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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von Tumorzellen mittels Wirt-Gast-Komplexen von Makrozyklen mit fluoreszierenden Verbindungen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Mitteln zur Diagnose und Therapie von Tumoren.
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Zur wirksamen Behandlung von Tumorerkrankungen ist es notwendig, die Tumore im gesunden Gewebe zu erkennen. Dies ist insbesondere dann schwierig, wenn ein Tumor eine irreguläre Gestalt hat oder wenn es sich dabei um kleine Metastasen handelt. Es ist bekannt, zur Erkennung von Tumorzellen in Gewebeproben sowie auch in lebenden Organismen bei der Vorbereitung und während der Durchführung von Operationen tumorsuchende Peptide oder Antikörper einzusetzen, die mit einer radioaktiven und/oder einer fluoreszierenden Gruppe markiert sind (J. Kuil et al., Bioconjugate Chem. 21, 1709–1719 (2010)). Ein solches Verfahren wird auch als fotodynamische Diagnostik bezeichnet. Es wurde auch vorgeschlagen, zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses bei fluoreszenzfähigen tumorsuchenden Sonden eine Aktivierung des Fluorophors durch Enzyme bzw. Lysosome der Zielzelle zu ermöglichen (H. Kobayashi et al., Accounts Chem. Research 44, 83–90 (2011)). Des Weiteren sind auch fotodynamische Therapieverfahren bekannt, bei denen Sensibilisatoren eingesetzt werden, die sich im Tumorgewebe anreichern und bei Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge zusammen mit Sauerstoff schädigend auf die Tumorzellen wirken.
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Die genannten Verfahren erfordern die Synthese von Molekülen, welche spezielle Fluorophore mit den tumorsuchenden Peptiden bzw. Proteinen in sich vereinigen. Es wäre vorteilhaft, wenn man stattdessen übliche fluoreszierende Verbindungen verwenden könnte. Einen aktuellen Überblick über die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Fluoreszenzdiagnostik und fotodynamischen Therapie von Medulloblastomen gibt die Dissertation von C. Scheidle, Medizinische Fakultät der Universität Tübingen, 2010. S. Krees (Dissertation Bergische Universität Wuppertal, 2009) berichtet über Fluoreszenzverstärkung von 1,8-ANS (8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure) durch Komplexbildung mit β-Cyclodextrin in wässriger Lösung. Sakamoto et al. schlagen vor, synthetische Supramoleküle, beispielsweise Komplexe aus β-Cyclodextrin und Cumarin, zur Steuerung der Proteinstruktur bei der Synthese von Proteinen, beispielsweise als Biosensoren, anzuwenden (JACS 130, 9574–9582 (2008)). Einen Überblick über Fluoreszenzfarbstoffe und ihre supramolekularen Wirt-Gast-Komplexe mit Makrozyklen in wässriger Lösung geben R. N. Dzousa et al., Chem. Rev. 111, 7941–7980 (2011).
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Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Erkennung von Tumorzellen sowie Mittel zur Diagnose und/oder Therapie von Tumoren bereitzustellen. Durch Verfahren und Mittel sollen die konventionellen Bildgebungsverfahren verbessert sowie eine Möglichkeit zur Verminderung der Dosierung der Mittel und damit der Nebenwirkungen eröffnet werden.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach dem Hauptanspruch sowie durch eine Verwendung nach Anspruch 7 sowie eine Sammelpackung nach Anspruch 10.
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Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, dass die Verstärkung der Fluoreszenz durch Einbetten des Fluorophors in einen Makrozyklus auch dann erfolgt, wenn der Komplex sich in einer physiologischen Umgebung wie Serum, Zelle oder Gewebe befindet. Dies war nicht vorauszusehen, weil die zahlreichen unterschiedlichen Bestandteile eines solchen Mediums in der Regel eine Löschung der Fluoreszenz erwarten lassen.
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Erfindungsgemäße Wirt- und Gastverbindungen sind zweckmäßig so auszuwählen, dass sich durch die Komplexbildung eine Verstärkung der Fluoreszenz des Gastmoleküls ergibt. Dies ist in der Regel zuverlässig durch einfache Vorversuche möglich. Beispielsweise lässt sich an einer Verschiebung des Fluoreszenzspektrums in der Regel erkennen, ob überhaupt einen Komplexbildner stattfindet. Auch die Verstärkung der Fluoreszenz lässt sich durch vergleichende Messung leicht bestimmen.
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Unter dem Begriff makrozyklischer Stoff wird hier ein Stoff mit einem Molekül verstanden, bei dem mehrere Atomgruppen so angeordnet sind, dass sie einen großen Ring bilden, in den sich andere Moleküle, hier Fluorophore, einlagern können. Die Atomgruppen können jeweils gleich oder unterschiedlich sein oder sich auch nur durch einzelne Substituenten voneinander unterscheiden. Beispiele sind
- – Cyclodextrine, bei denen 6, 7 oder 8 Glukosebausteine über glykosidische Bindungen ringförmig miteinander verknüpft sind,
- – Calixarene, deren Grundgerüst aus beispielsweise 4, 5, 6 oder 8 Phenoleinheiten, verbunden über Methylenbrücken, besteht und die bevorzugt in 4-Stellung sperrig substituiert sind, so dass eine Kelchform stabilisiert ist,
- – Cucurbiturile, die sich als über jeweils zwei Methylenbrücken verknüpfte Glykouril-Einheiten auffassen lassen, wodurch eine Art Käfigstruktur mit aufgeweitetem Innenraum entsteht,
- – Kronenether, deren Struktur sich als ringförmiger Ether aus Glykoleinheiten darstellt.
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Im Wirt-Gast-Komplex nimmt der von dem Ring des Makrozyklus umschlossene Raum das Gastmolekül auf. Die Auswahl des geeigneten Makrozyklus wird dabei durch die Eigenschaften des Gastmoleküls mitbestimmt, wie Größe, Gestalt, Hydrophobie bzw. Hydrophilie. Alle Makrozyklen sind in verschiedenen Ringgrößen verfügbar und können Gastmoleküle sehr unterschiedlicher Größen einlagern. Gemeinsam sind ihnen die hydrophoben Interaktionen mit den Gastmolekülen in ihrer Kavität, wobei die Calixarene und die Curcurbiturile kationische oder neutrale Gäste bevorzugen, während die Cyclodextrine Affinitäten zu anionischen Gästen haben. Falls notwendig, lassen sich die Eigenschaften der Makrozyklen auch durch die Art der Substituenten an den Atomgruppen beeinflussen.
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Erfindungsgemäß bevorzugte Makrozyklen sind Cyclodextrine, Calixarene und Cucurbuturile sowie deren Derivate. Besonders bevorzugt sind β-Cyclodextrin (β-CyD), gegebenenfalls mit 2-Hydroxypropyl substituiert oder als Halbester mit Schwefelsäure (CAS 37191-69-8), Calix[6]arenhexasulfonsäure, Cucurbit[7]uril (CB7), Cucurbit[8]uril (CB8) und deren Derivate. Der Begriff Derivate bedeutet hier sowohl Salze und Additionsverbindungen als auch Konjugate und durch Substitution mit Substituenten wie Hydroxyl, Niedrigalkyl, Hydroxyalkyl, Amino, Carboxyl, Sulfo, Cyan, Halogen aus solchen Makrozyklen hervorgegangene Stoffe.
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Erfindungsgemäß verwendbare fluoreszierende Gastverbindungen (Fluorophore) sind neben anderen wasserlösliche Verbindungen wie Acridinfarbstoffe, Xanthinfarbstoffe, Chinoniminfarbstoffe, Azofarbstoffe, Cumarinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, Benzothiazolfarbstoffe. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Neutralrot, Berberin, 8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure (1,8-ANS), Thiazolorange, Thioflavin T, Protoporphyrin IX (PpIX). Geeignete Wirt-Gast-Paarungen sind mit den zugehörigen Wellenlängen der Anregung und des Fluoreszenzmaximums in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
| Gast (Fluorophor) | Wirt (Makrozyklus) | λex (Anregung) | λmax (Fluoreszenz) | Zitat |
| Neutralrot – NR | 2-HP-β-CyD/sulfatiertes-β-CyD | 460/460 | 575/573 | 1 |
| Berberin – BE | CB7 | 400 | 508 | 2 |
| 1,8-ANS | 2-HP-β-CyD | | | |
| Thiazolorange – TO | CB8 | 488 | 625 | 3 |
| Thioflavin T – ThT | CB8 | 390 | 570 | 4 |
HP = Hydroxypropyl
1 G. Zhang, S. Shuang, Z. Dong, C. Dong, J. Pan, J. Anal. Chim. Acta 2002, 474, 189,
2 M. Megyesi, L. Bicz6k, I. Jablonkai, J. Phys. Chem. C 2008, 112, 3410,
3 Y. Xu, M. Guo, X., Li, A Malkovskiy, C. Wesdemiotis, Y. Pang, Chem. Commun. 2011, 47, 8883,
4 J. Mohanty, S. D. Choudhury, H. P. Upadhyaya, A. C. Bhasikuttan, H. Pal, Chem.-Eur. J. 2009, 15, 5215. Strukturformeln bevorzugter Fluorophore
(1) Neutralrot, (2) Berberin, (3) 1, 8-ANS, (4) Thiazolorange, (5) Thioflavin T.
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Die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Wirt-Gast-Komplexe können in bekannter Weise in wässriger Lösung hergestellt werden, beispielsweise, indem man Lösungen beider Komponenten miteinander mischt. Je nach der Stärke des Komplexes kann es vorteilhaft sein, die Wirtverbindung im Überschuss, beispielsweise 2-5-fach, anzuwenden. Das zu untersuchende Gewebe kann dann mit dieser Lösung inkubiert werden. Schon dabei kann eine örtliche Anreicherung oder Verarmung des Wirt-Gast-Komplexes in den Tumorzellen stattfinden, wobei durch Anregung des Fluorophors mit Licht geeigneter Wellenlänge die Gewebestruktur sichtbar wird und die Tumorzellen gegebenenfalls hervortreten.
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Ebenso ist es möglich, das zu untersuchende Gewebe nacheinander mit dem Makrozyklus und dem Fluorophor in wässriger Lösung in dieser oder in umgekehrter Reihenfolge zu behandeln. Dabei bildet sich der fluoreszenzverstärkende Komplex in situ im Gewebe.
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Die Wirt-Gast-Komplexe werden zweckmäßig so ausgewählt, dass sie sich bereits in vitro im Bereich der zu diagnostizierenden Tumorzellen aufgrund von derer spezifischen Eigenschaften anreichern. Bei der Anwendung in vivo kann eine Anreicherung auch beispielsweise durch gesteigerte Stoffwechselaktivität und Durchblutung gefördert werden.
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Die Anreicherung des Wirt-Gast-Komplexes im Bereich der Tumorzellen wird verstärkt, wenn zumindest eine der den Komplex bildenden Komponenten mit einem Tumorzellen suchenden Stoff verbunden (konjugiert) wird. Der Tumorzellen suchende Stoff ist beispielsweise ein Peptid oder Protein, insbesondere ein Antikörper, der/das sich an spezifische Oberflächenproteine der Tumorzellen anlagern kann. Geeignete, insbesondere monoklonale Antikörper sowie andere Proteine oder Peptide stehen aus der Entwicklung von Medikamenten gegen Tumor- und Autoimmunerkrankungen zur Verfügung. Es ist dabei vorteilhaft, den nachzuweisenden Zelltyp zu bestimmen und einen spezifisch diesen Zelltyp suchenden Antikörper auszuwählen. Umgekehrt ist es auch möglich, durch Versuche mit unterschiedlichen Antikörpern den Zelltyp zu bestimmen und gegebenenfalls das Vorhandensein unterschiedlicher Tumorzellen nachzuweisen.
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Verfahren zur Konjugation von Makrozyklen mit Proteinen sind bekannt. Beispielsweise beschreibt die oben zitierte Arbeit von Sakamoto (2008) die Konjugation von β-CyD mit einem Protein, wobei danach Cumarin als Gastmolekül eingelagert wird.
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Die Konzentration der Lösungen von Wirt- und Gastmolekülen für die Inkubation mit dem Zellmaterial kann in weiten Grenzen an die konkreten Substanzen angepasst werden. Brauchbar sind Konzentrationen von 0,1 μmol/l bis 0,01 Mol/l, bevorzugt sind 0,1 bis 1 mmol/l. Die Temperatur der Inkubation kann beispielsweise zwischen 10 und 40°C liegen, bevorzugt ist Raumtemperatur. Der pH-Wert bei der Inkubation wird zweckmäßig nahe neutral gepuffert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich zum diagnostischen Nachweis von Tumorzellen sowohl in soliden Gewebeproben von Menschen oder Tieren als auch in Zellkulturen anwenden. Es kann auch ebenso in vivo, beispielsweise bei der Vorbereitung oder Durchführung chirurgischer Eingriffe an Mensch oder Tier, ausgeführt werden. Die Inkubation, Bestrahlung und Beobachtung des interessierenden Gewebes kann dabei auf übliche Weise, beispielsweise mit einem geeignet angepassten Endoskop oder Zystoskop, vorgenommen werden.
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Die erfindungsgemäßen Wirt-Gast-Komplexe lassen sich aber auch für eine fotodynamische Therapie anwenden, wenn als Gastverbindung ein geeigneter Fotosensibilisator verwendet wird. Hierbei sind besonders die Konjugate mit tumorsuchenden Stoffen vorteilhaft, weil der Sensibilisator im Tumorgewebe angereichert wird und die mit der herkömmlichen systemischen Anwendung des Sensibilisators verbundenen Nebenwirkungen wie allgemeine Überempfindlichkeit gegen Licht vermieden werden können.
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Zur Erfindung gehören daher auch Mittel zur fotodynamischen Diagnose und/oder Therapie, vorzugsweise von Tumoren in menschlichen oder tierischen Gewebe, die einen erfindungsgemäßen Wirt-Gast-Komplex aus einem makrozyklischen Stoff als Wirt und einen fluoreszierenden Farbstoff (Fluorophor) als Gast enthalten. Dieses Mittel kann als wässrige Lösung formuliert sein, deren Konzentration nahe der Sättigung ist und für die Anwendung verdünnt wird. Es kann aber auch als gebrauchsfähige Lösung formuliert werden. Schließlich ist es auch möglich, das Mittel unmittelbar vor Gebrauch aus Lösungen der Komponenten herzustellen. Das Mittel kann neben den erfindungsgemäßen Makrozyklen, Fluorophoren bzw. Komplexen übliche Zusätze wie Puffersalze, nichtionische Verbindungen zur Einstellung des osmotischen Drucks, Konservierungsstoffe, Verdickungsmittel und dergleichen enthalten.
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Im erfindungsgemäßen Mittel ist der makrozyklische Stoff bevorzugt ein Cyclodextrin, ein Calixaren und/oder ein Cucurbituril, die gegebenenfalls substituiert sein können, und weiter bevorzugt mit einem Tumorzellen suchenden Stoff konjugiert sind. Bevorzugte Fluorophore für die Verwendung im erfindungsgemäßen Mittel sind Protoporphyrin IX, Berberin, Neutralrot, 8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure, Thiazolorange und/oder Thioflavin T.
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Weil es vorteilhaft sein kann, die Lösung des Wirt-Gast-Komplexes erst kurz vor der Verwendung herzustellen, gehört zur Erfindung auch eine Sammelpackung zur Verwendung in der fotodynamischen Diagnose und/oder Therapie von Tumoren, welche die bevorzugt wässrige Lösung eines erfindungsgemäßen makrozyklischen Stoffes und die bevorzugt wässrige Lösung eines Fluorophors enthält, wobei das molare Verhältnis dieser beiden Stoffe zwischen 0,1 und 10 liegt.
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Der der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende überraschende Befund, dass die Fluoreszenzverstärkung durch Bildung der Wirt-Gast-Komplexe auch in physiologischer Umgebung erhalten bleibt, wurde mit einer Anzahl von Versuchen demonstriert, die im Folgenden beschrieben sind:
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Einfluss von Serum auf die Fluoreszenzverstärkung
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In Vorversuchen wurde die optimale Anregungswellenlänge λex für den isolierten Fluorophor in wässriger Lösung mit 0,1 μmol/ml bestimmt. Danach wurden mit einem Fluoreszenz-Spektrometer F-4500 von Hitachi Fluoreszenzspektren mit dieser Anregungswellenlänge aufgenommen. Die Fläche unter der Kurve des Fluoreszenz-Spektrums wurde als Maß für die Intensität der Fluoreszenz gewertet. Dabei wurde jeweils die Intensität der Fluoreszenz für die Lösung des Wirt-Gast-Komplexes ins Verhältnis zur Intensität bei der Lösung des reinen Fluorophors gesetzt und als Verstärkung bezeichnet. Es wurde eine Messreihe mit rein wässrigen Lösungen durchgeführt, die jeweils 0,1 μmol/ml Fluorophor und gegebenenfalls 0,2 μmol/ml Makrozyklus enthielten. In einer zweiten Messreihe wurden diesen Lösungen noch 40% Ziegenserum bzw. Wasser zugegeben. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse dieser zweiten Messreihe.
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Man sieht, dass durch die Zugabe von Serum die Fluoreszenzverstärkung zu einem großen Teil erhalten bleibt oder sogar zunimmt.
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Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an Zellen
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Durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit menschlichen Kulturzellen ließ sich auch die Frage klären, ob sich die genannten Fluorophore und ihre Wirt-Gast-Komplexe in einer Zelle anreichern und an welche Zellstrukturen sie sich gegebenenfalls binden. Hierzu wurden lebende oder fixierte und permeabilisierte (Formaldehyd, Triton X 100) menschliche HeLa- und HepG2-Zellen mit einer Lösung des Fluorophors und eines Fluorophor/Makrozyklus-Gemisches (1 mmol/l) in PBS-Puffer (pH 7,4) inkubiert. Die Beobachtungen an einem Laser-Scanning-Mikroskop TCS SP2 der Firma Leica mit den Fluorophoren Thioflavin T, Thiazolorange und Berberin zeigen, dass Thioflavin in die Zelle eindringt, ohne zu akkumulieren, während Thiazolorange selektiv an die DNA im Zellkern bindet. Dieses Phänomen ist auch zu beobachten, wenn die Zellen vorher in einer Lösung aus dem entsprechenden Wirt-Gast Komplex mit sulf. β-CyD inkubiert wurden. Berberin liefert mit lebenden und nicht-lebenden Zellen eine intensive Kernfluoreszenz, die die Membrangängigkeit des Farbstoffs belegt. Ihre Intensität kann mit sulfat. β-CyD nochmals erheblich gesteigert und neben der Beschränkung auf den Kern über die ganze Zelle verteilt werden.
