CN102735663B - 一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了以化合物二[(1-羟基2-萘基)-次甲基]腙为探针分别测定钴离子的荧光光谱分析法。方法中在含H2O量为60%的DMF/H2O混合液中，用Tris-HCl缓冲溶液控制pH~8，Co2+可将化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙的荧光猝灭，测定溶液荧光强度的降低可以确定溶液中Co2+的含量。设计了特定的介质条件，使化合物成为检测钴离子的荧光猝灭型探针，实施对不同样品中钴离子的高灵敏、高选择识别检测。
Description
技术领域
本发明一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，属分析化学领域。
背景技术：在分子识别领域中，具有分子器件性质的荧光探针通过与目标物质选择性键合，使结合前后的荧光增强或猝灭、荧光偏振、波长及峰形、荧光寿命等参数变化，将微观领域的作用通过光信息表现出来，从而实现在分子水平上的原位实时检测，达到对金属离子、有机分子、生物分子等的有效识别。利用探针分子与非荧光或弱荧光物质以共价或其他形式结合形成发荧光的配合物、超分子或聚集体进行测定，即所谓“荧光探针”技术。由于荧光分析的高灵敏和高选择性，实时原位检测，设备简单，并能提供丰富的光谱信息，在分析化学、生物化学、环境科学、医药学等领域中各种离子检测、DNA及蛋白质分子标记、细胞成像、免疫分析等方面发挥着重要作用。
有机荧光探针以荧光素、罗丹明、吖啶、香豆素类为主要代表，具有荧光量子产率高，激发波长长，适用范围宽。其中，能检测Hg2+，Cu2+，Pb2+，Cr3+，Fe3+等离子的荧光增强或猝灭型罗丹明类探针已有大量报道。芳香族化合物常被用作有机荧光探针的荧光信号发生基团。以萘、蒽、芘、喹啉、菁类、吡咯甲川类等为主要代表的稠环芳烃具有强而稳定的荧光，斯托克斯位移大，在荧光探针领域，作为模型荧光团，所构建的荧光探针是一类性能优良的传感器。例如，以萘为荧光基团的杯芳烃、三角架等结构的荧光探针，表现出对Zn2+、Hg2+、Cu2+等离子的识别、喹唑啉作为Co2+离子荧光猝灭型探针的研究也有报道。
钴是人体必需的微量元素，作为过渡金属离子作用在新陈代谢和血色素的合成，主要以维生素B12及B12辅酶形式发挥其生物学作用和生理功能。临床医学中有用钴对人体进行治疗，食品中引入过多的钴，可能导致诸多生理疾病。当空气中钴浓度超标时，易引起肺纤维化等。因此痕量钴的检测应用在包括医学、环境监测及食品安全等领域。
对微量金属离子在生物体系、生理过程、环境及食品安全等领域的高灵敏、高选择性检测和识别研究具有广泛的应用领域。发现有别于传统的有机荧光染料分子，使其测试成本低廉、样品处理简单、测定方法快捷，并能同时分别检测多种金属离子、性能优越的荧光探针具有研究价值。痕量钴检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体、质谱法、紫外-可见分光光度法、荧光法等方法。荧光光谱法由于操作简单，不需要昂贵的仪器设备，更具有应用价值。但是由于大部分的显色剂水溶性差，需要经过萃取、分离等复杂的预处理才能用于检测，关键的是检测的灵敏度和选择性不能满足越来越高的需求。荧光信号在灵敏度上具有无可比拟的优越性，目前使用荧光方法检测钴离子含量的相关报道还很少，大多数对钴离子响应的荧光基团需要在氧化剂的存在下或碱性条件下才能作用，或者一些荧光探针选择性差，背景干扰严重。只需一种荧光试剂就能完成同时检测微量钴和锌离子的探针目前未见报道。因此，寻找新的对Co2+有足够高的选择性和灵敏度的荧光探针极具挑战性和应用价值。本发明的发明人在研究过程中发现化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙，在DMF/H2O (V/V，2/3) 的混合溶剂中，在荧光分光光度计上，以458nm为激发波长，537nm为荧光发射波长，在有Co2+存在时，会使探针化合物的荧光降低，在Co2+一定浓度范围内，荧光强度的减弱与Co2+浓度成正比，常见的共存金属离子不干扰测定，具有高灵敏度和高选择性，为本发明一种钴离子的高灵敏、高选择荧光发射光谱分析法奠定了基础。
发明内容：本发明的目的在于使用荧光分光光度方法，定量检测样品钴离子含量，创建一种新的对Co2+浓度有足够高的选择性和灵敏度的荧光猝灭光谱定量分析方法。
本发明一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析方法，其特征是以化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙为探针，采用荧光猝灭分析法定量测定钴离子的浓度，化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙的化学结构式为
分子式C22H16N2O2，英文名称为Bis(1-hydroxy-2-naphthyl)-methylene hydrazone。分析方法采用标准曲线法：取数个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入浓度为0.10 mmol·L-1的探针化合物溶液1ml，Tris-HCl缓冲液1ml，pH~8。然后在各容量瓶中加入不同浓度的Co2+标准溶液，其中一个容量瓶中加样品液，最后用DMF和H2O的混合液定容到10.0ml，摇匀，25℃恒温放置半小时，在荧光分光光度计上，以458nm为激发波长，537nm为发射波长测定荧光强度，绘出荧光强度对标准Co2+浓度的校准曲线，根据样品溶液的荧光强度，利用校准曲线求得样品溶液中Co2+的浓度，计算样品含量，标准溶液中Co2+浓度在2.00×10-7~1.70×10-5 mol·L-1范围内，Co2+使探针荧光强度降低呈线性关系；其它共存离子包括碱金属、碱土金属、过渡金属、重金属、稀土金属及锌离子在浓度与Co2+浓度相同时，对钴离子检测的荧光强度的影响低于5%。DMF化学名称为N，N-二甲基甲酰胺，分子式为HCON(CH3)2，为常规的有机溶剂。DMF和H2O的混合液的体积比为2:3，所指的探针化合物溶液为二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙的DMF溶液；所指Tris为三羟甲基氨基甲烷。本发明同样适用于标准加入法：取6个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入样品溶液1ml、浓度为0.10 mmol·L-1的探针化合物溶液1ml，Tris-HCl缓冲液1ml，pH~8。然后在第一个容量瓶中不加Co2+标准溶液，其余各容量瓶中依次加入相同浓度不同体积的Co2+标准溶液，最后用DMF和H2O的混合液定容到10.0ml，摇匀，25℃恒温放置半小时，在荧光分光光度计上，以458nm为激发波长，537nm为发射波长依次测定荧光强度，绘出荧光强度对加入Co2+标准溶液的体积校准曲线，根据直线外推至纵坐标为零与横坐标相交处，即可求得样品溶液中Co2+的浓度，计算样品含量。
上述是各种试剂的配制方法是：
（1）探针化合物溶液的配制方法：称取3.4 mg的二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙，用DMF溶解，配制成100mL溶液，浓度为0.100 mmol·L-1；
（2）Co2+标准溶液：称取优级纯Co(NO3)2 ·6H2O 58.2 mg，用DMF溶解，并配制成100mL溶液，Co2+ 浓度为2.00×10-3 mol·L-1；根据需要用DMF逐级稀释到适宜的浓度；
（3）Tris-HCl缓冲溶液配制：称取0.242 g Tris 用DMF溶解，配制成500 mL浓度为0.004 mol·L-1的溶液，移取一定体积Tris与适量的HCl相混合，调节pH值至8。
（4）其它共存离子溶液的配制：取优级纯的各种金属的硝酸盐或盐酸盐，用DMF溶解，并配制成浓度为2.00×10-3 mol·L-1的DMF溶液。
本发明上述分析方法当所取体积变化时，各种溶液加入量要按比例作相应的变化。
本发明测定离钴子时，共存离子Na+，K+，Rb+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Bi2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Sc3+，Ti3+，Cr3+和Zn2+，在浓度与Co2+相当时，对Co2+检测的荧光强度影响的相对偏差都在 5%以内。均不干扰测定。
本发明方法所用的试剂为分析纯试剂，所用的水为二次蒸馏水。
本发明所用仪器为荧光分光光度计，型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产。
本专利申请是利用化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙作为荧光猝灭探针，检测钴离子的荧光光谱分析方法。与其它荧光检测Co2+的方法相比，该方法具有大的Stokes位移、高的选择性、检测限极低、不需要分离、响应时间快、接近中性测试条件等优点。可以用于环境监测（污染水）、药物分析（钴辅助治疗药剂）、食品检验等领域Co2+含量的检测。
利用化合物二[(1-羟基2-萘基)-次甲基]腙分子在混合溶剂(DMF/H2O，2/3)中因形成聚集态时分子内围绕氮-氮单键的自由旋转受阻、分子趋于共平面及分子呈现有序堆积的协同作用，而诱导荧光显著增强。在特定的条件下能与金属钴离子形成确定配位比的配合物。本发明专利中的关键技术是控制DMF/H2O混合溶剂比例和一定的pH值，才能使化合物二[(1-羟基2-萘基)-次甲基]腙成为检测Co2+离子的荧光猝灭型探针。操作及控制方法简便，性能独特，是该有机分子作为荧光探针的实际应用。
附图说明：
图1 化合物二[(1-羟基2-萘基)-次甲基]腙（10μM，DMF/H2O，V/V，2/3， Tris-HCl，pH~8）检测识别钴离子（200μM）的荧光光谱。其它金属离子（200μM）：Na+，K+，Rb+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Bi2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Sc3+，Ti3+，Cr3+ 和Zn2+在误差范围内不干扰测定。从图中可知控制溶液pH在8左右，DMF/H2O混合溶剂体积比为2:3，探针化合物发生聚集荧光增强现象，在537nm波长发射强荧光，在此条件下，加入Co2+离子，能使探针化合物溶液的荧光发生猝灭，而其它实验金属离子包括Zn2+离子均不能够使其荧光强度显著降低。
图2 化合物二[(1-羟基2-萘基)-次甲基]腙为探针检测Co2+时共存金属离子的荧光强度。白色：探针；或探针+金属离子；黑色：探针+ Co2++金属离子。从图中可知探针化合物在pH 8的DMF/H2O（V/V，2:3）介质中，由于产生聚集荧光增强而发射强荧光（图中左1黑色条），加入其它实验共存离子后对探针荧光降低强度影响不大（图中从左3至20，金属离子对应的黑色条），加入Co2+后使探针荧光猝灭（图中左2黑色条），在探针和有钴离子存在的溶液中加入其它金属离子后对钴离子猝灭探针荧光几乎无影响（图中白色条）。
图3 检测Co2+的校准曲线。纵坐标表示荧光强度，横坐标表示加入的Co2+标准溶液浓度。
图4 湖水样品中检测Co2+的荧光光谱。按标准加入法依次在样品液中加入不同量的Co2+标准溶液测得的光谱图。
图5 饮料中Co2+含量检测的荧光光谱。按标准加入法依次在样品液中加入不同量的Co2+标准溶液测得的光谱图。
具体实施方法：
实施例1：污染湖水中Co2+含量检测。
1. 湖水样品前处理：取污染湖水样品2.0 L，煮沸10分钟，冷却，静置放置12小时，过滤，检测水样pH值。浓缩为10ml ，冷却备用。
2. 检测：移取1mL 处理过的湖水样品于10mL 容量瓶中，加入1 mL探针化合物(10 μM，DMF)，1 mL Tris-HCl，依次加入0、1、2 mL Co2+ (1μM)，用DMF/H2O（V/V，2/3）混合液定容，25℃恒温放置半小时。平行测定3次。
3. 测定的光谱图见附图4，按照标准加入法计算得到结果见表1；
实施例2：保健饮料中Co2+含检测。
1. 饮料样品的处理：取10ml样品经离心后取其清液备用。
2. 检测过程：移取1mL的样品液于10mL 容量瓶中，加入1 mL探针化合物(100 μM，DMF)，1 mL Tris-HCl，依次加入0、1、2 mL Co2+(1μM)，用DMF/H2O（V/V，2/3）混合液定容。25℃恒温放置半小时，在533nm处测定荧光强度，平行测定3次。
测定的光谱图见附图5，按照标准加入法计算得到结果见表2。
Claims (6)
1. 一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是以化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙为探针，采用荧光猝灭法定量测定钴离子浓度，化合物二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙的化学结构式为
分子式C22H16N2O2，英文名称为Bis(1-hydroxy-2-naphthyl)-methylene hydrazone；分析方法采用标准校准曲线法：取数个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入浓度为0.10mmol·L-1的探针化合物溶液1ml，Tris-HCl缓冲液1ml，pH~8，然后在各容量瓶中加入不同浓度的Co2+标准溶液，其中一个容量瓶中加样品溶液，最后用DMF和H2O的混合液定容到10.0ml，摇匀，25℃恒温放置半小时，在荧光分光光度计上，以458nm为激发波长，537nm为发射波长测定荧光强度，绘出荧光强度对标准Co2+浓度的校准曲线，根据样品溶液的荧光强度，利用校准曲线求得样品溶液中Co2+的浓度，计算样品含量；标准溶液中Co2+浓度在2.00×10-7~1.70×10-5 mol·L-1范围内，Co2+使探针荧光强度降低呈直线关系；其它共存离子包括Na+，K+，Rb+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Bi2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Sc3+，Ti3+，Cr3+和Zn2+在浓度与Co2+浓度相同时，对钴离子检测的荧光强度影响的相对偏差都在5%以内，DMF化学名称为N，N-二甲基甲酰胺，分子式为HCON(CH3)2，为常规的有机溶剂，DMF和H2O混合液的体积比为2:3，所指的探针化合物溶液为二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙的DMF溶液；所指Tris为三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是分析方法同样适用于标准加入法：取6个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入样品溶液1ml、浓度为0.10 mmol·L-1的探针化合物溶液1ml，Tris-HCl缓冲液1ml，pH~8，然后在第一个容量瓶中不加Co2+标准溶液，其余各容量瓶中依次加入相同浓度不同体积的Co2+标准溶液，最后用DMF和H2O的混合液定容到10.0ml，摇匀，25℃恒温放置半小时，在荧光分光光度计上，以458nm为激发波长，537nm为发射波长依次测定荧光强度，绘出荧光强度对加入Co2+标准溶液的体积校准曲线，根据直线外推至纵坐标为零与横坐标相交处，即可求得样品溶液中Co2+的浓度，计算样品含量。
3.根据权利要求1或2所述的一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是各种试剂的配制方法是：
（1）探针化合物溶液的配制方法：称取3.4 mg的二[(1-羟基，2-萘基)-次甲基]腙，用DMF溶解，配制成100mL溶液，浓度为0.100 mmol·L-1；
（2）Co2+标准溶液：称取优级纯58.2 mg Co(NO3)2·6H2O，用DMF溶解，并配制成100mL溶液，Co2+ 浓度为2.00×10-3 mol·L-1，根据需要用DMF逐级稀释到适宜的浓度；
（3）Tris-HCl缓冲溶液配制：称取0.242 g Tris 用DMF溶解，配制成500 mL浓度为0.004 mol·L-1的溶液，移取一定体积Tris与适量的HCl相混合，调节pH值至8；
（4）其它共存离子溶液的配制：取优级纯的各种金属的硝酸盐或盐酸盐，用DMF溶解，并配制成浓度为2.00×10-3 mol·L-1的DMF溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是当容量瓶体积变化时，各种溶液加入量要按比例作相应的变化。
5.根据权利要求1或2所述的一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是测定钴离子时其它共存离子包括：Na+，K+，Rb+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Bi2+，Mn2+，Ni2+，Cu2+，Cd2+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Sc3+，Ti3+，Cr3+和Zn2+之一，在浓度与Co2+相当时，对Co2+检测的荧光强度影响的相对偏差都在5%以内。
6.根据权利要求1或2所述的一种钴离子的高灵敏、高选择荧光猝灭光谱分析法，其特征是所用的试剂为分析纯试剂，所用水为二次蒸馏水。
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