CN111803511B - Dna四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
Dna四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂,包括DNA四面体核酸框架并负载化疗药物,然后连接MUC1靶向适配体与Mcl‑1 siRNA即得。本发明还公开了一体化试剂的制备方法和应用。本发明提供的一体化试剂能够对耐药性胃癌细胞SGC‑7901/ADR靶向识别、miRNA检测成像以及化学药物与基因沉默联合协同治疗,提高试剂在耐药性胃癌细胞中的内化效率与miRNA检测效率,同时利用miRNA检测过程中的核酸框架的结构变化,实现了负载在DNA双链中的DOX的快速释放。该试剂还结合了Mcl‑1 siRNA,Mcl‑1 siRNA的基因沉默显著提高了DOX的治疗效果,克服了纳米药物在生物体系应用中存在的耐药性问题。
Description
技术领域
本发明属于功能纳米探针技术领域,具体涉及DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用。
背景技术
DNA四面体核酸框架(DNA Tetrahedral Nucleic Acid Framework),作为一种最简单而又最牢固的金字塔形三维结构模型之一,具有高度的机械刚性和稳定性,功能化修饰位点丰富,制作过程简单,产率高,在活体成像、基因载体、药物传送、生物传感检测等方面显示出良好的应用前景。DNA四面体核酸框架是通过巧妙的DNA序列设计,应用互补配对原则,各链自动杂交组合而成的具有四面体形状的DNA三维纳米结构。每个DNA四面体至少由四条ssDNA组成,每条ssDNA又分成三个小片段,这三个小片段分别与其他三条ssDNA中的各个小片段杂交结合形成四面体结构的一个面,每两两杂交结合的小片段形成四面体具有双螺旋结构的一条边,每条ss DNA的5’和3’端交汇于四面体的顶点处或在边上形成一个端口,该端口可作为功能基团的修饰位点。
胃癌是世界范围内导致癌症相关性死亡的第二大主要原因。由于缺乏有效的早诊方法,绝大多数胃癌患者在确诊时已是晚期。对这些患者来说,化疗是一线常用的治疗方法。然而,尽管有大量的化疗药物应用于临床实践,但是,由于固有的或者获得性的耐药,特别是多药耐药(MDR),常常导致化疗失败。
髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白是Bcl-2家族抗调亡分子成员之一,最初在诱导髓系白血病细胞ML-1分化中作为早期诱导基因被发现。与正常的胃熟膜相比,Mcl-1在胃癌组织中高表达,同时与肿瘤的发生发展和预后关系密切,是判断胃癌患者预后的潜在生物标志物。研究表明,在耐药细胞中Mcl-1表达更高,而Mcl-1高表达会使肿瘤细胞逃避调亡而产生耐药,抑制Mcl-1表达能够显著提高化疗效果。
MUC1蛋白是黏蛋白(Mucins)家族的一种跨膜糖蛋白,通常分布在腺体导管、呼吸道,由肽核心和糖链以O型糖苷键连接组成,具有润滑及物理屏障作用。研究表明,MUC1参与肿瘤的发生、肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移等过程,在多种上皮癌(胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌)细胞表面异常高表达,使其成为广谱肿瘤靶标分子。选取亲和度最高的MUC1-aptamer作为主动靶向分子,对肿瘤检测与治疗具有重要意义。
发明内容
发明目的:为了克服目前集合诊疗一体化的靶向纳米探针数量相对较少的缺陷,本发明提供了一种用于耐药性胃癌细胞靶向胃癌微小核酸标志物miRNA成像以及化疗与基因双模式协同治疗的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法,该一体化试剂即纳米探针采用DNA四面体核酸框架作为主体,负载常用化疗药物DOX,然后进一步在DNA四面体上连接能够靶向耐药性胃癌细胞的MUC1适配体和具有Mcl-1蛋白沉默效果的Mcl-1 siRNA,制备得到一种能够用于肿瘤细胞靶向识别、双元miRNA成像以及化疗与基因双模式协同治疗的多功能纳米试剂。
本发明所述DNA四面体核酸框架在制备用于耐药性胃癌细胞靶向识别、miRNA成像及化疗与基因双模式协同治疗的多功能一体化试剂中的应用,通过简单的碱基插入无需任何特殊处理,DNA四面体核酸框架即可负载DOX,随后将MUC1适配体与Mcl-1siRNA通过DNA杂交连接上DNA四面体核酸框架,即制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供了一种DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂,所述试剂包括DNA四面体核酸框架并负载化疗药物,然后连接MUC1靶向适配体与Mcl-1 siRNA即得。
其中,所述化疗药物为阿霉素(DOX)。
其中,所述DNA四面体核酸框架是由四条DNA链组装得到,所述四条DNA链序列如下:
ssDNA A:
ssDNA B:
ssDNA C:
ssDNA D:
其中,所述MUC1靶向适配体序列为:5’-TTAAATTAATTATATATTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’,所述Mcl-1 siRNA包括一个正义链Mcl-1 siRNA sense和一条反义链Mcl-1siRNA antisense,其核酸序列如下:Mcl-1 siRNA sense:5’-GCAGGAUUGUGACUCUCAUdTdT-3’,Mcl-1 siRNA antisense:5’-AUGAGAGUCACAAUCCUGCdTdTAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。
其中,所述DNA四面体核酸框架、MUC1适配体和Mcl-1 siRNA摩尔比例为1∶1∶2~1∶2∶4。
本发明内容还包括所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的制备方法,包括以下步骤:
1)合成DNA四面体核酸框架:将等量的ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D在2×PBS中混匀,90-95℃退火5-10min,然后将其置于20-40℃环境中孵育0.5-1.5h得到DNA四面体核酸框架;
2)将制备得到的DNA四面体核酸框架与化疗药物混匀,置于20-40℃100-300rpm的摇床中孵育2-4h,随后将混合物加入超滤离心管,6000rpm 10min离心后,加水再离心两次;
3)将负载有化疗药物的DNA四面体核酸框架与等量的MUC1适配体和Mcl-1 siRNA置于2×PBS中20-40℃杂交1-3h,即获得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。
其中,所述步骤1)中ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D用量相同,终浓度均为3μM。
其中,所述步骤2)中DNA四面体核酸框架与化疗药物的用量摩尔比为1∶100~1∶200。
其中,所述步骤2)的DNA四面体、MUC1适配体和Mcl-1 siRNA摩尔比例为1∶1∶2~1∶2∶4。
本发明内容还包括所述的一种DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂在制备或筛选治疗耐药性胃癌相关疾病药物方面的应用。
反应机理:本发明的DNA四面体核酸框架由四条DNA单链A、B、C、D退火形成,其中C链的3′和5′端分别修饰有荧光染料Cy3和Cy5,D链中间修饰有淬灭剂BHQ-2。四条DNA单链两两部分序列互补配对,形成三维DNA核酸框架,淬灭剂BHQ-2恰好与染料Cy3、Cy5处于DNA四面体核酸框架的同一个角上,使得染料的荧光得以淬灭。随后将DNA四面体核酸框架与DOX混匀,将DOX负载到DNA四面体核酸框架上。为了赋予试剂靶向能力和基因治疗能力,MUC1适配体和Mcl-1 siRNA通过与捕获链的碱基互补配对连接到DNA四面体核酸框架上,构建得到DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。在中性环境下(pH=7.4),只有少量的DOX可以从DNA四面体核酸框架上释放;在偏酸性的肿瘤微环境下(pH=5)DOX能够大量释放。与此同时,肿瘤细胞过表达的miRNA-106a和miRNA-21,能够与DNA四面体核酸框架的棱边发生链置换反应,打开DNA四面体核酸框架的三维结构,使得荧光染料Cy3和Cy5远离BHQ-2,在实现miRNA双元检测的同时迅速释放出两条棱边中负载的DOX,进一步加快DOX的释放。此外,细胞内的RNase H酶能够特异性降解DNA与RNA的杂交双链,因此DNA四面体核酸框架上的Mcl-1 siRNA可以从DNA四面体核酸框架解离,抑制Mcl-1 mRNA产生,提高DOX的化疗效果。综上所述,DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂为胃癌诊疗提供了高效的集影像诊断、药物和基因治疗为一体的解决方案。
本发明采用四条DNA单链组装得到的DNA四面体核酸框架具有两个延伸出来的粘性末端,当miRNA-106a和miRNA-21存在时,这两种miRNA能够分别与一个粘性末端结合,破坏DNA四面体的两个棱边,从而引发整个三维结构的坍塌。上述可变形的DNA四面体核酸框架与已有报道的DNA四面体不同。已有报道的DNA四面体大多是在四面体的四个端口直接修饰活性分子或延伸出捕获链结合具有靶标活性的DNA结构来实现功能化,这种DNA四面体只作为载体;还有一部分DNA四面体是在DNA四面体的棱边上修饰活性单位,棱边在检测前后会出现长短变化,引起信号变化。但是,这两类DNA四面体在应用过程中并不会改变其三维结构的基本形态。因此,已报道的DNA四面体与本发明制备的DNA四面体核酸框架有明显区别。该DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂能与耐药性胃癌细胞中的miRNA-106a和miRNA-21相互作用,使得DNA四面体核酸框架结构打开,原先猝灭的荧光信号恢复并使得DOX快速释放,实现耐药性胃癌细胞的荧光成像检测及快速释药化学治疗,Mcl siRNA能抑制Mcl蛋白实施胃癌的基因治疗。
有益效果:相对于现有技术,本发明具备以下优势:本发明提供的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂能够对耐药性胃癌细胞SGC-7901/ADR靶向识别、miRNA检测成像以及化学药物与基因沉默联合协同治疗。本发明通过简单的碱基杂交,负载上MUC1靶向适配体,提高了试剂在耐药性胃癌细胞中的内化效率与miRNA检测效率,同时利用miRNA检测过程中的核酸框架的结构变化,巧妙的实现了负载在DNA双链中的DOX的快速释放。此外,该试剂还结合了Mcl-1 siRNA,Mcl-1 siRNA的基因沉默显著提高了DOX的治疗效果,克服了以往纳米药物在生物体系中应用中的耐药性难题。本发明中的DNA四面体核酸框架型试剂结构简单,功能多样。
附图说明
图1为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂工作原理图;
图2为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的组装过程与反应机理凝胶电泳表征;
图3为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂检测miRNA工作曲线,其中A、B、C对应miRNA-106a,D、E、F对应miRNA-21;
图4为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂释药曲线,其中A和B是探针在pH=7.4和pH=5条件下加入miRNA的释药曲线;C是探针在DNase I酶作用下的释药曲线;
图5为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂靶向效果表征,其中DNA四面体上修饰有Cy3;
图6为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂在SGC-7901/ADR细胞中的miRNA响应性释药;
图7为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂Mcl mRNA基因沉默效果表征;
图8为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂治疗效果MTT表征;
图9为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂治疗效果流式表征;
图10为用本发明制得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂活体治疗效果表征,其中A是治疗期间肿瘤大小随时间变化统计图;B是治疗18天后肿瘤照片;C是治疗18天后肿瘤质量对比图;D是治疗期间裸鼠体重变化图。
图中简写:TD:DNA四面体核酸框架;apt-TD:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架;TDD:DNA四面体核酸框架-DOX;TDND:DNA四面体核酸框架-NC siRNA-DOX;TDMD:DNA四面体核酸框架-Mcl-1 siRNA-DOX;apt-TDN:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-NC siRNA;apt-TDNH:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-半量NC siRNA;apt-TDM:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-Mcl-1 siRNA;apt-TDD:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-DOX;apt-TDMH:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-半量Mcl-1 siRNA;apt-TDND:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-NCsiRNA-DOX;apt-TDMD:MUC1适配体-DNA四面体核酸框架-Mcl-1 siRNA-DOX即DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,以下实例仅是说明性的,本发明的保护内容不局限于此。
本发明所用到的核苷酸链如下:
ssDNA A:
ssDNA B:
ssDNA C:
ssDNA D:
MUC1靶向适配体序列为:
Mcl-1 siRNA sense:
Mcl-1 siRNA antisense:
本发明的核苷酸链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供。
实施例1
1、DNA四面体核酸框架合成
本设计通过简单的一步合成的方法合成DNA四面体核酸框架,合成效果将使用PAGE凝胶电泳进行表征分析。
1)ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D各条单链分别使用超纯水稀释至100μM。
2)上述样本配置好混合到一起,震荡混匀并用2×PBS稀释至3μM,95℃孵育10min,37℃冷却1h即可得到DNA四面体核酸框架。
2、DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的构建
1)将DOX溶液加入已经制备好的DNA四面体核酸框架中,37℃反应3h,产物加入超滤离心管,6000rpm 10min离心后,加水再离心2次得到负载有DOX的DNA四面体核酸框架(TDD);
2)将等体积的3μM负载有DOX的DNA四面体核酸框架与3μM apt-MUC1和6μM Mcl-1siRNA(Mcl-1 siRNA sense和Mcl-1 siRNA antisense的杂交双链)置于2×PBS中37℃杂交2h,得到DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。
实施例2 DNA四面体核酸框架组装过程及其反应机理表征
DNA四面体核酸框架的工作原理如图1所示,为了验证机理的正确性使用10%的PAGE胶进行凝胶电泳实验,取5μL DNA样品与1μL的6×DNA loading buffer混匀,80V电压下运行90min后成像。
其中该DNA样品分别具体对应于不同的泳道的DNA样品,即分别具体为:泳道1:ssDNA A;泳道2:ssDNA B;泳道3:ssDNA C;泳道4:ssDNA D;泳道5:ssDNA A与ssDNA B等量杂交;泳道6:ssDNA A与ssDNA C等量杂交;泳道7:ssDNA A与ssDNA D等量杂交;泳道8:ssDNA B与ssDNA C等量杂交;泳道9:ssDNA B与ssDNA D等量杂交;泳道10:ssDNA C与ssDNAD等量杂交;泳道11:ssDNA A、ssDNA B和ssDNA C等量杂交;泳道12:ssDNA A、ssDNA B和ssDNA D等量杂交;泳道13:ssDNA A、ssDNA C和ssDNAD等量杂交;泳道14:ssDNA B、ssDNA C和ssDNA D等量杂交;泳道15:ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C和ssDNA D等量杂交即DNA四面体核酸框架;泳道16:DNA四面体核酸框架与miRNA-21孵育产物;泳道17:DNA四面体核酸框架与miRNA-106a孵育产物;泳道18:DNA四面体核酸框架与两种miRNA(miRNA-21和miRNA-106a)的孵育产物;泳道19:miRNA-21;泳道20:miRNA-106a;
其中miRNA-106a与miRNA-21使用相应的DNA替代RNA进行实验,具体序列如下:
miRNA-21(DNA):TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miRNA-106a(DNA):AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG;
具体实验步骤如下:泳道16:将制备好的2μM DNA四面体核酸框架与等量的miRNA-21混匀,37℃反应2h后,进行电泳实验;泳道17:将制备好的2μM DNA四面体核酸框架与等量的miRNA-106a混匀,37℃反应2h后,进行电泳实验;泳道18:将制备好的2μM DNA四面体核酸框架与等量的miRNA-21和miRNA-106a混匀,37℃反应2h后,进行电泳实验;泳道19:8μMmiRNA-21直接进行电泳实验;泳道20:8μM miRNA-106a直接进行电泳实验;
图2中1-4号泳道为组装所需的四条DNA单链,电泳条带单一,表明四条DNA单链没有出现自杂交现象。5-10号泳道对应的是四条DNA单链两两杂交的结果,清晰的条带显示ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D相互之间杂交效率很高。11-14号泳道为三条单链的杂交组合,由于DNA链的增多,结构更复杂,电泳速率更加缓慢。15号泳道是最终形成的DNA四面体核酸框架,四面体形成产率很高,没有发现明显的杂条带。当DNA四面体核酸框架与外加miRNA-106a(19号泳道)和miRNA-21(20号泳道)共同孵育后,条带迁移更慢(16-18号泳道),证明了探针能够对miRNA-106a和miRNA-21进行特异性响应。
实施例3 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂检测miRNA
向实施例1构建好的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂中,加入终浓度为1、2、5、10、20、30、40、50、75、100nM的miRNA-106a或miRNA-21,试剂终浓度为50nM,37℃孵育两个小时后,使用荧光光谱仪测试其荧光强度。
如图1所示,当miRNA-106a存在时,miRNA-106a会与DNA四面体核酸框架型试剂一棱边上带有Cy3染料DNA链置换出来,使原本相互靠近的Cy3和淬灭剂BHQ-2相互远离引起Cy3信号恢复;类似的,当miRNA-21存在时,miRNA-21则会与DNA四面体核酸框架型试剂另一棱边上带有Cy5染料DNA链置换出来,使相互靠近的Cy5和淬灭剂BHQ-2相互远离引起Cy5信号恢复。基于上述原理实现miRNA的双元检测,测试过程中Cy3和Cy5分别使用540nm和640nm光进行激发,工作曲线取562nm和662nm处荧光强度作图。
图3A、图3D分别对应miRNA-106a和miRNA-21的荧光光谱图,图3B、图3E是取图3A、图3D的峰值做的工作曲线,图3C、图3F则是其拟合结果。从图3C中得知,DNA四面体核酸框架型试剂对miRNA-106a的工作范围是1-50nM(ImiR-106a=2.92CmiR-106a+81.49),检测限为1.246nM;图3F显示,miRNA-21的工作范围同样为1-50nM(ImiR-21=6.38CmiR-21+32.01 LOD=0.499nM),检测限为0.499nM,探针表现出不错的检测效果。
实施例4 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的载药与释药
将实施例1上述负载好DOX的DNA四面体核酸框架(TDD)加入500uL到超滤离心管,6000rpm 10min离心后,加水再离心2次,将三次离心上清液混匀测荧光,通过减差的方法计算出DOX负载率为82.2%,DOX插入每个DNA四面体核酸框架的数量为82.2个。由于四面体碱基对是99个,因而可以得出DOX占用的插层空间数目:100%*82.2/99=83.0%,相较于已报道的DOX负载核酸药物,本发明的插入效率更高。
为了研究药物在肿瘤微环境中的释药情况,在溶液环境中进行了模拟,实验步骤如下:
1)将负载有DOX的四面体DNA核酸框架(TDD)在两种不同pH的溶液中分散,其中:
A、pH=7.4组,包括空白组;添加miRNA-21组;添加miRNA-106a组;添加miRNA-21+miRNA-106a组;
B、pH=5组,包括空白组;添加miRNA-21组;添加miRNA-106a组;添加miRNA-21+miRNA-106a组;共计8组样品;
2)将上述8组样品置于摇床中(37℃,50rpm)孵育10min,20min,30min,40min,50min,1h,3h,5h,7h,16h,24h,48h和120h,6000rpm 12min离心,取出上清液测其荧光强度,剩余负载有DOX的DNA四面体核酸框架稀释后定容至原浓度继续进行释药。
此外,为了模拟探针进入细胞后,溶酶体对探针释药的影响,我们在pH=7.4的对照组中加入终浓度为5U/ml DNase,观察DOX的释放。
实验结果如图4所示,图4A、图4B中是不同pH=7.4与pH=5组别的释药情况,结果显示pH=5组别释药速度明显快于pH=7.4组别,在同一pH条件下加入了miRNA-21和miRNA-106a两种miRNA的释药速率最快,其次是仅加入miRNA-21或miRNA-106a其中的一种,不含有miRNA的空白组释药最慢,这表明探针具有很好的靶标响应性DOX释药。在DNase I的作用下,试剂能够将80%以上的DOX释放出来,避免释药效率不足导致的疗效下降(图4C)。
实施例5 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂胞内成像与释药
1、细胞培养
SGC-7901/ADR细胞(即SGC-7901/ADR人类胃癌耐阿霉素细胞,广州吉妮欧生物科技有限公司)接种于1640培养液中(含10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素),将培养瓶放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每1-2天换培养液一次。当细胞生长到覆盖瓶底壁80%时,用胰蛋白酶消化贴壁细胞。
2、细胞实验的共聚焦成像:取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞胰蛋白酶消化后,计数,细胞浓度为1×103个/ml,以1ml接种于共聚焦培养皿中,次日,向3个共聚焦皿中分别加入DOX(4μM)、TDMD(50nM)、apt-TDMD即DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂(50nM)。2h后,进行共聚焦荧光测试,Cy3荧光信号使用559nm激光激发;Cy5荧光信号使用635nm激光激发;DOX荧光信号使用488nm激光激发。
按照上述细胞实验中共聚焦成像的方法,准备三个共聚焦培养皿,分别将4μM的DOX、50nM TDMD(负载有DOX的并且连接了Mcl-siRNA的DNA四面体核酸框架)和50nM制备好的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂(apt-TDMD)加入这三个皿中(三者DOX含量相同)。为了表征探针进入细胞含量差异,这里使用的的DNA四面体核酸框架不带有淬灭剂,其组装序列如下:
ssDNA A:
ssDNA B:
ssDNA C:
如图5所示,由于DNA四面体核酸框架不需要转染剂就能够进入细胞,因而即使没有适配体链,DNA四面体核酸框架也能进入细胞中,提高DOX在细胞中的富集。在此基础上,带有MUC1适配体的DNA四面体核酸框架型试剂进入SGC-7901/ADR细胞量明显增多,DOX转运效率也有明显提高,证明了探针具有良好的靶向递送药物的特点。
如图6所示,DNA四面体核酸框架型试剂加入细胞培养皿后,miRNA与DOX荧光信号逐渐增强,到达120min后,miRNA信号与DOX信号同时达到饱和,这意味着试剂能够在胞内双元检测miRNA的同时,实现药物释放的目的。
实施例6 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂治疗效果表征
本发明实施例1制备的DNA四面体诊疗一体化试剂,在一个四面体DNA上负载有两个Mcl-1 siRNA。这里取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞胰蛋白酶消化后,计数,细胞浓度为5×103个/ml,以1mL接种于6孔板中,次日,取一个孔不做处理作为对照组,另取8个孔分别加入1 NC siRNA(50nM)、2 NC siRNA(100nM)、3 Mcl-1 siRNA DNA(50nM)、4 Mcl-1siRNA DNA(100nM)、5 apt-TDNH(50nM)、6 apt-TDN(50nM)、7 apt-TDMH(50nM)、8 apt-TDM(50nM),培养48h后,分别将细胞消化下来并裂解细胞提取RNA然后进行RT-PCR扩增,测试其Mcl mRNA表达量,其中单纯的siRNA使用脂质体转染剂(Lipofectamine-2000)孵育进入细胞。其中,对照组NC siRNA序列如下:
RT-PCR扩增中采用的引物:
1、RNA提取
1.1样本:六孔板加入1mL预冷的TRIzol,用1mL蓝枪头反复吹打至无颗粒透明装溶液,样品(细胞)倒入1.5ml离心管;
1.2在室温下放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离;
1.3加入氯仿(每使用1mL TRIzol加0.2mL氯仿),盖紧离心管管盖,用手上下振荡15s,溶液呈乳白状,无分层现象,室温静置3min;
1.4 12,000g,4℃离心15min;
1.5取出离心管,样品分为三层:无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相;
1.6小心吸取无色上清水相移至另一离心管,水相体积约为所用Trizol试剂的60%;
1.7向得到的上清水相加入等体积的异丙醇,轻轻混匀,室温静置10min;
1.8小心去除上清,缓慢沿管壁加入1mL 70%的乙醇(用DEPC处理过的水配制),轻轻混匀;
1.9 12,000g,4℃离心10min;
1.10小心吸尽上清,室温干燥沉淀5min左右,适量而定(不可晾得太干,否则RNA将会很难溶解),加入30~50μL的无RNase水溶解RNA沉淀,待完全溶解后于-70℃保存。
2、RNA浓度和纯度的测定:
2.1取5μL RNA样品到495μL 1×TE Buffer中,测定样品在260nm和280nm的吸收值确定;
2.2 RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04μg/μL(比色皿光径1cm),OD260/280在1.8~2.1视为抽提的RNA的纯度很高。
3、cDNA第一链合成(20μL体系):
3.1使用前每个组份轻轻混匀,然后2000rpm离心20s;
3.2取灭过菌且无核酸酶的0.2mL PCR管,依次加入如下组份:
RNA(2μg) 2μL
5×PrimeScript RT Master Mix 2μL
无核酸酶的双蒸水至总体积 10μL
3.3轻轻混匀后,然后2000rpm离心20s;
3.4先在37℃保温15min,然后85℃保温5s,然后置于冰上5min;
3.5上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。
4、Real time-PCR预实验
4.1为减少干扰,每个cDNA样本都稀释10倍(5μL cDNA+45μL H2O);
4.2引物MIX(引物的F和R在同一管中),浓度各为10μM;
4.3往0.1mL PCR管,依次加入如下组份:
4、PCR程序
在PCR仪上于94-96℃预加热5min,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于95℃保持15s使模板变性,然后将温度降到复性温度(60℃),保持20s,使引物与模板充分退火;在72℃保持40s(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环40次,使扩增的DNA片段大量累积。最后,在72℃保持5min,使产物延伸完整,4℃保存。
5、Real time-PCR正式实验
5.1按照一定的顺序,一个样本基因做3个复孔;
5.2往0.1ml PCR管,依次加入如下组份:
5.3PCR程序
在PCR仪上于94-96℃预加热5min,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于95℃保持15s使模板变性,然后将温度降到复性温度(60℃),保持20s,使引物与模板充分退火;在72℃保持40s(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环40次,使扩增的DNA片段大量累积。最后,在72℃保持5min,使产物延伸完整,4℃保存。
结果如图7所示,单纯的四面体DNA核酸框架和不具有基因沉默效果的NC siRNA对Mcl-1 mRNA表达量没有明显的影响,Mcl-1 siRNA则能够降低Mcl-1 mRNA表达量。将Mcl-1siRNA负载到DNA四面体后,由于DNA四面体的细胞转运能力,更多的Mcl-1 siRNA能够富集到细胞内部,提高了Mcl-1 siRNA对mRNA的基因沉默效果。结果表明,负载了两个Mcl-1siRNA的DNA四面体核酸框架型试剂能够将Mcl-1 mRNA表达量下降至51%。
细胞毒性测试方法如下:取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞胰蛋白酶消化后,计数,细胞浓度为5×104个/ml,以100μL接种于96孔板,次日,细胞完全贴壁并向孔板中加入药物(未做特殊说明情况下孵育时间均为48h,试剂浓度均为50nM、DOX浓度均为4μM),孵育完成后,每孔加50μL 1×MTT,在37℃孵育4h,使MTT还原为甲臜。随后吸出上清液,每孔加150μL DMSO使甲臢溶解,用平板摇床摇匀。最后酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度。使用细胞毒性测试的方法,结果如图8所示。其中,图8A药物为TD和apt-TD;图8B中药物为apt-TDNH、apt-TDMH、apt-TDN、apt-TDM、apt-TDND、apt-TDMD、DOX;图8C中药物为DOX、TDND、TDMD、apt-TDMD。图8A中不同浓度的四面体DNA连接适配体前后都没有出现明显的细胞毒性,图8B显示制备的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂具有最好的抗癌效果。图8C中的探针浓度是以DOX来标定的,带有靶向分子的DNA四面体核酸框架型试剂相较于不带适配体的DNA四面体核酸框架型试剂和不带siRNA的DNA四面体核酸框架型试剂显示出更好的治疗效果,上述三种纳米药物相较于DOX,均显示出了更好的治疗效果。
实施例7 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂引发的细胞凋亡表征
流式细胞仪计数:取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞胰蛋白酶消化后,计数,细胞浓度为5×103个/ml,以1mL接种于6孔板中,次日取一个孔作为对照组不做处理,其余5个孔分别加入1 apt-TDN(6.25nM)、2 apt-TDM(6.25nM)、3 DOX(0.5μM)、4 apt-TDND(6.25nM)、5apt-TDMD(6.25nM)。孵育48h后先加入2μL Annexin V-FITC混匀后,再加入2μL碘化丙啶混匀,室温避光反应5~15min;在1h内,进行流式细胞仪检测。
如图9所示,apt-TDM相较于apt-TDN和对照组细胞凋亡比例没有明显变化,这意味着DNA四面体核酸框架与Mcl-1siRNA本身不具有促细胞凋亡的作用。当DOX负载到DNA四面体核算框架后,得益于DNA四面体核算框架的细胞转运作用,细胞早期和晚期凋亡比例分别相较于游离DOX的26.8%和4.36%提高到了36.1%和5.26%。结合了Mcl-1siRNA的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂,进一步提高了细胞凋亡比例,超过75%的细胞呈现凋亡状态,体现了良好的联合治疗效果,具有逆转肿瘤耐药性的能力。
实施例8 DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂活体治疗表征
荷瘤裸鼠模型的建立:动物实验选择SGC-7901/ADR人类胃癌耐阿霉素细胞来构建荷瘤裸鼠肿瘤模型。将预先培养的SGC-7901/ADR细胞收集,并用PBS缓冲液垂悬至1×107个/mL。按照该浓度在裸鼠右前肢腋下部位接种,每只裸鼠接种100μL。接种后的裸鼠继续置于独立通气笼(Individual Ventilated Cages,IVC)系统中饲养,每周更换两次鼠笼和垫料。每日观察裸鼠接种部位的生长变化,使用数显游标卡尺测量裸鼠接种部位生长的肉瘤的长径A和短径B的数值,并按照下述公式计算肿瘤的体积:
肿瘤体积(V)=A×B2/2
实验分组及数据测定:取肿瘤体积在80mm3左右,体重相差不大的裸鼠25只,分为五组,每组5只。具体分组如下:
(1)PBS组;(2)apt-TDM组;(3)DOX组;(4)apt-TDD组;(5)apt-TDMD组即DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂
荷瘤的裸鼠均采用尾静脉注射给药,注射体积均为100μL,除了PBS对照组外,所有药物浓度均以DOX浓度进行标定,每次每只裸鼠给药量为4mg/kg(DOX浓度),控制每组DOX浓度一致。初次给药后每三天给药一次,连续给药6次。每两天称体重、测量瘤体积并做记录。
如图10A所示,PBS组和apt-TDM组肿瘤体积随着时间越来越大,肿瘤体积分别达到了1652mm3和1330mm3,这表明单纯的基因治疗效果并不理想。该肿瘤具有耐药性,单纯的DOX组肿瘤体积也超过了1100mm3,而负载了DOX的DNA四面体核酸框架能够递送更多的药物到肿瘤部位,将肿瘤大小控制在了700mm3。apt-TDMD组对肿瘤的抑制作用最为明显,治疗12天后,肿瘤大小被控制在了250mm3。通过对比上述各组药物给药后的瘤体积与治疗后的肿瘤照片(图10B)、肿瘤质量(图10C),能够证明本发明提出的一体化试剂能够有效抑制裸鼠肿瘤生长。此外,图10D中各组的裸鼠体重在治疗过程中均没有明显下降,这说明本发明提出的一体化试剂具有良好的安全性。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> ssDNA A(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt ttttttttta tcaccaggca gttgacagtg tagcaagctg taatagctac 60
ctgcactgta agcactttt 79
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> ssDNA B(Artificial Sequence)
<400> 2
aatatataat taatttaatc aactgcctgg tgataaaacg acactacgtg ggaatctact 60
atggcggctc ttc 73
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> ssDNA C(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcttatca gactggcttc ccacgtagtg tcgtttctta cagtgcaggt ag 52
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> ssDNA D(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaacatcag tctgataagc taacattaca gcttgctaca cgagaagagc cgccatagta 60
tttttttttt tttttttt 78
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> apt-MUC1(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaaattaat tatatattgc agttgatcct ttggataccc tgg 43
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Mcl-1 siRNA antisense(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaggauugu gacucucaud tdt 23
<210> 7
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> Mcl-1 siRNA antisense(Artificial Sequence)
<400> 7
augagaguca caauccugcd tdtaaaaaaa aaaaaaaaaa a 41
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> miRNA-21(Artificial Sequence)
<400> 8
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> miRNA-106a(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaagtgctt acagtgcagg tag 23
Claims (7)
1.一种DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂,其特征在于,所述试剂包括DNA四面体核酸框架并负载化疗药物,然后连接MUC1靶向适配体与Mcl-1 siRNA即得,所述化疗药物为DOX, 所述DNA四面体核酸框架是由四条DNA链组装得到,所述四条DNA链序列如下:
ssDNA A:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGC(BHQ2)TACCTGCACTGTAAGCACTTTT -3’,
ssDNA B:
5’-AATATATAATTAATTTAATCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC -3’,
ssDNA C:
5’-Cy5-TAGCTTATCAGACTGGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTCTTACAGTGCAGGTAG-Cy3-3’,
ssDNA D:
5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(BHQ2)ACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’;
所述MUC1靶向适配体序列为:5’-TTAAATTAATTATATATTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’,所述Mcl-1 siRNA包括一条正义链Mcl-1 siRNA sense和一条反义链Mcl-1 siRNAantisense,其核酸序列如下:Mcl-1 siRNA sense:5’-GCAGGAUUGUGACUCUCAUdTdT-3’,Mcl-1 siRNA antisense:5’-AUGAGAGUCACAAUCCUGCdTdTAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂,其特征在于,所述DNA四面体核酸框架、MUC1适配体和Mcl-1 siRNA摩尔比例为1:1:2~1:2:4。
3.权利要求1或2所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)合成DNA四面体核酸框架:将等量的ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D在2×PBS中混匀,90~95℃退火5~10 min,然后将其置于20~40℃的环境中孵育0.5~1.5 h得到DNA四面体核酸框架;
2)将制备得到的DNA四面体核酸框架与化疗药物混匀,置于20~40℃100-300 rpm的摇床中孵育2-4h,随后将混合物加入超滤离心管,6000 rpm 10 min离心后,加水再离心两次;
3)将负载有化疗药物的DNA四面体核酸框架与等量的MUC1适配体和Mcl-1 siRNA置于2×PBS中20~40℃杂交1-3 h,即获得DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂。
4.根据权利要求3所述的所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中ssDNA A、ssDNA B、ssDNA C、ssDNA D用量相同。
5.根据权利要求3所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中DNA四面体核酸框架与化疗药物的用量摩尔比为1:100~1:200。
6.根据权利要求3所述的DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤2)的DNA四面体、MUC1适配体和Mcl-1 siRNA摩尔比例为1:1:2~1:2:4。
7.权利要求1或2所述的一种DNA四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂在制备或筛选治疗耐药性胃癌相关疾病药物方面的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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