CN113736776A - 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途，属于核酸分子药物领域。首先提供了一种具有一个或多个DNA粘性末端的DNA四面体框架核酸，然后提供了以前述的DNA四面体框架核酸作为载体，载microRNA后得到的microRNA纳米复合体。该纳米复合体既能够保持microRNA的稳定性，又可以实现体内microRNA与载体DNA四面体的分离，并且不会影响microRNA的作用效率，克服了现有技术中microRNA纳米复合材料稳定性差，效果不好的缺陷。本发明microRNA纳米复合材料入胞效果高，能够被BMSC很好地摄取，促进BMSC成骨分化，并且实现体内骨再生，具有优异的生物活性，应用前景优良。

Description

一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法 和用途
技术领域
本发明属于核酸分子药物领域，具体涉及一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途。
背景技术
基于Watson-Crick杂交原则，DNA具有良好的可编辑性，这也使得DNA纳米技术在1982年首次被提出以来，能够在各种领域飞速发展并应用广泛。由于DNA纳米结构具有良好的生物学稳定性与生物相容性，可编辑性以及出色的穿透细胞膜能力，使得DNA纳米结构能够在药物运输领域具有巨大的应用潜力。在DNA纳米结构中，DNA四面体纳米结构显示出了极为优秀的运载药物能力。目前已被证实的是，DNA四面体框架核酸结构(tFNA)，既能够运输具有中性电荷的肽核酸，也能运输带有负电荷的DNA和RNA。作为目前已成功合成的最简单的DNA纳米结构，tFNA能够以小窝蛋白依赖的方式被细胞内吞，最终将所装载的“货物”运输到细胞内部。
核酸药物是具有不同功能的RNA或DNA作用于目标mRNA，从转录后水平进行基因沉默来起到治疗效果，核酸药物具有高特异性，高效性，长效性等明显优势。microRNA(miRNA)能与mRNA相作用而调控着细胞内生化反应的发生。每个miRNA可以调控多个靶基因，而几个miRNA也可以共同调节同一个基因。这样就形成了一个错综复杂的调解网络，miRNA目前被证实参与着几乎所有人体内的生命调节。因此miRNA在核酸药物领域的具有巨大的应用潜力。即便拥有功能多样性，然而由于miRNA的单链结构，其自身的不稳定性也大大限制了它的应用范围。
作为一种高效安全的药物递送系统，tFNAs具有良好的生物相容性及穿过细胞膜的特性，因此将miRNA装载在tFNAs上运输进入细胞或许能打破不稳定性对于miRNA应用上的限制。发明人在专利CN110404081A中通过合成miRNA-DNA混合核酸序列来组装出装载有miRNA的tFNAs。并且通过这种方式也成功的观察到了这种纳米复合体进入细胞后发挥作用。然而由于所装载的miRNA为单链结构，与双链结构的miRNA相比，单链的miRNA结构稳定性较差。除此之外，这种运输方式是将miRNA通过磷酸二酯键连接在tFNAs上的，在进入细胞后，所运输的miRNA在细胞内将会组成RNA-induced silencing complex(RISC)来发挥作用，而运载体的存在可能影响miRNA在细胞内的作用效率。
因此，寻找一种新的miRNA递送系统，既保持miRNA的稳定性，又不影响miRNA在体内作用的效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途。
本发明提供了一种DNA四面体框架核酸，它是具有一个或多个DNA粘性末端的DNA四面体框架核酸。
进一步地，所述DNA粘性末端的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA四面体框架核酸的未连接DNA粘性末端的四条DNA单链序列如SEQ IDNO.1～4所示；
所述四条DNA单链中一条或多条DNA单链上连接了DNA粘性末端。
进一步地，所述四条DNA单链上都连接了DNA粘性末端；
优选地，所述连接了DNA粘性末端的四条DNA单链序列如SEQ ID NO.6～9所示。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸由如SEQ ID NO.6所示的连接了DNA粘性末端的DNA单链序列和如SEQ ID NO.2～4所示DNA单链序列组成；
和/或，所述DNA四面体框架核酸由如SEQ ID NO.6～9所示的连接了DNA粘性末端的DNA单链序列组成。
本发明还提供了一种制备前述的DNA四面体框架核酸的方法，它包括如下步骤：
将四条DNA单链加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得；
优选地，所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
本发明还提供了前述的DNA四面体框架核酸在作为运载microRNA的药物载体中的用途。
本发明还提供了一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体，它是以前述的DNA四面体框架核酸作为载体，在DNA粘性末端上携载microRNA形成的microRNA纳米复合体；
优选地，所述microRNA是带有RNA粘性末端的microRNA前体，microRNA前体上的RNA粘性末端与DNA四面体框架核酸上的DNA粘性末端互补连接；
更优选地，所述microRNA前体的随从链连接RNA粘性末端；
和/或，所述RNA粘性末端的序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述microRNA为miRNA-2861；
优选地，所述microRNA前体的主义链5’-3’的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述连接了RNA粘性末端的microRNA前体的随从链5’-3’的序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还提供了一种制备前述的microRNA纳米复合体的方法，它包括如下步骤：
将前述的DNA四面体框架核酸和microRNA混合后室温孵育即得。
本发明还提供了前述的microRNA纳米复合体在制备促进骨修复的药物中的用途；
优选地，所述药物为促进骨再生的药物。
本发明中，DNA四面体框架核酸是指由4条DNA单链通过碱基互补配对形成的在四个顶点带有粘性末端的四面体结构。
microRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。本发明通过粘性末端载DNA四面体框架核酸上载的microRNA为双链microRNA前体。
本发明提供了一种基于DNA四面体框架核酸的microRNA纳米复合体。该纳米复合体以具有特定粘性末端的DNA四面体作为载体，粘性末端与microRNA粘性末端互补配对后载microRNA得到复合体。该纳米复合体既能够保持microRNA的稳定性，又可以实现体内microRNA与载体DNA四面体的分离，并且不会影响microRNA的作用效率，克服了现有技术中microRNA纳米复合材料稳定性差，效果不好的缺陷。本发明microRNA纳米复合材料入胞效果高，能够被BMSC很好地摄取，促进BMSC成骨分化，并且实现体内骨再生，具有优异的生物活性，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明microRNA纳米复合体的合成路线图以及合成后的纳米复合体表征结果：A为stFNA-miR纳米复合体的合成路线图；B为s1tFNA-miR的PAGE检测结果；C为stFNA-miR的PAGE检测结果；D为stFNA-miR的TEM图像；E为stFNA和stFNA-miR的zeta电位检测结果。
图2为本发明stFNA-miR纳米复合体细胞外酶剪切测试和酶环境中的稳定性实验结果：A为RNase H降解RNA/DNA杂合分子中的RNA的示意图；B为不同酶活力单位RNase H对s1tFNAs-miR剪切后的PAGE结果；C为不同酶活力单位RNase H对stFNA-miR剪切后的PAGE结果；D为不同酶活力单位RNase H对s1tFNAs-miR剪切结果统计图；E为不同酶活力单位RNaseH对stFNAs-miR剪切结果统计图；F为tFNA-miR和s1tFNA-miR在不同酶活力单位RNase A中稳定性的PAGE结果；G为tFNA-miR和s1tFNA-miR在不同酶活力单位RNase A中稳定性统计结果。
图3为stFNA-miR复合体应用的体外评估结果：A为stFNA将miR转运到细胞中并选择引导链以参与后续生化反应的示意图；B为示意图显示了RNase H的结合位点以及主义链和随从链的位置；C为BMSC细胞摄取stFNA的流式细胞术结果；D为使用mir-QPCR分析验证stFNA-miR组的miR-2861的主义链表达高于miR-mimics组的miR-2861的主义链；E为使用mir-QPCR分析验证stFNA-miR组的miR-2861的随从链表达高于miR-mimics组的miR-2861的随从链；F为stFNA-miR组中主义链表达显著高于随从链结果；G为碱性磷酸酶染色用于观察第5天的成骨分化结果图；H为碱性磷酸酶染色结果的统计分析；I为在第14天通过茜素红染色监测成骨分化；J为茜素红染色结果的统计分析。
图4为stFNA-miR促进成骨分化的结果：A为各组处理48小时后HDAC5表达的免疫荧光检测图；B为HDAC5表达的蛋白质印迹结果；C为HDAC5表达的免疫荧光结果的统计分析；D为HDAC5表达的蛋白质印迹结果的统计分析；E为第5天ALP表达的免疫荧光检测图；F为第5天ALP表达的蛋白质印迹结果；G为ALP表达的免疫荧光结果的统计分析；H为ALP表达的蛋白质印迹结果的统计分析；I为第5天RUNX2表达的免疫荧光检测图；J为第5天RUNX2表达的蛋白质印迹结果；K为第5天RUNX2表达的免疫荧光结果的统计分析；L为第5天RUNX2表达的蛋白质印迹结果的统计分析。
图5为第14天的成骨相关蛋白表达结果：A为第14天ALP表达的免疫荧光检测图；B为第14天ALP表达的蛋白质印迹结果；C为第14天ALP表达的免疫荧光结果的统计分析；D为第14天ALP表达的蛋白质印迹结果的统计分析；E为第14天RUNX2表达的免疫荧光检测图；F为第14天RUNX2表达的蛋白质印迹结果；G为第14天RUNX2表达的免疫荧光结果的统计分析；H为第14天RUNX2表达的蛋白质印迹结果的统计分析。
图6为stFNA-miR在第7天的体内评估结果：A为各组股骨的3D重建图；B为各组矢状面和水平面显示骨缺损区的松质骨含量；C为H&E染色在5倍和10倍放大倍数下的图像；D为Masson染色放大5倍和10倍的图像；E、F、G、H分别为骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度和骨小梁厚度结果的统计分析。
图7为stFNA-miR在第14天的体内评估结果：A为各组股骨的3D重建图；B为各组矢状面和水平面显示骨缺损区的松质骨含量；C为H&E染色在5倍和10倍放大倍数下的图像；D为Masson染色放大5倍和10倍的图像；E、F、G、H分别骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度和骨小梁厚度结果的统计分析。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明的microRNA为带有粘性末端的miRNA-2861前体(miR-2861)。
本发明stFNA-miR纳米复合体的合成路线如图1A所示。
DNA四面体框架核酸(tFNA)是由独特设计的四条DNA单链(S1，S2，S3，S4)通过PCR程序自组装合成的，其常规制备方法包括如下步骤：
四条DNA单链S1、S2、S3和S4(具体序列如表1所示)按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度分别为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃维持10min，之后迅速降温至4℃并维持20min以上，即自组装合成得到DNA四面体框架核酸(tFNA)。
表1.制备tFNA的四条DNA单链的具体序列
Figure BDA0003245974750000051
实施例1、本发明microRNA纳米复合体的制备及表征
1、s1tFNA-miR纳米复合体的制备及表征
(1)具有1个粘性末端顶点的DNA四面体的合成
按照常规DNA链合成方法在DNA单链S1的5’端添加了一段DNA粘性末端，得到DNA单链sS1。
DNA粘性末端的序列为：TTGACCTGTGAATT(SEQ ID NO.5)
sS1的序列为：
TTGACCTGTGAATTATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.6)
将DNA单链sS1、S2、S3和S4按照上述tFNA常规制备方法合成具有1个粘性末端顶点的tFNA(s1tFNA)，具体方法如下：
四条DNA单链sS1、S2、S3和S4按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mMMgCl2，pH 8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度分别为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃维持10min，之后迅速降温至4℃并维持20min以上，即自组装合成得到具有1个粘性末端顶点的tFNA(s1tFNA)。
(2)s1tFNA-miR纳米复合体的合成
按照常规RNA链合成方法合成含有RNA粘性末端的miRNA-2861。
RNA粘性末端的序列为：uucacaggucaa(SEQ ID NO.10)
含有RNA粘性末端的miRNA-2861的主义链5’-3’：ggggccuggcggcgggcgg(SEQ IDNO.11)；
含有RNA粘性末端的miRNA-2861的随从链(含粘性末端)5’-3’：uucacaggucaaccgcccgccgccaggcccc(SEQ ID NO.12)
将含有RNA粘性末端的miRNA-2861与s1tFNA按照1:1等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，在室温下孵育20分钟，得到microRNA纳米复合体(s1tFNA-miR)。
得到的microRNA纳米复合体s1tFNA-miR使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测，结果如图1B所示。由图1B可知s1tFNA-miR的迁移速率明显变慢，证实了miRNA-2861能够成功装载到s1tFNA上。
2、stFNA-miR纳米复合体的制备及表征
(1)具有4个粘性末端顶点的DNA四面体的合成
按照常规DNA链合成方法在4条DNA单链S1、S2、S3和S4的5’端都添加一段SEQ IDNO.5所示的DNA粘性末端，得到DNA单链sS1、sS2、sS3、sS4。
sS1的序列为SEQ ID NO.6所示；
sS2的序列为：
TTGACCTGTGAATTACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQ ID NO.7)
sS3的序列为：
TTGACCTGTGAATTACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.8)
sS4的序列为：
TTGACCTGTGAATTACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ ID NO.9)
将DNA单链sS1、sS2、sS3和sS4按照上述tFNA常规制备方法合成具有4个粘性末端顶点的tFNA(stFNA)，具体方法如下：
四条DNA单链sS1、sS2、sS3和sS4按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度分别为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃维持10min，之后迅速降温至4℃并维持20min以上，即自组装合成得到具有4个粘性末端顶点的tFNA(stFNA)。
(2)stFNA-miR纳米复合体的合成
将主义链5’-3’的序列如SEQ ID NO.11所示，随从链(含粘性末端)5’-3’的序列如SEQ ID NO.12所示的含有RNA粘性末端的miRNA-2861与stFNA按照4:1的摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，均匀混合后在室温下孵育20分钟，得到microRNA纳米复合体s1-4tFNA-miR(stFNA-miR)。
得到的stFNA-miR使用PAGE检测，结果如图1C所示，图1C显示了stFNA-miR合成成功。
为了进一步证实stFNA-miR纳米复合体的成功合成，使用透射电子显微镜(TEM)进行观察，结果如图1D所示。从图1D可以看出纳米复合体的尺寸在20-30nm之间，并且近似四面体结构的形状。
图1E为stFNA-miR和stFNA的zeta电位检测结果，结果显示stFNA在装载完miRNA-2861后zeta电位有所降低，这是由于核酸分子带负电所导致的，这一结果也证实了stFNA-miR纳米复合体的成功合成。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、细胞外酶剪切测试
核糖核酸内切酶RNase H能够剪切RNA/DNA杂合分子中的RNA，并且其对单链或双链RNA分子几乎无作用效果(图2A)。为了证明miRNA在细胞内成功呈递，利用核糖核酸内切酶RNase H进行了细胞外酶剪切实验。具体试验步骤如下：
将核糖核酸内切酶RNase H加入到RNase H Buffer(500mM Tris-HCl,750mM KCl,30mM MgCl2,100mM DTT,pH＝8.3)中，配制成酶活力单位为0U/ml、12.5U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml的RNase H溶液。随后将RNase H溶液与s1tFNAs-miR或stFNA-miR在37℃条件下进行混合孵育1小时后，使用8％的SDS-PAGE来观察s1tFNA-miR和stFNA-miR被RNase H剪切的结果。
首先使用RNase H对s1tFNAs-miR进行了剪切。结果发现(图2B和图2D)，当RNase H酶活力单位达到50U/ml以上时，miRNA(miR)能够被卸载下来，并且当酶活力单位继续增加时，卸载下来的miR越多。在完成1个位点的剪切后，又对stFNAs-miR进行了4个位点的酶剪切实验(图2C和图2E)。同样的当酶活力单位达到50U/ml以上时miR能够进行卸载，并且随着酶活力单位的增加，收获的miR也越多。说明核糖核酸内切酶RNase H能够实现对本发明stFNA-miR纳米复合体中microRNA的卸载。
试验例2、stFNA-miR在酶环境中的稳定性实验
专利CN110404081A中，将microRNA(miR)单链直接修饰在DNA单链的5’端形成一个拥有RNA和DNA的混合单链，再与其他DNA单链进行组装，最终将miR装载在tFNA上(tFNA-miR)。由于单链miR相较于双链miR的稳定性较差，这样的程序可能会在变性时造成miR的降解。为了更直观的观察到stFNA-miR在稳定性上的提升，分别将按照专利CN110404081A方法制备的tFNA-miR与本发明s1tFNAs-miR与RNase A混合来观察RNA的降解情况。具体试验步骤如下：
将RNase A与tFNA-miR和s1tFNA-miR复合体混合，配制成酶活力单位为0U/ml、0.05U/ml、0.1U/ml、0.2U/ml、0.4U/ml、0.8U/ml的RNase A溶液。随后在37℃条件下进行混合孵育1小时后，使用8％的SDS-PAGE来观察RNA被降解的情况。
从图2F可以看出当RNase A酶活力单位达到0.05U/ml时，tFNA-miR复合体中的miR就发生了完全降解。而s1tFNA-miR需要在RNase A酶活力单位达到0.8U/ml以上的情况下，才发生miR的完全降解。这证实了本发明合成出的stFNA-miR要比现有技术一步法合成的tFNA-miR在稳定性上大大增强(图2G)。
试验例3、stFNA-miR体外细胞试验
1、stFNA入胞
为了验证人骨髓间充质干细胞(BMSC)能够成功对本发明microRNA纳米复合体stFNA-miR完成摄取，使用流式细胞仪来检测载体stFNA进入BMSC的能力。具体试验步骤参考专利CN110404081A：
使用cy5标记的sS1，获得Cy5-stFNA，该复合体能够被Flow cytometer(CytoFLEX，Beckman Coulter)检测到。将P3代的BMSC播种在6孔板内24小时。在使用1％胎牛血清的α-MEM培养基饥饿细胞2小时后，使用250nM浓度的Cy5-stFNA处理BMSC，等待纳米复合体作用6小时、12小时、24小时后，使用胰蛋白酶消化细胞并收集到流式细胞试管中，随后使用PBS对细胞洗涤三次来去除游离的纳米复合体。最后将洗涤完成的细胞在PBS中进行重悬放入到流式细胞仪中进行检测。
根据流式细胞仪的结果(图3C)，在加入载体12小时后，BMSC对stFNA进行了大量摄取。这是由于stFNA具有独特的四面体形态结构，能够依赖小窝蛋白介导的途径顺利穿过细胞膜。而与stFNA相反，单链寡聚脱氧核苷酸很难被内在化并且很容易在细胞质中发生降解。
2、主义链miRNA在细胞内的成功表达
在本研究中使用SanPrep Column microRNA Extraction Kit(生工，上海)对microRNA进行提取后，使用加尾法完成miRNA第一链cDNA合成，最后使用MicroRNAs qPCR试剂盒(生工，上海)和Bio-Rad CFX96 detection system(Bio-Rad,USA)用于完成miRNA-QPCR。
在stFNA-miR进入细胞后，细胞内的RNase H降解了DNA-RNA杂合链中的RNA部分，然后miRNA-2861进入到RNA诱导沉默复合体(RISC)进一步加工筛选出主义链miRNA，并最终抑制蛋白的表达(图3A-B)。为了证实stFNA-miR复合体能够被转运进入细胞并且在细胞内被成功剪切，提取了细胞内的miRNA并进行了miRNA-QPCR。在本实验中设置了三个分组，ctrl组(空白对照)，miRNA-mimics组(miRNA-mimics是miRNA的双链模拟物，是两条互补的miRNA链退火完成的。miRNA-2861主义链5’-3’：ggggccuggcggcgggcgg；miRNA-2861随从链5’-3’：ccgcccgccgccaggcccc(SEQ ID NO.13))和stFNA-miR组。根据图3D-F所展示的结果可见，stFNA能够成功的将miR运载进入细胞，并且不论是主义链还是随从链的表达均显著高于miR-mimics组，这也表明了在没有载体的协助下miR仅能极少量的进入细胞。通过比较stFNA-miR组中主义链与随从链的表达量，能够说明在miR完成卸载后，细胞主动筛选了主义链。这也正是由于主义链在5’末端相比于随从链的3’末端的热力学稳定性更差导致的。因此，通过miRNA-QPCR证明了stFNA-miR顺利进入细胞，miR能够成功地被卸载，并且细胞筛选主义链这三个关键步骤。
3、stFNA-miR促进BMSC成骨向分化
为了排除掉RNA对BMSC成骨向分化的其他影响，设计了一段无意义的miRNA序列(Negative Control,NC)：
miRNA-NC主义链5’-3’：uuguacuacacaaaaguacug(SEQ ID NO.14)
随从链5’-3’：uucacaggucaacaguacuuuuguguaguacaa(SEQ ID NO.15)
按照实施例1所述步骤成功合成出了stFNA-NC后加入到BMSC细胞中观察其对BMSC成骨向诱导分化的结果。同时为了排除空载体stFNA对细胞的影响，还设置了stFNA组。因此在接下来的体外及体内实验中，共设置了ctrl组，stFNA组，stFNA-NC组，stFNA-miR组四个分组。
在使用成骨诱导液处理5天后，使用4％多聚甲醛固定细胞，利用BCIP/NBTAlkaline Phosphatase Color Development Kit(Beyotime,China)进行染色，30分钟后使用光学显微镜(Olympus,Japan)进行观察，不溶性的深蓝色沉淀代表着碱性磷酸酶活性位点。使用成骨诱导液处理BMSC 14天后固定细胞，将Alizarin Red S(Cyagen,China)对样本进行孵育30分钟，使用光学显微镜观察样本中的矿化结节。
(1)细胞染色
碱性磷酸酶染色能够定性观察BMSC的成骨向分化状态。如图3G-H所示，四个分组均能够观察到不溶性的蓝紫色沉淀，这是由于在成骨诱导液的作用下使得所有分组均具有碱性磷酸酶的活性位点。stFNA-miR组所观察到的颜色比其他三组的颜色更深，这证明stFNAs-miR组具有更多的碱性磷酸酶活性位点。
矿化结节的形成是成骨向分化的重要标志。如图3I-J所示，经过茜素红染色后，stFNA-miR组中产生了特别明显的矿化结节，而其余三组没有观察到矿化结节的产生。这也证实了stFNA-miR的加入能够促进BMSC发生成骨向分化。
(2)BMSC中骨相关蛋白的表达
通过western blot来确定HDAC5蛋白和Bone-related protein expressionlevel.除了HDAC5蛋白样本是在stFNAs-miR处理48小时后进行提取之外，其他蛋白质样本均在成骨诱导开始第5天和第14天完成提取。使用cell protein extraction reagent(KeyGen Biotech,Nanjing,China)提纯全部的蛋白样本，将样本加入到5x上样缓冲液混合均匀(Beyotime,China)，随后将蛋白样本放于沸水中5分钟，放入-20℃进行保存。蛋白样本使用PAGE凝胶电泳进行分离，随后，将它们转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，将PVDF膜使用5％脱脂奶封闭1小时，最后将膜用anti-HDAC5(1:1000,ER64245,Huabio,China),anti-RUNX-2(1:1000,ET1612-47,Huabio,China),anti-ALP(1:1000,ET1601-21,Huabio,China)一抗浸泡并在4℃下保存过夜。第二天使用二抗(Beyotime,China)浸泡膜60分钟，最后使用enhanced chemiluminescence detection system(Bio-Rad)检测PVDF膜上的蛋白质条带。
MiR-2861的过表达对HDAC5在mRNA水平没有发生影响，而是抑制转录后水平使得HDAC5蛋白发生了下调。因此在使用stFNA-miR处理BMSC细胞48小时后，对HDAC5的蛋白水平进行检测。在图4B所示的蛋白印迹图像中，stFNA-miR组的HDAC5蛋白表达受到抑制，在免疫荧光染色中也观察到了同样的结果(图4A、4C和4D)。miR-2861在成骨向分化中通过靶向HDAC5来调节Runx2蛋白水平，另外ALP的活性表达也与成骨向分化密切相关，所以也对Runx2及ALP的蛋白水平进行了检测。结果发现在成骨诱导后5天(图4E-L)和14天(图5A-H)时，实验组中Runx2与ALP均出现了不同程度的上调，在免疫荧光染色中也显示了相同的趋势。以上结果也证明了，miR-2861能够在细胞内完成卸载后，筛选主义链抑制HDAC5的表达，导致Runx2的表达增加，促进了BMSC进行成骨向分化，最终发生了成骨相关蛋白ALP的表达增加。
试验例4、stFNA-miR体内实验
对C57BL/6小鼠腹腔注射10％的水合氯醛，等待动物麻醉后，在膝部内侧切口，使用镊子与拉钩分离膝关节上方的股骨表面肌肉。在清晰暴露骨面后，使用1mm直径球形钻头在股骨制造一个1mm的球形缺损，同时使用生理盐水冲洗，最终缝合肌肉及皮肤。每隔一天将药物局部注射在术区周围，并在手术后第1周和第2周处死动物。
Micro-computed tomography(Micro-CT)是非破坏性的显微成像技术，可以在不破坏样本的情况下分析骨密度、骨结构、骨小梁、骨空隙等参数。因此在对样本切片前，使用micro-CT观察骨缺损内部结构的细微变化。在将第1周和第2周的股骨样本使用4％多聚甲醛固定并浸泡在70％的乙醇中，按照如下参数对样本进行扫描：10微米的像素大小，扫描电压为70kV(μCT 50,SCANCO Medical AG,Switzerland).完成扫描后，使用SCANCO MedicalEvaluation(SCANCO Medical AG,Switzerland)完成数据的重建与分析。观察骨缺损表面愈合程度，在冠状面，矢状面和水平面三个方向上观察骨缺损内部的骨形成情况。将骨缺损区域绘制成兴趣区ROI，该区域由100层二维切面所组成。使用SCANCO Medical Evaluationsoftware对ROI的骨体积与组织体积之比(Bone Volume/Total Volume,BV/TV),骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N),骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb.Th)以及骨小梁分离度(Trabecular Separation,Tb.Sp).
收取手术后第1周和第2周的股骨样本后使用4％多聚甲醛固定，使用EDTA脱钙30天后在石蜡中完成包埋。沿着股骨长轴的矢状面切取骨缺损中央。对组织学样本进行苏木精和曙红(H&E)染色和Masson染色。
在体内实验中，延续了在细胞试验中的分组(ctrl组，stFNA组，stFNA-NC组，stFNA-miR组四个分组)。为了更好地观察骨缺损区域的情况，使用了Micro-CT进行分析。从图6A和7A中可以看到无论是一周还是两周的样本，从股骨外观上来看stFNA-miR组愈合均要比对照组更好。并且stFNA-miR组在2周时在表面几乎完全愈合。随后利用CT断层来观察骨缺损内部的成骨结果。在冠状面，矢状面和水平面三个方向上观察到，stFNA-miR组在骨缺损区域的松质骨含量要明显高于对照组，在一周和两周的样本中均具有同样的趋势(图6B和7B)。从上述数据也说明，stFNA-miR组无论在表面以及内部均产生了不错的骨再生效果。BV/T、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp都是观察骨量改变的常用参数与观察指标。BV/T、Tb.N、Tb.Th这三个指标的升高代表了在ROI中产生了更多的骨量。然而Tb.Sp则相反，更小的Tb.Sp象征着更高的骨密度。基于以上理论，通过SCANCO Medical Evaluation(SCANCO Medical AG,Switzerland)来完成以上指标的分析来观察ROI内骨量的变化。从数据分析图可以看出(图6E-H)，stFNA-miR组在1周时，BV/T、Tb.N、Tb.Th均升高，Tb.Sp发生了下降，而对照组之间不存在统计学差异。而在两周的样本中也观察到了同样的趋势，这也代表着在stFNA-miR组具有更强的骨再生能力(图7E-H)。
为了进一步证实stFNA-miR组在体内模型中的成骨能力，观察了骨缺损区域的H&E染色和Masson染色。H&E染色结果显示(图6C)，在1周时stFNA-miR组所形成的骨量更多，并且相比于其他对照组而言，所形成的骨松质更加致密；2周时(图7C)，stFNA-miR组的再生骨组织充满了全部骨缺损区域，而其余对照组均有不同程度的未成骨区域。通过Masson染色结果也可以看出(图6D和7D)，在1周和2周时stFNAs-miR组所生成的胶原纤维含量均显著多余对照组。以上的研究成果也表明，stFNA-miR不仅能够在细胞水平促进BMSC的成骨向分化，也能够在体内水平实现骨再生。
综上，本发明提供了一种基于DNA四面体框架核酸的microRNA纳米复合体。该纳米复合体以具有特定粘性末端的DNA四面体作为载体，粘性末端与microRNA粘性末端互补配对后载microRNA得到复合体。该纳米复合体既能够保持microRNA的稳定性，又可以实现体内microRNA与载体DNA四面体的分离，并且不会影响microRNA的作用效率，克服了现有技术中microRNA纳米复合材料稳定性差，效果不好的缺陷。本发明microRNA纳米复合材料入胞效果高，能够被BMSC很好地摄取，促进BMSC成骨分化，并且实现体内骨再生，具有优异的生物活性，应用前景优良。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途
<130> GYKH1118-2021P0113763CC
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgacctgtg aatt 14
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<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgacctgtg aattatttat cacccgccat agtagacgta tcaccaggca gttgagacga 60
acattcctaa gtctgaa 77
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<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgacctgtg aattacatgc gagggtccaa taccgacgat tacagcttgc tacacgattc 60
agacttagga atgttcg 77
<210> 8
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgacctgtg aattactact atggcgggtg ataaaacgtg tagcaagctg taatcgacgg 60
gaagagcatg cccatcc 77
<210> 9
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttgacctgtg aattacggta ttggaccctc gcatgactca actgcctggt gatacgagga 60
tgggcatgct cttcccg 77
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggggccuggc ggcgggcgg 19
<210> 12
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
uucacagguc aaccgcccgc cgccaggccc c 31
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccgcccgccg ccaggcccc 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
uuguacuaca caaaaguacu g 21
<210> 15
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
uucacagguc aacaguacuu uuguguagua caa 33

Claims (10)

1.一种DNA四面体框架核酸，其特征在于：它是具有一个或多个DNA粘性末端的DNA四面体框架核酸。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体框架核酸，其特征在于：所述DNA粘性末端的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA四面体框架核酸的未连接DNA粘性末端的四条DNA单链序列如SEQ ID NO.1～4所示；
所述四条DNA单链中一条或多条DNA单链上连接了DNA粘性末端。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体框架核酸，其特征在于：所述四条DNA单链上都连接了DNA粘性末端；
优选地，所述连接了DNA粘性末端的四条DNA单链序列如SEQ ID NO.6～9所示。
4.根据权利要求3所述的DNA四面体框架核酸，其特征在于：所述DNA四面体框架核酸由如SEQ ID NO.6所示的连接了DNA粘性末端的DNA单链序列和如SEQ ID NO.2～4所示DNA单链序列组成；
和/或，所述DNA四面体框架核酸由如SEQ ID NO.6～9所示的连接了DNA粘性末端的DNA单链序列组成。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述的DNA四面体框架核酸的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将四条DNA单链加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得；
优选地，所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
6.权利要求1～4任一项所述的DNA四面体框架核酸在作为运载microRNA的药物载体中的用途。
7.一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体，其特征在于：它是以权利要求1～4任一项所述的DNA四面体框架核酸作为载体，在DNA粘性末端上携载microRNA形成的microRNA纳米复合体；
优选地，所述microRNA是带有RNA粘性末端的microRNA前体，microRNA前体上的RNA粘性末端与DNA四面体框架核酸上的DNA粘性末端互补连接；
更优选地，所述microRNA前体的随从链连接RNA粘性末端；
和/或，所述RNA粘性末端的序列如SEQ ID NO.10所示。
8.根据权利要求7所述的microRNA纳米复合体，其特征在于：所述microRNA为miRNA-2861；
优选地，所述microRNA前体的主义链5’-3’的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述连接了RNA粘性末端的microRNA前体的随从链5’-3’的序列如SEQ ID NO.12所示。
9.一种制备权利要求7或8所述的microRNA纳米复合体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将权利要求1～4任一项所述的DNA四面体框架核酸和microRNA混合后室温孵育即得。
10.权利要求7或8所述的microRNA纳米复合体在制备促进骨修复的药物中的用途；
优选地，所述药物为促进骨再生的药物。
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