CN117695301A - 基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 - Google Patents
基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117695301A CN117695301A CN202311678954.3A CN202311678954A CN117695301A CN 117695301 A CN117695301 A CN 117695301A CN 202311678954 A CN202311678954 A CN 202311678954A CN 117695301 A CN117695301 A CN 117695301A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- framework
- mirna
- delivery system
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 75
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 230000008378 epithelial damage Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000009841 epithelial lesion Effects 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 91
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 30
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 9
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 5
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 18
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 abstract description 17
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 16
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 3
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 abstract description 2
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 21
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 21
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- JLEPZAUPTZFVIM-RHIZIOMBSA-N (3s,5s,9r,10s,13r,17r)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-1,2,3,4,5,6,9,11,12,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthrene-14-carbaldehyde Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CCC33C=O)C)C3=CC[C@H]21 JLEPZAUPTZFVIM-RHIZIOMBSA-N 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- CGDLWHGPJPVPDU-ATVHPVEESA-N n-[(5z)-5-[(4-bromophenyl)methylidene]-4-oxo-1,3-thiazol-2-yl]naphthalene-1-sulfonamide Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1\C=C/1C(=O)N=C(NS(=O)(=O)C=2C3=CC=CC=C3C=CC=2)S\1 CGDLWHGPJPVPDU-ATVHPVEESA-N 0.000 description 3
- -1 nucleic acid compound Chemical class 0.000 description 3
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010051559 Corneal defect Diseases 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091062170 Mir-22 Proteins 0.000 description 1
- 108091062140 Mir-223 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000023715 Ocular surface disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241001272996 Polyphylla fullo Species 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- RKTYLMNFRDHKIL-UHFFFAOYSA-N copper;5,10,15,20-tetraphenylporphyrin-22,24-diide Chemical compound [Cu+2].C1=CC(C(=C2C=CC([N-]2)=C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(N=2)=C(C=2C=CC=CC=2)C2=CC=C3[N-]2)C=2C=CC=CC=2)=NC1=C3C1=CC=CC=C1 RKTYLMNFRDHKIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940020947 fluorescein sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108091032320 miR-146 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091024530 miR-146a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000175 potential carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004537 potential cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
基于框架核酸的miRNA‑21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用，涉及基于框架核酸的miRNA‑21递送系统的应用技术。本发明的目的是为了提供安全且高效的基因递送载体，优化miRNA递送效率以促进角膜上皮损伤的修复。基于框架核酸的miRNA‑21递送系统是由四面体DNA框架结构和miRNA‑21构成的纳米级核酸复合物。所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的DNA单链自组装而成的微观3D立体四面体结构，其中一个顶点延伸出用于连接miRNA‑21的黏性末端。利用基于框架核酸的miRNA‑21递送系统递送miRNA‑21进入角膜上皮细胞。该纳米复合物结构稳定性较强，可在没有佐剂的情况下进入角膜上皮细胞，入胞效率高，提升靶细胞内miRNA‑21表达水平，并促进角膜上皮的增殖和迁移。在角膜上皮损伤修复中的应用中，经证明本发明对眼表组织无明显毒副作用，作为滴眼液，给药途径方便快捷，可促进角膜上皮损伤的修复。
Description
技术领域
本发明涉及基于框架核酸的miRNA-21递送系统在角膜上皮损伤修复中的应用，涉及基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用技术。
背景技术
角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性的维持依赖于上皮细胞间的紧密连接，上皮细胞与基底膜之间的锚定连接以及上皮细胞的不断自我更新。各种物理损伤、化学损伤、机械损伤、病原微生物、内分泌及免疫性因素均可导致角膜上皮损伤。角膜上皮层受损可影响细胞间的连接，引起细胞膜的通透性变化，从而影响其屏障功能，引起角膜炎症、角膜瘢痕、溃疡、穿孔，甚至失明。角膜损伤后的再上皮化是损伤修复的一个最基本的过程，迅速重建上皮屏障对于保持角膜的结构完整及正常功能非常重要。
因为角膜位于体表且具有免疫赦免特性，易于局部给药，且可以直观地进行非侵入性角膜评估。目前正在进行大量研究，以开发新颖而安全的非手术方法来治疗角膜缺损。基因治疗技术，是通过传递治疗性核酸(如反义寡核苷酸、mRNA、miRNA、和siRNA等)来选择性调节基因表达。与常规药物相比，基因治疗具有很好的优势。长期以来，该技术被认为是治疗人类获得性和遗传性疾病的有效方法，例如艾滋病、癌症、遗传性疾病和传染病等。
近年来，miRNA相关研究取得了长足的进展。miRNA作为一种小非编码RNA，其通过与靶mRNA序列结合来调节靶基因的蛋白质表达，进而参与调节多种生物学过程，在细胞分化、生物发育和疾病发病机制中发挥着重要作用。其中，miR-21是最早期在哺乳动物体内发现的miRNA之一。越来越多的证据证明，miR-21在皮肤以及角膜的损伤修复中具有潜在价值。据报道，多种miRNA(如miR-223、miR-21、miR-22、miR146a等)在角膜上皮损伤愈合过程中发挥调节作用。研究表明，皮肤损伤后角质形成细胞中miR-21的表达水平升高，过表达miR-21可显著加速伤口的愈合。此外，脐带间充质干细胞衍生的外泌体可以传递大量的miR-21，通过激活PTEN/PI3K/AKT信号转导轴来促进角膜上皮伤口愈合。因此，调控miR-21表达水平是改善角膜愈合的有效疗法。因miRNA功能的获得或丧失取决于对其含量的调节，而miRNA在复杂环境中极不稳定，这大大限制了其在临床中的应用。寻求有效的miR-21递送方式将对角膜上皮损伤修复产生积极的作用。
基因治疗临床成功转化的最大挑战之一是开发安全高效的载体。同时，治疗过程中正确的给药方式、给药时间、远期药物安全性等问题仍有待解决。为了攻破这些难题，研究者们开发了多种基因载体，包括基于病毒的基因载体以及非病毒的纳米载体(如脂质纳米颗粒、阳离子聚合物、超分子自组装多肽、无机纳米颗粒等)以协助治疗性核酸进入细胞中。然而，上述载体均有其缺点。尽管病毒递送系统具有高稳定性和转染能力的独特优势，但其潜在致癌性、免疫原性、非选择性以及高昂的经济成本等局限性仍需解决；基于脂质的载体是使用小而均匀的脂质体来封装治疗性核酸，其中通常要添加辅助脂质(如胆固醇)来改善和稳定膜的融合过程，潜在的细胞毒性是脂质体需要解决的问题；阳离子聚合物是通过静电吸附的作用结合治疗性核酸并将其聚合成紧凑的结构。然而，需要通过合理的结构修饰，控制分子量来降低阳离子电荷固有的细胞毒性；超分子自组装多肽能在特定的条件下形成具有确定结构的聚合体，可用于药物传递。但自组装形成的纳米结构容易受到多种因素(如pH值、手性、离子浓度等)的影响，其不稳定性需要控制，且其在递送功能性基因方面还需更多科学证据；无机纳米颗粒也可以作为基因治疗的载体，例如金、二氧化硅和氧化铁等纳米颗粒等。然而，这些无机颗粒的生物相容性和转染效率受到尺寸、均匀性和表面环境的显著影响。此外，无机纳米颗粒在体内是不可降解的，需要考虑药物安全性的问题。因此，探寻新的安全且高效的基因载体，优化miRNA递送效率势在必行。
在过去的几十年里，随着DNA纳米技术的飞速发展，DNA纳米载药系统引起了人们的广泛关注。自组装的核酸纳米结构具有设计灵活、可编程、易于合成和功能化等独特优势。其中，DNA四面体框架结构(tFNAs)是一种具有优异的结构稳定性、生物相容性以及丰富的功能修饰位点的纳米材料。据报道，tFNAs作为基因载体，可以负载siRNA、CGP和miRNA等核酸分子进入靶组织，发挥其生物功能。基于以上优点，tFNAs是一种很有前途的核酸载体，有望搭载miR-21为角膜损伤修复提供帮助。
目前，尚无基于框架核酸的miRNA-21递送模式用于治疗角膜上皮损伤修复的相关研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：本发明为了提供一种安全且高效的miRNA递送载体(基因递送载体)以用于递送miRNA-21，从而优化miRNA递送效率、促进角膜上皮损伤修复的效果，为此提供了基于框架核酸的miRNA-21递送系统，其作为滴眼液在角膜上皮损伤修复中的应用。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统，它是由四面体DNA框架结构和单链RNA(ssRNA)组成的纳米级核酸复合物，基于框架核酸的miRNA-21递送系统简称T-21。
所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的单链DNA(ssDNA)自组装而成的微观3D四面体框架结构，其中一个顶点延伸出用于连接ssRNA的黏性末端；所述ssRNA通过碱基互补配对方式连接于四面体DNA框架结构的黏性末端，从而连接于四面体DNA框架结构上。
在T-21结构中，作为载体的四面体DNA框架结构由S1、S2、S3’、S4四条DNA单链组成；DNA单链S3’是以S3单链序列为基础，延长其5’端核酸序列作为用于连接单链RNA的黏性末端，DNA单链S1、S2、S3、S4核酸序列等长；四条DNA单链依据碱基互补配对原则，经一步退火法折叠形成微观的3D四面体框架结构，其中DNA单链S3’中未结合的核酸序列自四面体一顶点延伸出来作为黏性末端，用于连接RNA单链S5和S6；
各条单链的核酸序列如下表所示：
上述基于框架核酸的miRNA-21递送系统的合成方法为：所述合成方法先经一步退火法合成四面体DNA框架结构(tFNAs’)，后将tFNAs’与S5、S6室温孵育以最终合成T-21，具体步骤为：
(1)制备含有10mM Tris-HCl和50mM MgCl2的pH为8.0的TM缓冲液用于合成四面体DNA框架结构；通过自动DNA合成仪合成ssDNA及ssRNA，为减少ssDNA及ssRNA粉末损耗，将ssDNA及ssRNA离心管于4℃8000rpm离心10分钟，确保粉末聚集于试管底部，加入DEPC水溶解，配置为终浓度为100μM的工作液，于4℃条件下保存；
(2)紫外线分光光度计进一步测定各ssDNA工作液在260nm波长处的光吸收值，根据以下公式进一步计算出100μL，2μM体系中各单链的总体积：
V＝2×100/[(A260)×105/(15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目)]；
(3)根据上述计算结果，分别吸取步骤(2)中相应ssDNA单链的总体积数，加入TM工作液中，漩涡振动，充分混匀；预热热循环仪，设置热循环仪程序：温度95℃，变性10分钟，随后快速冷却至4℃，持续30分钟，获得tFNAs’母液；
(4)将S5、S6工作液加入至tFNAs’母液中使其终浓度为2μM，室温下孵育2小时以获得T-21纳米结构。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，基于框架核酸的miRNA-21递送系统在促进角膜上皮损伤修复中的应用，利用基于框架核酸的miRNA-21递送系统递送miRNA-21进入角膜上皮细胞。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，所述纳米复合物在体外模拟泪液环境中的结构稳定性验证中的应用；
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，所述纳米复合物在进入角膜上皮细胞的效果及胞吞途径控制中的应用。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，所述纳米复合物在促进角膜上皮细胞增殖和迁移的作用中的应用。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，所述纳米复合物在基于动物模型的局部点眼给药途径的药物安全性验证中的应用。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，所述纳米复合物在基于动物模型为小鼠角膜上皮刮除模型的促进角膜上皮损伤修复的应用，有效的药理有效浓度为250nM。
本发明具有以下有益技术效果：
本发明设计合成的新型微小RNA递送系统，通过将黏性末端修饰的DNA框架核酸结构与miR-21模拟物相连构成，构成的核酸复合物(tFNAs-miR-21，简称T-21)用于将miR-21输送到角膜上皮组织，促进角膜上皮损伤的修复。本发明设计并合成的基于四面体DNA框架结构的miRNA递送系统实现了眼表疾病中miRNA递送治疗模式的创新。
本发明给出的纳米复合物结构稳定性较强，可在没有佐剂的情况下进入角膜上皮细胞，入胞效率高，能提升靶细胞内miR-21表达水平，并促进角膜上皮的增殖和迁移。在角膜上皮损伤修复中的应用中，经证明本发明对眼表组织无明显毒副作用，该递送载体作为滴眼液(作为眼药水)给药途径方便快捷，可促进角膜上皮损伤的修复。本发明提出的递送方案在角膜上皮miRNA递送的有效性(在治疗角膜上皮损伤修复的有效性)、递送方案泪液环境中的稳定性、递送载体在眼表应用的药物安全性已得到验证，本发明上述应用的技术效果，请参见下文的技术效果验证部分。
发明的技术构思为：近年来，miRNA相关研究取得了长足的进展。越来越多的证据证明，miR-21在皮肤以及角膜的损伤修复中具有潜在价值。而miRNA在复杂环境中极不稳定，这大大限制了其在临床中的应用。寻求有效的miR-21递送方式将对角膜上皮损伤修复产生积极的作用。随着核酸纳米技术的快速发展，其在生物医学领域的应用也越来越广泛。核酸纳米技术是使用核酸作为构建模块进行设计和组装的纳米结构。近年来，大量可精细编辑和精确控制的DNA纳米结构不断被构建，如立方体、四面体、DNA环，DNA步行者、纳米管、DNA纳米机器人以及DNA折纸等。自组装核酸纳米结构具有设计灵活、尺寸和形状可控、易于合成和功能化，具有良好的生物相容性和生物降解性等独特优势。基于其双螺旋结构和碱基互补配对，以及DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶等酶的使用，DNA可以编辑、折叠和组装成不同形状和大小的复杂纳米材料。这些特性使得核酸纳米结构既可作为载体又可作为治疗药物解决了基因传递中的许多挑战，并在实现基因治疗的最终目标方面表现出了巨大的潜力。目前尚无基于框架核酸的miRNA递送模式用于治疗角膜上皮损伤修复的相关研究。且其有效的给药方式尚无相关研究。因此，本发明设计了一种用于递送miR-21进入角膜上皮细胞的核酸纳米载体，并给出其在促进角膜上皮损伤修复中的可行性。
鉴于Anjali等[Wei,H.,F.Li,T.Xue,H.Wang,E.Ju,M.Li and Y.Tao(2023)."MicroRNA-122-functionalized DNA tetrahedron stimulate hepatic differentiationof human mesenchymal stem cells for acute liver failure therapy."Bioact Mater28:50-60.]的实验结论，DNA的四面体结构比四方体、八面体以及球体结构更容易被细胞内化。本发明中使用的核酸纳米载体的基本骨架为四面体DNA纳米结构(tFNAs)，因其结构简单且稳定、易于编辑、生物相容性好，是一种理想的纳米材料[Xiao,D.,Y.Li,T.Tian,T.Zhang,S.Shi,B.Lu,Y.Gao,X.Qin,M.Zhang,W.Wei and Y.Lin(2021)."TetrahedralFramework Nucleic Acids Loaded with Aptamer AS1411 for siRNA Delivery andGene Silencing in Malignant Melanoma."ACS Appl Mater Interfaces 13(5):6109-6118.]。
附图说明
图1是T-21的合成模式图(本发明所述的基于框架核酸的miRNA-21递送系统合成示意图)；图2是T-21以及ssDNA单链的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；图3是T-21在透射电子纤维镜下的微观结构图；图4是T-21在原子力显微镜下的微观结构图；图5是tFNAs和T-21的纳米粒径分析图；图6是tFNAs和T-21的Zeta电位分布图；图7是T-21的入胞验证图；图8是T-21在体外模拟的泪液环境的稳定性验证；图9是不同浓度tFNAs和T-21对HCEC增殖活力的影响图；图10是T-21对HCEC迁移的影响图；图11是RT-qPCR检测miR-21的表达水平图。图12是使用Western Blot检测增殖相关通路关键蛋白p-PI3K、p-AKT蛋白表达情况图。图13是通过免疫荧光验证Pitstop 2对T-21入胞的影响。图14是验证小鼠角膜对Cy3-T-21的摄取情况。图15是T-21的眼表毒性验证。图16是T-21局部点眼对小鼠角膜上皮损伤愈合情况的验证。图17是免疫荧光检测各组小鼠角膜上皮组织中p-AKT和p-PI3K的表达差异。
具体实施方式
具体实施方式一：本发明所述的基于框架核酸的miRNA-21递送系统合成示如图1所示。本发明所述的一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统是由四面体DNA框架结构和单链RNA(ssRNA)组成的纳米级核酸复合物，基于框架核酸的miRNA-21递送系统简称T-21；所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的单链DNA(ssDNA)自组装而成的微观3D四面体框架结构，其中一个顶点延伸出用于连接单链RNA的黏性末端。所述单链RNA通过碱基互补配对方式连接于四面体DNA框架结构的黏性末端，从而连接于四面体DNA框架结构上。在T-21结构中，作为母体的四面体DNA框架结构由S1、S2、S3’、S4四条DNA单链组成，其依据碱基互补配对原则折叠形成微观的3D四面体框架结构，其中DNA单链S3’中未结合的核酸序列自四面体一顶点延伸出来作为黏性末端，即所述S3’以S3链序列为基础，延长其5’端核酸序列作为黏性末端；作为挂载修饰的单链RNA由S5、S6组成；所述黏性末端与S5和S6连接。
基于框架核酸的miRNA-21递送系统T-21，从最终的结构上来讲，母体的四面体DNA框架结构是在tFNAs四面体核酸纳米材料的基础上修饰并合成的，称为tFNAs’。换言之，tFNAs由四条不同的单链DNA(ssDNA)组成，分别为S1、S2、S3、S4；tFNAs’组成为：S1、S2、S3’S4，而所述S3’以S3链序列为基础，延长其5’端核酸序列得到(作为黏性末端)；在作为母体的四面体DNA框架结构上挂载S5和S6，合成T-21。从基于框架核酸的miRNA-21递送系统T-21的合成时顺上来讲，基于制备好的S1、S2、S3’、S4、S5、S6粉末，先由S1、S2、S3’、S4合成tFNAs’，再附加实验步骤挂载S5、S6从而合成T-21。各条ssDNA的序列如图表1所示。
表1各条ssDNA的序列表
具体实施方式二：本实施方式给出一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的合成方法，根据本发明的miRNA-21递送系统微观结构，可以有多种合成方式，本发明给出其中的一种。
所述合成方法的过程为：
(1)制备含有10mM Tris-HCl和50mM MgCl2的pH为8.0的TM缓冲液，TM缓冲液用于合成四面体DNA框架结构；通过自动DNA合成仪合成ssDNA及ssRNA，为减少ssDNA及ssRNA粉末损耗，将ssDNA及ssRNA离心管于4℃8000rpm离心10分钟，确保粉末聚集于试管底部，加入DEPC水溶解，使其终浓度为100μM，于4℃条件下保存；
(2)紫外线分光光度计进一步测定各ssDNA工作液在260nm波长处的光吸收值，根据以下公式进一步计算出100μL，2μM体系中各单链的体积：
V＝2×100/[(A260)×105/(15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目)]；
(3)根据上述计算结果，分别计算四条ssDNA总体积，确定S1、S2、S3’、S4四条DNA单链的数目；根据步骤(2)中计算的总体积数，将步骤(1)所得的等摩尔浓度的四种ssDNA(S1、S2、S3’、S4)加入TM缓冲液中，漩涡振动，充分混匀；预热热循环仪，设置热循环仪程序：温度95℃，变性10分钟，随后快速冷却至4℃，持续30分钟，获得tFNAs’母液；
(4)将S5、S6以等摩尔浓度加入至tFNAs’母液中，室温下孵育2小时以获得T-21纳米结构。
上述是合成T-21纳米结构的一种方法。
具体实施方式三：基于制备好的S1、S2、S3、S4四条DNA单链，采用上述步骤(1)至(3)的相同步骤，可制得作为实验对照组的tFNAs。
将tFNAs和T-21放置于4℃冰箱备用，1周内可保持结构稳定。
本发明技术效果的验证
如图1所示，图1给出了T-21的合成模式图，T-21理论预测的微观结构为纳米级3D立体四面体结构，伴一条延伸链自一顶角延伸出来。
图2是T-21以及ssDNA单链的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。泳道1含有DNA单链S1；泳道2含有DNA单链S1和S2；泳道3含有DNA单链S1、S2、S3；泳道4含有DNA单链S1、S2、S3、S4；泳道5含有DNA单链S1、S2、S3’、S4；泳道6含有DNA单链S1、S2、S3’、S4、S5、S6；各泳道DNA均为相同的热变性程序得到的产物(泳道6附加室温孵育S5、S6步骤)。从图2中可看出：T-21对应的DNA分子量较tFNAs’和tFNAs大，证明miRNA-21成功装载到tFNAs’母体结构上。
图3是T-21在透射电子纤维镜下的微观结构图。从图3中看出:T-21微观结构呈三角形。
图4是T-21在原子力显微镜下的微观结构图。从图4可见纳米级微观结构，粒径约15至25nm。
图5是tFNAs和T-21的纳米粒径分析。tFNAs结构的纳米粒径为21.01±0.02nm，T-21结构的纳米粒径为24.12±0.20nm(n＝3)。
图6是tFNAs和T-21的Zeta电位分布。tFNAs和T-21纳米结构表面均带负电荷，平均Zeta电位分别为-7.89±0.75mV和-8.02±0.89mV(n＝3)，两者所带电荷相近。
图7是T-21的入胞验证。为了验证DNA纳米结构的细胞摄取情况，使用Cy3荧光基团修饰的S1单链作为模版合成Cy3-tFNAs和Cy3-T-21纳米结构。将250nM浓度的ssDNA(Cy3-S1)、Cy3-tFNAs和Cy3-T-21分别与HCEC共同孵育12小时。ssDNA组胞内无明显红色荧光信号。tFNAs组和T-21组可见胞质内大量红色荧光信号。以上结果表明，ssDNA在没有佐剂的条件下，无法进入细胞，而tFNAs和T-21可以自主进入细胞，并存留在细胞质内。
图8是T-21在含酶环境的稳定性验证。为验证T-21纳米结构的稳定性，我们向TM工作液中加入1％FBS以体外模拟泪液环境，将T-21和miRNA-21分别置于该条件中孵育0小时、2小时和24小时。琼脂糖凝胶电泳结果显示，孵育两小时后，T-21和miRNA-21均无明显降解；孵育24小时后，miRNA-21几乎完全降解，而T-21无明显降解。
图9是不同浓度tFNAs和T-21对HCEC增殖活力的影响。CCK8结果表明，tFNAs刺激细胞的浓度低于250nM时，对HCEC无明显毒副作用及促进增殖的作用。当tFNAs浓度大于250nM时，HCEC的细胞活力下降，证明较高浓度tFNAs对细胞有潜在毒性；而较高浓度T-21(＞250nM)对HCEC的增殖有促进作用。
图10是T-21对HCEC迁移的影响。HCEC在不同条件下培养24小时，细胞迁移情况如图11所示。体外细胞划痕实验表明，与miRNA-21和tFNAs组相比，T-21可显著提升HCEC的迁移能力。
图11是RT-qPCR检测miR-21的表达水平。T-21处理组，细胞内miR-21的表达水平显著升高(如图12)，证明T-21进入细胞后成功地完成了“货物的卸载”，这有利于miR-21发挥生物学功能。
图12是使用Western Blot检测p-PI3K、p-AKT蛋白表达情况。T-21处理组中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白表达水平较空白对照组、miR-21组和tFNAs组显著提高。而空白对照组、miR-21组和tFNAs组间p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白表达比例无统计学差异。该结果表明，T-21可以激活PI3K/AKT信号通路。
图13是通过免疫荧光验证Pitstop-2对T-21入胞的影响。使用Pitstop-2试剂耗竭网格蛋白介导的细胞内吞途径，结果表明，T-21是通过网格蛋白介导的细胞内吞途径进入细胞。
图14是验证小鼠角膜对Cy3-T-21的摄取情况。建立了小鼠眼球器官培养模型，将小鼠眼球与荧光标记的ssDNA或T-21共培养，T-21孵育组角膜可见大量红色荧光，而ssDNA孵育组角膜组织内荧光微弱。结果证明，T-21可以被小鼠角膜摄取。
图15是T-21的眼表毒性验证。向小鼠结膜囊内滴加治疗浓度的tFNAs和T-21溶液，48小时后对小鼠眼表进行评估，裂隙灯检查显示，无眼红、炎症、肿胀、流泪或分泌物增多等刺激症状，荧光素钠染色示小鼠角膜上皮未见明显的荧光着染(图15A)。HE染色结果显示，角膜及结膜组织上皮细胞形态完整，细胞层数规则，未见坏死细胞或炎症细胞浸润(图15B)。PAS糖原染色结果显示，结膜杯状细胞形态正常，数量与对照组相比未见明显减少(图15C)。以上结果初步证明，tFNAs和T-21局部点眼对小鼠角结膜无明显毒副作用。
图16是T-21局部点眼对小鼠角膜上皮损伤愈合情况的验证。我们构建小鼠角膜上皮刮除模型，并分组行PBS、tFNAs和T-21局部点眼。如图所示，T-21点眼治疗8小时，三个治疗组间上皮愈合速率无显著差异；24小时和36小时的时间点，T-21点眼组小鼠角膜上皮愈合速率均较其他两组显著加快。
图17是免疫荧光检测各组小鼠角膜上皮组织中p-AKT和p-PI3K的表达差异。局部点眼T-21，T-21局部点眼后，角膜上皮组织中p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平增加。
Claims (10)
1.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统，其特征在于，它是由四面体DNA框架结构和单链RNA(ssRNA)组成的纳米级核酸复合物，基于框架核酸的miRNA-21递送系统简称T-21。
2.如权利要求1所述的一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统，其特征在于，所述四面体DNA框架结构是由特定核酸序列的单链DNA(ssDNA)自组装而成的微观3D四面体框架结构，其中一个顶点延伸出用于连接ssRNA的黏性末端；所述ssRNA通过碱基互补配对方式连接于四面体DNA框架结构的黏性末端，从而连接于四面体DNA框架结构上。
3.如权利要求2所述的一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统，其特征在于，在T-21结构中，作为载体的四面体DNA框架结构由S1、S2、S3’、S4四条DNA单链组成；DNA单链S3’是以S3单链序列为基础，延长其5’端核酸序列作为用于连接单链RNA的黏性末端，DNA单链S1、S2、S3、S4核酸序列等长；四条DNA单链依据碱基互补配对原则，经一步退火法折叠形成微观的3D四面体框架结构，其中DNA单链S3’中未结合的核酸序列自四面体一顶点延伸出来作为黏性末端，用于连接RNA单链S5和S6；
各条单链的核酸序列如下表所示：
4.权利要求3所述基于框架核酸的miRNA-21递送系统的合成方法，其特征在于：所述合成方法先经一步退火法合成四面体DNA框架结构(tFNAs’)，后将tFNAs’与S5、S6室温孵育以最终合成T-21，具体步骤为：
(1)制备含有10mM Tris-HCl和50mM MgCl2的pH为8.0的TM缓冲液用于合成四面体DNA框架结构；通过自动DNA合成仪合成ssDNA及ssRNA，为减少ssDNA及ssRNA粉末损耗，将ssDNA及ssRNA离心管于4℃8000rpm离心10分钟，确保粉末聚集于试管底部，加入DEPC水溶解，配置为终浓度为100μM的工作液，于4℃条件下保存；
(2)紫外线分光光度计进一步测定各ssDNA工作液在260nm波长处的光吸收值，根据以下公式进一步计算出100μL，2μM体系中各单链的总体积：
V＝2×100/[(A260)×105/(15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目)]；
(3)根据上述计算结果，分别吸取步骤(2)中相应ssDNA单链的总体积数，加入TM工作液中，漩涡振动，充分混匀；预热热循环仪，设置热循环仪程序：温度95℃，变性10分钟，随后快速冷却至4℃，持续30分钟，获得tFNAs’母液；
(4)将S5、S6工作液加入至tFNAs’母液中使其终浓度为2μM，室温下孵育2小时以获得T-21纳米结构。
5.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：基于框架核酸的miRNA-21递送系统在促进角膜上皮损伤修复中的应用，利用基于框架核酸的miRNA-21递送系统递送miRNA-21进入角膜上皮细胞。
6.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：所述纳米复合物在体外模拟泪液环境中的结构稳定性验证中的应用。
7.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：所述纳米复合物在进入角膜上皮细胞的效果及胞吞途径控制中的应用。
8.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：所述纳米复合物在促进角膜上皮细胞增殖和迁移的作用中的应用。
9.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：所述纳米复合物在基于动物模型的局部点眼给药途径的药物安全性验证中的应用。
10.一种基于框架核酸的miRNA-21递送系统的应用，其特征在于：所述纳米复合物在基于动物模型为小鼠角膜上皮刮除模型的促进角膜上皮损伤修复的应用，有效的药理有效浓度为250nM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311678954.3A CN117695301B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311678954.3A CN117695301B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117695301A true CN117695301A (zh) | 2024-03-15 |
| CN117695301B CN117695301B (zh) | 2024-08-16 |
Family
ID=90143492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311678954.3A Active CN117695301B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117695301B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103044338A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-04-17 | 天津医科大学总医院 | miR-21小分子抑制剂及应用 |
| CN110404081A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-05 | 四川大学 | 一种DNA四面体和microRNA的纳米复合物 |
| CN111803511A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-10-23 | 南京邮电大学 | Dna四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用 |
| CN112843085A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-05-28 | 四川大学 | 一种治疗视神经疾病的复合物及其制备方法和用途 |
| CN113736776A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-03 | 四川大学 | 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途 |
-
2023
- 2023-12-08 CN CN202311678954.3A patent/CN117695301B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103044338A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-04-17 | 天津医科大学总医院 | miR-21小分子抑制剂及应用 |
| CN110404081A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-05 | 四川大学 | 一种DNA四面体和microRNA的纳米复合物 |
| CN111803511A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-10-23 | 南京邮电大学 | Dna四面体核酸框架型胃癌诊疗一体化试剂及其制备方法和应用 |
| CN112843085A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-05-28 | 四川大学 | 一种治疗视神经疾病的复合物及其制备方法和用途 |
| CN113736776A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-12-03 | 四川大学 | 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NANXIN LIU等: "Tetrahedral Framework Nucleic Acids Promote Corneal Epithelial Wound Healing in Vitro and in Vivo", 《SMALL》, vol. 15, 13 June 2019 (2019-06-13), pages 1 - 12 * |
| XIAOLONG LIU等: "Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell-Derived Small Extracellular Vesicles Deliver miR-21 to Promote Corneal Epithelial Wound Healing through PTEN/PI3K/Akt Pathway", 《STEM CELLS INTERNATIONAL》, vol. 2022, 14 July 2022 (2022-07-14), pages 1 - 15 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117695301B (zh) | 2024-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rackley et al. | RNA fibers as optimized nanoscaffolds for siRNA coordination and reduced immunological recognition | |
| Liu et al. | Structurally flexible triethanolamine-core poly (amidoamine) dendrimers as effective nanovectors to deliver RNAi-based therapeutics | |
| JP5744513B2 (ja) | 肺送達のための核酸微小粒子 | |
| Fattal et al. | Nanomedicine-based delivery strategies for nucleic acid gene inhibitors in inflammatory diseases | |
| Tai et al. | A novel penetratin-modified complex for noninvasive intraocular delivery of antisense oligonucleotides | |
| AU2012353058A1 (en) | Novel oligonucleotide conjugates and use thereof | |
| CN110248665A (zh) | 具有降低的肾清除的多聚体寡核苷酸 | |
| WO2020064017A1 (zh) | 核酸纳米载体药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
| CN112679741B (zh) | 一种聚多巴胺聚乙烯亚胺纳米颗粒、其制备和应用 | |
| Geinguenaud et al. | Vectorization of nucleic acids for therapeutic approach: tutorial review | |
| CA3224950A1 (en) | Signal activatable nucleic acid complexes | |
| CN117695301B (zh) | 基于框架核酸的miRNA-21递送系统及其在角膜上皮损伤修复中的应用 | |
| Sharma et al. | Nanoparticles as nucleic acid delivery vectors | |
| Chyi et al. | Dendrimer-based nanocomposites for the production of RNA delivery systems | |
| Dore et al. | Templated synthesis of spherical RNA nanoparticles with gene silencing activity | |
| CN111150852B (zh) | 含顺铂的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
| Sun et al. | Supramolecular assembly models of siRNA delivery systems | |
| CN110960534B (zh) | 含五氟尿嘧啶的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
| Li et al. | Engineering Exosomes and Exosome-like Nanovesicles for Improving Tissue Targeting and Retention | |
| CN110960530B (zh) | 含他克林的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
| Shabbirahmed et al. | Recent Nanotechnological Advancement of Graphene-Based Nanomaterials in Gene Delivery and Protein Delivery | |
| CN110960683B (zh) | 含甲氨蝶呤的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
| Li et al. | Tetrahedral DNA‐Based Functional MicroRNA‐21 Delivery System: Application to Corneal Epithelial Wound Healing | |
| Soni | Strategies and approaches for siRNA delivery | |
| CN110960536B (zh) | 含阿司匹林的药物、其制备方法、药物组合物及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |