CN115228517A - 一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控芯片技术、DNA纳米技术和光学分析领域，具体是一种基于框架核酸检测新型冠状病毒和/或流感病毒的旋转型微流控纸芯片及其制备方法。旋转型微流控纸芯片由两张印刷有不同微流控通道的上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加固定构成可旋转的微流控通道体系；其中，上层检测盘滤纸上设置多个检测位点；下层洗涤盘滤纸上设置与上层检测盘滤纸检测位点相对应的孔洞，任意相邻的两个孔洞之间沿径设置洗涤通道。本发明在一个框架核酸功能化的旋转型微流控纸芯片分析装置上完成了从样本输入到检测结果输出的全部过程，具有操作简单、检出限低、选择性好等优势，为临床诊断提供了一种新型装备与策略，适用于现场、即时、快速检测。

Description

一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片及其制备 方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术、DNA纳米技术和光学分析领域，更具体地说是一种基于框架核酸检测新型冠状病毒和/或流感病毒的旋转型微流控纸芯片及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，具有很强的传染性，患者会出现发热、干咳以及浑身乏力的症状，病情若没有得到及时的控制，会出现呼吸困难等严重症状，威胁患者的生命健康。新型冠状病毒患者初期症状与流感病毒患者极为相似，因此干扰了对患者进行准确的诊断与鉴别。面对全球复杂的新冠肺炎疫情形势，对新型冠状病毒肺炎感染者的早期筛查和诊断对疫情防控至关重要。
目前，核酸检测法和肺部CT检查是广泛应用于新型冠状病毒肺炎分析的临床检测技术，该方法检测结果受限于多个方面，包括仪器昂贵、程序复杂、检测时间长等。因此，迫切需要研发快速、低成本、高灵敏和易于推广的检测方法用于新型冠状病毒和流感病毒的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，旋转型微流控纸芯片由两张印刷有不同微流控通道的上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加固定构成可旋转的微流控通道体系；
其中，上层检测盘滤纸上设置多个检测位点；检测位点的直径通常为3-10mm。
下层洗涤盘滤纸上设置与上层检测盘滤纸检测位点相对应的孔洞，任意相邻的两个孔洞之间沿径设置洗涤通道。其中，孔洞直径通常为3-10mm；洗涤通道一般长为25-30mm，宽为3-10mm。
所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加，中心通过铆钉连接，使上下两层能够相对旋转。
所述上层检测盘滤纸上的多个检测位点位于同一圆周上，且上层检测盘滤纸除检测位点以外的区域均为疏水区域；
下层洗涤盘滤纸上的孔洞以及洗涤通道一端位于同一圆周上，且下层洗涤盘滤纸除孔洞和洗涤通道以外区域均为疏水区域。
所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸以中心为旋转中心自由旋转，检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；
洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
所述上层检测盘滤纸上设置多个检测位点内添加检测病毒的功能化框架核酸。
所述功能化框架核酸由四条单链DNA自组装形成为正四面体结构，组装正四面体结构中的四条单链DNA中任意三条单链DNA的5′端修饰有生物素，另一条未修饰的单链DNA的任意一个端延伸出正四面体结构，其中，延伸出的序列为能够与待检测病毒识别DNA分子互补。
所述待检测病毒识别DNA分子部分互补的序列3′端未标记生物素。
上述四条单链DNA自组装为通过四条单链DNA根据碱基互补配对原则两两(T1-T4)的单链DNA相互杂交，四条单链DNA中任意三条单链DNA的5′端修饰有生物素，剩余一条单链DNA并未修饰，以任意一条的单链DNA的5′端修饰的生物素为顶点形成正四面体结构，未标记生物素的单链DNA在一端延伸出正四面体结构，延伸出的序列为能够与待检测病毒识别DNA分子互补。
所述待检测病毒为新型冠状病毒或流感病毒。其中，新型冠状病毒模板分子为S蛋白，流感病毒模板分子为H1N1。
所述样本为咽/鼻拭子样本。
进一步的说，新型冠状病毒的功能化框架核酸探针中的序列依次为：新冠S蛋白序列：
Figure BDA0003551169180000021
流感H1N1的功能化框架核酸探针中的序列依次为：
流感H1N1序列：
Figure BDA0003551169180000031
一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片的制备方法，
步骤1：首先利用画图软件设计出纸芯片图样，通过采用蜡印技术将设计的多通道芯片图样打印到滤纸上，获得上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸，将打印完成的滤纸进行烘干，冷却至室温后，得到亲水区和疏水区相间的纸芯片，组装获得自由旋转的多通道纸芯片；
步骤2：将下层洗涤盘滤纸的洗涤通道转离上层检测盘滤纸的检测位点，在检测盘的检测位点依次加入壳聚糖溶液、戊二醛溶液、链霉亲和素和功能化框架核酸，室温干燥；
所述壳聚糖溶液的浓度为0.2-0.3mg/mL；加入量为1-8μL；戊二醛溶液的浓度为1.5-3.5％；加入量为1-8μL；链霉亲和素的浓度为0.01-0.2mg/mL；加入量为1-8μL；功能化框架核酸的浓度为5×10-7-5×10-5mol/L；加入量为1-8μL。
步骤3：检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
所述步骤2中将下层洗涤盘滤纸的洗涤通道转离上层检测盘滤纸的检测位点，在检测盘的检测位点滴加1-8μL浓度为0.2-0.3mg/mL的壳聚糖溶液，在空气中干燥；随后加入1-8μL浓度为1.5-3.5％的戊二醛溶液，反应2h。旋转洗涤盘，使洗涤通道对准检测盘的检测位点，用0.1X PBS(含有0.05％Tween-20)洗涤液进行洗涤，除去未完全反应的物质。将洗涤通道转离检测位点，然后加入1-8μL浓度为0.01-0.2mg/mL的链霉亲和素反应5-15分钟后进行洗涤，洗涤步骤同前述。洗涤完成后，将洗涤通道转离检测位点。随后加入1-8μL浓度为0.3-0.7％的牛血清蛋白进行封闭，用于除去检测位点区域多余非特异性位点，反应完成后进行洗涤，将所述的1-8μL浓度为5×10-7-5×10-5mol/L的框架核酸通过链霉亲和素与生物素的亲和作用修饰到芯片表面。随后滴加1-8μL浓度为0.05-0.2％的生物素，用于消除多余链霉亲和素的干扰。将1-8μL浓度为5×10-7-5×10-5mol/L的识别DNA分子与所述的框架核酸结构杂交形成框架核酸探针，反应5-15分钟后用PBS洗涤液进行洗涤。
一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片的制备方法，所述基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片在定量和/或定性分析检测新型冠状病毒或流感病毒中的应用。
一种检测病毒的方法，将待检测样品加入至所述旋转型微流控纸芯片的检测位点孵育5-15分钟；而后旋转芯片上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，采用含Tween-20的PBS溶液进行洗涤，洗涤后再次旋转芯片上层检测盘滤纸使检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠，向检测位点加入1-8μL浓度为5×10-7-5×10-5mol/L检测DNA分子室温孵育5-15分钟；旋转芯片上层检测盘滤纸经PBS溶液进行洗涤，洗涤后向检测位点加入1-8μL浓度为0.2-0.6μg/mL的链霉亲和素标记的过氧化氢酶(SA-HRP)孵育5-15分钟；旋转芯片上层检测盘滤纸经PBS溶液进行洗涤，洗涤后再次旋转芯片上层检测盘向检测位点加入2-6μL显色剂产生颜色信号，采用手机或相机拍照方式，利用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值和样本浓度的关系，实现对新型冠状病毒和流感病毒的定量和/或定性分析检测。
根据灰度值的大小判断检测样本的阴阳性及病毒类型。
进一步地说，所述检测时框架核酸与待检测病毒识别DNA分子结合，当存在待检测物时，待检测物与识别DNA分子结合，使其从框架核酸上脱落，随后框架核酸与待检测物检测DNA分子结合；特定结构的框架核酸有助于调控配体的取向和距离。
本发明所具有的优点：
本发明在一个框架核酸功能化的旋转型微流控纸芯片分析装置上完成了从样本输入到检测结果输出的全部过程，具有操作简单、检出限低、选择性好、成本低、便携等优势，为临床诊断提供了一种新型装备与策略，适用于现场、即时、快速检测和筛查；具体为：
1)本发明旋转型多通道微流控纸芯片能够将反应所涉及到的反应过程、洗涤过程和检测过程集成到芯片上，实现对多组分标志物的快速检测，具有成本低，便捷，易携带的优势。
2)本发明芯片中框架核酸结构能够精准调控配体的取向，有效调节配体间的距离，增强结合效率和降低空间位阻，以提高体系的灵敏度。
3)本发明利用所得芯片可用于新型冠状病毒和流感病毒分析检测方法中，利用手机等便携工具拍照，使用ImageJ软件进行灰度值分析，无需大型仪器检测，适用于现场筛查和快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的旋转型多通道框架核酸纸芯片分析装置组装示意图，其中，黑色和灰色部分为疏水区域，白色为亲水区域。
图2为本发明实施例提供的旋转型多通道框架核酸纸芯片分析装置的实物图。
图3为本发明实施例提供的自组装框架核酸示意图。
图4为本发明实施例提供的新型冠状病毒框架核酸及框架核酸探针电泳图，其中：1、Marker，2、T1，3、T2，4、T1+T2，5、T1+T2+T3，6、框架核酸，7、框架核酸探针。
图5为本发明实施例提供的采用装置对不同浓度S蛋白测定的标准工作曲线。
图6为本发明实施例提供的采用装置对不同浓度H1N1测定的标准工作曲线。
图7为本发明实施例提供的采用无框架核酸(双链DNA分子)装置对不同浓度S蛋白测定的标准工作曲线。
图8为本发明实施例提供的有无框架核酸对不同浓度S蛋白检测的检测性能对比。
具体实施方式
下面的实施例将参照附图对本发明作进一步详细说明，但并不因此而限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明获得的基于微流控芯片、框架核酸、光学检测技术于一体的纸基分析装置，其可用于新型冠状病毒和流感病毒的分析检测，实现对新型冠状病毒和流感病毒的高灵敏度、高选择性、简便、快速的识别与检测。所述微流控纸芯片在区分新型冠状病毒和流感病毒方面具有良好的应用价值，对于新型冠状病毒防控具有重要的应用价值和意义。
实施例1
如图1所示的旋转型微流控纸芯片，旋转型微流控纸芯片由两张印刷有不同微流控通道的上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加固定构成可旋转的微流控通道体系；
其中，上层检测盘滤纸上设置多个检测位点；本实施例设置4个检测位点，相连的两个检测位点呈轴对称，且检测位点的直径为5mm。
下层洗涤盘滤纸上设置与上层检测盘滤纸检测位点相对应的孔洞，任意相邻的两个孔洞之间沿径设置洗涤通道。本实施例孔洞同样设置4个，且与检测位点对应，孔洞的直径为5mm；洗涤通道长28mm，宽为5mm。
所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加，中心通过铆钉连接，使上下两层能够相对旋转。
所述上层检测盘滤纸上的多个检测位点位于同一圆周上，且上层检测盘滤纸除检测位点以外的区域均为疏水区域；
下层洗涤盘滤纸上的孔洞以及洗涤通道一端位于同一圆周上，且下层洗涤盘滤纸除孔洞和洗涤通道以外区域均为疏水区域。
所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸以中心为旋转中心自由旋转，检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；
洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
所述上层检测盘滤纸上设置多个检测位点内添加检测病毒的功能化框架核酸。
所述功能化框架核酸由四条单链DNA自组装形成为正四面体结构，组装正四面体结构中的四条单链DNA中任意三条单链DNA的5′端修饰有生物素，另一条未修饰的单链DNA的任意一个端延伸出正四面体结构，其中，延伸出的序列为能够与待检测病毒识别DNA分子互补。
所述待检测病毒识别DNA分子部分互补的序列3′端未标记生物素。
上述四条单链DNA自组装为通过四条单链DNA根据碱基互补配对原则两两(T1-T4)的单链DNA相互杂交，四条单链DNA中任意三条单链DNA的5′端修饰有生物素，剩余一条单链DNA并未修饰，以任意一条的单链DNA的5′端修饰的生物素为顶点形成正四面体结构，未标记生物素的单链DNA在一端延伸出正四面体结构，延伸出的序列为能够与待检测病毒识别DNA分子互补。
如图2所示，基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片的制备方法，具体为：
步骤1：首先利用Adobe illustrator制图软件设计2个圆片形芯片图样，分别为检测盘图样和洗涤盘图样，且要求每个圆片形芯片图样上都设计有圆心孔；纸芯片以WhatmanNo.1纤维素滤纸为载体，采用蜡印技术将设计的多通道芯片图样打印到Whatman No.1滤纸上，将打印完成的滤纸加热到140℃，60s后取出，冷却至室温后，得到亲水区和疏水区相间的纸芯片，将印有检测盘图样和洗涤盘图样的纸芯片进行裁剪，组装顺序由上到下为检测盘和洗涤盘，且所述检测盘和洗涤盘可以分别以圆心孔为旋转中心自由旋转，组装获得自由旋转的多通道纸芯片；
步骤2：将下层洗涤盘滤纸的洗涤通道转离上层检测盘滤纸的检测位点，在检测盘的检测位点依次将壳聚糖溶液、戊二醛溶液、链霉亲和素和功能化框架核酸加入上层检测盘滤纸的检测位点，室温干燥；
所述壳聚糖溶液的浓度为0.25mg/mL，加入量为2.5μL；戊二醛溶液的浓度为2.5％，加入量为2.5μL；链霉亲和素的浓度为0.05mg/mL，加入量为2.5μL；功能化框架核酸的浓度为10-6mol/L，加入量为2.5μL。
步骤3：检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
所述步骤1中位于上层的检测盘为直径60mm的黑色圆盘，且检测盘上设计有四个直径为5mm的样品检测位点，用于同时进行多种标志物的检测。位于下层的洗涤盘为直径90mm的绿色圆盘，且洗涤盘上设计有四个直径为5mm圆孔和四个长度为28mm的洗涤通道，用于洗脱除去检测盘多余的样品，洗涤液沿洗涤通道流出，离开检测位点。通过旋转洗涤盘可以控制检测区域和洗涤通道的接通与断开。
所述步骤2中将下层洗涤盘滤纸的洗涤通道转离上层检测盘滤纸的检测位点，在检测盘的检测位点滴加2.5μL 0.25mg/mL壳聚糖溶液，在空气中干燥；随后加入2.5μL2.5％戊二醛溶液，反应2h。旋转洗涤盘，使洗涤通道对准检测盘的检测位点，用0.1X PBS洗涤液进行洗涤，除去未完全反应的物质。然后加入2.5μL 0.05mg/mL链霉亲和素反应10分钟后进行洗涤，洗涤步骤同前述。洗涤完成后，将洗涤通道转离检测位点。随后加入2.5μL0.5％牛血清蛋白进行封闭，用于除去检测位点区域多余非特异性位点，反应完成后进行洗涤，将所述的2.5μL 10-6mol/L框架核酸通过链霉亲和素与生物素的亲和作用修饰到芯片表面。随后滴加2.5μL 0.1％生物素，用于消除多余链霉亲和素的干扰。将2.5μL 10-6mol/L识别DNA分子与所述的框架核酸结构杂交形成框架核酸探针，反应10分钟后用0.1X PBS洗涤液进行洗涤。
实施例2
使用实施例1制备组装获得旋转型微流控纸芯片用于对新型冠状病毒的定量和/或定性分析检测，具体包括以下步骤：
(1)框架核酸探针功能化：
(a)将洗涤盘的洗涤通道转离检测盘的检测位点，在检测盘的检测位点滴加2.5μL0.25mg/mL壳聚糖溶液，在空气中干燥；随后加入2.5μL 2.5％戊二醛溶液，反应2h。旋转洗涤盘，使洗涤通道对准检测盘的检测位点区域，滴加10μL PBS缓冲液洗涤3次，除去未完全反应的物质。室温干燥后，在检测盘的相应检测位点区域滴加2.5μL 0.05mg/mL链霉亲和素，室温反应10分钟后进行洗涤，洗涤步骤同前述。洗涤完成后，将洗涤通道转离检测区域，随后加入2.5μL 0.5％牛血清蛋白室温反应10分钟，用于除去检测区域多余非特异性位点，并进行洗涤。
(b)将等摩尔浓度的四条单链DNA混合于1X TM缓冲液中，95℃反应7min随即置于4℃冰水反应25min即可形成框架核酸，所述的框架核酸结构包括延伸出的一段与识别DNA分子部分互补的序列(本实施例为T-S-1)以及三个生物素标记的顶点(参见表1和图3)。
(c)将2.5μL 10-6mol/L框架核酸滴加至检测盘的检测位点通过链霉亲和素与生物素的亲和作用修饰到芯片表面，反应10分钟后进行洗涤。随后滴加2.5μL 0.1％生物素溶液反应7-10分钟，并进行洗涤。
(d)将2.5μL 10-6mol/L S蛋白识别DNA分子(S-aptamer)与所述的框架核酸结构中T-S-1延伸出部分杂交形成框架核酸探针，反应10分钟后进行洗涤。
(e)用凝胶电泳对框架核酸和框架核酸探针进行表征，见图4。新冠S蛋白序列：
Figure BDA0003551169180000081
上述表中T-S-1、T-S-2、T-S-3和T-S-4根据碱基互补配对原则两两杂交形成组装为正四面体结构，同时T-S-1序列中连字符“-”后即为延伸出与新冠病毒S蛋白识别DNA分子相互互补部分；S-aptamer为S蛋白识别DNA分子；S-detection为S蛋白检测DNA分子，当检测时样品与S-aptamer结合后，脱离框架核酸，S-detection与框架核酸结合。
(2)含有新型冠状病毒样本溶液的光学检测：以采集的阴性样本作为缓冲溶液分别配置一系列不同浓度(具体不同浓度为0,10-14,10-13,10-12,10-11,10-10,10-9,10-8g/mL)的新型冠状病毒标准溶液；将配置的2.5μL不同浓度标准溶液分别加入上述添加功能化框架核酸探针的微流控纸芯片上孵育10分钟；经PBS洗涤液洗涤后分别滴加2.5μL 10-6mol/L S蛋白检测DNA分子(S-detection)孵育10分钟；经PBS洗涤液洗涤后，加入2.5μL链霉亲和素标记的过氧化氢酶(SA-HRP)孵育10分钟；洗涤后，加入4μL TMB-双氧水显色剂产生颜色信号，控制反应时间，采用手机等便携工具拍照，利用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值和样本浓度的关系(随着样本浓度增加，灰度值减小)，进而获得不同浓度新型冠状病毒的标准工作曲线(参见图5)。
由图5可见，在10-14～10-8范围内，ΔI(ΔI＝I0-I，I0和I分别代表不存在和存在S蛋白时的灰度值)随新型冠状病毒浓度呈现出良好的线性关系。
实施例3
使用实施例1制备组装获得旋转型微流控纸芯片用于对流感H1N1的定量和/或定性分析检测，具体包括以下步骤：
(1)框架核酸探针功能化：
(a)将洗涤盘的洗涤通道转离检测盘的检测位点，在检测盘的检测位点滴加2.5μL0.25mg/mL壳聚糖溶液，在空气中干燥；随后加入2.5μL 2.5％戊二醛溶液，反应2h。旋转洗涤盘，使洗涤通道对准检测盘的检测位点区域，滴加10μL PBS缓冲液洗涤3次，除去未完全反应的物质。室温干燥后，在检测盘的相应检测位点区域滴加2.5μL 0.05mg/mL链霉亲和素，室温反应10分钟后进行洗涤，洗涤步骤同前述。洗涤完成后，将洗涤通道转离检测区域，随后加入2.5μL 0.5％牛血清蛋白室温反应10分钟，用于除去检测区域多余非特异性位点，并进行洗涤。
(b)将等摩尔浓度的四条单链DNA混合于1X TM缓冲液中，95℃反应7min随即置于4℃冰水反应25min即可形成框架核酸，所述的框架核酸结构包括延伸出的一段与识别DNA分子部分互补的序列(本实施例为T-H-1)以及三个生物素标记的顶点(参见表2和图3)。
(c)将2.5μL 10-6mol/L框架核酸滴加至检测盘的检测位点通过链霉亲和素与生物素的亲和作用修饰到芯片表面，反应10分钟后进行洗涤。随后滴加2.5μL 0.1％生物素溶液反应7-10分钟，并进行洗涤。
(d)将2.5μL 10-6mol/L流感H1N1识别DNA分子(H-aptamer)与所述的框架核酸结构中T-H-1延伸出部分杂交形成框架核酸探针，反应10分钟后进行洗涤。
流感H1N1序列：
Figure BDA0003551169180000091
上述表中T-H-1、T-H-2、T-H-3和T-H-4根据碱基互补配对原则两两杂交形成组装为正四面体结构，同时T-H-1序列中连字符“-”后即为延伸出与流感H1N1识别DNA分子相互互补部分；H-aptamer为流感H1N1识别DNA分子；H-detection为流感H1N1检测DNA分子，当检测时样品与H-aptamer结合后，脱离框架核酸，H-detection与框架核酸结合。
(2)含有流感病毒的样本溶液的光学检测：以采集的阴性样本作为缓冲溶液分别配置一系列不同浓度(具体不同浓度是0,10-14,10-13,10-12,10-11,10-10,10-9,10-8g/mL)的流感病毒标准溶液；将配置的2.5μL不同浓度标准溶液分别加入上述添加功能化框架核酸探针的微流控纸芯片上孵育10分钟；经PBS洗涤液洗涤后分别滴加2.5μL 10-6mol/L流感H1N1检测DNA分子(H-detection)孵育10分钟；经PBS洗涤液洗涤后，加入2.5μL链霉亲和素标记的过氧化氢酶(SA-HRP)孵育10分钟；洗涤后，加入4μL TMB-双氧水显色剂产生颜色信号，控制反应时间，采用手机等便携工具拍照，利用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值和样本浓度的关系(随着样本浓度增加，灰度值减小)，进而获得不同浓度流感H1N1的标准工作曲线(参见图6)。
由图6可见，在10-14～10-8范围内，ΔI(ΔI＝I0-I，I0和I分别代表不存在和存在流感H1N1时的灰度值)随流感H1N1浓度呈现出良好的线性关系。
而后，取1例空白样本、4例流感H1N1阴性样本和4例流感H1N1阳性样本用旋转型微流控纸芯片装置进行检测，如表3所示，空白样本和流感H1N1阴性样本显示阴性，流感H1N1阳性样本显示阳性，表明本装置可以有效检测流感H1N1。
Figure BDA0003551169180000101
对比例1
使用实施例1制备组装获得旋转型微流控纸芯片，采用双链DNA分子用于对新型冠状病毒的分析检测，具体包括以下步骤：
(1)双链DNA分子形成：等摩尔浓度的捕获DNA分子(D-capture)与识别DNA分子(S-aptamer)混合于1X TM缓冲液中，95℃反应7min后自然冷却，反应12h即可形成双链DNA分子，所述的双链DNA分子结构包括一个3′端标记生物素的顶点。
Figure BDA0003551169180000111
上述表中D-capture和S-aptamer根据碱基互补配对原则杂交组装为双链结构；D-capture为双链捕获DNA分子；S-aptamer为S蛋白识别DNA分子；D-detection为双链检测DNA分子，当检测时样品与S-aptamer结合后，双链DNA分子解旋，D-detection与D-capture结合。
(2)双链DNA分子探针功能化：(a)将洗涤盘的洗涤通道转离检测盘的检测位点，在检测盘的检测位点滴加2.5μL 0.25mg/mL壳聚糖溶液，在空气中干燥；随后加入2.5μL2.5％戊二醛溶液，反应2h。旋转洗涤盘，使洗涤通道对准检测盘的检测位点区域，滴加10μLPBS洗涤液洗涤3次，除去未完全反应的物质。室温干燥后，在检测盘的相应检测位点区域滴加2.5μL0.05mg/mL链霉亲和素，室温反应10分钟后进行洗涤，洗涤步骤同前述。洗涤完成后，将洗涤通道转离检测区域，随后加入2.5μL 0.5％牛血清蛋白室温反应10分钟，用于除去检测区域多余非特异性位点，并进行洗涤。(b)将2.5μL 10-6mol/L双链DNA分子通过链霉亲和素与生物素的亲和作用修饰到芯片表面，反应10分钟后进行洗涤。随后滴加2.5μL0.1％生物素溶液反应7-10分钟，并进行洗涤。
(3)含有新型冠状病毒的样本溶液的光学检测：以采集的阴性样本作为缓冲溶液分别配置一系列不同浓度(具体不同浓度是0,10-14,10-13,10-12,10-11,10-10,10-9,10-8g/mL)的新型冠状病毒标准溶液；将配置的2.5μL不同浓度标准溶液分别加入上述双链DNA分子探针功能化的微流控纸芯片上孵育10分钟；洗涤后分别滴加2.5μL 10-6mol/L双链检测DNA分子(D-detection)孵育10分钟；洗涤后，加入2.5μL链霉亲和素标记的过氧化氢酶(SA-HRP)孵育10分钟；洗涤后，加入4μL TMB-双氧水显色剂产生颜色信号，控制反应时间，采用手机等便携工具拍照，利用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值和样本浓度的关系，实现对新型冠状病毒的分析检测，见图7。
由图7可见在10-14～10-8范围内，ΔI(ΔI＝I0-I，I0和I分别代表不存在和存在S蛋白时的灰度值)随新型冠状病毒浓度呈现出较差的线性关系。
对实施例2和对比例1进行比较，可知在10-14～10-8范围内，有框架核酸时，ΔI随着浓度的增加而增加，具有良好的线性关系；无框架核酸时，ΔI随着浓度的增加变化不明显，线性关系较差，见图8。

Claims (10)

1.一种基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：旋转型微流控纸芯片由两张印刷有不同微流控通道的上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加固定构成可旋转的微流控通道体系；
其中，上层检测盘滤纸上设置多个检测位点；
下层洗涤盘滤纸上设置与上层检测盘滤纸检测位点相对应的孔洞，任意相邻的两个孔洞之间沿径设置洗涤通道。
2.按权利要求1所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸对应叠加，中心通过铆钉连接，使上下两层能够相对旋转。
3.按权利要求1所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：所述上层检测盘滤纸上的多个检测位点位于同一圆周上，且上层检测盘滤纸除检测位点以外的区域均为疏水区域；
下层洗涤盘滤纸上的孔洞以及洗涤通道一端位于同一圆周上，且下层洗涤盘滤纸除孔洞和洗涤通道以外区域均为疏水区域。
4.按权利要求1-3任意一项所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：所述上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸以中心为旋转中心自由旋转，检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；
洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
5.按权利要求1-3任意一项所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：所述上层检测盘滤纸上设置多个检测位点内添加检测病毒的功能化框架核酸。
6.按权利要求5所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片，其特征在于：所述功能化框架核酸由四条单链DNA自组装形成为正四面体结构，组装正四面体结构中的四条单链DNA中任意三条单链DNA的5′端修饰有生物素，另一条未修饰的单链DNA的任意一个端延伸出正四面体结构，其中，延伸出的序列为能够与待检测病毒识别DNA分子互补。
7.一种权利要求1所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片的制备方法，其特征在于：
步骤1：首先利用画图软件设计出纸芯片图样，通过采用蜡印技术将设计的多通道芯片图样打印到滤纸上，获得上层检测盘滤纸和下层洗涤盘滤纸，将打印完成的滤纸进行烘干，冷却至室温后，得到亲水区和疏水区相间的纸芯片，组装获得自由旋转的多通道纸芯片；
步骤2：将下层洗涤盘滤纸的洗涤通道转离上层检测盘滤纸的检测位点，在检测盘的检测位点依次加入壳聚糖溶液、戊二醛溶液、链霉亲和素和功能化框架核酸，室温干燥；
步骤3：检测时上层检测盘滤纸的检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠；洗涤时旋转上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠，构成流通通道。
8.一种权利要求1所述的基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片的应用，其特征在于：所述基于框架核酸检测病毒的旋转型微流控纸芯片在定量和/或定性分析检测新型冠状病毒或流感病毒中的应用。
9.一种检测病毒的方法，其特征在于：将待检测样品加入至权利要求1所述旋转型微流控纸芯片的检测位点孵育5-15分钟；而后旋转芯片上层检测盘滤纸，检测位点与下层洗涤盘滤纸上洗涤通道的一端重叠采用含Tween-20的PBS溶液进行洗涤，洗涤后再次旋转芯片上层检测盘滤纸使检测位点和下层洗涤盘滤纸孔洞重叠，向检测位点加入待检测DNA分子室温孵育5-15分钟；旋转芯片上层检测盘滤纸经PBS溶液进行洗涤，洗涤后向检测位点加入链霉亲和素标记的过氧化氢酶(SA-HRP)孵育5-15分钟；旋转芯片上层检测盘滤纸经PBS溶液进行洗涤，洗涤后再次旋转芯片上层检测盘向检测位点加入2-6μL显色剂产生颜色信号，采用手机或相机拍照方式，利用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值和样本浓度的关系，实现对新型冠状病毒和流感病毒的定量和/或定性分析检测。
10.按权利要求9所述的检测病毒的方法，其特征在于：根据灰度值的大小判断检测样本的阴阳性及病毒类型。
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