예에서 본원에 따른 앱타머의 핵산서열은 서열번호 2 또는 6으로 표시될 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 앱타머는 쿠커르비타신의 검출을 위해, 목적에 따라 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 검출체로 표지되거나, 또는 나노입자에 결합되어 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 핵산 앱타머를 포함하는 쿠커르비타신 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열을 갖는, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 핵산 앱타머를 제공하는 단계; 및 상기 앱타머를 시험 대상 시료와 접촉하는 단계; 상기 접촉결과를 검출하는 단계를 포함하는, 쿠커르비타신 검출 방법을 제공한다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 앱타머는 표지 물질로 표지되어 있고, 상기 표지 물질로 표지된 앱타머는 고형지지체 상에 결합되어 있으며, 상기 검출하는 단계는 상기 표지물질에서 발생하는 신호를 검출하는 것을 포함한다.
본원에 따른 방법은 특히 쿠커르비타신 B, E, I, J, K, L 또는 S 형을 검출에 사용된다.
본원에 따른 방법에서 상기 검출 결과 음성 대조군과 비교하여 상기 신호가 증가한 경우, 상기 시험 대상 시료를 쿠커르비타신 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 따른 앱타머 또는 이를 이용한 쿠커르비타신 검출 방법에서 시험대상 시료는 문어, 오징어, 가리비, 전복, 달팽이를 포함하는 연체동물문, 또는 해면류를 포함하는 해면동물문(Phylurn Porifera)에 속하는 해양무척추 동물 유래의 시료이나, 이로 제한되는 것은 아니며, 쿠커르비타신의 검출이 필요한 다양한 시료에 사용될 수 있다.
본원에 따른 쿠커르비타신(Cucurbitacin)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머는 높은 정확도와 민감성으로 해양생물 등의 생물자원으로부터 쿠커르비타신을 함유하고 있는 다양한 종을 확인할 수 있어 치료제로서 다양한 유용성을 갖는 쿠커르비타신의 의약제, 기능성 식품 및 기능성 화장품의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원에 따른 앱타머에 의해서 인식될 수 있는 다양한 쿠커르비타신의 구조식이다.
도 2a는 본원에 따른 일 구현예에서 사용된 각 SELEX round를 거치면서 쿠커르비타신 I(Cucurbitacin I)에 결합하는 DNA를 확보 및 회수하는 비율이 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 2b는 본원에 따른 일 구현예에서 사용된 쿠커르비타신 I에 특이적으로 결합 가능한 핵산 앱타머 스크리닝 과정의 모식도이다.
도 3a는 본원의 일 구현예에서 선별된 앱타머의 하나인 #2 핵산 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 3b는 본원의 일 구현예에서 선별된 앱타머의 하나인 #8의 핵산 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따라 선별된 20종 핵산 앱타머의 쿠커르비타신 I에 대한 특이적 결합능 선별 결과를 나타낸 결과이다.
도 5는 도 4에서 쿠커르비타신 I에 대한 특이적 결합능을 갖는 것으로 선별된 7종의 핵산 앱타머의 쿠커르비타신 I과 유사한 카운터 표적물질(counter target)에 대한 결합능 선별 결과를 나타낸 결과이다.
도 6은 본원의 일구현예에 따른 앱타머 #2 및 #8의 쿠커르비타신 I에 대한 KD 값을 분석한 그래프이다. 본원의 일구현예에 따른 앱타머 #2 및 #8의 KD 값은 각각 4.7135μM 및 8.5052μM 인 것으로 나타났다.
도 7은 쿠커르비타신 E 및 B에 대한 결합능을 분석한 결과이다.
본원은 항암, 항염증, 항응고, 항당뇨, 항동맥경화 등의 뛰어난 약리적 잠재력을 갖고 있어 유용성이 매우 큰 쿠커르비타신(또는 쿠쿠르비타신, Cucurbitacin)을 특이적으로 검출할 수 있는 물질을 개발하고자 하였다. 그 결과 특정 서열의 핵산 앱타머가 높은 특이성으로 쿠커르비타신에 결합할 수 있음을 규명하였다.
이에 한 양태에서 본원은 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다.
본원에 따른 앱타머는 높은 특이성으로 쿠커르비타신에 결합한다.
본원에 따른 핵산 앱타머가 특이적으로 인식할 수 있는 쿠커르비타신을 설명하면 다음과 같다.
쿠커르비타신은 다양한 식물에 존재하는데, 특히 박과 식물에서 발견되며 브리오니아(Bryonia), 오이속(Cucumis), 호박속(Cucurbita), 수세미(Luffa), 박(Lagenaria) 및 수박(Citrullus)에서 발견된다. 여주속 식물들에서는 모모디코시드(momordicosides)라는 쿠커르비타신의 특정한 그룹이 포함되어 있다. 쿠커르비타신의 농도는 식물체의 조직마다 상이하며, 주로 성숙한 식물의 뿌리와 과육에 집중되어 있다. 쿠커르비타신은 성숙한 과일에서 최고 농도로 존재하고 씨앗에는 일반적으로 매우 낮은 농도의 쿠커르비타신이 함유되어 있다. 쿠커르비타신은 박과 이외의 식물에서도 발견되며, 예를 들면 현삼과(Scrophulariaceae), 베고니아과(Begoniaceae), 앵초과(Primulaceae), 백합과(Liliaceae), 한련속(Tropaeolaceae) 및 장미과(Rosaceae의) 식물 등에서도 확인되었다. 이베리스(Iberis) 종과 큰 다닥냉이(Lepidium sativum)과 같은 특정 십자화(cruciferous)과 식물의 씨앗에도 쿠커르비타신이 포함되어 있다. 식물체 내에서 생성된 쿠커르비타신은 식물의 다른 부분으로 옮겨지지 않는 것으로 알려져 있다.
쿠커르비타신의 구조는 도 1에서 보는 바와 같이 다양한 구조가 알려져 있으며, A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, O, P, Q, R, S 및 T 구조가 존재한다. 본원에서 쿠커르비타신이라는 용어는 상기 열거한 각 구조를 포함하는 글리코시드 형태의 쿠커르비타신에 속하는 다양한 구조의 쿠커르비타신을 포함할 수 있다.
쿠커르비타신의 화합물은 19-(10→9β)-abeo-10α-lanost-5-ene 고리 골격을 기본으로 포함하고 있으며, 공통적인 특징으로 5, (6) - 이중 결합을 지닌다. 쿠커르비타신류의 스테로이드 핵과의 차이점은 쿠커르비타신의 기본 구조에서 메틸기가 C-10이 아닌 C-9에 위치한다. 쿠커르비타신의 대부분은 테트라사이클릭 이지만 대표적으로 S 와 T에서는 C-16과 C-24 사이의 공식적인 고리 화로 인해 여분의 고리를 가지기도 한다. 쿠커르비타신은 고도로 불포화되어 있으며, 이는 케톤 -, 하이드록실 -, 및 아세톡시- 그룹을 함유하는 대부분의 테트라사이클릭 트리테르펜(tetracyclic triterpene)들과 상이하다. 특정한 쿠커르비타신은 글리코시드(glycoside)의 형태로 발견되었으며, 일부는 C-11의 카보닐 작용기가 없다. 화학적으로 쿠커르비타신은 고리 A 와 C의 다양한 작용기, 측쇄의 다양성 및 입체 화학적 고려에 따라 명명되었다. 쿠커르비타신 G 및 H는 동일한 구조를 가지고 있으나, 아직까지 확립되지 않은 24번 위치의 히드록시기의 구조에 차이가 있다. 쿠커르비타신 R은 23, 24-dihydrocucurbitacin D (DHCD)로 밝혀졌으며, Cucurbitacin D 군으로 옮겨졌다. 이와 유사하게 쿠커르비타신 J 및 K는 아직 결정되지 않은 24 위치의 히드록실기 배열만이 상이하다. 쿠커르비타신의 특수한 그룹인 모모디코시드(momordicosides)는 여주(momordica charantia) 유래로 명명되었으며, 모모디코시드는 다른 식물종에서 발견되지 않는다. 모모디코시드는 C19가 공통적으로 알데히드 그룹으로 산화된 구조를 갖는다.
본원에 따르면, 카운터 타겟 역시 쿠커르비타신과 매우 유사한 고리 구조를 가진 화합물을 그 대상으로 하였으나, 카운터 타겟에는 결합하지 않으며, 본원에서 도출된 결과를 근거로 쿠커르비타신이 갖는 기본 골격인 19-(10→9β)-abeo-10α-lanost-5-ene 고리를 특이적 인식을 한다고 볼 수 있다. 따라서 이를 통해 (1,2) 및 (5,6)번에 이중결합 및 고리구조에 H, -CH3 측쇄를 갖는 I와 동일한 구조적 유사성을 갖는 쿠커르비타신, 특히 쿠커르비타신 B, E, I, J, K, L, 및 S에 특이적 결합을 할 수 있다.
본원에서 앱타머는(Aptamer)는 저분자 탐침으로써 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이(20~60 뉴클레오티드)의 단일가닥 핵산(DNA 혹은 RNA) 단편이다. 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291) 등을 참조할 수 있다.
본원에서 용어 "핵산 앱타머"는 DNA 앱타머 및 RNA 앱타머를 모두 포함하는 용어이다.
본원에 따른 앱타머는 표적 물질에 대해 나노 몰 내지 피코 몰 수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지나, 항체와 비교할 때 앱타머는 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 가능하고, 필요한 경우 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, 화학적 합성으로 제조되므로 순도가 높고, 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하고, 생체 내 면역반응을 거의 일으키지 않는다.
본원에 따른 앱타머는 상술한 바와 같은 다양한 쿠커르비타신에 결합력을 갖는 특히 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
또한 본원에 따른 앱타머는 상술한 바와 같은 다양한 쿠커르비타신에 대한 결합력을 유지하는 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98%의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본원에 따른 앱타머는 RNA 앱타머를 또한 포함한다. 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열은 DNA 앱타머이나, RNA 앱타머는 DNA 앱타머에서 티민(T)이 우라실(U)로 치환된 것이다. RNA에서 U는 DNA의 T와 유사하게 아데닌(A)과 2개의 수소결합을 통해 결합하며, DNA 앱타머의 핵산 서열 중 T를 U로 치환한 RNA 앱타머 서열도 대응되는 DNA 앱타머와 비슷한 구조를 형성하여 타겟 리간드와 결합할 것을 쉽게 예상할 수 있다.
본원에 따른 단일가닥 DNA 앱타머는 이들 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태로 포함될 수도 있다. 예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 다양한 목적 예를 들면 뉴클리아제 저항성 등을 갖게 하기 위해 변형될 수 있다.
이러한 변형은 예를 들면 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다.
본원에 따른 앱타머는 검출 목적으로 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 물질로 표지될 수 있다. 상기 물질은 리간드에 본원에 따른 앱타머가 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 예를 들면 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(125I, 32P 또는 35S 등)을 포함한다. 상기 표지 물질이 상기 앱타머에 표지되는 경우, 상기 표지물질은 상기 앱타머에서 리간드에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 핵산 앱타머에 링커(공유결합 또는 가교)를 통해 결합될 수 있다. 상기와 같은 표지물질의 결합 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있고, 특히 상기 핵산 앱타머의 5'-말단일 수 있다.
본원에 따른 앱타머는 다양한 식물에서 쿠커르비타신의 검출을 위해 다양한 형태로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 상술한 바와 같은 본원에 따른 앱타머는 쿠커르비타신 검출용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 조성물의 형태로 제공되는 경우, 조성물에 포함된 앱타머는 나노입자와 같은 입자에 결합된 형태로 포함될 수 있다.
다른 구현예에서 상술한 바와 같은 본원에 따른 앱타머는 고상(solid state) 지지체 상에 고정화될 수 있다. 이러한 지지체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 나이트로셀룰로스 막을 포함하는 막(membrane), 마이크로 어레이, 금 또는 은 나노입자를 포함하는 나노입자, 자성비드를 포함하는 비드, 또는 이온교환수지를 포함하는 레진에 부착되어 사용될 수 있다. 핵산 앱타머를 지지체상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 (S.Balamurugan et al., Anal Bioanal Chem. 390: 1009-1021 (2008)를 참조할 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 앱타머는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 키트에 포함되는 앱타머는 조성물의 형태 또는 막에 결합된 형태로 제공될 수 있으며, 쿠커르비타신 검출을 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 앱타머를 이용한 시험 대상 시료에서 쿠커르비타신을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 앱타머, 또는 상기 앱타머를 포함하는 조성물, 또는 앱타머가 결합된 막 또는 마이크로 어레이, 앱타머가 결합된 나노입자 또는 비드를 제공하는 단계; 및 상기 앱타머 또는 이를 포함하는 조성물 등을 시험 대상 시료와 접촉시켜 쿠커르비타신과의 결합을 관찰하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에서 시험 대상 시료는 쿠커르비타신이 존재할 것으로 추정되어 이에 대한 검출을 필요로 하는 시료를 의미하며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 본원에 따른 앱타머 또는 이를 이용한 쿠커르비타신 검출 방법에서 시험대상 시료는 문어, 오징어, 가리비, 전복, 달팽이를 포함하는 연체동물문, 또는 해면류를 포함하는 해면동물문(Phylurn Porifera)에 속하는 해양무척추 동물 또는 이들 유래의 시료이다.
상기 동물 유래의 시료는 동물에서 채취된 조직을 분쇄한 분쇄물 (lysate 또는 extract), 또는 상기 분쇄물에서 고형물을 원심분리 등으로 제거한 상층액을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또는 상기 동물유래의 시료는 동물에서 채취된 조직 또는 세포 자체를 포함한다. 이러한 조직은 예를 들면 조직을 동결한 후 얇은 두께의 절편의 형태로 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에 의해 검출될 수 있는 쿠커르비타신은 앞서 언급한 바와 같다.
본원에 따른 방법에서 본원에 따른 앱타머와 쿠커르비타신의 결합은 앞서 언급한 바와 같이 표지된 물질 및/또는 사용되는 고 특성에 따라 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 관찰할 수 있다. 본원에 따른 방법의 분석 과정에 의한 시료에서 발생하는 최종적인 시그널의 세기를 분석하여, 예를 들면 양성 및/또는 음성 대조군의 시그널과 비교하여 쿠커르비타신의 포함 여부를 판단할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. DNA pool 합성
Random library (N40)는 EuRx®, XELEX DNA core kit에 포함된 library 주형 및 완충액을 제조자의 방법대로 이용하고, 하기 서열의 프라미어를 사용하여 증폭하였다: Bank-40 (77mer): 5’-TGA CAC CGT ACC TGC TCT - N40 - AAG CAC GCC AAG GGA CTA T-3’; 5’-Bank40-Primer: 5’-TGA CAC CGT ACC TGC TCT-3’; 및 3’-Bank40-Primer: 5’-ATA GTC CCT TGG CGT GCT T-3. PCR은 95℃에서 2분(1 cycle), 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 3분(10~25 cycles), 72℃에서 5분(1 cycle) 조건에서 수행하였다.
실시예 2. 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 선별
쿠커르비타신 I에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 선별하기 위해 다음과 같이 총 6번의 반복 선별과정을 수행하였다.
2-1. 1 st round SELEX
쿠커르비타신 I에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 선별하기 위해 상기 실시예 1에서 합성된 0.02nmol/㎕ DNA pool 50㎕에 10X SELEX buffer 50㎕, 10mM 농도의 쿠커르비타신 I(Cucurbitacin I, Cayman chemical사) 5㎕ 및 Nuclease free water 395㎕를 주입하여 최종 부피 500㎕가 되도록 혼합하고, 혼합액을 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물에 쿠커르비타신 I과 반응하지 않은 DNA strand들은 GO (Graphene oxide)에 부착시키기 위해 하기 합성법에 따른 GO-MNP 복합체 200㎕ (함유 GO 농도 약 1mg/ml)를 주입하고 상온에서 2시간 반응시켰다. GO-MNP 복합체와 반응이 끝난 혼합물에서 마그넷을 이용하여 GO-MNP 복합체를 분리하였다. 총 700㎕의 상청액(supernatant) 내 DNA strand들을 농축하기 위해 3M NaOAc 용액 770㎕와 2-프로판올 770㎕을 혼합하여 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 인큐베이션이 끝난 용액을 4℃, 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상청액(supernatant)을 제거하였다. 얻어진 펠렛은 70% Ethanol 1ml에 용해하여 4℃, 15,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상청액을 제거하고 상온에서 완전히 건조시켰다. 최종적으로 1X SELEX buffer 37㎕에 reconstitution 하고, 10X PCR buffer(Bioneer Taq polymerase 제품) 5㎕, 5’-Bank40-primer 2㎕, 3’-Bank40-primer 2㎕, dNTP mix(Bioneer Taq polymerase 제품) 4㎕, 및 농축된 template solution (37㎕)를 모두 혼합하여 최종 50㎕ 혼합물을 표 1과 같은 조건으로 PCR을 수행하고 반응물은 4℃에서 보관하였다.
[표 1]
Figure 112017094128545-pat00001
GO- MNP (Magnetic Nano Particle) 복합체 합성 방법
Graphene oxide(GO)용액 (1mg/ml, Graphene Square Korea) 10ml를 water-bath sonicator를 이용하여 2시간 동안 소니캐이션(sonocation)하였다. 2M 클로로아세트산을 4M NaOH 용액에 녹여 준비하였다 (3.78g per 20ml 4M NaOH). 상기 GO용액 4ml를 2M 클로로아세트산을 16ml와 혼합하고 75분간 water-bath sonicator를 이용하여 소니캐이션하면서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 4,000rpm, 25℃에서 30분간 원심분리한 후 3‘증류수를 이용하여 세척하였다. 총 5번 세척 반복 후 최종 4ml 3’DW에 reconstitution하고 4℃에서 overnight 보관하였다.
상기 과정으로 카복실화된 GO 용액 4ml을 water-bath sonicator를 이용하여 30분간 소니캐이션하고, 0.15g의 EDC를 주입하고 15분 뒤, 0.15g의 NHS를 주입하여 15분간 반응시켰다. 상기 반응물에 1mg/ml 농도의 Dynabead M270 자성입자용액을 주입하고 8시간 동안 상온에서에서 3D 오비탈 쉐이커를 이용하여 믹싱하면서 반응시켰다. 마그넷을 이용하여 반응물을 처음 2번은 3’DW를 이용하여 세척하고, 다시 3번은 10mM PBS, pH7.4를 이용하여 세척한 후 마지막으로 4ml의 10mM PBS, pH7.4에 reconstitution후 사용전까지 4℃에서 보관하였다.
2-2. 2 nd ~ 4 th round SELEX
두 번째 SELEX를 수행하기 위해 상기 실시예 2-1의 PCR 반응물 50㎕에 DMSO용액 50㎕를 주입하고 (최종 50% DMSO) 5분간 denaturation하였다. denaturation된 PCR 반응물 100㎕, 10X SELEX buffer 50㎕, 10mM 쿠커르비타신 I 2.5㎕, 및 Nuclease free water 347.5㎕를 모두 혼합하여 최종 부피 500㎕의 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물에 GO-MNP 복합체 200㎕ (함유 GO농도 약 1mg/ml)를 주입하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. GO-MNP 복합체와 반응이 끝난 혼합물에서 마그넷을 이용하여 GO-MNP 복합체를 분리하였다. 총 700㎕의 상청액(supernatant) 내 DNA strand들을 농축하기 위해 3M NaOAc 용액 770㎕와 2-프로판올 770㎕을 혼합하여 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션(incubation)하였다.
인큐베이션이 끝난 용액을 4℃, 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상청액(supernatant)을 제거하였다. 얻어진 펠렛은 70% Ethanol 1ml에 용해하여 4℃, 15,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상청액을 제거하고 상온에서 완전히 건조시켰다. 최종적으로 1X SELEX buffer 37㎕에 reconstitution 하고, 10X PCR buffer(Bioneer Taq polymerase 제품) 5㎕, 5’-Bank40-primer 2㎕, 3’-Bank40-primer 2㎕, dNTP mix(Bioneer Taq polymerase 제품) 4u, 및 농축된 template solution (37㎕)를 모두 혼합하여 최종 50㎕ 혼합물을 표 3과 같은 조건으로 PCR을 수행하고 반응물은 4℃에서 보관하였다.
세 번째 SELEX는 두 번째 SELEX에서 수득한 PCR 반응물을 두 번째 SELEX와 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만 PCR 진행을 표 2에서 보는 바와 같이 25 cycle을 수행하였다.
네 번째 SELEX는 세 번째 SELEX에서 수득한 PCR 반응물 50㎕에 DMSO용액 50㎕를 주입하고 (최종 50% DMSO) 5분간 denaturation하였다. denaturation된 PCR 반응물 100㎕, 10X SELEX buffer 50㎕, 10mM 쿠커르비타신 I 2.5㎕, 및 Nuclease free water 347.5㎕ 모두 혼합하여 최종 부피 500㎕의 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 외의 과정은 세 번째 SELEX와 동일하게 수행하였다.
[표 2]
Figure 112017094128545-pat00002
2-3. 5 th 6 th round SELEX
다섯 번째 SELEX를 수행하기 위해 상기 실시예 2-2의 네 번째 SELEX PCR 반응물 50㎕에 DMSO용액 50㎕를 주입하고 (최종 50% DMSO) 5분간 denaturation하였다. denaturation된 PCR 반응물 100㎕, 10X SELEX buffer 50㎕, 10mM 쿠커르비타신 I 1.25㎕, 및 Nuclease free water 348.75㎕를 모두 혼합하여 최종 부피 500㎕의 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물에 GO-MNP 복합체 200㎕ (함유 GO농도 약 1mg/ml)를 주입하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. GO-MNP 복합체와 반응이 끝난 혼합물에서 마그넷을 이용하여 GO-MNP 복합체를 분리하였다. 총 700㎕의 상청액(supernatant) 내 DNA strand들을 농축하기 위해 3M NaOAc 용액 770㎕와 2-프로판올 770㎕을 혼합하여 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션(incubation)하였다.
인큐베이션이 끝난 용액을 4℃, 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상청액(supernatant)을 제거하였다. 얻어진 펠렛은 70% Ethanol 1ml에 용해하여 4℃, 15,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상청액을 제거하고 상온에서 완전히 건조시켰다. 최종적으로 1X SELEX buffer 37㎕에 reconstitution 하고, 10X PCR buffer(Bioneer Taq polymerase 제품) 5㎕, 5’-Bank40-primer 2㎕, 3’-Bank40-primer 2㎕, dNTP mix(Bioneer Taq polymerase 제품) 4u, 및 농축된 template solution (37㎕)를 모두 혼합하여 최종 50㎕ 혼합물을 표 3과 같은 조건으로 PCR을 수행하고 반응물은 4℃에서 보관하였다.
여섯 번째 SELEX는 다섯 번째 SELEX에서 수득한 PCR 반응물 50㎕에 DMSO용액 50㎕를 주입하고 (최종 50% DMSO) 5분간 denaturation하였다. denaturation된 PCR 반응물 100㎕, 10X SELEX buffer 50㎕, 10mM 쿠커르비타신 I 2.5㎕, 및 Nuclease free water 347.5㎕ 모두 혼합하여 최종 부피 500㎕의 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 이 외의 과정은 세 번째 SELEX와 동일하게 수항하였으며, 다만 PCR 진행을 표 3에서 보는 바와 같이 10 cycle을 수행하였다.
[표 3]
Figure 112017094128545-pat00003
여섯 번째까지 각 단계에서 반복 선별되는 핵산 앱타머의 양은 도 2a에 나타냈다.
실시예 3. 쿠커르비타신에 특이적으로 결합가능한 핵산 앱타머 풀 제조
실시예 2에서 선별된 DNA의 농도를 흡광도 A260/A280을 이용하여 측정한 결과 A260/A280 = 1.57로 측정되었다. 이어 DNA에 2X reaction buffer 10㎕, 실시예 2에서 확보한 PCR 반응물 7㎕, DNA blunting enzyme 1㎕를 혼합하여 최종 부피 18㎕의 혼합액을 만들고 약하게 vortexing하고 낮은 rpm으로 원심분리를 수행하였다. 70℃ water-bath를 이용하여 5분간 인큐베이션하고, 즉시 ice로 냉각하여 샘플을 제조하였다. pJET cloning vetor (50ng/㎕) 1㎕, T4 DNA ligase 1㎕를 상기 샘플에 혼합하여 최종 20㎕를 제조한 후 약하게 vortexing하고 낮은 rpm으로 원심분리를 수행하였다. 상온에서 5분간 인큐베이션한 후 Enzynomics DH5α competent E. coli를 사용하여 transformation하였다.
상기 transformation은 제조한 DNA 샘플을 컴피턴트 세포(competent cell) 100㎕에 첨가하고 약하게 mixing 후 ice에서 30분간 인큐베이션하고, 42℃에서 30초간 heat-shock 후 ice에서 2분간 인큐베이션하였다. 이 후 Clean bench에서 SOC media 400㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 shaking하면서 인큐베이션하였다. 제조된 샘플에 0.1M IPTG 4㎕, X-Gal 20㎕를 혼합하고, 2개의 LB plate를 준비하여 한 개는 100㎕, 다른 한 개는 200㎕를 떨어뜨린 후 각각 스프레딩(spreading)하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
실시예 4. 선별된 20 종의 핵산 앱타머의 염기서열 결정 및 결합 특이성
상기 실시예 3에 의해 총 48개의 콜로니가 생성된 플레이트 두 개를 시퀀싱하여 최종적으로 표 4에 나타낸 것과 같이 20개의 핵산 앱타머 후보 염기서열을 수득하였다.
[표 4]
Figure 112017094128545-pat00004
표 4에서 서열번호 1 및 6은 밑줄 친 공통된 염기서열을 포함하고 있다.
상기 20종의 핵산 앱타머 중에서 쿠커르비타신 I에 특이성이 가장 높은 앱타머를 선택하기 위해 0.2mM 쿠커르비타신 I에 대해 금 나노입자를 이용하여 핵산 앱타머 후보들에 대한 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝 방법의 모식도를 도 2b에 나타냈다.
구체적으로 각 번호에 해당하는 1mM 핵산 앱타머 후보 50㎕와 0.2mM 쿠커르비타신 I 50㎕를 혼합하고 상온에서 15분간 반응시켰다. 여기에 100㎕의 금 나노입자 용액(Sigma Aldrich, 10nm size, ~6.0 x 1012 particles/ml)을 각각 주입하고 10분간 반응 후, 2M NaCl 용액 10㎕를 각각 주입주고 상온에서 10분간 developing 하였다. 표적물질과 강하게 결합하는 핵산 앱타머 후보의 경우에는 NaCl을 혼합하면, 금 나노입자들이 응집하여 색깔이 보라색으로 변한다. 또는 Positive control (gold nanoparticles과 charge에 의해 결합될 free DNA가 없는 경우)에도 보라색으로 변할 수 있다. 스크리닝 결과를 도 4에 나타냈다. 핵산 앱타머 후보들 중 #2, #4, #5, #8, #21, #25, #29가 쿠커르비타신 I와 결합되는 것으로 확인되었다.
실시예 5. 결합 특이성 및 교차반응성 분석
실시예 4에서 선별된 핵산 앱타머 #2, #4, #5, #8, #21, #25, #29의 교차반응성 분석을 위해 쿠커르비타신 I과 유사구조인 카운터 표적(counter target) triptolide, lupeol을 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 1mM #2, #4, #5, #8, #21, #25, #29의 각각 50㎕에 0.2mM triptolide, lupeol을 각각 50㎕씩 혼합하고 상온에서 15분간 반응시켰다. 여기에 100㎕의 금 나노입자 용액(Sigma Aldrich, 10nm size, ~6.0 x 1012 particles/ml)을 각각 주입하고 10분간 반응 후, 2M NaCl 용액 10㎕를 각각 주입주고 상온에서 10분간 developing 하였다.
카운터 표적물질 결합을 통해 유추할 수 있는 결과는 핵산 앱타머 후보들의 경우 연속된 cyclohexane과 같은 고리구조와 공통적으로 결합을 하는 것으로 보이나 #2, #8의 경우에는 표적물질인 쿠커르비타신 I가 카운터 표적물질과 달리 해당 고리구조의 (1,2) 및 (5,6) 위치에 이중결합 및 측쇄가 존재하는 차이점이 있으며 이러한 구조를 특이적으로 인식할 수 있음을 나타낸다.
그 결과를 도 5에 나타냈다. 카운터 표적물질과 결합하는 핵산 앱타머 후보는 NaCl을 주입한 경우, 금 나노입자들이 응집하여 색깔이 보라색으로 변하는 것으로, #4, #5, #21, #25, #29에서 색변화가 관찰되었다. 최종적으로 curcubitacin I 에만 선택적으로 결합하는 #2(도 3a), #8(도 3b)의 핵산 앱타머를 발굴하였다. #2, #8 핵산 앱타머는 쿠커르비타신 I를 선택적으로 검출할 수 있는 77mer 길이의 단일가닥 DNA 앱타머들이며, 유사화합물인 Triptolide, Lupeol에서는 반응하지 않고 쿠커르비타신 I에 선택적 반응을 나타내었고, 그 구조는 도 3a 및 도 3b에 각각 나타낸 바와 같다.
3a와 3b 모두 27도 상온에서 free energy가 가장 작은 안정된 상태의 구조를 예측한 결과이며 13.2kJ/mol, -16kJ/mol의 free energy를 각각 갖는다. 앱타머의 N40 가변 부위의 차이에 따라서 이들 앱타머의 예측된 2차 구조는 다르게 나타났으나 양 앱타머 서열 내에서 유사한 위치에 공통서열 (CGTA 또는 CCA)을 포함하는 것으로 나타났다. 이로부터 상기 공통 서열이 앱타머의 특이적 결합에 일정부분 영향을 미치는 것으로 보인다.
실시예 6. K D 값 결정
상기 실시예에서 테스트한 본원에 따른 앱타머의 KD 값을 결정하였다. 방법은 실시예 4와 동일하나, 쿠커르비타신의 농도를 달리하여 얻은 수치를 비선형비회귀 방법을 이용하여 결정하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있으며, 본원에 따른 #2 및 8의 KD 값은 각각 4.7135μM 및 8.5052μM 인 것으로 나타났다. 일반적으로 저분자화합물에 대한 앱타머의 KD 값은 타겟물질의 종류 및 앱타머의 길이에 따라 수백 pM에서 수십 μM로 다양할 수 있다. 상기 본원에 따른 앱타머의 KD 값은 비교적 긴 편에 달하는 본원에 따른 앱타머의 길이를 고려할 때, 쿠커르비타신에 대하여 우수한 민감도를 나타내는 것으로, 예를 들면 낮은 농도의 쿠커르비타신 검출도 가능할 수 있음을 나타낸다. 도 6의 세로 축은 반응물에 대한 상대적 형광세기 변화를 나타낸 결과이다.
실시예 7. 쿠커르비타신 B 및 E에 대한 결합능 분석
쿠커르비타신 I에 부가하여, 구조가 유사한 E 및 B에 대한 결합력을 또한 분석하였다. 실험은 실시예 4와 같이 수행되었다. 쿠커르비타신 E 및 B는 ㈜시그마 알드리치 코리아에서 구매를 하였다.
결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 본원에 따른 앱타머는 쿠커르비타신 I는 물론, E 및 B 형에도 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> National Marine Biodiversity Institute of Korea <120> Nucleic acids aptamer binding specifically to cucurbitacin <130> DP201709001P <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 1 tgacaccgta cctgctctcc acgcatatag tcctgatcag agtaatcgtg ccctggtgaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 2 tgacaccgta cctgctctac ggcgtcgtct tgcgtactaa tctgttcggc cactctccaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 3 tgacaccgta cctgctctgg cgtcggctgc actctctcgt tggtctaggg tccacgataa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 4 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 4 tgacaccgta cctgctctcg acactgtgac caagccagcc tacaggtctg cccgtaagca 60 cgccaaggga ctat 74 <210> 5 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 5 tgacaccgta cctgctctat ctggtccgag cacgcggttg gccgccaact tggctctgaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 6 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 6 tgacaccgta cctgctctca ctgagaaaaa tcgtacgaac tgagaccagt gtgcccctaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 7 tgacaccgta cctgctctag gcggggctgg ctcggttgtc cggtagagtg gtgcacgctc 60 aaagcacgcc aagggactat 80 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 8 tgacaccgta cctgctctcc tcaatgcgtg ttctaaccgg taattgatgg tatagcgaag 60 cacgccaagg gactat 76 <210> 9 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 9 tgacaccgta cctgctctgg ccaatctact tcaataccca gcgctctgaa cgatagggaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 10 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 10 tgacaccgta cctgctctcc aagctacggt ctatatgggc tgggctcatc agtaccgtaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 11 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 11 tgacaccgta cctgctctgg cgtgatcggt atttgcgggt tagtacgggg gtgcgcataa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 12 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 12 tgacaccgta cctgctctag tatcgatggc ctcctggctc atagggtgaa cactaatcaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 13 tgacaccgta cctgctctgg tagcgtagtc aggctagcgc ctcttagcct tcagcgtaag 60 cacgccaagg gactat 76 <210> 14 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 14 tgacaccgta cctgctctac cggcatctct ggccatattg ctggttgcgc ccaaagcacg 60 ccaagggact at 72 <210> 15 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 15 tgacaccgta cctgctctgg agcaaccagt atggaatcag accttcccac gctatggaag 60 cacgccaagg gactat 76 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 16 tgacaccgta cctgctctcg atgtcggatc tggcgtatct ataagggtca tcaaccacaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 17 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 17 tgacaccgta cctgctctgg cccgttctcc ttctgtctgg cttctaaccc agatgggtaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 18 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 18 tgacaccgta cctgctctcc tgggctgttt tcaggtaaac tgtccgcatc actcgtggaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 19 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 19 tgacaccgta cctgctctgc ttggggttga aaggcgtaca ggaatcttag gtcgccctaa 60 gcacgccaag ggactat 77 <210> 20 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cucurbitacin aptamer <400> 20 tgacaccgta cctgctctcc tgggctgttt tcaggtaaac tgtccgcatc actcgtggaa 60 gcacgccaag ggactat 77

Claims (10)

  1. 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열로 이루어진, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 쿠커르비타신은 19-(10→9β)-abeo-10α-lanost-5-ene 고리 및 도 1의 A에 기재된 탄소원자 번호를 기준으로 탄소원자(1,2) 및 (5,6)번에 이중결합 및 상기 고리에 -H, -CH3 측쇄를 갖는 구조를 포함하는 것인, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 쿠커르비타신은 쿠커르비타신 B, E, I, J, K, L 또는 S 형인, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산서열은 서열번호 2 또는 6인, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 앱타머는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 검출체로 표지되거나, 또는
    상기 앱타머는 나노입자에 결합된 것인, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 앱타머를 포함하는 쿠커르비타신 검출용 조성물.
  7. 서열번호 2, 3, 4, 6, 12, 13, 및 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열로 이루어진, 쿠커르비타신에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 핵산 앱타머를 제공하는 단계; 및
    상기 앱타머를 시험 대상 시료와 접촉하는 단계;
    상기 접촉결과를 검출하는 단계를 포함하는, 쿠커르비타신 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 앱타머는 표지 물질로 표지되어 있고, 상기 표지 물질로 표지된 앱타머는 고형지지체 상에 결합되어 있으며,
    상기 검출하는 단계는 상기 표지물질에서 발생하는 신호를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 검출 결과 음성 대조군과 비교하여 상기 신호가 증가한 경우, 상기 시험 대상 시료를 쿠커르비타신 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험대상 시료는 문어, 오징어, 가리비, 전복, 또는 달팽이를 포함하는 연체동물문 또는 해면류를 포함하는 해면동물문에 속하는 해양무척추 동물 유래인, 방법.
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