CN109507165A - 一种蜂蜜中果糖含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜂蜜中果糖含量的检测方法，该方法为：以苯硼酸衍生物3‑喹啉‑硼酸为荧光探针加入到稀释后的蜂蜜溶液中，对该蜂蜜溶液进行荧光检测，以316nm的光源作为激发波长，测量400nm处的荧光强度，对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合计算，得到果糖含量。本发明与传统的果糖含量测量方法相比，具有灵敏度高、选择性好、样品无需预处理、低成本、检测快速等优点。

Description

一种蜂蜜中果糖含量的检测方法

技术领域

本发明属于食品快速检测技术领域，尤其涉及一种以苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)为荧光探针对蜂蜜中果糖含量进行检测的方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集花朵中的花蜜或植物的分泌物，经蜜蜂使用特殊物质的加工、酿造、混合并储存于蜂巢中的一种甜蜜物质。蜂蜜具有丰富的营养物质，对人们益处很大，深受人们喜爱。蜂蜜中碳水化合物由葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类物质组成，果糖在蜂蜜中的含量在37.8％到41.3％之间，由于蜂蜜具有独特的风味和营养价值，蜂蜜有着巨大的市场空间和利润，因此，蜂蜜掺假是目前市场上比较突出的问题，掺假蜂蜜不利于人体健康，通过检测蜂蜜中果糖含量有助于判断蜂蜜是否掺假。高效液相法是检测果糖含量的最常见方法，该类方法测量结果准确可靠，检测限和定量检测限非常低，二者的值可以分别达0.07mg/L和0.22mg/L。分光度法也是检测果糖的常用方法，该种方法需要用化学试剂将果糖转化为吸光度和果糖浓度成线性关系的反应产物，常用的试剂有新铜试剂、二硝基水杨酸等。但上述方法都存在需要配备专业的操作人员、样品的前处理比较复杂、检测时间长和检测费用高等缺点。

研究快速、低成本、高效的检测果糖的方法是目前食品安全领域研究的热点，一些果糖生物传感器采用类似循环伏安法的检测设备，在果糖脱氢酶的催化作用下，果糖分子被工作介质氧化，失去H⁺，生成5-酮-D-果糖，同时，处于还原态的工作介质在两电极之间电压的作用下被氧化，失去电子，传感器的工作电流和果糖浓度成线性关系，工作介质有锇聚合物、聚酰胺-胺树状大分子等。

近几年来，荧光探针因其灵敏度高、选择性好、样品无需预处理、低成本、检测快速等优点而备受关注，可用于氨基酸检测、DNA检测、金属离子检测、疾病预测等方面的检测。喹啉-硼酸作为糖类识别功能起步较早，有文献报导了8-喹啉-硼酸(8QBA)、5-喹啉-硼酸(5QBA)和3-喹啉-硼酸(3QBA)对糖类的识别能力和识别机制。利用苯硼酸衍生物对蜂蜜中果糖含量测定的方法尚未见报导，相关检测技术并没有得到突破性的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)为荧光探针对蜂蜜中果糖含量进行检测的方法，旨在解决上述背景技术中现有技术的不足。

本发明是这样实现的，一种蜂蜜中果糖含量的检测方法，该方法为：以苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)为荧光探针加入到稀释后的蜂蜜溶液中，对该蜂蜜溶液进行荧光检测，以316nm的光源作为激发波长，测量400nm处的荧光强度，对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合计算，得到果糖含量。

优选地，所述荧光探针的浓度为3.6mg/L，配制时需要通氩气至少30分钟以上，使得400nm处的荧光产生淬灭；

所述对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合具体为：选取果糖浓度分别10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的水溶液作为标准溶液，分别测量其对应的荧光强度，荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合。

优选地，所述最小二乘法线性拟合的计算函数为：

I₄₀₀＝4.211×10³x+1.673×10⁵；

上式中，I₄₀₀为400nm处的荧光强度，x为果糖含量，单位为mg/L。

优选地，所述蜂蜜的浓度应低于125mg/L。

本发明克服现有技术的不足，提供一种以苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)作为荧光探针蜂蜜中果糖含量的检测方法。荧光是一种基于电子跃迁的光致发光现象。当用紫外-可见光照射荧光物质时，荧光物质吸收某些特征频率的光子的能量，电子从基态跃迁到第一或第二电子激发态中各个振动能级，处于激发态的电子不稳定，停留短暂时间(10^-9s级)，又跃迁到基态中的各个不同能级，同时释放荧光。不同荧光物质的能级结构不同，荧光特征也不相同。因此，可利用物质的激发光谱和荧光光谱特征对物质进行定性鉴定。也以对溶液中的荧光物质进行定量分析，其含量和对应荧光强度服从郎伯-比尔定律，公式如(1)：

(1)式中，I(c)表示光电探测器的光电流，它和溶液中荧光物质的荧光强度成正比；系数K_Φ为与光电探测器响应、荧光量子效率、系统采集效率和输入光的强度等参数决定的一个综合系数；ε(λ)为摩尔吸收系数；ι为光程；c为样品的含量。

已知e^－x可以展开为级数：

当x很小时，忽略高次项，则E^-x≈1-x，则1-E^-x≈x，故(1)式可展开为：

I(c)＝K_Φε(λ)ιc (2)

当溶液中荧光物质浓度比较低时，ε(λ)ιc值比较小，(2)式成立，即ι、K_Φ和ε(λ)一定时，溶液中荧光物质的含量和其荧光强度呈线性关系。3QBA荧光探针有一个喹啉发光基团和一个硼酸识别基团，识别基团与果糖的两个以CH2OH形式的羟基发生酯化反应：喹啉基团失去一个质子，呈酸性，同时果糖分子的羟基表现出供电子特性，呈碱性，果糖中的羟基进入硼酸基团中硼原子中空着的P轨道，改变硼原子的SP3杂化状态。上述过程大大增强了喹啉发光基团在400nm处的荧光强度，荧光强度与果糖的含量成线性关系，从而实现果糖含量的测量。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明与传统的果糖含量测量方法相比，具有灵敏度高、选择性好、样品无需预处理、低成本、检测快速等优点。

附图说明

图1是3QBA溶液的激发光谱、发射光谱和通氩气30分钟后荧光淬灭后的发射光谱；

图2是蜂蜜在316nm的光激发、发射光峰值波长为440nm左右时不同浓度的蜂蜜溶液的荧光光谱；

图3是荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合(标定曲线)的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1、试剂与测量仪器

试剂采用3-喹啉-苯硼酸，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、D-果糖和酒精，纯净水，选取蜂蜜4种不同样品，依次编号，不同生产厂家的1号样品、2号样品、3号样品和4号样品，测量仪器为稳态荧光光谱仪(Horiba，Ltd.)。

3QBA微溶于水，溶解速度缓慢，配制浓度为3.6mg/L左右，溶液中加入酒精溶液，加入的量为3QBA溶液的10％，摇匀，通氩气至少30分钟以上。备用。果糖溶液用于配置标准溶液，其配制的浓度依次为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L。葡萄糖、蔗糖和麦芽糖用于荧光探针选择性识别实验，配制溶液的浓度均为30mg/L。

2、荧光探针的荧光特性

3QBA溶液的激发光谱和发射光谱如图1所示，最大激发波长为316nm，最大发射波长为400nm，通氩气30分钟后，在400nm处的荧光淬灭，没有荧光产生。

3、待测样品的荧光特性

蜂蜜在316nm的光激发下，有荧光产生，发射光峰值波长为440nm左右，不同浓度的蜂蜜溶液的荧光光谱如图2，由图2可以看出，其荧光强度随蜂蜜浓度减小而减弱，当蜂蜜浓度低于125mg/L时，蜂蜜溶液中荧光物质发出的荧光强度比较小，再经过水溶剂的吸收，几乎无荧光发出。

4、标定曲线

将荧光探针3QBA浓度为3.6mg/L的水溶液和分别和浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的果糖标准溶液按1：1在容量瓶中混合、摇匀，由于荧光探针的作用，荧光强度在400nm处得到增强，分别测量其对应的荧光强度，通过Origin8.0软件对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合，结果如图3所示，果糖含量和荧光强度呈线性关系，线性相关系数为0.996。

预测函数如下式(3)所示：

I₄₀₀＝4.211×10³x+1.673×10⁵ (3)

5、蜂蜜果糖含量测量及加标回收率检测

将4种来自不同产地的蜂蜜样品，依次编号为1～4，均用纯净水稀释至100mg/L，分别和探针溶液按1：1在容量瓶中混合、摇匀，测量其荧光强度，根据公式(3)，计算出每个样品的果糖含量。

为了验证基于3QBA荧光探针法测试果糖浓度的准确，用高效液相色谱仪(Agilent1100)分别测量样品1～4的果糖含量，测试条件为如下，

色谱柱：zorbax NH2(250mm×4.6mmID，5μm)，流动相：乙腈/水＝85：15(V/V)，流速：1.0ml/min，示差折光检测器，柱温：30℃。

为了测试样品1至样品4的加标回收率，将上述浓度为100mg/L的4种蜂蜜溶液分别和浓度为50mg/L的果糖按体积比分别为1：1在容量瓶中混合摇匀，再和3QBA荧光探针混合搅匀，分别测量其对应的荧光强度，加标回收率公式如下式(4)所示：

加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％(4)

由公式(4)计算样品1到样品4的加标回收率。所有样品的测量结果如表1所示：

表1所有样品的测量结果

6、荧光探针对单糖及双糖的选择性

将3QBA探针溶液分别与浓度均为30mg/L的果糖溶液、葡萄糖溶液、蔗糖溶液和麦芽糖溶液进行混合搅匀，测量的荧光如表2所示，为了比较荧光探针对单糖及双糖的选择性，定义“识别能力”参数进行评价，将“识别能力”记作Ra，设3QBA探针溶液在400nm处的荧光强度为F0，加入待识别物质后的荧光强度为F1，定义如下式(5)所示：

经测量，3QBA探针溶液在400nm处的荧光强度F0＝2.72×10⁵CPS，样品测试数据及按照公式(5)计算识别能力Ra数据如下表2所示：

表2样品测试数据及识别能力数据

加入的待识别物	浓度(g/L)	F1	识别能力(Ra)
				果糖	0.003	6.39×10<sup>5</sup>	134.92％
葡萄糖	0.003	2.87×10<sup>5</sup>	5.51％
				蔗糖	0.003	3.12×10<sup>5</sup>	14.71％
麦芽糖	0.003	3.35×10<sup>5</sup>	23.16％

表2的数据表明，3QBA对蜂蜜中的果糖选择性最强，其识别能力达134.92％，分别约是葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的24倍、9倍、6倍，由于蔗糖和麦芽糖在蜂蜜含量均在5％以下，其含量约是果糖在蜂蜜中含量的1/8，相当于对果糖的识别能力分是对蔗糖识别能力的72倍，是对麦芽糖识别能力的48倍。因此，利用3QBA对蜂蜜中的果糖浓度检测是可行的。

7、结果与讨论

3QBA浓度从3.6mg/L到0.36mg/L都合适用来检测果糖的浓度，浓度高的探针溶液的荧光强度大，检测设备灵敏度高，同时果糖对荧光探针的增强能力强，故实验中选择3QBA浓度为3.6mg/L。天然蜂蜜在316nm激发光作用下有荧光，尽量降低蜂蜜溶液荧光对实验的干扰，当蜂蜜溶液浓度低至125mg/L时，蜂蜜几乎无荧光发出，本发明选择蜂蜜稀释至100mg/L。

图3的关系曲线表明，果糖在一定浓度范围内，对3QBA的荧光增强与果糖浓度成线性关系，线性相关系数为0.996。表1中是采用3QBA荧光增强的方法测量4种蜂蜜中果糖浓度、高效液相测量的对应样品的果糖浓度，相对误差在5％左右，加标回收率分别为94.3％、96.4％、96.2％和96.6％。测试数据表明，该方法能有效地检测蜂蜜中的果糖含量。

8、结论

本发明提出苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)的作为荧光探针检测果糖含量的新方法，分别研究了3QBA荧光探针和蜂蜜的荧光特性，确定了最佳激发波长和发射波长；通过实验分别确定了荧光探针和被测样品的最佳浓度；选择合适的定标曲线；研究了3QBA对蜂蜜中主要糖分的选择性。研究表明，该方法对果糖选择性识别能力强，检测果糖的检测限达到5mg/L，定量限9mg/L，和检测方法相比，它不需要复杂的样品前处理、有毒的溶剂、专业的检测人员、较高的检测费用和较长的检测时间，因此，基于3QBA荧光探针检测蜂蜜中的果糖浓度，特别是在蜂蜜中有蔗糖、麦芽糖和蔗糖同时存在的情况下，本发明提出检测果糖浓度的方法是一个非常好的选择，它具有分辨能力强、快速检测、灵敏度高的优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种蜂蜜中果糖含量的检测方法，其特征在于，该方法为：以苯硼酸衍生物3-喹啉-硼酸(3QBA)为荧光探针加入到稀释后的蜂蜜溶液中，对该蜂蜜溶液进行荧光检测，以316nm的光源作为激发波长，测量400nm处的荧光强度，对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合计算，得到果糖含量。

2.如权利要求1所述的蜂蜜中果糖含量的检测方法，其特征在于，所述荧光探针的浓度为3.6mg/L，配制时需要通氩气至少30分钟以上，使得400nm处的荧光发生淬灭；

所述对荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合具体为：选取果糖浓度分别10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L的水溶液作为标准溶液，分别加入探针溶液，测量其对应的荧光强度，荧光强度和果糖含量进行最小二乘法线性拟合。

3.如权利要求1所述的蜂蜜中果糖含量的检测方法，其特征在于，所述最小二乘法线性拟合的计算函数为：

I₄₀₀＝4.211×10³x+1.673×10⁵；

上式中，I₄₀₀为400nm处的荧光强度，x为果糖含量，单位为mg/L。

4.如权利要求1所述的蜂蜜中果糖含量的检测方法，其特征在于，所述蜂蜜的浓度应低于125mg/L。