CN110082456B - 一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，涉及药物分析领域。本发明所利用的原理即：中成药中活性成分小檗碱和巴马汀异喹啉生物碱本身无荧光，葫芦脲[7]（CB[7]）本身也无荧光，但CB[7]能与小檗碱和巴马汀形成稳定的包合物，且可以使无荧光的小檗碱和巴马汀的荧光显著增敏，溶液的荧光显著增强。借助毛细管电泳的良好分离能力，小檗碱和巴马汀与CB[7]形成的包合物还能实现良好的分离，而且不被其它物质干扰，选择性好，而且灵敏度也比紫外检测高两个数量级。该毛细管电泳/荧光分析测定方法灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强；比现有的毛细管电泳/紫外分析测定法高两个数量级，而且该方法也可以用于生物样品中小檗碱和巴马汀的分析测定。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体为一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法。
背景技术
小檗碱和巴马汀是结构非常相似的异喹啉生物碱，主要存在于黄连、黄柏、三棵针和南天竹等天然中草药植物的根茎中。小檗碱和巴马汀有很多药理活性，可作为抗菌药、杀疟原虫药、止泻药、心血管药。小檗碱和巴马汀分离测定方法也有多种，如：毛细管电泳紫外检测法（CE-UV）、近红外光谱法（NIRS）、离子对超临界流体色谱法（IP-SFC）、流动注射胶束电色谱法（MEKC）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱质谱联用技术法（LC-MS）。前五种方法灵敏度比较低，液质方法灵敏度较高，但液质联用仪器设备昂贵较难推广。对相关成分进行简单快速、高灵敏测定一直是分析研究亟待解决的问题。
葫芦脲[n]（CB[n]）是由n个甘脲单元通过亚甲基桥联成的低聚物。CB[n]的端口具有酰脲羰基，它对有机阳离子化合物具有超强的包合能力。由于CB[n]及其衍生物和很多客体分子之间存在氢键作用、离子－偶极相互作用和偶极－偶极相互作用，被广泛应用于分子识别。葫芦脲[7]（CB[7]）因为它在水中有良好的溶解性，应用十分广泛，在水溶液中能与客体分子很快形成包合物，且形成的包合物在水溶液中很稳定。前期研究也发现CB[7]与异喹啉生物碱（如：小檗碱和巴马汀）之间具有很强的超分子作用，能形成稳定的包合物，在荧光分光广度计上能分别用于小檗碱或巴马汀药物、药物制剂和生物样品的测定，但荧光传感器选择性差，只能用于单个样品的测定。现有测定中成药中小檗碱、巴马汀等异喹啉生物碱的毛细管电泳/紫外检测法，主要不足之处在于灵敏度低，选择性差。因此需要改进现有技术中对小檗碱和巴马汀的检测方法，提高灵敏度、改善选择性。
发明内容
本发明为了解决小檗碱和巴马汀的检测中灵敏度低，选择性差问题，提供了一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，包括如下步骤：
（1）检测准备：缓冲溶液为PH=7的60 mmol·L‒1Na2HPO4和35%的甲醇水溶液；激光诱导荧光检测器：激发波长λex =300~500 nm，发射波长λem=450~600nm；准备色谱条件：实验所用毛细管柱；检测分离电压为24 kv，进样压力为0.5 psi，进样量为3~5s，温度为25℃；
（2）储备液的配制：称取一定量的小檗碱、巴马汀标准品和葫芦脲[7]，用步骤（1）中的缓冲溶液配制成一定浓度的小檗碱标准储备液和巴马汀标准储备液；并在两种储备液中加入葫芦脲[7]，葫芦脲[7]的物质的量是小檗碱和巴马汀物质的量的3倍以上；因为小檗碱和巴马汀分别与葫芦脲[7]形成1:1的包合物，葫芦脲[7]可使无荧光的小檗碱和巴马汀的荧光显著增强，当葫芦脲[7]的量达到3倍以上时，包合物的荧光基本不再增加。
（3）供试品溶液的配制：称取一定量的待测样品，并用一定量的甲醇超声萃取20min，静置10~15min，重复三次，合并三次萃取液；取一定量萃取液，估计该萃取液中小檗碱和巴马汀的含量；称取一定量的葫芦脲[7]粉末，葫芦脲[7]粉末是萃取液中小檗碱和巴马汀含量估计值的3倍以上，加入萃取液中；然后用步骤（1）中的缓冲溶液定容；
（4）将小檗碱和巴马汀标准储备液进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性和定量测定；然后将供试品溶液的进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性定量测定。
本发明所采用的原理为：中成药中活性成分小檗碱和巴马汀异喹啉生物碱本身无荧光，葫芦脲[7]（CB[7]）本身也无荧光，但CB[7]能与小檗碱和巴马汀形成稳定的包合物，且可以使无荧光的小檗碱和巴马汀的荧光显著增敏，溶液的荧光显著增强，在该测定方法中，要加入过量的葫芦脲[7]，就是为了保证将小檗碱和巴马汀全部包合后还有剩余，因此葫芦脲[7]的物质的量必须是小檗碱和巴马汀物质的量的3倍以上；在使用毛细管电泳-荧光检测法检测中成药药品中的小檗碱和巴马汀含量时，在药品中加入CB[7]，可以实现中成药中小檗碱和巴马汀的毛细管电泳-荧光检测，借助毛细管电泳的良好分离能力，小檗碱和巴马汀与CB[7]形成的包合物还能实现良好的分离，而且不被其它物质干扰，选择性好，而且灵敏度也比紫外检测高两个数量级。该方法同时也可应用于生物样品中小檗碱和巴马汀的测定。
本发明所提供的方法中，所有待测样品中添加葫芦脲[7]，采用毛细管电泳色谱分离，激光诱导荧光检测样品，步骤（1）的最佳检测波长：激发波长λex=400nm，发射波长λem=500nm。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：本发明所提供的一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，采用了毛细管电泳/荧光检测，相比现有毛细管电泳/紫外检测法灵敏度高、选择性好；可以实现中成药中该两种生物碱的快速高效测定，比毛细管电泳/紫外检测法高2个数量级，而且具有更高的选择性，也可应用于生物样品中小檗碱和巴马汀的测定。
附图说明
图1为金鸡胶囊的毛细管电泳色谱图。
图2为一清颗粒的毛细管电泳色谱图。
图3为血浆的毛细管电泳色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，包括如下步骤：
（1）检测准备：缓冲溶液为PH=7的60 mmol·L‒1Na2HPO4和35%的甲醇水溶液；激光诱导荧光检测器：激发波长λex =488 nm，发射波长λem=520 nm；准备色谱条件：实验所用毛细管柱75 μm × 60.00 cm；检测分离电压为24 kv，进样压力为0.5 psi，进样量为3~5s，温度为25℃；
（2）储备液的配制：称取一定量的小檗碱、巴马汀标准品和葫芦脲[7]，用步骤（1）中的缓冲溶液配制成一定浓度的445μg/mL的小檗碱标准储备液和450μg/mL的巴马汀标准储备液；并在两种储备液中加入葫芦脲[7]，葫芦脲[7]的物质的量是小檗碱和巴马汀物质的量的3倍以上；因为小檗碱和巴马汀分别与葫芦脲[7]形成1:1的包合物，葫芦脲[7]可使无荧光的小檗碱和巴马汀的荧光显著增强，当葫芦脲[7]的量达到3倍以上时，包合物的荧光基本不再增加。
（3）供试品溶液的配制：各称取0.3g的金鸡胶囊和一清颗粒，放入50mL锥形瓶中，并用20mL的甲醇超声萃取20min，静置10~15min，重复三次，合并三次萃取液；取2mL萃取液，估计该萃取液中小檗碱和巴马汀的含量；称取一定量的葫芦脲[7]粉末，葫芦脲[7]粉末是萃取液中小檗碱和巴马汀含量估计值的3倍以上，加入萃取液中；然后用步骤（1）中的缓冲溶液定容至10mL；
（4）加标血样溶液的配制：取1mL血浆于离心管中，加入已配制好的50μL小檗碱和巴马汀标准储备液，振荡摇匀，再加入4mL甲醇，在离心机中以6000rpm转速离心15min去蛋白，然后取1mL的上层清液，加入过量的葫芦脲[7]粉末，葫芦脲[7]含量是5mL小檗碱标准储备液和5mL巴马汀标准储备液所含小檗碱和巴马汀物质的量总的3倍以上，用步骤（1）中的缓冲溶液定容；
（5）将小檗碱和巴马汀标准储备液进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性和定量测定；然后将金鸡胶囊和一清颗粒的供试品溶液进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性定量测定；将加标血样溶液进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性定量测定。
在步骤（1）的色谱条件下，对金鸡胶囊、一清颗粒、加标血浆中的小檗碱和巴马汀进行了定性和定量测定。金鸡胶囊、一清颗粒、加标血浆的毛细管电泳色谱图见图1–3，图中a峰为小檗碱，b峰为巴马汀，从图中可以看出在几个样品中小檗碱和巴马汀均能达到基线分离，其它物质峰无干扰，表明具有良好的选择性，3种实际样品在12分钟内就可以完成分离测定。金鸡胶囊中的杂质峰在此色谱条件下是不出峰，只有小檗碱和巴马汀两个峰；一清颗粒中的杂质峰不影响样品峰的测定，加标血浆中的杂峰对样品峰不会产生干扰，并且谱图基线噪音小，说明此方法适用于中药金鸡胶囊、一清颗粒以及血浆中小檗碱和巴马汀的测定。此方法线性关系良好，且相比毛细管电泳/紫外检测检测限高两个数量级，可以实现小檗碱和巴马汀的简便快速、灵敏的测定。
本发明要求保护的范围不限于以上具体实施方式，而且对于本领域技术人员而言，本发明可以有多种变形和更改，凡在本发明的构思与原则之内所作的任何修改、改进和等同替换都应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）检测准备：缓冲溶液为PH=7的60 mmol·L‒1Na2HPO4和35%的甲醇水溶液；激光诱导荧光检测器：激发波长λex =300~500 nm，发射波长λem=450~600nm；准备色谱条件：实验所用毛细管柱；检测分离电压为24 kv，进样压力为0.5 psi，进样量为3~5s，温度为25℃；
（2）储备液的配制：称取一定量的小檗碱、巴马汀标准品和葫芦脲[7]，用步骤（1）中的缓冲溶液配制成一定浓度的小檗碱标准储备液和巴马汀标准储备液；并在两种储备液中加入葫芦脲[7]，葫芦脲[7]的物质的量是小檗碱和巴马汀物质的量的3倍以上；
（3）供试品溶液的配制：称取一定量的待测样品，并用一定量的甲醇超声萃取20min，静置10~15min，重复三次，合并三次萃取液；取一定量萃取液，估计该萃取液中小檗碱和巴马汀的含量；称取一定量的葫芦脲[7]粉末，葫芦脲[7]粉末是萃取液中小檗碱和巴马汀含量估计值的3倍以上，加入萃取液中；然后用步骤（1）中的缓冲溶液定容；
（4）将小檗碱和巴马汀标准储备液进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性和定量测定；然后将供试品溶液的进行毛细管电泳/荧光检测，对其进行定性定量测定。
2.根据权利要求1所述的一种测定中成药中巴马汀和小檗碱的方法，其特征在于：所有待测样品中添加葫芦脲[7]，采用毛细管电泳色谱分离，激光诱导荧光检测样品，步骤（1）的最佳检测波长：激发波长λex=400nm，发射波长λem=500nm。
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