CN115777627A - 一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法及其应用 - Google Patents
一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于动物异种肿瘤模型构建及检测技术领域，具体涉及一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法及其应用。本发明先将用胰酶消化处理后的肿瘤细胞，离心，去上清，再将肿瘤细胞与噻唑橙孵育，再次离心，去上清后添加PBS，使用细胞计数板计数。对斑马鱼进行肿瘤细胞注射，挑选出成瘤且荧光均一的斑马鱼，使用药物进行药浴，从而分析该药物对斑马鱼体内的肿瘤细胞生长的影响情况。本发明利用噻唑橙荧光快速准确，简单易行且成本较低的分析斑马鱼中肿瘤细胞生长情况，可用于肿瘤药物筛选，因此具有良好的实际推广和应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于动物异种肿瘤模型构建及检测技术领域，具体涉及一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在新型抗癌药物的研发过程中，体内抗肿瘤药效评价实验是不可或缺的，传统方法是使用裸鼠建立人肿瘤细胞异种移植模型。但该方法所需时间长、技术操作复杂，因此不适合进行大量候选化合物的抗肿瘤药效评价。
斑马鱼作为一种实验动物已广泛应用于药品，生物制品，食品，工业产品，化妆品等的安全性，有效性，毒性等方面的实验与检验。斑马鱼早期的胚胎处于透明状，没有自体免疫，肿瘤异种移植的成功率高，加上实验周期短——注射肿瘤细胞后两天即可成瘤，给药3天后即可观察药效，因此近些年来越来越多人使用斑马鱼做异种肿瘤模型。但发明人发现，该方法同样存在着使用荧光蛋白转染人肿瘤细胞整个过程周期较长，转染阳性率受外界影响较大，转染一次的成本也较高等问题，因此也存在一定的局限性，不利于推广使用。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法及其应用。本发明利用噻唑橙荧光快速准确，简单易行且成本较低的分析斑马鱼中肿瘤细胞生长情况的方法，因此具有良好的实际推广和应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法，所述方法包括：
S1、收集肿瘤细胞并计数后，离心弃上清，缓冲液洗涤并去除培养基；
S2、向所述肿瘤细胞中加入噻唑橙染色液进行孵育，洗涤，离心，去上清；
S3、加入缓冲液重悬并计数；
S4、将上述S3计数后的肿瘤细胞注入斑马鱼体内；
S5、观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况，筛选成瘤且荧光均一的斑马鱼；
S6、使用抗癌药物对斑马鱼进行处理，并观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况。
本发明的第二个方面，提供上述方法在肿瘤药物筛选中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案采用将消化下来的人肿瘤细胞先离心策略，以纯化肿瘤细胞，并去除培养基，减少了细胞毒性；
(2)上述技术方案采用噻唑橙对人肿瘤细胞进行荧光标记，与传统荧光蛋白转染相比节省了大量成本与时间，且阳性率也更稳定；操作起来也更简单易行。根据荧光的强弱和多少就可以定量肿瘤细胞的数目，了解肿瘤细胞在斑马鱼体内的生长情况；同时，通过控制噻唑橙加入量等，从而使得人肿瘤细胞能够被荧光标记同时降低对肿瘤细胞的影响，避免影响后续实验结果；
(3)上述技术方案快速，准确，简单易行且成本较低，有利于在异种移植斑马鱼肿瘤细胞领域推广应用，从而有利于肿瘤药物筛选等，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实验组1使用噻唑橙(thiazoleorange)标记人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)。其中图1A和1C为对照组的肿瘤荧光图，图1B为实验组使用顺铂对斑马鱼进行药浴后的肿瘤荧光图，图1D为实验组使用紫杉醇对斑马鱼进行药浴后的肿瘤荧光图。
图2为本发明实验组1异种移植231肿瘤细胞对照组与实验组的肿瘤面积统计图，纵坐标代表肿瘤面积的差异倍数；其中图2A是在成瘤后使用顺铂药浴后2天对荧光面积进行统计(与对照组比较)；图2B是在成瘤后使用紫杉醇药浴后2天对荧光面积进行统计(与对照组比较)；
图3为本发明实验组2使用噻唑橙(thiazoleorange)标记人肺癌癌细胞系(A549细胞系)。其中，图3A和3C为对照组的肿瘤荧光图，图3B为实验组使用顺铂对斑马鱼进行药浴后的肿瘤荧光图，图3D为实验组使用紫杉醇对斑马鱼进行药浴后的肿瘤荧光图。
图4为本发明实验组2异种移植A549肿瘤细胞对照组与实验组的肿瘤面积统计图，纵坐标代表肿瘤面积的差异倍数；其中图4A是在成瘤后使用顺铂药浴后2天对荧光面积进行统计(与对照组比较)；图4B是在成瘤后使用紫杉醇药浴后2天对荧光面积进行统计(与对照组相比)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中，一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法，所述方法包括：
S1、收集肿瘤细胞并计数后，离心弃上清，缓冲液洗涤并去除培养基；
S2、向所述肿瘤细胞中加入噻唑橙染色液进行孵育，洗涤，离心，去上清；所述噻唑橙使用浓度为0.05-1μg/ml，使用量为每百万人肿瘤细胞添加0.1-2ml，人肿瘤细胞与噻唑橙孵育温度为室温，孵育时间可以为5-60分钟；噻唑橙染料是菁染料的一种，也是一类荧光分子探针，它可以与细胞内的DNA或RNA结合并产生荧光，通过荧光显微镜使用蓝光激发后会产生绿色荧光，能够特异性标记肿瘤细胞的位置和数目。通过优化孵育条件，从而使得人肿瘤细胞能够被荧光标记同时降低对肿瘤细胞的影响，避免影响后续实验结果。
S3、加入缓冲液重悬并计数；
S4、将上述S3计数后的肿瘤细胞注入斑马鱼体内；
S5、观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况，筛选成瘤且荧光均一的斑马鱼；
S6、使用抗癌药物对斑马鱼进行处理，并观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况。
其中，所述步骤S1中，所述肿瘤细胞可以为人肿瘤细胞，所述肿瘤细胞不做具体限定，该肿瘤细胞可先采用胰酶消化处理，在本发明的一个具体实施方式中，所述肿瘤细胞可以为人乳腺癌细胞和肺癌细胞。选取所述肿瘤细胞数量可以根据实际情况而定，所述肿瘤细胞选取2000万-4000万个(优选3000万个)，离心，去上清，加缓冲液(如PBS)重悬，定量为1ml；
所述步骤S3中，缓冲液可以为PBS缓冲液；
所述步骤S4中，注入量控制为每只斑马鱼注入200-400个(优选为300个)肿瘤细胞，注入体积控制为5-15nl(优选为10nl)；同时优选将肿瘤细胞注入斑马鱼卵黄囊中间靠近背侧的位置；通过控制注入量和注入体积以及注入位置，既能便于后续荧光观察肿瘤细胞，同时有效控制肿瘤细胞对斑马鱼的负面影响，从而更易获得合格的斑马鱼；
所述步骤S6中，所述抗癌药物可以为任意针对上述肿瘤细胞有效或潜在有效的药物，所述处理方式可以是采用药浴方式进行。
本发明的第二个方面，提供上述方法在肿瘤药物筛选中的应用。
下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。
实施例1
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清，如此4遍后，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
实施例2
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入0.1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为1μg/ml，室温孵育5分钟，洗涤，离心，弃上清，如此4遍后，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
实施例3
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入2ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.05μg/ml，室温孵育60分钟，洗涤，离心，弃上清，如此4遍后，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
实施例4
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入0.5ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.1μg/ml，室温孵育40分钟，洗涤，离心，弃上清，如此4遍后，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
实施例5
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入1.5ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.5μg/ml，室温孵育40分钟，洗涤，离心，弃上清，如此4遍后，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
对比例1
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
对比例1没有使用噻唑橙染色，则在荧光显微镜下观察时无荧光出现，根本无法对斑马鱼中肿瘤细胞的生长进行定量定位。
对比例2
1.分别收集人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231细胞系)和肺癌细胞系(A549细胞系)，计数，各取3000万个细胞，离心，去上清，加PBS重悬，定量为1ml；
2.向人乳腺癌细胞中加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清，加PBS重悬，定量为1ml；
3.操作显微注射仪系统，对使用三卡因甲磺酸(MS-222)麻醉后的斑马鱼从卵黄囊中间靠近背侧的位置注射肿瘤细胞。每个斑马鱼胚胎注射10nl，300个肿瘤细胞。注射完毕后在荧光显微镜下观察。
对比例2噻唑橙染完后，没有洗涤至少4遍，导致噻唑橙浓度过高，对斑马鱼本身造成太大毒性，在还未给药时造成大量实验动物死亡。
对比例3
1.第一天体外用6孔板培养MDA-MB-231细胞系，每孔设置成20万细胞数，加2ml L-15培养基于37度孵箱培养24小时。
2.第二天，每孔分别加浓度为0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.5μg、1μg/ml的噻唑橙，同时设置对照组继续于37度孵箱培养24小时。
3.第三天使用显微镜对每孔细胞生长情况进行观察拍照。
对比例3，与对照组相比上述不同浓度的噻唑橙对MDA-MB-231细胞生长无明显影响。
对比例4
1.第一天体外用6孔板培养A549细胞系，每孔设置成20万细胞数，加2ml DMEM培养基于37度孵箱培养24小时。
2.第二天，每孔分别加浓度为0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.5μg、1μg/ml的噻唑橙，同时设置对照组继续于37度孵箱培养24小时。
3.第三天使用显微镜对每孔细胞生长情况进行观察拍照。
对比例4，与对照组相比上述不同浓度的噻唑橙对A549细胞生长无明显影响。
实验例1
在显微注射肿瘤细胞后两天(2dpi)，挑选成瘤且荧光均一的异种肿瘤移植斑马鱼(人乳腺癌细胞和人肺癌细胞)，放在六孔板中，药浴顺铂三天(cisplatin)，浓度为20μg/ml，其余步骤同实施例1，同时设置对照组。
为验证本发明效果，在本实验例中，对实验组异种肿瘤移植斑马鱼进行顺铂药浴，顺铂是临床上常用抗肿瘤药物，具有抑制肿瘤生长的作用。如图1A与图1B，图2A，图3A与图3B，图4A所示，与对照组相比，采用顺铂药浴后，异种肿瘤移植斑马鱼中荧光面积明显减小，即肿瘤面积明显减小，实验结果与预期相符。
实验例2
在显微注射肿瘤细胞后两天(2dpi)，挑选成瘤且荧光均一的异种肿瘤移植斑马鱼(人乳腺癌细胞和人肺癌细胞)，放在六孔板中，药浴紫杉醇三天(paclitaxel)，浓度为40μg/ml，其余步骤同实施例1，同时设置对照组。
为验证本发明效果，在本实验例中，对实验组异种肿瘤移植斑马鱼进行紫杉醇药浴，紫杉醇是临床上常用抗肿瘤药物，具有抑制肿瘤生长的作用。如图1C与图1D，图2B，图3C与图3D，图4B所示，与对照组相比，采用紫杉醇药浴后，异种肿瘤移植斑马鱼中荧光面积明显减小，即肿瘤面积明显减小，实验结果与预期相符。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种基于噻唑橙荧光标记肿瘤细胞评价分析斑马鱼异体接种肿瘤负荷的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、收集肿瘤细胞并计数后，离心弃上清，缓冲液洗涤并去除培养基；
S2、向所述肿瘤细胞中加入噻唑橙染色液进行孵育，洗涤，离心，去上清；所述噻唑橙使用浓度为0.05-1μg/ml，使用量为每百万肿瘤细胞添加0.1-2ml，肿瘤细胞与噻唑橙孵育温度为室温，孵育时间为5-60分钟；
S3、加入缓冲液重悬并计数；
S4、将上述S3计数后的肿瘤细胞注入斑马鱼体内；注入量控制为每只斑马鱼注入200-400个肿瘤细胞；肿瘤注入体积控制为5-15nl；
S5、观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况，筛选成瘤且荧光均一的斑马鱼；
S6、使用抗癌药物对斑马鱼进行处理，并观察评估肿瘤细胞在斑马鱼体内生长情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞，所述肿瘤细胞先采用胰酶消化处理。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述肿瘤细胞选取2000万-4000万个，离心，去上清，加缓冲液重悬。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述肿瘤细胞选取3000万个，所述缓冲液为PBS缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述缓冲液为PBS缓冲液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，注入量控制为每只斑马鱼注入300个肿瘤细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，肿瘤注入体积控制为10nl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，将肿瘤细胞注入斑马鱼卵黄囊中间靠近背侧的位置。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述抗癌药物为任意针对肿瘤细胞有效或潜在有效的药物，所述处理方式采用药浴方式进行。
10.权利要求1-9任一项所述方法在肿瘤药物筛选中的应用。
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