CN113552068A - 一种异喹啉生物碱的快速精准检测方法、应用及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种采用8‑羟基‑1,3,6‑芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有机荧光探针快速、精准检测异喹啉类生物碱,特别是盐酸小檗碱的方法,及其在中药黄连生产工艺中的应用,以及一种异喹啉类生物碱快速检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种采用8-羟基-1,3,6-芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有荧光探针,快速精准检测异喹啉类生物碱,特别是盐酸小檗碱的 方法,及其在跟踪黄连生产工艺中的应用,以及一种异喹啉类生物碱快速检测试 剂盒。
发明背景
异喹啉类生物碱是最大的一类生物碱。以异喹啉或四氢异喹啉为母核,根据 连接基团的不同,可分为:简单异喹啉类、苄基异喹啉类、阿朴菲类、双苄基异 喹啉类、小檗碱类、普罗托品类、吗啡类和苯菲啶类。异喹啉类生物碱具有多种 生物活性,如抗肿瘤、抗炎、镇痛、免疫调节和抗氧化作用等。
研究显示,黄连、黄柏的药理活性主要与其所含的多种季铵型异喹啉类生物 碱有关,包括盐酸小檗碱(以下简称小檗碱)、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药 根碱等,其中以小檗碱的含量最高。五种主要生物碱均具有季铵基团,在分子结 构特点上均属异喹啉类生物碱。
小檗碱是黄连、黄柏等中药材的主要活性成分之一,属于异喹啉类,特别是 单苄异喹啉类季铵型生物碱,具有抗菌、消炎、抗心律失常、降血脂、降血糖以 及抗肿瘤等多种药理活性。由于药源十分丰富,价格相对适中,不良反应少,小 檗碱作为一种广谱的抗菌药物被广泛用于现代制药行业。
小檗碱含量测定是衡量黄连质量的重要指标,其测定方法主要有高效液相色 谱法、SDS法、双波长薄层扫描法、化学发光法、毛细管电泳法和电化学分析法 等。一些传统的分析方法具有量化小檗碱的能力,但大多数方法需要昂贵的仪器, 复杂和耗时的操作步骤。
目前,大生产实践中,缺少一种快速、精准检测异喹啉类生物碱,特别是小 檗碱的方法。同时,荧光方法用于异喹啉生物碱,特别是小檗碱检测的研究也十 分有限,特别是工业化生产中的快速检测。
发明内容
本发明针对异喹啉生物碱实施快速精准检测的问题,采用荧光法,特别是有 机荧光探针法,基于荧光“开关”原理,对小檗碱进行快速检测。
本发明有动机地设计大量的、不同的有机荧光探针、无机荧光探针实验,筛 选、对比、优化。申请人对荧光素类、罗丹明类、香豆素类、苯并噻唑类等有机 类荧光探针和碳点、量子点、金纳米簇等无机类荧光探针进行了筛选。最终得到 了一种采用HPTS作为有机荧光探针快速精准检测异喹啉类生物碱的方法。
本发明建立小檗碱快速检测技术方法;确定工艺判定标准,将快速检测小檗 碱的方法应用于黄连生产工艺;跟踪并检测黄连提取各工序中的小檗碱的浓度; 为大生产提供能够快速精准检测小檗碱的试剂盒实物。
本发明从以下几方面进行了设计研究(1)从发光材料中筛选高量子产率和 长荧光寿命的有机探针;(2)建立小檗碱快速检测方法,并进行方法学考察;(3) 跟踪黄连生产工艺,验证检测方法,确定检测操作方法及工艺判定标准;(4)制 作成品检测试剂盒。
申请人发现,由于HPTS和小檗碱之间的静电相互作用和π-π堆积形成了复 合物导致HPTS荧光猝灭。HPTS对小檗碱的检测方法成本较低、灵敏度高、易 于观察且响应速度快,参见图1。
本发明HPTS速检测小檗碱的方法,具有量子产率高、荧光寿命长、易于可 视化且检测结果的准确度较高、成本较低的特点。
本发明检测方法对大生产中的黄连样品进行了实测,相较HPLC等其他检测 方法,检测时间大幅缩短,每个样品在荧光光度计中的检测时间低于1分钟,甚 至低于30秒,比HPLC方法缩短了约2个数量级。
本发明方法考虑了成本的经济性,适用于工业化大生产。
说明书附图
图1:HPTS与小檗碱结合前后的示意图;
图2:HPTS检测不同浓度小檗碱结果图;
其中,图2(A):不同浓度的小檗碱对HPTS荧光响应的照片;
图2(B)不同浓度的小檗碱对HPTS的荧光滴定光谱;
图2(C)HPTS相对小檗碱浓度的相对强度图;
图2(D)和图2(E):分别为(F/F0)与小檗碱浓度在0.74至7.44 μg/mL和7.442至26.03μg/mL之间的线性关系;
图3:利用HPTS对第一批样品浓度的计算过程图;
图4:利用HPTS对第二批样品浓度的计算过程图;
图5:HPTS对小檗碱的检测机理数据分析图;
其中,图5(A)含和不含小檗碱的HPTS(1μM)的荧光寿命衰减曲线;
图5(B)不同温度对荧光响应F/F0的影响;
图6:HPTS对样品的测定值与液相值的对比图;
图7:HPTS检测中的样品、仪器图;
图8:HPTS检测黄连样品的步骤图;
图9:荧光分光光度计参数配置图。
具体实施方式
实施例1HPTS探针的合成
探针HPTS的制备过程
在三口烧瓶中加入浓硫酸,搅拌下加入芘(芘与浓硫酸的质量比例为3∶25), 升温使其全部溶解,加热至90℃并保温1小时。对三口烧瓶用水浴降温至40℃ 以下,滴加液态SO3(芘与液态SO3的质量比例为1∶4),3小时滴加完毕。滴加 液态SO3完毕后,保持温度100℃左右反应5小时,降至室温。把上述三口烧瓶 中物料倒入冰水中(芘与冰水的质量比例为1:5),形成粘稠物,过滤抽干得滤饼, 得到芘四磺酸。将芘四磺酸溶于水中,搅拌下用片状NaOH中和至中性后;再 加入片状氢氧化钠(芘与片状NaOH的质量比例为1:2.5),慢慢升温至微沸状态 下保温5小时。降至室温后,先用盐酸中和到pH值为7,再加入NaCl(芘与 NaCl的质量比例为1.2∶1)搅拌溶解,慢慢析出淡黄色固体8-羟基-1,3,6-芘三磺 酸钠盐(HPTS)。
实施例2HPTS检测盐酸小檗碱
配制HPTS母液:首先,准确称取0.0262g HPTS固体粉末置于50mL容量 瓶中,用水定容并摇匀。然后从上述溶液中取2mL加入另一50mL容量瓶中, 用水定容并摇匀,即得到浓度为40μmol/L的HPTS母液。
配制小檗碱标准品溶液:准确称取0.0214g小檗碱标准品,置于25mL容 量瓶中,并用乙醇进行定容。即得到2mmol/L浓度的小檗碱标准品溶液,此时 小檗碱标准品溶液的质量体积浓度为0.0214g/25mL=0.86mg/mL。
小檗碱标准品溶液对HPTS的荧光滴定实验:取若干个体积为10mL的容 量瓶进行标号,并使用微量移液器在每个容量瓶中都加入100μL的HPTS荧光 探针母液,然后再按标号分别加入0、10、20、30、40、50、75、100、125、150、 200、250、300、350μL的小檗碱标准品溶液,并用蒸馏水进行定容。充分摇匀 混合溶液在室温下静置10min以使其充分反应。然后将它们放入紫外箱中,如 图2A所示,在365nm紫外灯的照射下,随着小檗碱浓度的增加,HPTS的绿色 荧光逐渐减弱,肉眼可清楚地观察到荧光猝灭现象。然后利用荧光分光光度计进行混合溶液荧光强度的准确测定。
仪器参数设置:将仪器扫描模式调整为发射模式,然后将激发波长设置为 400nm,发射起始波长设置为420nm,发射终止波长设置为700nm,同时将激 发狭缝和发射狭缝均设置为5nm,然后开始进行扫描,并做好数据的记录和保 存。以上实验在相同的条件下平行三次。
浓度之间的换算关系:根据CxVx=CyVy,此式中Cx为2mmol/L,Vx为每个 容量瓶中所加入的小檗碱标准品溶液的体积(0、10、20、30、40、50、75、100、 125、150、200、250、300、350μL),Vy为10mL(所用容量瓶的规格),由以 上稀释定律可以得到每个容量瓶中小檗碱的浓度Cy(μmol/L)。由CyM/1000即 得到每个容量瓶中小檗碱的质量体积浓度C(μg/mL)。浓度之间的换算关系见 下表1。
表1浓度之间的换算关系
用Origin软件进行线性曲线的绘制:首先,将第一次实验得到的荧光滴定 数据导入Origin,以发射波长为横坐标(X),荧光强度为纵坐标(Y)进行折 线图的绘制,此图即为不同浓度的小檗碱对HPTS的荧光响应图(图2B),该 图显示HPTS的荧光强度随着加入小檗碱浓度的增加而降低。将三次平行实验得 到的荧光滴定数据导入Origin,以发射波长为横坐标(X),荧光强度为纵坐标 (Y),然后选中荧光滴定数据中发射波长为518nm所对应的那一行荧光强度 值,复制,粘贴到Excel中。
(1)计算标准偏差。将未加入小檗碱的HPTS溶液的三组荧光强度数据输 入Excel,分别计算三组平行实验数据的平均值得到然后将加入不同浓度小 檗碱后对应的荧光强度数据输入Excel,计算出分别计算三组平行实验数 据的平均值【接下来用F/F0表示】,待用。在“统计”类 别中选择函数“STDEVA”,然后分别计算三组数据的标准偏差,待用。
以表1中最后一行为横坐标、以相应浓度对应的荧光响应(F/F0)为纵坐标 做散点图2C,即得到HPTS相对小檗碱浓度的相对强度图。分别取0.74至7.44 μg/mL之间的小檗碱浓度为横坐标,相应的荧光响应(F/F0)为纵坐标;7.44至 26.03μg/mL之间的小檗碱浓度为横坐标,相应的荧光响应(F/F0)为纵坐标进 行线性拟合,得到线性曲线。图2D和图2E分别为(F/F0)与小檗碱浓度在0.74 至7.44μg/mL和7.44至26.03μg/mL之间的线性关系。(F/F0)与小檗碱浓度在 0.74至7.44μg/mL之间的线性方程为:
F/F0=-0.0708C+0.9336 公式(1)
根据LOD=3σ/K,检出限为0.96mg/mL。(F/F0)与小檗碱浓度在7.44至 26.03μg/mL之间的线性方程为:
F/F0=-0.0153C+0.5167 公式(2)
根据LOD=3σ/K,检出限为4.43mg/mL。
其中,图2(A)为不同浓度的小檗碱对HPTS荧光响应的照片;(B)不同 浓度的小檗碱对HPTS的荧光滴定光谱;(C)HPTS相对小檗碱浓度的相对强 度图;(D)和(E)分别为(F/F0)与小檗碱浓度在0.74至7.44μg/mL和7.442 至26.03μg/mL之间的线性关系。
实施例3第一批样品的检测
黄连样品在申请人相关药品生产工序采集。
各工序样品溶液配制:首先,取若干个25mL容量瓶,分别标号,然后分 别精确称取0.017g调酸后的黄连样品、0.017g调碱后的黄连样品以及用微量移 液器移取25μL黄连浓缩膏分别加入到对应的容量瓶中,并用乙醇定容,然后将 所有样品溶液超声10min至全溶,置于室温下静置,待用。
黄连样品用量条件的摸索:首先各取1个调酸后的黄连样品母液、调碱后的 黄连样品母液以及加入25μL的黄连浓缩膏样品母液,然后进行对照实验。调酸 后黄连样品用量条件的摸索:取4个10mL容量瓶,分别标号,然后在每个容 量瓶中都加入100μL HPTS探针母液,并分别加入200、400、600、800μL体积 的调酸后的黄连样品母液,并用蒸馏水定容,摇匀,静置10min以使其充分反 应。然后利用荧光分光光度计进行荧光强度的准确测定,测定方法及参数设置均 同小檗碱标准品溶液荧光测定一致。同理,调碱后的黄连样品母液也是照此进行。 加入25μL黄连浓缩膏样品母液设置了3个对照实验,即取3个10mL容量瓶, 分别标号,然后在每个容量瓶中都加入100μL HPTS探针母液,并分别加入50、 100、150μL黄连浓缩膏样品母液,并用蒸馏水定容,摇匀,静置10min后开始 测其荧光强度。之后,又取1组样品进行了对照实验。通过小檗碱标准曲线得出 样品中小檗碱含量,经过和液相分析相比,发现加入600μL调酸后的黄连样品 母液、600μL调碱后的黄连样品母液、100μL黄连浓缩膏样品母液所测得的样品 中小檗碱含量与液相分析的结果最接近,因此在后续实验中我们将按照这个标准 进行取样。
待检测溶液的配制:首先,取出若干个10mL容量瓶,分别进行标号(0、 J-89、J-90、J-91、J-92、J-95、J-96...J-104;S-89、S-90、S-91、S-92、S-95、S-96...S-104; P-89、P-90、P91-92、P97-98、P99-100、P101-102、P103-104),然后在每个容 量瓶中都加入100μL HPTS探针母液,并分别加入600μL调酸后的黄连样品母 液、600μL调碱后的黄连样品母液以及100μL黄连浓缩膏样品母液的上清液到 相应的容量瓶中,并用蒸馏水定容到10mL,放置10min,以使其充分反应,然 后开始测定其荧光强度。
样品中小檗碱浓度的检测:参数设置和测定方法均与上述小檗碱标准品溶液 荧光测定相同,将所测荧光数据导入到Origin中,并进行绘制折线图。然后选 中518nm发射波长处所对应的那一行荧光强度值,进行复制,并在Origin表格 中进行转置粘贴,然后将此列数据重新选中进行复制并粘贴到Excel表格中,此 列数据即为所测的荧光强度值F。其中加入样品量为0μL的样品所对应的荧光 强度值为F0,然后利用公式求出F/F0得到新的一列。若F/F0>0.417,则可利用公 式(1)求出对应的C1(单位:μg/mL),若F/F0<0.417,则利用公式(2)求出 对应的C1(单位:μg/mL),得到新的一列即为C1,然后我们根据C1V1=C2V2, 此式中V1为10mL(容量瓶规格),V2视每个取样的样品而定,若为调酸后的或 调碱后的黄连样品母液则V2为600μL,则输入公式“=C1/60”可得到一列与之对 应的C2(单位为mg/mL),若为黄连浓缩膏样品母液则V2为100μL,则输入公 式“=C1/10”可得到与之对应的C2(单位为mg/mL)。然后我们通过公式 “=C2×25/0.017”将调酸或调碱后的黄连样品母液对应的一系列C2(mg/mL)转换 为C3(单位为mg/g),即为调酸或调碱后的黄连样品中的异喹啉生物碱含量C3。 同理,通过公式“=C2×25/(100×10-3)”将黄连浓缩膏样品母液对应的一系列C2转换为C3(单位为mg/mL),即为黄连浓缩膏样品中的异喹啉生物碱含量C3。以上 计算过程,见图3。
与液相分析相比,探针HPTS检测的样品中小檗碱浓度基本一致,仅存在 0-50mg/g左右的差异,表明本发明快速检测方法快速、准确。
实施例4第二批样品的检测
HPTS对第三批样品的检测及计算过程见图4,检测步骤与对第二批样品的 检测类似。结果表明本发明快速检测方法快速、准确。
实施例5HPTS对小檗碱的检测机理分析
HPTS具有良好的水溶性,并带有很强的负电荷。小檗碱是一种带正电荷的 分子,可能促进HPTS和小檗碱之间的静电相互作用。为了研究HPTS在小檗碱 存在下显著荧光猝灭的机理,我们进行了以下测量。首先,研究了在无小檗碱和 有小檗碱情况下HPTS的荧光寿命。从图5A中可以发现,添加小檗碱后,HPTS 的荧光寿命几乎没有影响,这表明小檗碱对HPTS很可能发生了静态猝灭。另外, 在小檗碱存在下,从HPTS的温度依赖性荧光光谱(图5B)可以看出,在低温 下,荧光猝灭的效果更好。这些结果表明HPTS荧光猝灭不是由动态猝灭引起的, 而是由HPTS和小檗碱之间的复合物形成的。这些结果表明,HPTS可以通过静 电相互作用和π-π堆积等非共价协同作用选择性结合小檗碱,从而导致荧光猝灭。
其中,图5(A)含和不含小檗碱的HPTS(1μM)的荧光寿命衰减曲线; 图5(B)不同温度对荧光响应F/F0的影响。
实施例6HPTS对样品的测定值与液相值的对比
样品调碱、调酸的方法参照实施例3。
表2本法对调碱样品的测定值与液相值的对比
表3本法对调酸样品的测定值与液相值的对比
表4本法对黄连浓缩膏的测定值与液相值的对比
相关的数据拟合曲线请见图6。可以看出,本法测定值与液相测定值基本一 致,呈现良好的拟合关系,满足大生产检测要求。
实施例7HPTS对小檗碱荧光检测试剂盒的实验操作方法
准备25mL和10mL的试剂瓶或容量瓶若干;100μL和200μL的微量移液 器各一个,移液器吸头若干;胶头滴管;小烧杯;ZF-20D暗箱式紫外分析仪; 港东科技的F-380荧光分光光度计。HPTS探针母液、小檗碱标准品溶液和黄连 样品母液的配置详见实施例1。
ZF-20D暗箱式紫外分析仪的使用。先打开“电源”开关,再打开“365nm”开 关,肉眼观察暗箱中样品的荧光。观察完毕后,先关闭“365nm”开关,再关闭“电 源”开关。
F-380荧光分光光度计的使用。
1、开机:启动计算机,开启仪器主机电源。2、双击桌面图标(ZWin荧光 分光光度计软件)。主机自行初始化,扫描界面自动进入。初始化结束后,须预 热15-20分钟。3、参数设置:点击扫描界面右侧“测量方法”,然后点击“仪器” 进行主要参数设置;扫描模式:发射。数据模式:荧光强度。激发波长:400nm。 发射起始波长:420nm。发射终止波长:700nm。激发狭缝:5nm。发射狭缝: 5nm。4、扫描测试:(1)将制备的样品加入样品池中,样品体积在1/2-2/3之间, 然后打开光度计上方的盖子将样品池放入其中,最后盖上光度计的盖子。(2)点击扫描界面右侧“扫描”,窗口出现扫描谱图。5、按住Ctrl+S,对文件进行保存。
研究发现,由于HPTS和小檗碱之间的静电相互作用和π-π堆积形成了复合 物导致HPTS的荧光猝灭,HPTS对小檗碱的检测方法成本较低、灵敏度高、易 于观察且响应速度快,检出限可达4.43mg/mL。荧光探针法完全适用于黄连提 取工艺中小檗碱含量的快速、实时监测。
Claims (7)
1.一种异喹啉类生物碱的检测方法,其特征在于采用HPTS作为有机荧光探针。
3.权利要求1所述的检测方法,其特征在于:
配制HPTS母液;
配制异喹啉类生物碱溶液;
取HPTS荧光探针母液,加入异喹啉类生物碱标准品溶液,蒸馏水定容,摇匀、静置;利用荧光分光光度计进行混合溶液荧光强度测定。
4.权利要求2所述的检测方法,其采用的荧光分光光度计参数为:激发波长为400nm,发射起始波长为420nm,发射终止波长为700nm,激发狭缝5nm,和发射狭缝5nm。
5.权利要求1-4所述的检测方法,其特征在于异喹啉类生物碱选自小檗碱。
6.权利要求1-4所述的检测方法,在黄连提取物生产中的应用。
7.一种异喹啉类生物碱检测试剂盒,其特征在于采用权利要求1-4任一项所述的方法。
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