JP2016073290A - Ｒｎａ治療用ペプチドリボ核酸縮合体粒子のための化合物及び方法 - Google Patents

Ｒｎａ治療用ペプチドリボ核酸縮合体粒子のための化合物及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＲＮＡ干渉及びその他の治療方法に使用するための様々なペプチド−ＲＮＡ化合物及び組成物の提供。
【解決手段】直径１０００ｎｍ未満の縮合粒子を含む化合物であって、ここでその粒子が１又はそれ以上の二本鎖リボ核酸（ｄｓＫＮＡ）及び１又はそれ以上のペプチドを含む化合物、組成物、及び方法。さらに詳細には、ＲＮＡｉを通して標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する、ＲＮＡとペプチドとが縮合した安定な小粒子を含有する化合物。
【選択図】図１０

Description

本発明は、ＲＮＡ干渉の分野及びＲＮＡ治療送達の分野全般に関する。より詳細には、
本発明はペプチドリボ核酸縮合体粒子の化合物及び組成物、並びにそれらの薬物への使用
及び治療法としての送達への使用に関する。本発明は、哺乳動物内での遺伝子発現の遺伝
子特異的抑制のためのＲＮＡ干渉における、ペプチドリボ核酸縮合化合物の使用方法全般
に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる二本鎖ＲＮＡ
（ｄｓＲＮＡ）が媒介する、配列特異的な転写後ジーンサイレンシングの方法のことであ
る。Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９１，ｐ．８０６, １９９８、及びＨａｍｉ
ｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８６，ｐ．９５０−９５１, １９９９、を参照
のこと。ＲＮＡｉは種々の動植物に共有されており、進化の過程で保存されてきた異質遺
伝子の発現に対する細胞の防御メカニズムであると考えられている。Ｆｉｒｅら，Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．３５８, １９９９、を参照のこと。
従って、ＲＮＡｉは、小さなノンコーディングＲＮＡを用いて遺伝子の発現をサイレン
シングする、普遍的内在性メカニズムである。Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，Ｄ．Ｍ． ａｎｄ
Ｊ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ
．８，ｐ．３７７−４０２, ２００６、を参照のこと。ＲＮＡｉは、細胞死、分化、及び
発生に関与する重要な遺伝子を制御することができる。ＲＮＡｉはさらに、トランスポゾ
ン及びウィルスによってコードされた侵入遺伝要素からゲノムを保護することもできる。
ｓｉＲＮＡは細胞内に導入されると内在性のＲＮＡｉメカニズムと結びつき、高い特異性
をもって相補的配列を含むｍＲＮＡの発現を阻害する。いかなる疾患原因遺伝子、及び細
胞種又は組織も潜在的に標的となり得る。この技術は、遺伝子機能解析並びに創薬ターゲ
ットの探索及び確認に急速に利用されてきている。ｓｉＲＮＡをインビボで細胞へ導入す
ることには依然として重大な障害が伴うが、ＲＮＡｉの利用は治療の分野においても非常
に有望である。
ＲＮＡｉのメカニズムは、また完全には解明されていないが、標的となるｍＲＮＡの開
裂を介するものである。ＲＮＡｉ応答には、ＲＮＡ誘導性サイレンシング化合物（ＲＩＳ
Ｃ）として知られるエンドヌクレアーゼ化合物が関与しており、この複合体がｓｉＲＮＡ
二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な一本鎖ＲＮＡの開裂を媒介する。標的ＲＮＡの開裂は
、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で生じる（Ｅｌｂａｓｈｉ
ｒら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１８８, ２００１）。
ＲＮＡｉを行う一つの方法は、ｓｉＲＮＡを細胞内へ導入するか、又は細胞内で発現さ
せることである。もう一つの方法は、ダイサーと呼ばれる内在性のリボヌクレアーゼＩＩ
Ｉ酵素を利用することである。ダイサーの一つの活性は、長鎖ｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡへ
変換することである。Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８６，ｐ．９５
０−９５１, １９９９、及びＢｅｒｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０９，ｐ．
３６３, ２００１、を参照のこと。ダイサーから誘導されたｓｉＲＮＡは通常、全体の長
さが約２１から２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二本鎖部分を有する。Ｈａｍｉ
ｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８６，ｐ．９５０−９５１, １９９９、及びＥ
ｌｂａｓｈｉｒら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１８８, ２００１、を参
照のこと。実質的に、長鎖ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡの前駆体として細胞内に導入すること
ができる。
いろいろな治療の中でとりわけＲＮＡｉ治療、アンチセンス治療、及び遺伝子治療の開
発により、活性な核酸剤を細胞内へ導入するための有効な方法に対する需要が生じてきた
。一般的に、核酸は細胞又は血漿内で非常に短い時間しか安定ではない。しかし、核酸剤
は、細胞送達するのに十分に小さい粒子となり得る縮合化合物へと凝集するか又は結合す
ることで安定化させることができる。
最終的には治療法としての細胞間送達のために活性核酸剤を含有する小粒子を含む化合
物、及びそのような化合物を作製する方法が求められている。特に、細胞へ二本鎖ＲＮＡ
を送達してＲＮＡｉ応答を発生させるための化合物及び方法が求められている。
本発明は、ＲＮＡ干渉及びその他の治療方法に使用するための様々なペプチド−リボ核
酸化合物及び組成物の範囲を提供することにより、本技術分野におけるこれらの及びその
他の障害を克服する。詳細には、本発明は、ＲＮＡ干渉を通して標的遺伝子の発現を阻害
する活性を有する、１又はそれ以上のペプチドと１又はそれ以上のリボ核酸剤とが縮合し
た安定な小粒子を含む化合物、並びに該化合物の製造方法を提供する。本概要は、図面の
説明、本発明の詳細な説明、並びに添付の実施例、請求項、及び図面と合わせて、開示さ
れた本発明を包含する。
ある局面では、本発明は、ＲＮＡ干渉及びその他の治療方法に使用するための様々なペ
プチド−ＲＮＡ化合物及び組成物を提供し、その化合物にはＲＮＡｉを通して標的遺伝子
の発現を阻害する活性を有する、ＲＮＡとペプチドが縮合した安定な小粒子を含有する化
合物を含む。本発明の化合物は、一般に合成ペプチドと核酸の様々な混合物又は縮合体と
して提供される。
他の局面では、本発明の縮合化合物及び組成物は、ペプチド−ＲＮＡ化合物から成る安
定小粒子を含む。ある態様では、これらの化合物及び粒子は架橋することによってさらに
安定化することができる。他の態様では、本発明の化合物及び組成物は送達促進のために
ポリエチレングリコールなどのステルス剤（ｓｔｅａｌｔｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）又は表
面改質剤を含む。
さらなる局面では、本発明の化合物は１又はそれ以上のリボ核酸と１又はそれ以上のペ
プチド成分との縮合化合物を含む。ペプチド成分は、リボ核酸と結合して非共有結合によ
るペプチド−リボ核酸縮合化合物を形成するのに十分な正の電荷を保持することができる
。
ある局面では、本発明の縮合化合物は均一粒子を形成することができる。ある態様では
、ペプチド−核酸化合物球状粒子の直径は、平均が１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の
狭い分布をとることができる。
本発明のペプチド−核酸縮合化合物は、独自の多成分製剤を提供することができる。あ
る態様では、インビボでの治療のために、化合物は細胞への送達のための担体若しくは運
搬体、又は様々な送達マトリックスといった薬物送達のためのその他の薬剤と組み合わせ
ることができる。
ある態様において、化合物は、少なくとも一つのリボ核酸剤を水性溶液へ溶解し、それ
から少なくとも一つのペプチド成分をその水性溶液へ添加して粒径１０００ｎｍ未満の粒
子を縮合し、その後粒子の質量を増加させる第二のペプチド成分又は第三以降のペプチド
成分をその水性溶液に添加することにより、１又はそれ以上のリボ核酸及び１又はそれ以
上のペプチドから提供される。
さらなる態様において、化合物は、第一のペプチド成分を水性溶液に溶解し、そしてリ
ボ核酸剤をその水性溶液へ添加して粒径１０００ｎｍ未満の粒子を縮合し、その後粒子の
質量を増加させる第二のペプチド成分又は第三以降のペプチド成分をその水性溶液に添加
することにより、１又はそれ以上のリボ核酸剤及び１又はそれ以上のペプチド成分から提
供される。
本発明の一つの局面では、ペプチド成分はその核酸への相対的親和性に基づいて選択さ
れる。ペプチド成分は、該ペプチド成分の核酸への結合度を変化できるように選択するこ
とができる。
ある局面では、リボ核酸−ペプチド縮合化合物は可逆的に結合させることができる。リ
ボ核酸と一定量の正に帯電したリボ核酸結合性ペプチドから成る化合物は、細胞外生体環
境において十分に安定となることができ、細胞内エンドソームとの接触によってリボ核酸
を放出する。この放出によってＲＮＡｉ応答を誘起することができる。
さらなる局面では、ペプチド−リボ核酸化合物を安定化させる構造と方法が提供され、
その構造及び方法には化合物内でのリボ核酸結合性ペプチドの架橋が含まれる。ペプチド
−リボ核酸化合物を生命体内部での分解から保護する方法としては、化合物内でペプチド
の少なくとも一部を架橋することが含まれる。
本発明はさらに、この化合物の、薬物としての使用、並びに動物及びヒトのＲＮＡｉ治
療に用いるための薬物の製造において提供する。
本発明は、ＲＮＡ干渉及びその他の治療方法に使用するための様々なペプチド−ＲＮＡ
化合物及び組成物を提供する。さらに詳細には、本発明は、ＲＮＡｉを通して標的遺伝子
の発現を阻害する活性を有する、ＲＮＡとペプチドとが縮合した安定な小粒子を含有する
化合物を含む。
本発明の化合物は、一般的に合成ペプチドと核酸の混合物又は縮合体として提供される
。広範囲にわたる様々なペプチドを使用して化合物を形成することができる。ペプチドの
質量は通常、約１２０ｋＤａ未満、又は約６０ｋＤａ未満、又は約３０ｋＤａ未満である
。化合物のペプチドは粘膜透過修飾因子又は粘膜透過促進因子であってよい。
縮合化合物は、ペプチド−ＲＮＡ複合体の安定な小粒子を含む。これらの化合物及び粒
子は、様々な試薬で架橋することによりさらに安定化することができる。ある態様におい
て、本発明の化合物及び組成物は、送達促進のためにポリエチレングリコールなどのステ
ルス剤（ｓｔｅａｌｔｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）又は表面改質剤を含む。
本発明の化合物には、１又はそれ以上のリボ核酸及び１又はそれ以上のペプチド成分を
含む縮合複合体が含まれる。ペプチド成分は、リボ核酸と結合して非共有結合によるペプ
チド−リボ核酸縮合化合物を形成するのに十分な正の電荷を持つことができる。リボ核酸
及びインビボでの条件下でリボ核酸を安定化させるのに有効な量のリボ核酸結合性ペプチ
ドから構成される安定なリボ核酸複合体が提供される。ペプチド−核酸化合物の成分の結
合は一部イオン間力によるものであり、ファンデルワールス力又は水素結合など様々なそ
の他の相互作用も伴う場合がある。
本発明のペプチド−核酸縮合化合物は均一な粒子を含むことができる。ペプチド−核酸
化合物の球状粒子の直径は、平均が１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の狭い分布をとる
ことができる。球状粒子の直径は、１０００ナノメートル未満であってよく、約０．５乃
至約４００ナノメートル、約１０乃至約３００ナノメートル、及び約４０乃至約１００ナ
ノメートルであってもよい。安定粒子のゼータ電位の大きさは、約２０ミリボルト超又は
約３０ミリボルト超であってよい。
本明細書で用いる“均一”という用語は化合物の粒子の大部分が狭い粒径分布を持つこ
とを意味する。均一粒子の化合物において複数の粒径分布が生じていてもよい。一つの狭
い粒径分布は、粒子径測定器の対時間相関係数の生データに基づく粒径分布グラフ中の一
つのピークに相当する。均一な化合物は、少なくとも粒子の３０％を一つの狭い粒径分布
内に有することが好ましい。
本発明のペプチド−核酸縮合化合物は、独自の多成分製剤を提供することができ、生体
内治療のために、細胞への送達のための担体若しくは運搬体、又は様々な送達マトリック
スといった薬物送達のためのその他の薬剤と組み合わせることができる。
本発明の化合物及び組成物は、薬理学的に許容される媒体内に分散させ、マトリックス
と会合させ、又は細胞若しくは対象へ送達するための担体若しくは運搬体と会合させるこ
とができる。本発明の化合物又は粒子の分散体を含む溶液は、治療法としての送達のため
に提供することができる。
ペプチド成分
本発明の化合物に好適なペプチド成分は合成したものでもよく、又は自然若しくはその
他の供給源に由来するものでもよい。
ペプチド成分は、２から約１０００個のアミノ酸の長さ、２から約６００個のアミノ酸
の長さ、２から約６０個のアミノ酸の長さ、５から約３０個のアミノ酸の長さ、及び５か
ら約２５個のアミノ酸の長さを含んでもよい。
ペプチド成分は複数の正の電荷を含んでよい。例えば、ペプチド成分は１から約１００
個、５から約３０個、及び９から約１５個の正電荷を含んでよい。ペプチド成分の正電荷
は正に帯電したリシン又はアルギニンの残基によって提供することができる。
広範囲にわたる様々なペプチドを使用することで、ペプチド−核酸化合物を形成するこ
とができる。ペプチド成分の質量は通常、約１２０ｋＤａ未満、又は約６０ｋＤａ未満、
又は約３０ｋＤａ未満である。ペプチド成分のペプチドは、任意にポリアルキレンオキシ
ド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、又はこれらの組み合わせなどのポ
リマと抱合体を形成するか又は誘導体化されてもよい。例えば、本発明の化合物のペプチ
ド成分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合により誘導体化されてよい。
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの機能性ドメインは、ｓｉＮＡを細胞内へ送達
する能力において有用である。このような機能性ドメインには、膜付着領域、膜融合領域
、及びヌクレオチド結合領域が含まれる。膜付着は、典型的ポリヌクレオチド送達促進ポ
リペプチドが細胞膜と結合する能力を表す。膜融合性は、細胞膜から脱離して細胞質内に
進入する能力を表す。ペプチドの膜付着ドメイン及び膜融合ドメインは機構的に密接なつ
ながりがあり（すなわち、ペプチドが細胞内へ入る能力）、従って実験的に区別すること
は難しいであろう。最後に、ヌクレオチド結合性は、ペプチドがヌクレオチドと結合する
能力を表す。
化合物のペプチドは、粘膜などの障壁間の化合物の送達を促進することが知られている
構造的特徴を含んでよい。送達を促進する特徴の例としては様々なタンパク質導入ドメイ
ンが挙げられる。ペプチド成分は粘膜透過修飾因子であってよい。
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのタンパク質導入ドメインの例として
は、
１．ＴＡＴタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）（配列番号１）ＫＲＲＱＲＲＲ；
２．ペネトラチンＰＴＤ（配列番号２）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；
３．ＶＰ２２ ＰＴＤ（配列番号３）ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡ
ＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ；
４．カポジＦＧＦシグナル配列（配列番号４）ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ；及び
（配列番号５）ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ；
５．ヒトβ３インテグリンシグナル配列（配列番号６）ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ
；
６．ｇｐ４１融合配列（配列番号７）ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ；
７．カイマンクロコディルス（ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ）のＩｇ（ｖ）軽鎖
（配列番号８）ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡ；
８．ｈＣＴ誘導性ペプチド（配列番号９）ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶ
ＧＡＰ；
９．トランスポータン（配列番号１０）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡ
ＫＫＩＬ；
１０．ロリゴマー（ｌｏｌｉｇｏｍｅｒ）（配列番号１１）ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫ
ＫＫＫ；
１１．アルギニンペプチド（配列番号１２）ＲＲＲＲＲＲＲ；並びに
１２．両親媒性モデルペプチド（配列番号１３）ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ
；
が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのウィルス融合ペプチド膜融合ドメイ
ンの例としては、
１．インフルエンザＨＡ２（配列番号１４）ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧ；
２．センダイＦ１（配列番号１５）ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＡ；
３．呼吸器多核体ウィルスＦ１（配列番号１６）ＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶ；
４．ＨＩＶ ｇｐ４１（配列番号１７）ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧＳ；及び
５．エボラＧＰ２（配列番号１８）ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡ；
が挙げられる
ある態様では、本発明の方法及び組成物の範囲内で、ポリペプチド−ｓｉＮＡ複合体の
形成を促進し、及び／若しくはｓｉＮＡの送達を促進するＤＮＡ結合性ドメイン又はモチ
ーフが組み込まれたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが提供される。ここで言うＤ
ＮＡ結合性ドメインの典型例としては、以下の表１に示すＤＮＡ結合性調節タンパク質及
びその他のタンパク質に見られる、様々な「ジンクフィンガー」領域が挙げられる（Ｓｉ
ｍｐｓｏｎら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７８：２８０１１−２８０１８, ２０
０３、参照）。
Figure 2016073290
表１において、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＤｒｏｓＢｔｄ、ＤｒｏｓＳｐ、Ｃ
ｅＴ２２Ｃ８．５、及びＹ４ｐＢ１Ａ．４の配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号１９
、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６と定められる。
表１は、Ｃ−ｘ(２，４)−Ｃ−ｘ(１２)−Ｈ−ｘ(３)−Ｈ（配列番号２７）のモチーフ
パターンにより特徴付けられる二本鎖ＤＮＡ結合性保存ジンクフィンガーモチーフを示し
ており、それ自体を用いて本発明にかかるさらなるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチ
ドを選択して設計することができる。
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを構築するのに有用なＤＮＡ結合性ド
メインの他の選択肢としては、例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質配列の一部分が挙げられ
る。
本発明のある態様においては、前述の構造要素、ドメイン、又はモチーフのいずれかを
ｓｉＮＡの対象細胞への送達の促進を媒介する単一のポリペプチドへ組み入れることによ
って、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを構築することができる。例えば、ＴＡＴ
ポリペプチドのタンパク質導入ドメインは、ＨＡ２と呼ばれるインフルエンザウィルスの
赤血球凝集素タンパク質のＮ末端側の２０個のアミノ酸領域と融合してポリヌクレオチド
送達促進ポリペプチドを作り出すことができる。
本発明の化合物は、１又はそれ以上のペプチド成分を含むことができる。ペプチド成分
は、リボ核酸と結合して非共有結合によるペプチド−リボ核酸縮合化合物を形成するのに
十分な正の電荷を保持することができる。ペプチド−核酸複合体の成分の結合は一部イオ
ン間力によるが、ファンデルワールス力、水素結合、又は疎水性相互作用などのその他の
様々な相互作用も伴う場合がある。複合体は水性相互作用又は高溶媒濃度領域を保持して
いてもよい。
リボ核酸及び生体内条件下でリボ核酸を安定化させるのに有効な量のリボ核酸結合性ペ
プチドを含む安定なペプチド−リボ核酸複合体が得られる。
本発明の化合物に有用なペプチドのいくつかの例を表２に示す。
Figure 2016073290
本発明の化合物に有用なペプチドのさらなる例は以下の実施例中で示す。
縮合化合物とその調製
本発明は、直径が約１０００ｎｍ未満、約０．５ｎｍから約４００ｎｍ、約１０ｎｍか
ら約３００ｎｍ、及び約４０ｎｍから約１００ｎｍである粒子から構成されてよいペプチ
ド−リボ核酸縮合化合物を提供する。
化合物のペプチド成分は、粒子質量の５乃至９５％又は４５乃至９５％であってよい。
本発明のある態様においては、ペプチド−核酸化合物は１又はそれ以上のリボ核酸剤と
１又はそれ以上のペプチド成分から提供され、該リボ核酸剤と該ペプチド成分を水溶液中
で縮合することによって直径１０００ｎｍ未満の粒子を形成する。
一般に本発明の化合物は、１又はそれ以上のペプチドと１又はそれ以上の核酸から形成
されたペプチド−核酸縮合体を含む。この縮合体は、一つには核酸に対するペプチドの窒
素対リン比（Ｎ／Ｐ比）で特徴付けられる。
本発明の化合物は直径１０００ｎｍ未満の縮合体粒子から成ってよく、ここで各粒子は
少なくとも１０個の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子及び少なくとも１０個のペプチド
を含む。本明細書で用いられる「少なくとも１０個のペプチド」とは、部分モル量が１０
ペプチド分子であることを意味し、ペプチド分子の構造は同じであっても異なっていても
よい。従って、「少なくとも１０個のペプチド」とは、単一のペプチド構造の部分モル量
、又は２若しくは３個以上の異なるペプチド構造の部分モル量であってもよい。
一般に、本明細書で用いられる「ペプチド」、「核酸」、並びに「ｄｓＲＮＡ」及び「
ｓｉＲＮＡ」などの用語は、本発明の化合物を形成するのに十分な量にあるこれらの分子
を意味する。すなわち、一般に、このような用語は個々の分子ではなく部分モル量を表す
。「ペプチド」とは、例えばアボガドロ数個のペプチド分子など、１又は２個以上のペプ
チド分子のことである。「二つのペプチドをリボ核酸剤に付加する」とは、個々の部分モ
ル量にある構造の異なる二種類のペプチドの混合物をリボ核酸剤に添加混合することを意
味する。
複合体又は縮合体中の核酸（ＮＡ）に結合したペプチドの量は、窒素リン比（Ｎ／Ｐ比
）とも呼ばれる、単一分子ペア形成についてのペプチド：ＮＡ電荷比を用いることにより
結合した核酸の量から得ることができる。縮合後に溶液中に残存する遊離ペプチドの量は
、物質収支から得られる。従って、本明細書において、電荷比Ｎ／Ｐとは、初期縮合溶液
中における単一ペプチド成分の単一核酸剤に対する初期電荷比Ｎ／Ｐを意味する。
一般に、溶液中の核酸剤濃度はその溶解度によってのみ制限される。溶液中のペプチド
成分の濃度は、所望のＮ／Ｐ比が得られるよう調節される。
ある態様において、溶液のペプチド成分濃度は全体のＮ／Ｐ比が約１となるように調節
される。Ｎ／Ｐ比が約１の時、イオン電荷という面でペプチド成分も核酸剤も過剰ではな
い。
ある態様において、溶液の各ペプチド成分濃度は、Ｎ／Ｐ比が約０．２から約５０、約
０．５から約２０、約０．５から約７、又は約０．５から約２．５となるように調節され
る。
溶液のｐＨは通常約１１未満、約９未満、及び約８未満である。溶液の成分の混合は、
任意に、ボルテックス撹拌行ってもよい。
ある態様において、縮合化合物は核酸剤をペプチド成分を含有する溶液へ添加すること
によって調製される。
ある態様において、溶液は無機塩又は有機塩を含んでよい。例えば、水溶液は約１Ｍ以
下、約０．５Ｍ以下、及び約０．２５Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウムを含んでよい。
任意に、特定のサイズ分布を有するペプチド−核酸縮合化合物は溶液から単離すること
ができる。ある態様においては、ペプチド−核酸縮合化合物を含有する溶液をろ過するこ
とで様々なサイズの粒子が単離される。
他の態様において、ペプチド−核酸縮合化合物を含有する溶液を透析にかけることによ
って過剰な又は結合しなかったペプチド成分が除去される。
ある態様において、単離されたペプチド−核酸粒子は凍結乾燥される。
本発明のある態様において、ペプチド−核酸化合物は、少なくとも１種類のリボ核酸剤
を水溶液中に溶解し、それから少なくとも１種類のペプチド成分をその水溶液中へ添加し
て１０００ｎｍ未満の粒径を有する粒子を縮合させ、その後第二のペプチド成分又は第三
以降のペプチド成分をその水溶液中へ添加して粒子質量を増加させることにより、１又は
それ以上のリボ核酸剤と１又はそれ以上のペプチド成分から提供される。
本発明のある態様において、ペプチド−核酸化合物は、第一のペプチド成分を水溶液中
に溶解し、それからリボ核酸剤をその水溶液中へ添加して１０００ｎｍ未満の粒径を有す
る粒子を縮合させ、その後第二のペプチド成分又は第三以降のペプチド成分をその水溶液
中へ添加して粒子質量を増加させることにより、１又はそれ以上のリボ核酸剤と１又はそ
れ以上のペプチド成分から提供される。
本発明の一つの局面において、ペプチド−核酸化合物は、ペプチド成分を核酸への相対
親和性に基づいて選択することによって提供される。例えば、ペプチドによる核酸結合性
色素ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄの置換を測定することにより、様々なペプチドの核酸に対する相
対結合性の分析が行われる。化合物の核酸に対するペプチド成分の相対親和性を特徴付け
ることにより、ペプチド成分の核酸への結合度を変化できるようにペプチド成分を選択す
ることができる。
ペプチド成分の核酸への結合度を変化させることにより、最初に結合性の強いペプチド
成分によって縮合体粒子が形成され、続いて結合性の弱いペプチド成分が粒子を形成する
か、若しくはその逆が可能となり、又は縮合化合物に結合強度の異なる成分を複数回に分
けて添加することが可能となる。
ある態様において、核酸剤と縮合する第一のペプチド成分が、第二以降のペプチド成分
よりもその核酸剤に対して強い結合親和性を持つことが好ましい。これらの態様において
、溶液の第一のペプチド成分の濃度は、Ｎ／Ｐ比が約０．２から約７、約０．２から約２
．５、又は約０．２から約１となるよう調節される。これらの態様において、後に続くペ
プチド成分の濃度は、Ｎ／Ｐ比が約０．２から約５０、約０．５から約２０、約０．５か
ら約７、又は約０．５から約２．５となるよう調節される。
可逆的に結合したリボ核酸−ペプチド縮合化合物は、リボ核酸、並びに細胞外生体環境
下で十分に安定であって、細胞内エンドソームと接触することでリボ核酸を放出すること
ができるリボ核酸−ペプチド縮合体を形成する量にある正に帯電したリボ核酸結合性ペプ
チドを含む。
ペプチドがリボ核酸を結合させるのに有効な量の正に帯電した残基を含む、ペプチド−
核酸縮合体の集団が提供される。このリボ核酸−ペプチド縮合体は細胞外生体環境下で十
分に安定であり、ＲＮＡｉ応答を発生させるのに有効な方法で細胞内にリボ核酸を放出す
ることができる。
本発明のある局面において、試薬を用いてペプチド−ＲＮＡ縮合体が架橋される。例え
ば、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド基を導入することでペプチド又は粒子表面の
アミノ基を架橋し、ペプチド−ＲＮＡ縮合体の安定性を高めることができる。架橋剤の他
の例としては、ホルムアルデヒド、アクロレイン、及びジチオビス（スクシンイミジルプ
ロピオネート）が挙げられる。架橋された縮合化合物は、血清中のエンドヌクレアーゼに
よる代謝に対する耐性が向上していることであろう。
ある態様において、核酸剤と縮合する第一のペプチド成分は、第二以降のペプチド成分
を添加する前に架橋される。任意に、第一のペプチド成分の縮合体は、第二以降のペプチ
ド成分を添加した後に架橋されてもよい。ある態様において、第一のペプチド成分の縮合
体は、第二以降のペプチド成分の添加前及び添加後に架橋される。
ペプチド−リボ核酸化合物を安定化する方法には、化合物内においてリボ核酸結合性ペ
プチドを、例えばグルタルアルデヒド架橋剤で架橋することが含まれる。ペプチド−リボ
核酸化合物を生命体内部における分解から保護する方法としては、化合物内でペプチドの
少なくとも一部を、例えばグルタルアルデヒド架橋剤で架橋することが含まれる。
本発明のペプチド−リボ核酸化合物は、界面活性剤、中性脂質、又はポリエチレンオキ
シドなどの表面改質剤を添加することによっても安定化することができる。例えば、ポリ
エチレングリコールは縮合化合物の溶液に添加されるとその複合粒の粒子へ付着すること
ができる。例えば、非イオン性であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロッ
ク共重合体を添加して化合物の粒子を安定化させることもできる。
本開示には、動物及びヒトのＲＮＡｉ治療に用いるための薬物の製造における本発明の
化合物の使用が包含される。
核酸剤
本発明に有用な核酸剤は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、修飾若しくは分解耐性核酸、ＲＮＡ
、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、アンチセンス核酸、又はリボザイムであってよい。
これに関連して、本発明は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を調節するための化合物、
組成物、及び方法を提供する。本発明の化合物又は組成物はリボ核酸剤をＲＮＡｉ応答を
生じさせることが可能な細胞へ放出することができる。本発明の化合物又は組成物は、細
胞内エンドソームとの接触によってリボ核酸剤を細胞へ放出することができる。リボ核酸
剤の細胞内放出によって細胞内における遺伝子発現を阻害することができる。
本発明に有用なリボ核酸剤は様々な遺伝子を標的とすることができる。例えば、本発明
のｓｉＲＮＡ剤は、ＴＮＦ−α遺伝子の領域と相補的な配列を有することができる。本発
明のある態様において、この化合物及び組成物は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を
制御するのに有用である。ＴＮＦ−αは、例えば肺疾患において発生する炎症プロセスと
関連し得るため、抗炎症効果を生じ得る。本発明の組成物を送達することによってＴＮＦ
−αをブロックすることは、リウマチ性関節炎の兆候及び／又は症状の治療又は予防に有
用であろう。
本発明は、ＲＮＡ干渉によってＴＮＦ−αの発現及び活性を調節するための化合物、組
成物、及び方法を提供する。
ＴＮＦ−αの発現及び／又は活性は、例えばｓｉＲＮＡ分子であるＩｎｍ−４を細胞へ
送達することによって調節することができる。Ｉｎｍ−４は、ヒトＴＮＦ−α遺伝子と相
同的な配列を持つ２１ヌクレオチドの二本鎖ｓｉＲＮＡ分子である。Ｉｎｍ−４は、セン
ス鎖上に３’−ｄＴｄＴのオーバーハングを、アンチセンス鎖上に３’−ｄＡｄＴオーバ
ーハングを有する。Ｉｎｍ−４の一次構造は以下の通りである。
センス鎖（配列番号４４）
５’−ＣＣＧＵＣＡＧＣＣＧＡＵＵＵＧＣＵＡＵｄＴｄＴ
アンチセンス鎖（配列番号４５）
５’−ＡＵＡＧＣＡＡＡＵＣＧＧＣＵＧＡＣＧＧｄＴｄＴ
ＴＮＦ−αの発現及び／又は活性は、例えばｓｉＲＮＡ分子であるＬＣ２０を細胞へ送
達することによって調節することができる。ＬＣ２０は、ヒトＴＮＦ−α遺伝子と相同的
な配列を持つ２１ヌクレオチドの二本鎖ｓｉＲＮＡ分子である。ＬＣ２０が標的とするの
は、ヒトＴＮＦ−αの３’−ＵＴＲ領域である。ＬＣ２０は１９塩基対を持ち、センス鎖
上に３’−ｄＴｄＴのオーバーハングを、アンチセンス鎖上に３’−ｄＡｄＴオーバーハ
ングを有する。ナトリウム塩型の分子量は１４，２９８である。ＬＣ２０の一次構造は以
下の通りである。
センス鎖（配列番号４６）
（５’）−ＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡｄＴｄＴ
アンチセンス鎖（配列番号４７）
（５’）−ＵＡＡＧＣＵＵＧＧＧＵＵＣＣＧＡＣＣＣｄＴｄＡ
本発明のｓｉＲＮＡは、ウィルス遺伝子の領域と相補的な配列を有することができる。
例えば、本発明のある組成物及び方法は、インフルエンザのウィルスゲノムの発現を制御
するのに有用である。
これに関連して、本発明は、ＲＮＡ干渉によってインフルエンザの発現及び感染活性を
調節するための組成物及び方法を提供する。インフルエンザの発現及び／又は活性は、例
えばインフルエンザのＲＮＡポリメラーゼサブユニットの領域と相補的な配列を有する短
鎖干渉ＲＮＡ分子を細胞へ送達することによって調節することができる。例としてインフ
ルエンザのＲＮＡポリメラーゼサブユニットと相同的な配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分
子を表３に示す。
Figure 2016073290
本発明のｓｉＲＮＡは、インフルエンザのＲＮＡポリメラーゼサブユニットの領域と相
補的な配列を有することができる。
本発明は、インフルエンザのｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡを投与するための組成物及
び方法を提供し、これらの組成物と方法によってインフルエンザＲＮＡは効果的に下方制
御され、それによってインフルエンザ感染が低減、予防、又は寛解される。
ＲＮＡ干渉治療
ある態様において、本発明は、短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子又はその前駆体などの
ＲＮＡｉ誘導性化合物を有効量含有する組成物を対象へ投与することによって該対象内の
標的転写物の発現を阻害するための化合物、組成物、及び方法を提供する。ＲＮＡｉは、
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とし、
翻訳を減弱する。本発明で用いられるｓｉＲＮＡは、例えばｓｉＲＮＡへのプロセッシン
グを受ける長鎖ｄｓＲＮＡなど、ダイサーによるプロセッシングを受ける前駆体であって
よい。本発明は、標的転写物の発現又は標的転写物によってコードされたペプチド若しく
はタンパク質の活性に関連する疾患又は状態を治療又は予防する方法を提供する。
ＲＮＡｉに基づく治療法を用いて、ウィルス又は微生物の成長又は機能を停止したり、
疾患経路内の内在性遺伝子産物の機能を停止したりすることによって、広範囲にわたる様
々な疾患を治療することができる。
ある態様において、本発明は、短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子及びその前駆体などの
ＲＮＡｉ誘導性化合物を送達するための新規な組成物及び方法を提供する。詳細には、本
発明は、対象の細胞、組織、及び／又は器官の１又はそれ以上の転写物を標的とするＲＮ
Ａｉ誘導性化合物を含有する組成物を提供する。
ｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチドの長さの相補的領域を有する二本鎖ＲＮＡであって
よい。ｓｉＲＮＡは任意に一つ又は二つの一本鎖オーバーハング又はループを含んでいて
もよい。
ｓｈＲＮＡは自己相補的領域を有する一本鎖ＲＮＡであってよい。この一本鎖ＲＮＡは
ステムとループを有するヘアピン構造を形成することができ、任意に、このＲＮＡの５’
末端及び／又は３’末端において１又は２箇所以上の非対形成部分を有してよい。
活性治療剤は、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性が高められ、及び／又は細
胞取り込みが改善された化学修飾ｓｉＮＡであって、ＲＮＡｉ活性が保持されたものであ
ってよい。
本発明のｓｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子のある領域に相補的な配列を有してよい。本発明
のｓｉＲＮＡは２９塩基対から５０塩基対を有してよく、例えば標的遺伝子のある領域に
相補的な配列を有するｄｓＲＮＡである。あるいは、二本鎖核酸はｄｓＤＮＡであっても
よい。
ある態様において、活性剤は、遺伝子産物の発現を調節可能な短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ
）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、又
は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってよい。
選択された疾患状態と関連する原因因子又は寄与因子として発現が異常に増加すること
が知れらている大多数の遺伝子のいずれをも含む、対象の特定の疾患状態に関連する１又
はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的とする類似の方法及び組成物が提供される。
本発明のＲＮＡｉ誘導性化合物は、疾患状態に対するその他の公知の治療と合わせて投
与してもよい。
ある態様において、本発明は、送達促進化合物と混合、化合物化、又は抱合された形の
短鎖干渉核酸、短鎖干渉ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又は短鎖ヘアピンＲＮ
Ａなどの低分子核酸分子を含有する組成物を特徴とする。
本明細書で用いる「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮ
Ａ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、及び「化学修飾短
鎖干渉核酸分子」の各用語は、例えば配列特異的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又はジーンサ
イレンシングを媒介することによって、遺伝子発現又はウィルス複製を阻害又は下方制御
可能ないずれの核酸分子も意味する。
ある態様において、ｓｉＮＡは、アンチセンス領域が、発現を下方制御する標的リボ核
酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス領
域が、標的リボ核酸の配列又はその一部に対応する（すなわち実質的に同一の配列である
）ヌクレオチド配列を含む、自己相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ポリ
ヌクレオチド分子である。
「ｓｉＮＡ」は、例えば短鎖二本鎖核酸であるｓｉＲＮＡ、又は任意に、長鎖のその前
駆体等の低分子干渉核酸を意味する。本発明の範囲内で有用なｓｉＮＡの長さは、ある態
様においては約２０乃至５０ｂｐの長さで最適化される。しかし、ｓｉＲＮＡを含む有用
なｓｉＮＡの長さには特に制限はない。例えばｓｉＮＡはまず、標的細胞内に存在して、
標的細胞への送達と同時に又はその後にジーンサイレンシングを引き起こす最終的な形又
はプロセッシングを受けた形のｓｉＮＡとは十分に異なる前駆体の形で細胞へ導入するこ
とができる。ｓｉＮＡの前駆体は、例えば送達と同時に又はその後にプロセッシング、分
解、変性、又は開裂に付される前駆体配列要素を含むことで、細胞内でジーンサイレンシ
ングを媒介する活性を有するｓｉＮＡを生成することができる。ある態様において、有用
なｓｉＮＡの前駆体の長さは例えば約１００乃至２００塩基対、５０乃至１００塩基対、
又は約５０塩基対未満であって、これによって標的細胞内において活性なプロセッシング
を受けたｓｉＮＡが生成される。他の態様においては、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＮＡ前駆
体の長さは、約１０から４９塩基対、１５から３５塩基対、又は約２１から３０塩基対と
なる。
本発明のある態様においては、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを使用して、大
きなｓｉＮＡの核酸前駆体を含む従来のｓｉＮＡよりも大きな核酸分子の送達を促進する
。例えば、本発明の方法及び組成物を、所望のｓｉＮＡの「前駆体」である大きな核酸の
送達を促進するために用いることができ、ここで前駆体のアミノ酸が標的細胞への送達の
前、間、若しくは後に開裂又はプロセッシングに付されて標的細胞内での遺伝子発現を調
節する活性ｓｉＮＡを形成することができる。
例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリヌクレオチドとしては、自己相補的なセンス領域及びアン
チセンス領域を含む２又は３個以上のループ構造並びにステムを有する環状一本鎖ポリヌ
クレオチドを選択することができ、ここでアンチセンス領域は、標的核酸分子内のヌクレ
オチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を含み、センス領域は、標的核酸の
配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含み、そしてこの環状ポリヌクレオチド
がインビボ又はインビトロでプロセッシングを受けることでＲＮＡｉを媒介可能な活性ｓ
ｉＮＡ分子を生成することができる。
本発明のｓｉＮＡ分子、特に前駆体でない形のものは、３０塩基対未満であってよく、
約１７乃至１９ｂｐ、１９乃至２１ｂｐ、又は２１乃至２３ｂｐであってもよい。
ｓｉＲＮＡは哺乳類系で選択的なジーンサイレンシングを媒介することができる。短鎖
ループ及び１９乃至２７塩基対のステムを有するヘアピンＲＮＡも、その二本鎖ステムの
配列と相同的な遺伝子の発現を選択的にサイレンシングする。哺乳類細胞は短鎖ヘアピン
ＲＮＡを、ｓｉＲＮＡへ変換して選択的ジーンサイレンシングを媒介することができる。
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ
の開裂を媒介する。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な
領域内で発生する。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖は、通常２ヌクレオチドの３’
末端オーバーハングを含む場合に最も活性が高い。
２−ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖
の３’末端オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡ
ｉ活性への悪影響が生じない場合がある。ｓｉＲＮＡの各末端において４ヌクレオチドま
ではデオキシリボヌクレオチドによる置換が許容され得るが、完全にデオキシリボヌクレ
オチドで置換するとＲＮＡｉ活性が喪失する場合がある。
別の選択肢として、ｓｉＮＡは、単一の又は複数のｓｉＮＡをコードし、その発現を標
的細胞内で該ｓｉＮＡを発現させるポリヌクレオチドベクタによって発現された単一の又
は複数の転写産物として送達することができる。このような態様においては、標的細胞内
で発現されるｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分の長さは、例えば１５乃至４９ｂｐ
、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐであってよい。
本発明のある態様において、二本鎖が対合しているｓｉＮＡの二本鎖領域は、バルジ部
分、ミスマッチ部分、又はその両方を含んでよい。二本鎖が対合しているｓｉＮＡの二本
鎖部分は、完全に対合したヌクレオチドセグメントに限定されず、例えばミスマッチ（対
応するヌクレオチドが相補的でない）、バルジ（一方の鎖上の対応する相補的ヌクレオチ
ドが欠失）、又はオーバーハングによって対合していない部分を含んでよい。非対合部分
は、ｓｉＮＡ形成に干渉しない程度含まれていてよい。ある態様において、「バルジ」は
１つ又は２つの非対合ヌクレオチドを含んでよく、二本鎖が対合しているｓｉＮＡの二本
鎖領域は、約１個乃至７個又は約１個乃至５個のバルジを含んでよい。さらに、ｓｉＮＡ
の二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」部分は、１個乃至７個又は１個乃至５個存在して
よい。ミスマッチで最も多いのは、ヌクレオチドの一つがグアニンで他方がウラシルの場
合である。このようなミスマッチは、例えばセンスＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ内
のＣからＴ、ＧからＡ、又はそれらの組み合わせという変異に起因するであろうが、他の
要因も考えられる。
本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡが標的遺伝子の発現を阻害する活性を保持す
る限りにおいて、平滑末端又は粘着末端（オーバーハング）であってよい。粘着末端（オ
ーバーハング）構造は３’末端オーバーハングに限定されず、ジーンサイレンシングを誘
起する活性が保持される限りにおいて、５’末端オーバーハング構造も含まれる。さらに
、オーバーハング部のヌクレオチド数は２又は３に限定されず、ジーンサイレンシングを
誘起する活性が保持される限りにおいて、ヌクレオチド数はいくつであってもよい。例え
ば、オーバーハング部は１乃至約８のヌクレオチド又は２乃至４のヌクレオチドを含んで
よい。
粘着末端（オーバーハング）構造を有するｓｉＮＡの長さは、対合する二本鎖部分及び
各末端のオーバーハング部分の長さとして表すことができる。例えば、２ｂｐの３’末端
アンチセンスオーバーハングを有する２５／２７−ｍｅｒのｓｉＮＡ二本鎖は、２５−ｍ
ｅｒのセンス鎖及び２７−ｍｅｒのアンチセンス鎖を持ち、この場合、対合部の長さは２
５ｂｐである。
いずれのオーバーハング配列も標的遺伝子に対する特異性は低くてよく、標的遺伝子配
列に対して相補的（アンチセンス鎖）でなくても同一（センス鎖）でなくてもよい。ｓｉ
ＮＡはジーンサイレンシング活性を保持する限りにおいて、そのオーバーハング部中に、
例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウィルスＲＮＡなどの自然ＲＮＡ分子又は人工ＲＮＡ分子等
の低分子量構造を含んでよい。
ｓｉＮＡの末端構造は、二本鎖核酸の一方の末端部が、例えばリンカＲＮＡ等のリンカ
核酸によって繋がっているステム−ループ構造であってよい。二本鎖領域（ステム−ルー
プ部分）の長さは、例えば１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂ
ｐであってよい。別の選択肢として、標的細胞内で発現されるｓｉＮＡの最終転写産物で
ある二本鎖領域の長さは、例えば約１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｐ、又は約２１乃至
３０ｂｐであってよい。
ｓｉＮＡは、標的核酸分子内のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその
一部分を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むことができ、ここで一本鎖ポリヌクレオチ
ドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｃｅｌｌ． １１０： ５６３−５７４
, ２００２； Ｓｃｈｗａｒｚら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １０： ５３７−５６８
, ２００２、を参照）又は５’，３’−リン酸ジエステルなどの末端リン酸を含んでよい
。
本明細書で用いるｓｉＮＡ分子という用語は、天然のＲＮＡ又はＤＮＡのみを含む分子
に限定されず、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。ある態様に
おいて、本発明の短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ基（２’−ＯＨ）を含むヌクレオ
チドが欠失している。ある態様において、短鎖干渉核酸はＲＮＡｉを媒介するのに２’
−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドは存在する必要がなく、従って本発明の短鎖干渉核
酸分子は、任意にリボヌクレオチド（例：２’−ＯＨ基を持つヌクレオチド）をまったく
含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを媒介するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチ
ドが存在する必要がないｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１又は２個以上のヌクレ
オチドを含む、接合した一つ若しくは複数のリンカ、又はその他の接合若しくは会合した
基、部分、若しくは鎖を有してよい。ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド部位の少なくとも約
５、１０、２０、３０、４０、又は５０％にリボヌクレオチドを含んでいてもよい。
本明細書で用いるｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる
核酸分子を包含し、中でも特に例を挙げると、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本
鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ分子、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
分子、短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子、短鎖干渉核酸分子、短鎖干渉修飾オリゴヌクレ
オチド分子、化学修飾ｓｉＲＮＡ分子、及び転写後ジーンサイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇ
ｓＲＮＡ）分子等がある。
ある態様では、ｓｉＮＡ分子は個別のセンス及びアンチセンス配列若しくは領域を含み
、ここでセンス領域及びアンチセンス領域はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドリンカ
分子によって共有結合されているか、又はイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワー
ルス相互作用、疎水性相互作用、及び／若しくはスタッキング相互作用により非共有的に
結合されている。
「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡ鎖で
あって、標的遺伝子ｍＲＮＡと結合することによってＲＮＡｉを誘起することができるＲ
ＮＡ鎖をいう。
「センスＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であって
、その相補的アンチセンスＲＮＡとアニールしてｓｉＲＮＡを形成するＲＮＡ鎖をいう。
本明細書で用いる「ＲＮＡｉ構築物（ＲＮＡｉ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」又は「ＲＮＡ
ｉ前駆体」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及びイン
ビボで開裂してｓｉＲＮＡを形成することができるその他のＲＮＡ種等のＲＮＡｉ誘導性
化合物を意味する。本明細書におけるＲＮＡｉ前駆体は、細胞中でｄｓＲＮＡ若しくはヘ
アピンＲＮＡを形成する転写物、及び／又はｓｉＲＮＡをインビボで生成することができ
る転写物を生じさせることが可能な発現ベクタ（ＲＮＡｉ発現ベクタとも言う）も含む。
ｓｉＨｙｂｒｉｄ分子は、ｓｉＲＮＡと同様の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖
ＲＮＡ分子と違い、ｓｉＨｙｂｒｉｄはＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖から構成される。ＲＮＡ鎖
が標的ｍＲＮＡと結合するアンチセンス鎖であることが好ましい。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の
ハイブリダイゼーションによって生じたｓｉＨｙｂｒｉｄは、ハイブリダイズした相補的
部分、及び好ましくは少なくとも一つの３’末端オーバーハングを有する。
本発明の範囲内で使用するｓｉＮＡは、二つの別々のオリゴヌクレオチドから構築する
ことができ、ここでこのうち一方はセンス鎖でもう一方はアンチセンス鎖であって、この
場合、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的（すなわち、各鎖が他方の鎖のヌクレオチ
ド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖及びセンス鎖が二重又は二本
鎖構造を形成しており、この場合、例えばその二本鎖領域が約１９塩基対である。）であ
る。アンチセンス鎖は標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレ
オチド配列を含むことができ、センス鎖は標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレ
オチド配列を含むことができる。別の選択肢として、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチ
ドから構築することもでき、この場合、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセン
ス領域は核酸系又は非核酸系のリンカによって結合される。
ある態様では、細胞内送達のためのｓｉＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領
域を有し、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン、又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリ
ヌクレオチドであってよく、ここでアンチセンス領域は個々の標的核酸分子内のヌクレオ
チド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列
又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む。
ｓｉＮＡに施すことが可能な化学修飾の例としては、ヌクレオチド間のホスホロチオエ
ート結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’
−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「
非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、並びに末端グリセリル及び／又は
逆位デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｓ ｒｅｓｉｄｕｅ）
の取り込みが挙げられる。
ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、そのアンチセンス領域の３’末端にヌクレオチド
間ホスホロチオエート結合を有することができる。アンチセンス領域は、そのアンチセン
ス領域の５’末端に約１乃至約５個のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を有するこ
とができる。ｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、
若しくはバックボーンが化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド
を含むことができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１又は２個以上のユニバ
ーサル塩基リボヌクレオチドを含むことができる。３’末端ヌクレオチドオーバーハング
は、１又は２個以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。
例えば、化学修飾ｓｉＮＡは１、２、３、４、５、６、７、８個若しくは９個以上のヌ
クレオチド間ホスホロチオエート結合を一方の鎖に有することができ、又は１乃至８個若
しくは９個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を各鎖に有することができる。
ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌク
レオチド鎖に存在することができ、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方に存
在することができる。
ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の３’末端、５’末端、又
は３’末端と５’末端の両方に、１又は２個以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結
合を含むことができる。例えば、典型的なｓｉＮＡ分子は、１、２、３、４、５個、又は
６個以上の連続するヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス
鎖、又はその両方の５’末端に有することができる。
ある態様では、ｓｉＮＡ分子は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又は１１
個以上のヌクレオチド間ピリミジンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス
鎖、又はその両方に有する。
ある態様では、ｓｉＮＡ分子は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又は１１
個以上のヌクレオチド間プリンホスホロチオエート結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、
又はその両方に有する。
ｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含むことができ、この場合、ｓｉＮＡの長さは例えば約
３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０ヌクレオチド等の約３８乃至約７
０ヌクレオチドであって、例えば約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基対等の
約１８乃至２３塩基対を有し、この場合、この環状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対及
び２つのループを持つダンベル型構造を形成する。
環状ｓｉＮＡ分子は、二つのループモチーフを含むことができ、この場合、ｓｉＮＡ分
子の一方又は両方のループ部は生分解性である。例えば、環状ｓｉＮＡ分子のループ部は
インビボで変形されて、約２個のヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハン
グ等の３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成することができる。
ｓｉＮＡ分子の修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖、センス鎖、又はその両方にあっ
てよい。例えば、修飾ヌクレオチドはノーザンコンフォメーション（例：ノーザン擬回転
周期（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ）、例えばＳａｅｎ
ｇｅｒ著、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ編集、１９８４年を参照）を持つことができ
る。ノーザン立体配置を持つヌクレオチドの例としては、架橋型核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ；ＬＮＡ）ヌクレオチド（例：２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−
（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチ
ド、２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デ
オキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチル
ヌクレオチドが挙げられる。
化学修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら同時にヌクレアーゼ
分解に対する耐性を持つことができる。
二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、逆位デオキシ脱塩基部位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅ
ｏｘｙａｂａｓｉｓ ｍｏｉｅｔｙ）などの末端キャップ部位を３’末端、５’末端、又
は３’末端と５’末端の両方に有してもよい。
抱合体の例としては、２００３年４月３０日に出願されたＶａｒｇｅｅｓｅら、米国特
許出願番号１０／４２７１６０に記載の抱合体及びリガンドが挙げられ、図面を含むこの
出願の全文は参照することで本明細書に組み入れられる。
本発明のある態様では、抱合体は、生分解性リンカによって化学修飾ｓｉＮＡ分子と共
有結合することができる。例えば、抱合体分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アン
チセンス鎖、又はその両方の３’末端に結合することができる。
ある態様では、抱合体分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は
その両方の５’末端に結合する。ある態様では、抱合体分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子の
センス鎖、アンチセンス鎖、若しくはその両方の３’末端及び５’末端の両方、又はこれ
らのいずれかの組み合わせに結合する。
ある態様では、抱合体分子は、細胞等の生体系への化学修飾ｓｉＮＡ分子の送達を促進
する分子を含む。
ある態様では、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合する抱合体分子は、ポリエチレングリコー
ル、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを媒介できる細胞受容体のリガンドである。
本発明で意図する、化学修飾ｓｉＮＡ分子と結合可能な抱合体分子の具体例は、Ｖａｒｇ
ｅｅｓｅら、米国特許公開公報ＵＳ２００３／０１３０１８６及び米国特許公開公報ＵＳ
２００４／０１１０２９６に記載されており、これらの各文献の全文は参照することで本
明細書に組み入れられる。
ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡのセンス領域とｓｉＮＡのアンチセンス領域を連結する、ヌクレ
オチド、非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドとが混在するリンカを含む
ことができる。ある態様では、ヌクレオチドリンカの長さは３、４、５、６、７、８、９
、又は１０ヌクレオチドであってよい。ある態様では、ヌクレオチドリンカは核酸アプタ
マであってよい。本明細書で用いる「アプタマ」又は「核酸アプタマ」という用語は、標
的分子に特異的に結合する核酸分子を包含しており、この場合、核酸分子は、自然環境下
で標的分子によって認識される配列を含んでいる。別の選択肢として、アプタマは、標的
分子が核酸と自然には結合しない場合において、標的分子と結合する核酸分子であってよ
い。
例えば、アプタマを用いてタンパク質のリガンド結合ドメインと結合させ、それによっ
て天然のリガンドとタンパク質との相互作用を防ぐことができる。例えば、Ｇｏｌｄら，
Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４： ７６３, １９９５； Ｂｒｏｄｙ及び
Ｇｏｌｄ，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４： ５, ２０００； Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２： １００, ２０００； Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ. Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４： ２７, ２０００； Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２８７： ８２０, ２０００； 及びＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５： １６２８, １９９９、を参照のこと。
非ヌクレオチドリンカは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミ
ド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又はその他のポリマ化合物（例：２乃至
１００のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール等）であってよい。具
体例としては、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１８： ６３５３, １９９０、及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ３１
１３, １９８７； Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓ
ｏｃ． １１３： ６３２４, １９９１； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ
，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３： ５１０９, １９９１； Ｍａら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１： ２５８５, １９９３： 及びＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３２： １７５１, １９９３； Ｄｕｒａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． １８： ６３５３, １９９０； ＭｃＣｕｒｄｙら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０： ２８７, １９９１； Ｊｓｃｈｋｅら，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３４： ３０１, １９９３； Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３０： ９９１４, １９９１； Ａｒｎｏｌｄら、国際公開公報ＷＯ８９／０２４
３９、Ｕｓｍａｎら、国際公開公報ＷＯ９５／０６７３１、Ｄｕｄｙｃｚら、国際公開公
報ＷＯ９５／１１９１０、並びにＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ． Ａｍ． Ｃ
ｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３： ４０００, １９９１、に記載のものが挙げられる。
「非ヌクレオチドリンカ」とは、糖及び／又はリン酸エステル置換基を含む１又は２個
以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることができ、残った塩基に酵素
活性を示させる基又は化合物のことを言う。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１の位置
にアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミン等の一般的に認知されたヌク
レオチド塩基を含まない点において、脱塩基型となり得る。
ある態様では、修飾ｓｉＮＡ分子はリン酸エステル主鎖の修飾部を有することができ、
修飾には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホト
リエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデー
ト、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、
チオホルムアセタール、及び／若しくはアルキルシリルの１又はそれ以上の修飾が含まれ
る。オリゴヌクレオチド主鎖の修飾の例は、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ著、「
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ, ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｖ
ＣＨ、ｐ．３３１−４１７、１９９５年、及びＭｅｓｍａｅｋｅｒら著、「Ｎｏｖｅｌ
Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ， ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、ＡＣＳ、ｐ．２４−３９、１９９４年、に記載され
ている。
化学的修飾が可能なｓｉＮＡ分子は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の二つの相補鎖を合成する工
程、及び（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適した条件下でこの二つの相補鎖をアニー
ルする工程によって合成することができる。ある態様では、ｓｉＮＡ分子の相補的な部分
は、固相オリゴヌクレオチド合成又は固相タンデムオリゴヌクレオチド合成によって合成
される。
オリゴヌクレオチド（例：特定の修飾オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのリ
ボヌクレオチドを含まない部分）は、例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１： ３−１９, １９９２； Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際
公開公報ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． ２３： ２６７７−２６８４, １９９５； Ｗｉｎｃｏｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍ
ｏｌ． Ｂｉｏ． ７４： ５９, １９９７； Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
． Ｂｉｏｅｎｇ． ６１： ３３−４５, １９９８； 及びＢｒｅｎｎａｎ、米国特許公
報第６００１３１１号に記載の本技術分野で公知のプロトコルを用いて合成される。本発
明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成は、例えばＵｓｍａｎら，Ｊ． Ａｍ． Ｃ
ｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９： ７８４５, １９８７； Ｓｃａｒｉｎｇｅら，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８： ５４３３, １９９０； Ｗｉｎｃｏｔｔら, Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３： ２６７７−２６８４, １９９５； 及びＷｉｎ
ｃｏｔｔら, Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ７４： ５９, １９９７、に記載の一
般的手順に従う。
本明細書で用いる「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非
ヌクレオチドを含むことができるループ部と、アンチセンス領域と塩基対を作ってループ
付き二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてアンチセンス
領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域と、を含む直鎖ｓｉＮＡ分子である。
本明細書で用いる「非対称二重鎖」とは、センス領域及びアンチセンス領域を含む別々
の二本の鎖を有するｓｉＮＡ分子であり、この場合、センス領域は、アンチセンス領域と
塩基対を作って二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する限りにおいてア
ンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。
本明細書で用いる「遺伝子発現を調節する」とは、標的遺伝子の発現を上方制御又は下
方制御することであり、細胞内に存在するｍＲＮＡのレベル、ｍＲＮＡの翻訳、又は標的
遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制
御又は下方制御を含む場合がある。
本明細書で用いる、「阻害する」、「下方制御する」、又は「発現を低下させる」とい
う用語は、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子又は１又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク
質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によってコード
される１又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活
性が、本発明の核酸分子（例：ｓｉＮＡ）の非存在下で観察される値よりも低下すること
を意味する。
本明細書で用いる「ジーンサイレンシング」とは、細胞内における遺伝子発現を部分的
に又は完全に阻害することであり、「遺伝子ノックダウン」と言うこともある。ジーンサ
イレンシングの程度は本技術分野で公知の方法によって定量することができ、方法のうち
のいくつかは国際公開公報ＷＯ９９／３２６１９にまとめられている。
本明細書で用いる「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも一つのリボヌ
クレオチド残基を含む分子を意味する。リボヌクレオチドはベータ−Ｄ−リボフラノース
部位の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。これらの用語は、二本鎖Ｒ
ＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、実質的に純粋
なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって作製したＲＮＡ、並びに１若しくは２個以上の
ヌクレオチドの付加、欠失、置換、修飾、及び／又は変性によって修飾及び変性された天
然のＲＮＡとは異なるＲＮＡを含む。ＲＮＡの変性は、ｓｉＮＡの末端部又は内部等にお
いて、例えばＲＮＡの１又は２個以上のヌクレオチドに対する非ヌクレオチド材料の付加
を含む場合がある。
ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然ではないヌクレオチド又は化学合成されたヌク
レオチド若しくはデオキシヌクレオチド等の非標準的なヌクレオチドが含まれる。このよ
うな変性されたＲＮＡは類似体と呼ばれる場合がある。
「高度保存配列領域」とは、標的遺伝子の１又はそれ以上の領域のヌクレオチド配列が
、一つの世代から別の世代へ、又は一つの生体系から別の生体系へかけて実質的に変化し
ないことを意味する。
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するそのｓ
ｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的
核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌク
レオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、そのｓｉＮＡ分
子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含むことができる。
「標的核酸」とは、発現又は活性が調節されるいずれの核酸配列も意味する。標的核酸
はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
「相補性」とは、核酸が別の核酸配列と、従来のワトソン−クリック結合様式又はその
他の従来のものとは異なる結合様式によって水素結合を形成できることを意味する。
本明細書で用いる「生分解性リンカ」とは、例えば生物的に活性な分子とｓｉＮＡ分子
又はｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖を連結させるような、一つの分子をもう一
つの分子と連結させるための生分解性リンカとして設計された核酸又は非核酸リンカ分子
を意味する。生分解性リンカは、特定の組織又は細胞種への送達等の特定の目的のために
その安定性を調節することができるように設計されている。核酸系の生分解性リンカ分子
の安定性は、例えばリボヌクレオチドと、デオキシリボヌクレオチドと、２’−Ｏ−メチ
ル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−
アリル、及びその他の２’位修飾ヌクレオチド又は塩基修飾ヌクレオチド等の化学修飾ヌ
クレオチドとの組み合わせによって、様々に調節することができる。生分解性核酸リンカ
分子は、例えば長さが約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチ
ドのような二量体、三量体、四量体、若しくはさらに長い核酸分子であってよく、又は例
えばホスホロアミデート若しくはホスホジエステル結合等のリン含有結合を有する一つの
ヌクレオチドを含んでもよい。生分解性核酸リンカ分子は、核酸のバックボーン、核酸の
糖、又は核酸の塩基の修飾を含んでいてもよい。
本明細書で述べる２’位修飾ヌクレオチドと関連して、「アミノ」とは２’−ＮＨ２又
は２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、修飾されていてもされていなくてもよい。このような修飾
された基は、例えばＥｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許公報第５６７２６９５号及びＭａｔｕ
ｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許公報第６２４８８７８号に記載されている。
投与
本発明の範囲内で使用するための核酸分子を送達する方法の中には、例えばＡｋｈｔａ
ｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ２： １３９, １９９２； Ａｋｈｔａｒ編、
「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１９９５年、Ｍａｕｒｅｒら，Ｍ
ｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６： １２９−１４０, １９９９； Ｈｏｆｌａｎ
ｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １３７： １６５−
１９２, １９９９； 及びＬｅｅら，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７５２： １８４−
１９２, ２０００、に記載されているものもある。Ｓｕｌｌｉｖａｎら、国際公開公報Ｗ
Ｏ９４／０２５９５には、酵素核酸分子の送達の一般的方法がさらに記載されている。こ
れらのプロトコルは本発明の範囲内で意図される実質的にいかなる核酸分子の補助的な又
は補完的な送達に対しても利用することができる。
核酸分子及びペプチドは、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することがで
き、その方法にはｓｉＮＡ及びペプチドのみを含む製剤又は薬理学的に許容される担体、
希釈剤、賦形剤、アジュバンド、乳化剤、バッファ、安定剤、保存剤等の一つ若しくはそ
れ以上の追加成分をさらに含む製剤内における投与が含まれるが、これに限定されない。
特定の態様において、ｓｉＮＡ及び／又はペプチドは、リポソーム内に被包されたり、イ
オントフォレーシスで投与されたり、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性
ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質性ベクタ等の他の運搬
体へ取り込まれたりすることができる（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開公報
ＷＯ００／５３７２２参照）。別の選択肢として、核酸／ペプチド／運搬体の組み合わせ
を、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達することもできる。本発明の核
酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、標準的な針と
シリンジによる方法、又は、Ｃｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：
２３３０−２３３７, １９９９、及びＢａｒｒｙら、国際公開公報ＷＯ９９／３１２６２
に記載されるような無針技術を用いて行うことができる。
本発明の組成物は、実質的に医薬品として使用することができる。医薬品は、患者の疾
患状態若しくはその他の有害な状態の発生又は重症度化を予防若しくは調節したり、又は
これらを治療（一つ若しくはそれ以上の症状を、検出若しくは測定可能な程度で軽減）す
る。
従って、追加的態様の範囲内において、本発明は、通常ペプチドと組み合わされた、複
合体化し、若しくは抱合体形成した形であって、任意に希釈剤、安定剤、バッファ等の薬
理学的に許容される担体と共に製剤されていてもよい１若しくは２種類以上のｓｉＮＡで
ある、１若しくは２種類以上のポリ核酸の存在又は投与を特徴とする医薬組成物及び方法
を提供する。
本発明は、対象の特定の疾患状態又はその他の有害な状態と関連する遺伝子の発現を調
節する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供することにより、更なる課題及び利点を満足
するものである。通常ｓｉＮＡは、対象の疾患状態又は有害な状態と関連する原因因子又
は寄与因子として、高レベルに発現された遺伝子を標的とすることになる。この点で、ｓ
ｉＮＡは、１又はそれ以上の関連する疾患症状の再発が予防される、又はその重症度が軽
減若しくは減少するレベルまで遺伝子の発現を効果的に下方制御するであろう。別の選択
肢として、疾患又は他の有害な状態の結果又は続きとして標的遺伝子の発現が必ずしも高
まらない様々な個別の疾患モデルに対しても、それでも標的遺伝子の下方制御は遺伝子の
発現を低下させる（すなわち、標的遺伝子の選択されたｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産
物のレベルを下げる）ことによって治療効果を示すであろう。別の選択肢として、本発明
のｓｉＮＡは、一つの遺伝子の発現の低下を目的とすることによって、その標的遺伝子の
産物又は活性によって発現が負の制御を受ける「下流」の遺伝子の上方制御を行うことが
できる。
本発明のこのｓｉＮＡは、例えば経皮投与又は局所注射など、いかなる形でも投与する
ことができる。動物を対象として、選択された疾患状態と関連する原因因子又は寄与因子
として発現が異常に増加することが公知である大多数の遺伝子のいずれをも含む、その選
択された疾患状態と関連する１又はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的とする類似の方
法及び組成物が提供される。
本発明の負に帯電したポリヌクレオチド（例：ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、医薬組成物を形
成する安定剤やバッファ等を含んだ又は含まない状態で、いかなる標準的な方法によって
も患者に投与することができる。リポソームによる送達メカニズムの使用を所望する場合
は、リポソームを形成する標準的なプロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、
経口投与のために錠剤、カプセル、又はエリキシール剤として、直腸内投与のために坐薬
として、注射投与のために無菌溶液又は懸濁液として、及び本技術分野で公知のその他の
組成物として製剤し、使用することもできる。
本発明はさらに、本明細書で述べる組成物の薬理学的に許容される製剤も含む。このよ
うな製剤は、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸付加塩
等の上述の化合物の塩を含む。
ｓｉＮＡは、例えば薬物の直腸内投与のために坐薬の形で投与することもできる。この
ような組成物は、薬物を、常温で固体だが直腸内温度では液体となるため直腸内で融解し
て薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。
そのような物質としては、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞へ投与することができ、その方法
にはリポソーム内への封入、イオントフォレーシスによるもの、生分解性ポリマ、ハイド
ロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ． １０： １０６８−１０７４, １９９９、並びにＷａｎｇら、国際公開公報
ＷＯ０３／４７５１８及び国際公開公報ＷＯ０３／４６１８５参照）、乳酸−グリコール
酸共重合ポリマ（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフェア（例えば、米国特許公報第６
４４７７９６号、米国特許公開公報ＵＳ２００２／１３０４３０参照）、生分解性ナノカ
プセル、並びに生体接着性マイクロスフェア等のその他の運搬体への取り込みによるもの
、又はタンパク質ベクタによるもの（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開公報Ｗ
Ｏ００／５３７２２参照）が含まれるが、これらに限定されない。別の選択肢として、核
酸／運搬体の組み合わせは、直接注射又は輸液ポンプの使用によって局所的に送達される
。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射、若しくは皮内注射を問わず、
標準的な針とシリンジによる方法、又は、Ｃｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ． ５： ２３３０−２３３７, １９９９、及びＢａｒｒｙら、国際公開公報ＷＯ９９
／３１２６２に記載のような無針技術を用いて行うことができる。本発明の分子は医薬品
として使用することができる。医薬品は、対象の疾患状態について、その発生を予防若し
くは調節したり、又はこれらを治療（一つの症状を、好ましくはすべての症状をある程度
軽減）したりする。
本発明のカチオン性ペプチドのいずれか一つを選択又はいくつかを組み合わせることに
より、本発明の方法及び組成物の範囲内においてｓｉＮＡの細胞内送達を誘導又は促進す
るのに有効なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド試薬を得ることができる。
医薬組成物
本発明は、本明細書で述べる化合物の薬理学的に許容される製剤又は組成物も含む。こ
のような製剤には、例えば塩酸、臭素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩といった酸
付加塩等の上述の化合物の有機塩及び無機塩が含まれる。
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤との混合物の形で活性物質を含
む。そのような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、メチルセ
ルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロ
リドン、トラガントガム、及びアカシアガム等の懸濁剤であり、分散剤又は湿潤剤は例え
ばレシチン等の天然のホスファチド、例えばポリオキシエチレンステアレート等のアルキ
レンオキサイドと脂肪酸との縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール等
のエチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、ポリオキシエチレンソル
ビトールモノオレエート等のエチレンオキサイドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導され
る部分エステルとの縮合生成物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート等の
エチレンオキサイドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合
生成物であってよい。水性懸濁液は、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸のエチル若しくはｎ
−プロピルエステル等の１又はそれ以上の保存剤、１又はそれ以上の着色剤、１又はそれ
以上の香味料、及びスクロース若しくはサッカリン等の１又はそれ以上の甘味料をさらに
含んでよい。
油性懸濁液は、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはココナッツ油等の植物
性油、又は液状パラフィン等の鉱油中に活性成分を懸濁させることで調製することができ
る。油性懸濁液は、例えば蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコール等の増粘剤を含
んでもよい。飲みやすい経口製剤を提供するために甘味料及び香味料を加えてもよい。こ
のような組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を加えることで保存することができる。
水の添加によって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒により、活性成
分は、分散剤又は湿潤剤と、懸濁剤と、１又はそれ以上の保存料との混合物として提供さ
れる。例えば甘味料、香味料、及び着色料等の追加的な賦形剤も存在してよい。
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形をとることもできる。油相は、植物
油、鉱油、又はこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤としては、例えばアカシアガ
ム又はトラガントガム等の天然ガム、例えば大豆、レシチン等の天然ホスファチド、及び
例えばソルビタンモノオレエート等の脂肪酸と無水ヘキシトールとから誘導されるエステ
ル又は部分エステル、並びに例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の前
述の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物であってよい。また、エマルジョン
は甘味料及び香味料を含んでいてもよい。
医薬組成物は水性又は油性の無菌注射用懸濁液の形をとることができる。この懸濁液は
、適切な分散剤若しくは湿潤剤、及び／又は懸濁剤を用いて調製することができる。無菌
注射用製剤は、例えば１，３−ブタノール溶液等非経口的に許容される無害な希釈剤若し
くは溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。
医薬組成物用の許容可能な担体、運搬体、及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等
張性の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌固定油は、担体、運搬体、溶媒、
又は懸濁媒体として従来から使用されている。上記目的のためには、合成モノグリセリド
又はジグリセリドを含むいかなる無刺激性の固定油も使用することができる。さらに、オ
レイン酸等の脂肪酸も注射液の調製に有用である。
本明細書で引用するあらゆる刊行物、参考文献、特許、及び特許出願の全文献は、参照
することで具体的に本明細書に組み入れられる。
本発明を特定の態様について説明し、例示の目的で多くの詳細事項を述べてきたが、本
発明が追加的な態様を含み、本明細書で述べた詳細事項が本発明の範囲から逸脱しない範
囲で大きく変形され得ることは、当業者には明らかであろう。本発明は、そのような追加
的な態様、変更、及び同等な内容を含む。
本発明の説明及び請求項においてここで使用する「１の（ａ）」、「１の（ａｎ）」、
「その（ｔｈｅ）」、及びこれらに類似の言葉は、単数形及び複数形の両方を含むものと
して解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎ
ｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」
という言葉は、例えば「含むがこれらに限定されない」という意味のように、目的語を制
限しない言葉として解釈されるべきである。本明細書における数値の範囲の列挙は、その
範囲内の数値が明示的に列挙されていてもいなくても、本明細書において個々の数値が列
挙されているかのごとく、その範囲内に入る個々の各数値を意味することを意図したもの
である。本明細書で取り上げた具体的数値は典型例であって本発明を制限するものではな
いことが理解されるであろう。
本明細書で示された例及び用いられた典型的な用語は単に例示目的のためのものであっ
て、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
調製例１
水中でのＰＮ０８２６：ｓｉＲＮＡ化合物。
化合物は以下のようにして調製した。ＲＮａｓｅを含有しない８２．１２μｌの水、
続いて１０μｌのＧ１４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心用チ
ューブに添加した。この溶液をボルテックス撹拌により混合した。最後に７．８８μｌの
ＰＮ０８２６（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を加え、ボルテックス撹拌
により混合した。
調製例２
ＰＮ０８２６、Ｆ−１０８、及び水。
化合物は以下のようにして調製した。まずＲＮａｓｅを含有しない８２．１２μｌの水
を、続いて１０μｌのＧ１４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心
用チューブに添加した。ボルテックス撹拌により混合した。次に７．８８μｌのＰＮ０８
２６（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を加えてボルテックス撹拌により混
合した。最後に、５μｌのプルロニックＦ１０８（２０ｍｇ／ｍｌ、０．２μＭろ過済み
）を添加してピペットで混合した。
調製例３
Ｃｙ５−Ｉｎｍ４、ＰＮ０１８３、及び一晩。
化合物は以下のようにして調製した。まず１１９．４０μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
５％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて１５．６０μｌのペプチドＰＮ０
１８３（２ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心用チューブに添加し、ボル
テックス撹拌により混合した。この溶液を４℃で一晩保存した。最後に１５μｌのＣｙ５
−Ｉｎｍ４（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を添加して再度ボルテックス
撹拌により混合した。
調製例４
Ｃｙ５−Ｉｎｍ４、ＰＮ０１８３、Ｆ１２７、及び一晩。
化合物は以下のようにして調製した。まず１１９．４０μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
５％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて１５．６０μｌのペプチドＰＮ０
１８３（２ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）及び７．５μｌのプルロニックＦ
１２７（２０ｍｇ／ｍｌ、０．２μＭろ過済み）を遠心用チューブに添加した。ボルテッ
クス撹拌により混合した。この溶液を４℃で一晩保存した。最後に１５μｌのＣｙ５−Ｉ
ｎｍ４（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を添加して再度ボルテックス撹拌
により混合した。
調製例５
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、希釈用水、及びペプチドから添加。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心用チューブに添加し、ボルテッ
クス撹拌により混合した。最後に１０μｌのＧ１４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含
有しない水中）をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。
調製例６
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、希釈用バッファ、及びペプチドから添加。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。最後に１０μｌのＧ１
４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッフ
ァ中）をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。
調製例７
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、ペプチドから添加、及びボルテックス撹拌なし。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加してピペッティングにより混合した。最後に１０μｌのＧ１４
９８（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ
中）をこの溶液に添加して再度ピペッティングにより混合した。
調製例８
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、ペプチドから添加、そして希釈による濃度低下。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。１０μｌのＧ１４９８
（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）
をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。最後にこの溶液を１０倍に
希釈して濃度を下げた。
調製例９
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、及びｓｉＲＮＡから添加。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて１０μｌのＧ１４９８（１ｍｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を遠心用チュ
ーブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。
調製例１０
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、ペプチドから添加、そして３０分間放置。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。最後に１０μｌのＧ１
４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０Ｍ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ
中）をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。この溶液を氷上で３０
分間平衡化した。
調製例１１
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、ペプチドから添加、そして６０分間放置。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。最後に１０μｌのＧ１
４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッフ
ァ中）をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。この溶液を氷上で６
０分間平衡化した。
調製例１２
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、ペプチドから添加、そして２４時間放置。
化合物は以下のようにして調製した。まず８５．８３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのペプチドＰＮ０１８
３（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中
）を遠心用チューブに添加し、ボルテックス撹拌により混合した。最後に１０μｌのＧ１
４９８（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッフ
ァ中）をこの溶液に添加して再度ボルテックス撹拌により混合した。この溶液を氷上で２
４時間平衡化した。
調製例１３
Ｉｎｍ４、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９、及びｓｉＲＮＡを投与直前に添加。
化合物は以下のようにして調製した。まず２５９．１μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて１５．６０μｌのＰＮ０１８３（５
ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）及び
１０．３０μｌのＰＮ０９３９（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ中）を遠心用チューブに添加した。ボルテックス撹拌により混
合した。最後に１５．００μｌのＩｎｍ４（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅ
ｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を添加した。ボルテックス撹拌により混合した
。
調製例１４
Ｉｎｍ４、ｓｉＲＮＡ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９の順番、及びピペッティングによる
混合。
化合物は以下のようにして調製した。まず１７２．００μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
５％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて１０μｌのＩｎｍ４（５ｍｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を遠心用チュ
ーブに添加した。ピペッティングにより混合した。その後１１．２０μｌのＰＮ０１８３
（５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）
を添加した。ピペッティングにより混合した。最後に６．８０μｌのＰＮ０９３９（５ｍ
ｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を添加
した。再度ピペッティングにより混合した。この溶液を氷上で１時間平衡化した。
調製例１５
Ｉｎｍ４、ｓｉＲＮＡ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９の順番、及びボルテックス混合。
化合物は以下のようにして調製した。まず２２８９．５０μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
／５％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて２４．００μｌのＩｎｍ４（２
０ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心用チューブに添加した。ボルテック
ス撹拌により混合した。その後５３．６０μｌのＰＮ０１８３（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５
．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を添加した。ボルテック
ス撹拌により混合した。最後に３２．９０μｌのＰＮ０９３９（２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５
．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を添加した。ピペッティ
ングにより混合した。この溶液を氷上で１時間平衡化した。
調製例１６
Ｉｎｍ４、ｓｉＲＮＡ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９の順番、及びｐＨ７．４。
化合物は以下のようにして調製した。まず３７６．１９μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
５％デキストロースバッファ（ｐＨ７．４）を、続いて５μｌのＩｎｍ４（２０ｍｇ／ｍ
ｌ、ＲＮａｓｅを含有しない水中）を遠心用チューブに添加した。ボルテックス撹拌によ
り混合した。その後１５．３９μｌのＰＮ０１８３（７．２６ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅを
含有しない水中）を添加した。ボルテックス撹拌により混合した。最後に３．４２μｌの
ＰＮ０９３９を添加した。ピペッティングにより混合した。
調製例１７
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、及びｔｅｒｔ−ブタノール。
化合物は以下のようにして調製した。まず７２．９３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのＰＮ０１８３（５ｍ
ｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を遠心
用チューブに添加した。ボルテックス撹拌により混合した。その後１０μｌのＧ１４９８
（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）
を添加した。再度ボルテックス撹拌により混合した。最後に１２．９０μｌのｔｅｒｔ−
ブタノールを添加し、ピペッティングにより混合した。
調製例１８
Ｇ１４９８、ＰＮ０１８３、及びエタノール。
化合物は以下のようにして調製した。まず７３．３３μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ５．０）を、続いて４．１７μｌのＰＮ０１８３（５ｍ
ｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）を遠心
用チューブに添加した。ボルテックス撹拌により混合した。その後１０μｌのＧ１４９８
（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロースバッファ中）
を添加した。再度ボルテックス撹拌により混合した。最後に１２．５０μｌのエタノール
を添加し、ピペッティングにより混合した。
調製例１９
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９。
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ希釈した。１．６２μｌのＰＮ０１８３（１
ｍｇ／ｍｌ）及び１．９８μｌのＰＮ０９３９（１ｍｇ／ｍｌ）を１２１．４０μｌのＯ
ＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液を一つにまとめ、ピペッティングによ
り混合した。
Ｌａｃ−Ｚの構造は以下の通りである。
センス鎖：ＣＮ２９３８。（配列番号６４）
５’−ｒ（ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵ）ｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖：ＣＮ２９３９。（配列番号６５）
５’−ｒ（ＡＡＡＵＣＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＵＡＧ）ｄＴｄＣ−３’
調製例２０
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３８。
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ希釈した。１．６２μｌのＰＮ０１８３（１
ｍｇ／ｍｌ）及び０．９７μｌのＰＮ０９３８（１ｍｇ／ｍｌ）を一緒に１２２．４１μ
ｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液を一つにまとめ、ピペッティン
グにより混合した。
調製例２１
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０９３９、及び架橋。
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ希釈した。１．６２μｌのＰＮ０１８３（１
ｍｇ／ｍｌ）及び１．９８μｌのＰＮ０９３９（１ｍｇ／ｍｌ）を１１９．８０μｌのＯ
ＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液を一つにまとめ、ピペッティングによ
り混合した。次に１．６０μｌのグルタルアルデヒド（０．０５％、Ｗ／Ｖ）を添加して
ピペッティングにより混合した。この溶液を室温で１時間平衡化した。
調製例２２
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、架橋、及びＰＮ０９３９。
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ希釈した。１．６２μｌのＰＮ０１８３（１
ｍｇ／ｍｌ）を１１９．８０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液
を一つにまとめ、続いて１．６０μｌのグルタルアルデヒド（０．０５％、Ｗ／Ｖ）を添
加した。ピペッティングにより混合した。この溶液を室温で１時間平衡化した。最後に１
．９８μｌのＰＮ０９３９（１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。ピペッティングにより混合した
。
調製例２３
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、架橋、ＰＮ０９３９、及び架橋
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ希釈した。１．６２μｌのＰＮ０１８３（１
ｍｇ／ｍｌ）を１１９．８０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液
を一つにまとめ、続いて０．８μｌのグルタルアルデヒド（０．０５％、Ｗ／Ｖ）を添加
した。ピペッティングにより混合した。この溶液を室温で１時間平衡化した。続いて１．
９８μｌのＰＮ０９３９（１ｍｇ／ｍｌ）及び０．８μｌのグルタルアルデヒド（０．０
５％、Ｗ／Ｖ）を添加した。ピペッティングにより混合した。
調製例２４
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、架橋、透析、及びＰＮ０９３９
化合物は以下のようにして調製した。まず１５８．６μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５
％デキストロースバッファ（ｐＨ７．４）、１０３．４５μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ
（２０μＭ）、及び３３．５３μｌのＰＮ０１８３（１ｍｇ／ｍｌ）を加えることでＬａ
ｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡとＰＮ０１８３の混合物を作成した。ボルテックス撹拌によって混合
した。次に４．４μｌのグルタルアルデヒド（０．０５％、Ｗ／Ｖ）を添加した。ピペッ
ティングにより混合した。この溶液を室温で２時間平衡化した。続いてこの溶液を４℃で
一晩透析にかけた。４３．５μｌの架橋された混合物を３３１．５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍ中へ希釈した。４．９６μｌのＰＮ０９３９（０．１ｍｇ／ｍｌ）を５７．５４μｌの
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中へ希釈した。この二つの希釈溶液を一つにまとめ、ピペッティングに
より混合した。
調製例２５
Ｌａｃ−Ｚ、ＰＮ０１８３、ＰＮ０８２６、及びＰＥＧ３３５０
化合物は以下のようにして調製した。５．０μｌのＬａｃ−Ｚ ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）及び１．６μｌのＰＮ０１８３（０．１ｍｇ／ｍｌ）を１２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
培地中へ添加し、ボルテックス撹拌により混合した。３．９６μｌのＰＮ０８２６（０．
１ｍｇ／ｍｌ）及び２．５０μｌのＰＥＧ３３５０（１０ｍｇ／ｍｌ）を１１８．５４μ
ｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中へ添加した。この二つの溶液を一つにまとめ、ピペッティン
グにより混合した。
実施例１
ゴールドダイ置換分析（Ｇｏｌｄ Ｄｙｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｓｓａｙ）に
よるペプチド−ｓｉＲＮＡ親和性
高速スクリーニングによる様々なペプチドのｓｉＲＮＡに対する相対結合性を、核酸結
合性色素ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄの置換を間接的に測定することによって評価した。ペプチド
とＳＹＢＲ−ｇｏｌｄが同時にｓｉＲＮＡとの競争結合を起こすように、ｓｉＲＮＡ、ペ
プチド、及びＳＹＢＲ−ｇｏｌｄの緩衝混合物を測定プレート内で２つの系に重複して調
製した。ｓｉＲＮＡの濃度は１０μｇ／ｍＬに固定し、それを０．０５乃至１０のペプチ
ド：ｓｉＲＮＡ電荷比に対応する濃度範囲の各ペプチドの力価と組み合わせた。ＳＹＢＲ
−ｇｏｌｄ色素はｓｉＲＮＡと結合した時にのみ蛍光を発するため、ｓｉＲＮＡと結合す
るペプチドは色素の結合を阻害し、結果として蛍光発光が減少する。従って、蛍光発光量
はペプチドのｓｉＲＮＡとの結合と逆相関を示した。Ｋｄ及びＢｍａｘの両方の値を算出
した。高いＫｄ値は、ペプチドとｓｉＲＮＡとの結合親和性が高いことを示すものであっ
た。
１０，０００倍濃度の核酸結合性ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄ色素ストック液は、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、カールズバッド）より入手し、−２０℃で保存した。こ
のストック液は、室温と平衡状態にしてからＨｙｃｌｏｎｅ社のヌクレアーゼを含有しな
い水で１００倍希釈した。これを測定プレート上で１０倍希釈し、分析用の最終濃度であ
る１０倍濃度とした。これは、５０μｇ／ｍＬまでの濃度においてｓｉＲＮＡ二重鎖と正
比例にある結合が得られる最適濃度であった。ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄとＧ１４９８ｓｉＲＮ
Ａとの正比例にある結合度を示す検量線作成に用いた数値を表４に示す。
Figure 2016073290
サンプルは３８４ウェルの分析プレート上で直接混合した。まず、マルチチャネルピペ
ットを用い、ピペットチップをウェルの底に接触させることで溶液が完全に排出されるよ
うにして、５μＬのＳＹＢＲ−ｇｏｌｄ色素を各ウェルへ分注した。次に、２２．５μＬ
の２×ペプチド溶液をシングルチャネルピペットで添加した。最後に、２２．５μＬの２
×ｓｉＲＮＡ溶液をマルチチャネルピペットで添加した。プレートを直ちに箔でカバーし
、軽くたたいて混合しウェルの側壁についた液滴を落とした。
蛍光強度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社（カリフォルニア州、サニーベー
ル）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ蛍光プレートリーダーで測定した。プレートの設定条件に含
まれたのは、励起波長を４９５ｎｍ及び発光波長を５３７ｎｍとし、測定前の振とう及び
ウェル一つあたり１回の測定であった。プレートはｓｉＲＮＡの添加後３０分以内に測定
した。
ペプチド結合性のためのスキャッチャードプロット
スキャッチャードプロットはペプチドの結合性（結合[ペプチド]／遊離[ペプチド]）ｖ
ｓ結合[ペプチド]のプロットである。このプロットの直線回帰の傾きは、−１／Ｋｄであ
り、Ｂｍａｘはｙ切片である。遊離のペプチドと結合ペプチドの濃度を直接測定すること
はできないので、ｓｉＲＮＡの間接測定値を用いて算出した。遊離ｓｉＲＮＡは、測定さ
れた蛍光強度から検量線を用いて定量した。結合ｓｉＲＮＡは、既知の初期ｓｉＲＮＡ濃
度（１０μｇ／ｍＬ）からの物質収支により、検量線から定量した。
結合ペプチドは、（ｓｉＲＮＡ：ペプチド）結合モル比が単一分子対の（ｓｉＲＮＡ：ペ
プチド）電荷比に等しいと仮定して、結合ｓｉＲＮＡから算出した。この結合ペプチド算
出量から、物質収支により遊離ペプチドを算出した。
粒子サイズとゼータ電位
粒子サイズとゼータ電位は、ゼータ電位測定用透明使い捨てセルＤＴＳ１０６０Ｃを用
い、２５℃でＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社
、イギリス、ウスターシャー）により測定した。粒子サイズ用の分散剤は粘度１．０２０
０ｃＰのＰＢＳ又は粘度０．８８７２ＣＰの水を用いた。ゼータ電位用の分散剤は粘度０
．８８７２ＣＰの水を用いた。分散剤粘度をサンプル粘度として使用した。ゼータ電位と
粒子サイズの両方を測定する場合は、ゼータ電位測定用透明使い捨てセルを用いた。粒子
サイズのみを測定する場合は、サイズ測定用低容量使い捨てキュベットを用いた。
実施例２
様々な核酸濃度及びＮ／Ｐ比における縮合体粒子サイズ
様々なＧ１４９８濃度とＮ／Ｐ比におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８
３との縮合化合物の粒子径を図１に示す。特定のＮ／Ｐ比における各一組の３本の棒グラ
フにおいて、Ｇ１４９８濃度は一番左の棒グラフが１００μｇ／ｍｌ、真ん中が５０μｇ
／ｍｌ、一番右が１０μｇ／ｍｌであった。Ｎ／Ｐ比０．２及び０．５では、Ｇ１４９８
濃度が１０μｇ／ｍｌの時の粒子が非常に小さかったため、その濃度の棒グラフは図示さ
れていない。
Ｐ／Ｎ比が約１．４より小さい場合は、すべてのｓｉＲＮＡ濃度において粒子サイズは
約２００ｎｍよりも小さかった。Ｐ／Ｎ比が約１．４か又はそれより大きい場合も、最も
高い濃度（１００μｇ／ｍｌ）を除くすべてのＲＮＡ濃度において縮合体粒子サイズは約
２００ｎｍよりも小さいままであった。
実施例３
様々な核酸濃度及びＮ／Ｐ比における縮合体粒子サイズ
様々な混合後の時間及び窒素／リン比（Ｎ／Ｐ比）で得られたｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８
とペプチドＰＮ１８３との縮合化合物の粒子径を図２乃至図５に示す。図２乃至図５の各
図の特定のＮ／Ｐ比における各一組の２本の棒グラフにおいて、左の棒グラフがボルテッ
クス撹拌ありの場合、右の棒グラフがボルテックス撹拌なしの場合であった。
図２の粒子径は混合後直ちに測定されたものであり、図３、図４、及び図５の粒子径は
、それぞれ混合後３０分、６０分、及び２４時間で測定された。
実施例４
縮合体粒子サイズに対するｐＨの影響
Ｎ／Ｐ比１．４及びＧ１４９８濃度１００μｇ／ｍｌで得られた、様々なｐＨ値に対す
るｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合化合物の粒子径を図６に示す。
ｐＨが約１２より低い場合、縮合体粒子サイズは減少し、ｐＨの低下に伴って減少し続
ける。約１１より低いｐＨでは、粒子サイズは約５００ｎｍより小さかった。
強度は、後方散乱光子 (ｂａｃｋ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｐｈｏｔｏｎ)（後方散乱モ
ード (Ｂａｃｋ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｍｏｄｅ））の測定値である。粒子サイズは、拡
散自己相関アルゴリズムを使って計算したサイズである。
実施例５
縮合体粒子サイズに対する塩濃度の影響
様々な塩化ナトリウム濃度で得られたｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３と
の縮合化合物の粒子径を図７に示す。
約０．５までの塩化ナトリウム濃度では、粒子径は約１００ｎｍから約２７５ｎｍへ増
加する。塩化ナトリウム濃度が約０．５を超えると、縮合体粒子サイズは上下に変動する
。
実施例６
縮合体粒子サイズに対するＲＮＡ及びペプチドの添加順の影響
様々なＮ／Ｐ比及び混合順におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との
縮合化合物の粒子径を図８に示す。Ｎ／Ｐ比が０．５以下の場合、粒子サイズは添加順に
よる大きな影響は受けない。Ｎ／Ｐ比が０．５を超える場合は、ｓｉＲＮＡが先に溶液中
へ導入され、そのｓｉＲＮＡ溶液にペプチドが添加された場合に粒子サイズは概して小さ
かった。
実施例７
縮合体粒子の形態
ペプチド−ＲＮＡ縮合化合物の粒子形態は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングに
よって測定した。以下のプロトコルを用いた。
グリッド上に１５μＬのサンプルを滴下して１０分放置；
半分の強度のカルノフスキー液に浸漬；
カコジル塩バッファに浸漬；
ＴＥＭ造影剤：３％酢酸ウラニル（ＵＡ）；
３回水に浸漬、ＵＡに浸漬、湿らせたフィルター紙で余分な液体を除去、乾燥；
混合物１：（オリジナルのカルノフスキー混合物）；
１６％パラホルムアルデヒド溶液：２０ｍＬ；
５０％グルタルアルデヒド ＥＭ級：８ｍＬ；
０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファ：２５ｍＬ；
蒸留水：２５ｍＬ。
最終混合物は７８ｍＬで、０．０８Ｍバッファ中に５％グルタルアルデヒドと４％ホルム
アルデヒドを含む。
この混合物のモル浸透圧濃度は２０００ｍＯＳＭを超えていた。
カコジル酸ナトリウムバッファ０．１Ｍ；
カコジル酸ナトリウム：４．２８ｇｍ；
塩化カルシウム：２５．０ｇｍ；
０．２Ｎ塩酸：２．５ｍｌ；
蒸留水で２００ｍｌに希釈、ｐＨは７．４。
グロー放電なしで上記のプロトコルを用いた時の、ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８（濃度１０
０μ／ｍｌ）とペプチドＰＮ１８３（Ｎ／Ｐ比１．４）との縮合化合物の粒子のＴＥＭ写
真を図９に示す。この写真から、サイズが均一で形態が球状の粒子であることがわかる。
粒子サイズは１００ｎｍより小さく、典型的には約５０乃至６０ｎｍであった。
グロー放電ありで上記のプロトコルを用いた時の、ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８（濃度１０
０μ／ｍｌ）とペプチドＰＮ１８３（Ｎ／Ｐ比１．４）との縮合化合物の粒子のＴＥＭ写
真を図１０に示す。この写真から、サイズが均一で形態が球状の粒子であることがわかる
。粒子サイズは１００ｎｍより小さく、典型的には約３０乃至６０ｎｍであった。
実施例８
ペプチド−ＲＮＡ縮合化合物の粒子サイズの特徴
いくつかのペプチド−ＲＮＡ縮合化合物の粒子サイズ特性を表５にまとめて示す。
Figure 2016073290
例えば、Ｎ／Ｐ比０．５における化合物Ｇ１４９８／ＰＮ１８３は、全強度の９８．７
％を占めるピークを示し、ピーク径が７３．３ｎｍ、ピーク幅が３２．９ｎｍ、Ｚ−平均
粒子径が６３．８であった。
実施例９
ペプチド−ＲＮＡ縮合体を用いてＬＰＳ刺激されたマウスの肺内でのＴＦＮ−αのインビ
ボノックダウンアッセイ
ｓｉＲＮＡのノックダウン活性を、細胞にペプチド−ｓｉＲＮＡ縮合化合物をトランス
フェクトすることによって測定した。ランダムｓｉＲＮＡ配列をネガティブコントロール
として用いた。
ｓｉＲＮＡ Ｉｎｍ−４及びペプチドＰＮ１８３及びＰＮ９３９との縮合化合物を含む
組成物の鼻孔内投与による、モデルマウス内でのＬＰＳ誘導性ＴＦＮ−α発現（ｐｇ／ｍ
ｌ）のノックダウンアッセイの結果を図１１に示す。
図１１において、一番左の棒グラフがバッファコントロールであり、次がＩｎｍ−４／
ＰＮ１８３／ＰＮ９３９縮合体のデータ、その右がグルタルアルデヒド（Ｇ）で架橋した
Ｉｎｍ−４／ＰＮ１８３／ＰＮ９３９化合物のデータである。プラセボ（Ｐｌａｃｅｂｏ
）はｓｉＲＮＡを含有しておらず、Ｑｎｅｇは不活性ｓｉＲＮＡを含有している。
図１１のデータを表６に示す。
Figure 2016073290
投与は鼻腔内から行った。投与後４時間及び２４時間で、動物を０．６２５ｎｇ（５０
μｌ）のＬＰＳで誘起した。ＬＰＳ導入後２時間で肺を採取した。ＴＮＦαのＥＬＩＳＡ
アッセイ及びＢＣＡ全タンパク質アッセイを行った。実験に用いた物質及び方法は以下の
通りであった。
動物：正常マウス
投与量：０．５ｍｇ／ｋｇ
容量：５０μＬ
反復実験数：ｎ＝３
全グループ数：１０
コントロール：媒体、Ｑｎｅｇ
ｓｉＲＮＡ：Ｉｎｍ４
投与：Ｉｎｍ４濃度０．５ｍｇ／ｋｇで製剤を調製した。各製剤の全容量は２００μｌ
であった。各マウス（ｎ＝３）に５０μｌずつ投与した。
ｓｉＲＮＡの調製：既存の２０ｍｇ／ｍｌのＩｎｍ−４ｓｉＲＮＡストック液を Ｈｅ
ｐｅｓ／バッファにより５ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ｑｎｅｇは、既存の３．２９ｍｇ／ｍ
ｌのストック液を使用した。
ペプチド：ペプチドはバッファ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５％デキストロース）により
適切な濃度に希釈した。
賦形剤調製：グルタルアルデヒド（０．０５％Ｗ／Ｖ）を使用した。０．２μｍで滅菌
ろ過した。
製剤調製：１．５ｍｌＢｉｏ−ｐｕｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに各成分を加えた
。
（Ａ）まず、少量の他の成分を受ける容量のバッファを加えた。
（Ｂ）以下に示す順序で全成分を加えた。ｓｉＲＮＡ、ペプチド１、ペプチド２、必要に
応じて添加剤、バッファ。
（Ｃ）グルタルアルデヒド架橋を行う製剤については、１時間経ってから投与した。
代表的な製剤を表７に示す。
Figure 2016073290
代表的製剤の詳細を表８及び表９に示す。
Figure 2016073290
Figure 2016073290
実施例１０
ラット膠肉腫線維芽細胞（９Ｌ／ＬａｃＺ）におけるＬａｃ−ｚ発現のインビトロノック
ダウンアッセイ
ｌａｃ−ｚ ｓｉＲＮＡとペプチドＰＮ１８３並びに様々な第二のペプチドとの縮合化
合物によるラット膠肉腫線維芽細胞である９Ｌ／ＬａｃＺ内でのｌａｃ−ｚ発現のインビ
トロノックダウンアッセイの結果を図１２に示す。
図１２において、一番左の棒グラフがＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ社、
カリフォルニア州、バレンシア）を用いた比較データであり、それに続くのが本発明の様
々な化合物のデータによるものである。ＰＮ１８３のＮ／Ｐ比は０．７５であり、第二の
ペプチドのＮ／Ｐ比０．３であった。図１２のデータを表１０に示す。
Figure 2016073290
実験に用いた物質及び方法は以下の通りであった。
細胞：９Ｌ／ＬａｃＺ
投与量：１００ｎＭ、全トランスフェクション用量１００μｌに基づく
容量：製剤容量２５μＬ
反復実験数：ｎ＝３
全グループ数：２０
コントロール：Ｑｎｅｇ ｗ／Ａｌｅｘｉｓ５４６
ｓｉＲＮＡ：ＬａｃＺ
Ｌａｃ−Ｚ又はＱｎｅｇ：５４μｌのｓｉＲＮＡ＋１７．２８μｌのＰＮ０１８３＋１
２７８μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
ペプチドはＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で適切な濃度に希釈した。
賦形剤はすべて０．２μｍで滅菌ろ過した。
製剤：
（Ａ）ｓｉＲＮＡとＰＮ０１８３を一緒にＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈して粒子を形成させ
た。ボルテックス撹拌した。
（Ｂ）送達媒体をＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈した。ボルテックス撹拌で送達媒体を混合し
た。
（Ｃ）各製剤について、９６ウェルに希釈した送達媒体をまず添加し、続いてｓｉＲＮ
Ａ／ＰＮ０１８３製剤を添加した。ピペッティングにより混合した。トランスフェクトす
る前に３０分間放置した。トランスフェクション：各製剤は５つのウェルに十分な１２５
μｌであった。各ウェル（ｎ＝３）には２５μｌ注入した。
代表的な製剤の詳細を表１１に示す。
Figure 2016073290
代表的製剤の詳細を表１２に示す。
Figure 2016073290
実施例１１
ラット膠肉腫線維芽細胞（９Ｌ／ＬａｃＺ）におけるＬａｃ−ｚ発現のインビトロノック
ダウンアッセイ
様々な縮合化合物によるラット膠肉腫線維芽細胞である９Ｌ／ＬａｃＺ内でのｌａｃ−
ｚ発現のインビトロノックダウンアッセイの結果を表１３に示す。
Figure 2016073290
実験に用いた材料と方法は以下の通りであった。
細胞：９Ｌ／ＬａｃＺ
投与量：１００ｎＭ、全トランスフェクション用量１００μｌに基づく
容量：製剤容量２５μＬ
反復実験数：ｎ＝３
全グループ数：２０
コントロール：Ｑｎｅｇ ｗ／Ａｌｅｘｉｓ５４６
ｓｉＲＮＡ：ＬａｃＺ
トランスフェクション：各製剤は５つのウェルに十分な１２５μｌであった。各ウェル
（ｎ＝３）には２５μｌ注入した。
ペプチド調製：ペプチドはＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で適切な濃度に希釈した。
賦形剤調製：賦形剤はすべて０．２μｍで滅菌ろ過した。
製剤調製：
（Ａ）ＰＮ０１８３なしの製剤については、送達媒体をまず添加してからｓｉＲＮＡを
添加し、ピペッティングにより混合した。
（Ｂ）ＰＮ０１８３ありの製剤については、ｓｉＲＮＡとＰＮ０１８３の複合体をまず
作製した。９６ウェルプレートに、送達媒体をまず添加し、それからｓｉＲＮＡ／ＰＮ０
１８３複合体を添加し、ピペッティングにより混合した。
（Ｃ）架橋を行う製剤については、ｓｉＲＮＡとＰＮ０１８３の複合体をまず作製し、
それから透析（４℃、一晩）を行うか、又は行わなかった。続いて翌朝に他の送達媒体を
まず添加し、そしてｓｉＲＮＡ／ＰＮ０１８３複合体を添加、それからピペッティングに
より混合した。
代表的な製剤を表１４に示す。
Figure 2016073290
代表的製剤の詳細を表１５、１６、及び１７に示す。
Figure 2016073290
Figure 2016073290
Figure 2016073290
実施例１２
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド
典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３は、以下に示すヒトのヒスト
ン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列から誘導された。Ｈ２Ｂタンパク質中の下線
部１３乃至４８番目までの残基部分がＰＮ７３を誘導するために使用された断片部を示す
。Ｈ２Ｂの１２乃至４８番目までのアミノ酸で表される場合もある。ＰＮ７３の一次構造
も以下に示す。
Ｈ２Ｂ（ヒストン２Ｂ）アミノ酸配列（配列番号６６）
ＭＰＥＰＡＫＳＡＰＡＰＫＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＳＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶ
ＹＶＹＫＶＬＫＶＨＰＤＴＧＩＳＳＫＡＭＧＩＭＮＳＦＶＮＤＩＦＥＲＩＡＧＥＡＳＲＬ
ＡＨＹＮＫＲＳＴＩＴＳＲＥＩＱＴＡＶＲＬＬＬＰＧＥＬＡＫＨＡＶＳＥＧＴＫＡＶＴＫ
ＹＴＳＳＫ
ＰＮ７３（１３−４８）（配列番号４２）
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ
−アミド
典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３残基の置換及び欠失によって
作製したいくつかのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド変異体の構造を表１８に示す
。
Figure 2016073290
表１９に示すのは、典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３及びその
切断型誘導体の構造である。以下に示すＰＮ３６０及びＰＮ３６１のアミノ酸配列は、Ｐ
Ｎ７３の対応するアミノ酸配列にアラインメントしてある。
Figure 2016073290
ＰＮ３６０はＰＮ７３とＮ末端は共通だがＰＮ７３のＣ末端が欠失しており、ＰＮ３６
１はＰＮ７３とＣ末端が共通だがＰＮ７３のＮ末端が欠失している。ＰＮ７６６はＰＮ７
３のＣ末端側１５のアミノ酸に相当する。ＰＮ７３、ＰＮ３６０、ＰＮ３６１、及びＰＮ
７６６はＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアネート）（すなわち、−ＧＫ［イ
プシロン］Ｇ−アミド）によるＣ末端標識はされていない。表１９にはさらに１１のＰＮ
７３切断型を示し、これらはＰＮ７６８を除いてペプチドのＮ末端から順に残基を３つず
つ欠失させて作成した。これらのペプチドはすべて、このペプチドを含む細胞を蛍光顕微
鏡で検出し、そして／又はフローサイトメトリで分離できるように、ＦＩＴＣ（フルオレ
セイン−５−イソチオシアネート）（すなわち、−ＧＫ［イプシロン］Ｇ−アミド）によ
るＣ末端標識が施されている。ＰＮ７６６及びＰＮ７０８は同じアミノ酸配列を持つが、
ＰＮ７０８がＣ末端ＦＩＴＣ標識されている点で異なっている。
実施例１３
ｓｉＲＮＡの細胞取り込みと標的遺伝子ノックダウンのためのインビトロでの実験方法及
び手順
本実施例では、実施例１２の表１８及び表１９に挙げた典型的なポリヌクレオチド送達
促進ポリペプチドによる、ｓｉＲＮＡの細胞取り込み及びｓｉＲＮＡによる標的遺伝子ノ
ックダウン活性を促進する有効性を評価するために使用される方法と手順を示す。細胞の
生存率も評価した。各実験における細胞の培養条件及びプロトコルは以下に詳細に説明す
る。
細胞培養
初代ヒト単球：
健康な提供者からのヒトの新鮮血サンプルをＧｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｓ社より購入した。単球の単離のために、血液サンプルは入手後直ちにＰＢＳによ
り１：１の比率で希釈した。まず全血から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）勾配法により単離した。さらにＭｉｌｔｅｎｙｉＣＤ１４ポジテ
ィブ選別キット及び提供されたプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用い
て単球をＰＢＭＣから分離した。単球試料の純度を評価するために、細胞を抗ＣＤ１４抗
体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とインキュベートし、その後フローサイトメトリ
で分離した。単球試料の純度は９５％超であった。
０．１乃至１．０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セント
ルイス）を細胞培養液に添加して腫瘍壊死因子−±（ＴＮＦ−±）の生成を刺激すること
により、ヒト単球の活性化を行った。細胞はＬＰＳと共に３時間インキュベートした後に
回収し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社、カリフォルニア州
、フリーモント）を用いて製造元の説明書に従ってｍＲＮＡレベルを測定した。
マウス尾線維芽細胞：マウス尾線維芽細胞（ＭＴＦ）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾か
ら得た。尾を切り離し、７０％エタノールに浸漬した後剃刀の刃で切って小片とした。こ
の小片をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５ｍｇ/ｍＬのコラゲナーゼ、１００ユニット／
ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ/ｍＬのストレプトマイシンと共に３７℃で振とう器
中でインキュベーションして組織を破壊した。次に尾の小片を完全培地（２０％ＦＢＳ、
１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、及
び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン含有ダルベッコ改変必須培地）中で細胞が樹立
するまで培養した。細胞は、上で概説したように、３７℃、５％ＣＯ２下で、完全培地中
で培養した。
細胞生存率（ＭＴＴアッセイ法）
細胞生存率は、ＭＴＴアッセイ法（ＭＴＴ−１００、ＭａｔＴｅｋキット）を用いて評
価した。このキットは、テトラゾリウム塩の取り込みとホルマザン色素への変換を測定す
るものである。解凍した濃縮ＭＴＴ２ｍＬをＭＴＴ希釈剤８ｍＬと混合することで脂質を
用いて解凍して希釈したＭＴＴの濃縮物を投与終了時の１時間前に調製した。各細胞培養
インサートをＣａ２＋及びＭｇ２＋含有ＰＢＳで２回洗浄し、それから各ウェルに１００
μＬの混合ＭＴＴ溶液を含む新品の９６ウェル輸送用プレートへ移した。この９６ウェル
輸送用プレートを次に３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートした。３時間のイン
キュベーションの後ＭＴＴ溶液を除去し、各ウェルに２５０μＬのＭＴＴ抽出溶液を含む
第二の９６ウェル供給用トレイへ培養物を移した。各培養ウェルの表面へ１５０μＬのＭ
ＴＴ抽出溶液を追加添加し、このサンプルを暗所に室温で最小２時間、最大２４時間放置
した。その後ピペットチップをインサート膜に突き刺して、ウェルの上部と下部の溶液を
混合させた。この混合抽出溶液２００μＬを抽出ブランク（ネガティブコントロール）と
共にマイクロリーダー測定のための９６ウェルプレートへ移した。プレートリーダーによ
り、６５０ｎｍでバックグラウンド除去を行い、５７０ｎｍでサンプルの光学濃度（ＯＤ
）を測定した。細胞生存率はパーセントで表され、処理インサートに対して読み取ったＯ
ＤをＰＢＳ処理インサートに対して読み取ったＯＤで割り、それを１００倍して計算した
。本分析の目的のために、ＰＢＳは細胞生存率に影響せず、従って１００％の細胞生存率
を表していると仮定した。
ｓｉＲＮＡ調製
オリゴヌクレオチドの合成は、５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジ
メチルシリル−３’−Ｏ−スクシニルリボヌクレオシドで誘導体化された長鎖アルキルア
ミン処理多孔質ガラス上、又は場合によっては５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−デオ
キシ−３’−Ｏ−スクシニルチミジンの支持体上での標準２−シアノエチルホスホラミダ
イト法（１）によって行った。オリゴヌクレオチドはすべて、ＡＢＩ３４００ＤＮＡ/Ｒ
ＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、フォスタ
ーシティ）を用いて０．２又は１μｍｏｌのオーダーで合成し、濃ＮＨ４ＯＨを用いて固
体担体から切断し、ＮＨ４ＯＨ：エタノール３：１混合液を用いて５５℃で脱保護した。
保護基２’−ＴＢＤＭＳの脱保護は、塩基が脱された保護ＲＮＡをＮ−メチルピロリジノ
ン／トリエチルアミン／トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＮＭＰ／ＴＥＡ／３ＨＦ；
体積比で６：３：４）の溶液（１μｍｏｌあたり６００μＬ）と共に６５℃で２．５時間
インキュベートすることで達成した。対応する構成要素である、Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧの５’
−ジメトキシトリチル−Ｎ−（ｔａｃ）−２’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３
’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホラミダイト（Ｐｒｏ
ｌｉｇｏ社、コロラド州、ボールダー）、並びに修飾ホスホラミダイトである５’−ＤＭ
Ｔｒ−５−メチル−Ｕ−ＴＯＭ−ＣＥホスホラミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ
−Ａｃ−Ｃ−ＣＥホスホラミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥホスホラ
ミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＣＥホスホラミダイト、５’−ＤＭＴｒ
−２’−ＯＭｅ−Ａ−ＣＥホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、バージニ
ア州、スターリング）は供給業者から直接購入した。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩
、Ｎ−メチルピロリジノン、及び濃水酸化アンモニウムはＡｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコン
シン州、ミルウォーキー）から購入した。すべてのＨＰＬＣ分析及び精製は、Ｘｔｅｒｒ
ａ（商標）Ｃ１８カラムを用いてＷａｔｅｒｓ２６９０ＨＰＬＣシステムにより行った。
その他の試薬はすべてＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社から購入した。オリゴヌ
クレオチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したところ純度９７％超まで精製されていた。マウ
ス注射用ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社（カリフォルニア州、バレンシア）からインビボ
グレードのものを購入し、アニーリング後ＨＰＬＣで精製した。一本鎖ｓｉＲＮＡの量は
、λ＝２６０ｎｍにおけるナトリウム塩の形での消衰係数の計算値３５．０μｇ／ＯＤに
基づき、分光測定により求めた。二本の鎖がアニールされる時は、約１０％の淡色効果が
観測された。従って、二本鎖型の定量には消衰係数を１０％低下させた。ｓｉＲＮＡの内
毒素レベルは通常０．００２４ＥＵ／ｍｇ以下であった。
ペプチド合成
ペプチドは固相Ｆｍｏｃ法により、Ｒａｉｎｉｎ社シンフォニー（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）
合成装置を用いてＣＬＥＡＲアミド樹脂上に合成した。５当量のＨＣＴＵ及びＦｍｏｃア
ミノ酸を用い、過剰のＮ−メチルモルフォリンと共に４０分間カップリングを行った。こ
のペプチド樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で１０分間２回の処理を行い、Ｆｍｏｃ
を除去した。全ペプチドの反応が完了した時点で、Ｆｍｏｃ基をピペリジンで除去し、Ｄ
ＭＦで十分に洗浄を行った。ペプチド樹脂のＮ末端に、３．０当量の３−マレイミドプロ
ピオン酸及びＨＣＴＵを６当量のＮ−メチルモルフォリンの存在下でカップリングするこ
とにより、マレイミド変性ペプチドを調製した。カップリングの進み具合はカイザーテス
トでモニターした。２．５％の水と２．５のトリイソプロピルシランを含有するＴＦＡ１
０ｍＬを添加し、続いて室温で２時間ゆるやかに撹拌することによりペプチドを樹脂から
開裂させた。得られた粗ペプチドはエーテルで倍散し、続いてろ過により回収した。粗生
成物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に溶解し、凍結乾燥により乾固した。粗ペプチドを０．０５
％のＴＦＡを含有する水１５ｍＬと酢酸３ｍＬへ投入し、５ｍＬの注入ループを通して流
速５ｍＬ／分でＺｏｒｂａｘ ＲＸ−Ｃ８逆相カラム（内径２２ｍｍ×２５０ｍｍ、粒子
径５μｍ）にローディングした。精製は、溶媒Ａを０．０５％ＴＦＡ含有水とし、溶媒Ｂ
を０．０５％ＴＦＡ含有アセトニトリルとした場合、０．１％Ｂ／分の直線ＡＢ勾配を流
すことで達成した。精製ペプチドはＨＰＬＣ及びＥＳＭＳによって分析した。
フローサイトメトリ
蛍光活性セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌ
ｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ社のＣｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５
００セルアナライザー（カリフォルニア州、フラートン）で行った。装置は、用いた蛍光
プローブ（ｓｉＲＮＡにはＦＡＭ又はＣｙ５、ＣＤ１４にはＦＩＴＣ及びＰＥ）に合わせ
て調節した。細胞生存率及び細胞毒性の指標として、ヨウ化プロピジウム（Ｆｌｕｋａ社
、セントルイス）及びアネキシンＶ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス）を用い
た。工程順のプロトコルを簡単に以下に示す。
（ａ）ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体に曝露後、細胞を少なくとも３時間インキュベートし
た。
（ｂ）２００μｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。
（ｃ）１５μｌのＴＥによって細胞を脱離し、３７℃で温置する。
（ｄ）３０μｌのＦＡＣＳ溶液（０．５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム含有ＰＢ
Ｓ）が入った５つのウェル中で細胞を再懸濁する。
（ｅ）５つのウェルの溶液を一つのチューブにまとめる。
（ｆ）５μｌのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）各チューブへ加える。
（ｇ）蛍光活性セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃ
ｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）により、製造元の説明書に従って細胞を分析する
。
ｓｉＲＮＡ取り込みの分析については、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理し（
付着細胞のみ）、続いてフローサイトメトリで分析した。上述のＢＡで表されるｓｉＲＮ
Ａの取り込みも、細胞内のＣｙ５又はＦＩＴＣの蛍光強度によって測定し、そしてヨウ化
プロピジウム又はアネキシンＶ−ＰＥの添加によって細胞生存率を評価した。細胞取り込
みを蛍光標識ｓｉＲＮＡの膜への挿入と区別するため、トリパンブルーを用いて細胞膜表
面の蛍光を消光した。
実施例１４
典型的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失解析
初代マウス尾線維芽細胞（ＭＴＦ）の細胞取り込みアッセイをインビトロで行い、完全
長型と切断型のポリペプチドＰＮ７３の細胞内への進入効率を調べた。培養液中のＦＩＴ
Ｃ標識ペプチドを受けとった細胞数はフローサイトメトリで測定した。ペプチドの細胞取
り込み率は培養液中の全細胞数に対する割合で表した。さらに、細胞内のＦＩＴＣ標識ペ
プチド量は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて評価した。ＭＦＩは細胞内のＦＩＴＣ標識ペ
プチド量と正の相関関係があり、相対的に高いＭＦＩ値は高い細胞内ＦＩＴＣ標識ペプチ
ド量と相関している。ペプチドは０．６３μＭ、２．５μＭ、及び１０μＭの濃度で評価
し、ＰＮ７６８は２μＭ、１０μＭ、及び５０μＭでテストした。
完全長型と切断型のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３を、トランスフェ
クションの前日に細胞に曝露した。ＦＩＴＣ標識ペプチドはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標
）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で室温で約５分間希釈してから細胞へ添加した。細
胞は３時間かけてトランスフェクトして、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理後、フロー
サイトメトリで分析した。細胞生存率を上述のようにして測定した。細胞取り込みを膜挿
入と区別するため、トリパンブルーを用いて細胞膜表面の蛍光を消光した。
この細胞取り込み分析において、完全長型ＦＩＴＣ標識ＰＮ７３ペプチド（ＰＮ６９０
）は、テストしたすべての濃度において（１０μＭの結果を表２０中「ペプチド細胞取り
込み率（％）」の列に示す）ほぼ１００％の細胞取り込みを達成した。残りの切断型ＰＮ
７３は、５０μＭの濃度が必要であったＰＮ７６８を除いて、１０μＭの濃度においてＰ
Ｎ６９０と同等の細胞取り込み率（カッコ内の数値）を達成し、これはＰＮ７３のＮ末端
残基はペプチドが細胞内へ進入する能力にとって必要ではないことを示唆している。ペプ
チドの細胞取り込みには、ＰＮ７６８として示すＰＮ７３の５塩基分のＣ末端残基で十分
である。切断型ＰＮ７３は、０．６３μＭにおいてペプチドの長さに比例して細胞取り込
み活性の低下を示した。すなわち、０．６３μＭの濃度でテストされたペプチドを全体的
に見ると、ＰＮ７３ペプチドの長さが減少するとその細胞取り込み活性も低下し、従って
、ペプチドの細胞取り込み活性は投与量に依存することが示唆された。
表２０に細胞取り込みと標的遺伝子ノックダウン（ＫＤ）のデータをまとめた。
Figure 2016073290
表２０より、欠失したＰＮ７３のＮ末端部（ＰＮ３６１参照）がｓｉＲＮＡ細胞取り込
み活性を５０％低下させ、またＣ末端を除くことで（ＰＮ３６０参照）ｓｉＲＮＡ細胞取
り込み活性が低下したことが分かる。これらのデータは、典型的ポリヌクレオチド送達促
進ポリペプチドＰＮ７３のＣ末端領域が、ペプチドのヌクレオチド細胞取り込み活性に寄
与していることを示している。
本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド化合物による標的遺伝子
発現の有効なノックダウンを実証した。具体的には、ｓｉＲＮＡ／ペプチド化合物による
ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節する能力を評価した。ｈＴＮＦ
−α遺伝子は、ヒトやその他の哺乳類の対象中で過剰発現すると関節リウマチ（ＲＡ）の
発症と進行を媒介することが示唆されているため、これを標的とすることは重要である。
ヒト単球をモデルシステムとして用いて、ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体のｈＴＮＦ−α
遺伝子発現に対する影響を測定した。ＱｎｅｇはランダムｓｉＲＮＡ配列を表し、ネガテ
ィブコントロールとした。観察されたＱｎｅｇによるノックダウン活性を１００％（遺伝
子発現レベル１００％）の基準とし、以下の各ｓｉＲＮＡ、Ａ１９Ｓ２１、２１／２１、
及びＬＣ２０のノックダウン活性はこのネガティブコントロールに対する相対パーセント
で表した。Ａ１９Ｓ２１、２１／２１、及びＬＣ２０はｈＴＮＦ−αｍＲＮＡを標的とす
るｓｉＲＮＡである。典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであるＰＮ６４３
（完全長型ＰＮ７３からＣ末端標識を取り除いたもの）、ＰＮ６９０（Ｃ末端ＦＩＴＣ標
識付き完全長型ＰＮ７３）、並びに欠失系ＰＮ６６０，ＰＮ７３５、ＰＮ６５４及びＰＮ
７０８からのＰＮ７３の切断型を上で挙げたｓｉＲＮＡと複合体化させ、各ｓｉＲＮＡが
ヒト単球中ｈＴＮＦ−α遺伝子の発現レベルを低下させる能力に対するこれらポリペプチ
ドの影響を調べた。典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の完全長型
及び切断型のノックダウン活性を上の表２０にまとめる。「ＫＤ」の列の「＋」は、ペプ
チド／ｓｉＲＮＡ化合物がＱｎｅｇのネガティブコントロールｓｉＲＮＡに対して８０％
のノックダウン活性（Ｑｎｅｇネガティブコントロールと比較してｍＲＮＡレベルが２０
％低下）を有していたことを意味する。「＋／−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ化合物がＱ
ｎｅｇのネガティブコントロールｓｉＲＮＡに対して約９０％のノックダウン活性（Ｑｎ
ｅｇネガティブコントロールと比較してｍＲＮＡレベルが１０％低下）を有していたこと
を意味する。最後に「−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ化合物がＱｎｅｇネガティブコント
ロールと比較して有意なノックダウン活性を有していなかったことを意味する。
健康なヒトの血液をＧｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（カリフォル
ニア州）から購入し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の勾
配を用いて末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液から分離した。次にＭｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社の磁気マイクロビーズを用い、ヒト単球をＰＢＭＣ分画から分離した。
単離したヒト単球は、４ｍＭのグルタミン、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、及び１
×ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ中に再懸濁し、使用するまで４℃
で保存した。
９６ウェル平底プレートを使い、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に
ヒト単球を１００Ｋ／ウェル／１００μｌで播種した。典型的ポリヌクレオチド送達促進
ポリペプチドを、２０ｎＭのｓｉＲＮＡとモル比１：５にてＯｐｔｉＭＥＭ培地中室温で
５分間混合した。このインキュベーションの最後にＦＢＳをこの混合物へ添加し（終濃度
３％）、この混合物５０μｌを細胞へ添加した。細胞は３７℃で３時間温置した。温置の
後、細胞をＶ底プレートへ移し、１５００ｒｐｍで５分間かけてペレット化した。細胞を
増殖培地（グルタミン、非必須アミノ酸、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＩ
ＭＤＭ）中へ再懸濁した。一晩のインキュベーションの後、単球に１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ
（Ｓｉｇｍａ社）を適用して３時間刺激し、ＴＮＦ−α発現レベルを増加させた。ＬＰＳ
の導入後、ｍＲＮＡ定量のために細胞を上述のように回収し、上清はタンパク質定量が必
要な場合は保存した。
ｍＲＮＡの測定は、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社（カリフォルニア州）の分岐ＤＮＡ技術
を用いて製造者の仕様に従って行った。細胞中のｍＲＮＡレベルを定量するために、ハウ
スキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡの両方を測定
し、ＴＮＦ−αの読み取りをｃｙｐＢに対して標準化して相対発光単位を得た。
全体として、ＰＮ６４３（ＦＩＴＣ標識なし完全長型ＰＮ７３）及びＰＮ６９０（ＦＩ
ＴＣ標識完全長型ＰＮ７３）は、「ＫＤ」列の「＋」（結果を表２０に示す）が示すよう
に、テストしたすべてのｓｉＲＮＡにおいて、同等のｓｉＲＮＡノックダウン活性を有し
ていた。さらに、ＰＮ６６０は、テストしたすべてのｓｉＲＮＡにおいてＰＮ６４３及び
ＰＮ６９０と同等のｓｉＲＮＡノックダウン活性を有しており、このことはＰＮ７３の最
もＮ末端側の９残基を除いても、ｓｉＲＮＡが媒介する標的ＴＮＦ−αｍＲＮＡのノック
ダウン活性に影響がないことを示唆している。ＰＮ６５４は、Ａ１９Ｓ２１及び２１／２
１の両ｓｉＲＮＡに対して中程度のノックダウン活性を示したが、ＬＣ２０ｓｉＲＮＡに
対してはノックダウン活性を示さなかった（ノックダウン活性は、ノックダウン活性の列
中に「±」として示されている）。しかし、ＰＮ７０８又はＰＮ７３５と複合体化された
ｓｉＲＮＡは、いずれのｓｉＲＮＡについても観測可能なノックダウン活性を示さなかっ
た。
実施例１５
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７０８
上述のように、細胞取り込み分析は、ペプチドと化合物化されたＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡ
を受け入れる細胞の数を測定する。ｓｉＲＮＡの細胞取り込みはフローサイトメトリ（詳
細は実施例２を参照）で評価した。取り込み率は、Ｃｙ５抱合ｓｉＲＮＡを含有する細胞
の数を培養液中のトランスフェクトされた細胞及びされていない細胞を合わせた全細胞数
で割って計算したパーセントで表した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）はフローサイトメトリで
測定し、これにより細胞内のＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡを定量した。ＭＦＩ値は細胞内のＣｙ
５抱合ｓｉＲＮＡの量と正の相関関係があり、従って高いＭＦＩ値は細胞内のＣｙ５抱合
ｓｉＲＮＡの数が多いことを示す。
この例では、ＰＮ６４３（完全長型ＰＮ７３からＣ末端標識を取り除いたもの）、ＰＮ
６９０（Ｃ末端ＦＩＴＣ標識を有する完全長型ＰＮ７３）、及びＰＮ７０８（１５塩基長
、ＰＮ７３のＮ末端残基２１個を欠失して誘導）は５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、及び４
０μＭでテストした。ＰＮ６４３及びＰＮ６９０は２．５μＭでもテストし、ＰＮ６９０
はさらに１．２５μＭでもテストした。ＰＮ６４３及びＰＮ７０８の両方は８０μＭでも
テストした。
表２１に示すように、ＦＩＴＣ標識なしのＰＮ７３（ＰＮ６４３）ペプチドは１０μＭ
の濃度でほぼ１００％のｓｉＲＮＡの取り込みを達成した。しかし、ＰＮ７３をＦＩＴＣ
で標識すると（ＰＮ６９０）、最大細胞取り込み活性は約７０％まで低下した。ＰＮ７０
８は、ｓｉＲＮＡの細胞取り込み活性が投与量に依存して増加することを示した。ＰＮ７
０８は、８０μＭでｓｉＲＮＡの細胞取り込み活性の最大である９５％を達成した。完全
長型ＰＮ７３ペプチドでは、ペプチド濃度の上昇に伴って細胞生存率が減少した。対照的
に、ＰＮ７０８ペプチドとインキュベートした細胞は、すべてのテスト濃度のペプチド存
在下において９０％超の生存率を維持した。この例では、切断型ペプチドＰＮ７０８は、
完全長型ＰＮ７３（ＰＮ６９０）と比較して細胞内へ送達されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡの量
を約２倍に増加させた。
Figure 2016073290
ポリペプチドＰＮ７０８は、ｓｉＲＮＡが媒介する標的遺伝子発現低下への影響によっ
てその特性を評価した。ＰＮ７０８ペプチドのＣ末端ＦＩＴＣ標識を除いてから、ｓｉＲ
ＮＡと複合体化した時のその標的遺伝子発現低下を促進する能力を評価した。ＦＩＴＣ標
識が存在しない場合の切断型の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ＰＮ
７６６とした（実施例１２の表１９参照）。ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体によるヒト腫瘍
壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子発現の調節能を評価した（プロトコルの詳細は実施例
３参照）。この例では、ランダムｓｉＲＮＡ配列であるＱｎｅｇをネガティブコントロー
ルとし、ＬＣ２０及びＬＣ１７のｓｉＲＮＡを用いてヒト単球中のｈＴＮＦ−αｍＲＮＡ
を標的とした。テストしたｓｉＲＮＡのペプチドに対するモル比は１：５、１：１０、１
：２５、１：５０、１：７５、及び１：１００であった。ＬＣ２０、ＬＣ１７共に２０ｎ
Ｍの濃度で使用した。
ノックダウンの結果は、ＬＣ２０／ＰＮ７６６及びＬＣ１７／ＰＮ７６６の両方のｓｉ
ＲＮＡ／ペプチド複合体共に、１：５、１：１０、及び１：２５においてｈＴＮＦ−αｍ
ＲＮＡのレベルがｓｉＲＮＡネガティブコントロールＱｎｅｇの約７０乃至８０％まで低
下した（すなわち、ネガティブコントロールＱｎｅｇに比べてｍＲＮＡのレベルが２０乃
至３０％低下）。ｓｉＲＮＡ／ペプチド比が１：５０、１：７５、及び１：１００の場合
は、コントロールＱｎｅｇと比較してｈＴＮＦ−αｍＲＮＡのレベルに有意の影響はなか
った。ＰＮ７６６ペプチド存在下においてヒト単球に細胞毒性は見られなかった。
実施例１６
ペプチド媒介によるｓｉＲＮＡの細胞取り込み活性
ｓｉＲＮＡの細胞取り込み分析及びＭＦＩ測定を、実施例２及び３で既述のように行っ
た。データを表２２にまとめた。各ペプチドは、０．６３μＭ、１．２５μＭ、２．５μ
Ｍ、及び５μＭの濃度でテストした。
Figure 2016073290
実施例１７
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド
表２３に示すポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを、マウス尾線維芽細胞（ＭＴＦ
）中へのｓｉＲＮＡ送達能についてスクリーニングした。
Figure 2016073290
ｓｉＲＮＡと化合物化された表２３に挙げたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの
ｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性。各ポリペプチドのｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性データ、平
均蛍光強度（ＭＦＩ）測定値、及び細胞生存率データを表２４にまとめた。「処理」の列
にグレーでハイライトしたものがｓｉＲＮＡ細胞取り込み率７５％以上を達成したポリペ
プチドである。これらのハイライトした各ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体の具体的なｓｉＲ
ＮＡ細胞取り込み率も、「ｓｉＲＮＡ細胞取り込み率（％）」の列中にグレーでハイライ
トされている。
ＬＣ２０はヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡとし
て使用されるオリゴであり、以下のリボヌクレオチド配列で表される。
（配列番号９６）
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ
細胞によるｓｉＲＮＡの取り込みはフローサイトメトリ（詳細は実施例２参照）によっ
て評価した。取り込み率は、Ｃｙ５抱合ｓｉＲＮＡを含有する細胞の数を培養液中のトラ
ンスフェクトされた細胞及びされていない細胞を合わせた全細胞数で割って計算したパー
セントで表した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）はフローサイトメトリで測定し、これにより細
胞内のＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡを定量した。ＭＦＩ値は細胞内のＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡの量
と正の相関関係があり、従って高いＭＦＩ値は細胞内のＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡの数が多い
ことを示す。
データによると、ＰＮ６８０、ＰＮ６８１、ＰＮ７０９、ＰＮ７６０、ＰＮ７５９、及
びＰＮ６８２が、ｓｉＲＮＡと複合体化されると細胞内へｓｉＲＮＡを送達する。表２３
に示したポリペプチドのスクリーニングの結果を表２４に示す。
Figure 2016073290
表２４の「ｓｉＲＮＡ細胞取り込み率（％）」の列に示すように、「未処理」ネガティ
ブコントロールはｓｉＲＮＡの細胞取り込みが見られず、一方ポジティブコントロールの
ペプチドは９５％のｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性を達成した。ポリヌクレオチド送達促進
ポリペプチドのＰＮ６８０、ＰＮ６８１、ＰＮ７０９、ＰＮ７６０、ＰＮ７５９、又はＰ
Ｎ６８２と複合体化したｓｉＲＮＡのＣｙ５抱合ＬＣ２０は、７５％を超えるかそれ以上
のｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性を達成した。ポリペプチドＰＮ６９４及びＰＮ７１４は、
それぞれ５４％及び４３％という中程度のｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性を示した。ポリペ
プチドＰＮ６６５及びＰＮ７３４は、有意のｓｉＲＮＡ細胞取り込み活性を示さなかった
（５％未満）。
ポリペプチドはさらにそのｓｉＲＮＡを細胞中へトランスフェクトする能力を、平均蛍
光強度（ＭＦＩ）を分析することによって評価した。細胞取り込み分析がＣｙ５抱合ｓｉ
ＲＮＡを含む細胞のパーセントを定量したのに対し、ＭＦＩ測定では細胞内へ進入したＣ
ｙ５抱合ｓｉＲＮＡの相対平均量を定量した。表２４の「Ｃｙ５抱合ｓｉＲＮＡのＭＦＩ
」の列に示すように、ポジティブコントロールペプチドＰＮ６４３によるＣｙ５抱合ｓｉ
ＲＮＡの送達では、約７単位のＭＦＩが達成された。予想通り、「未処理」のネガティブ
コントロールでは測定可能なＭＦＩを示さなかった。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプ
チドＰＮ６６５に対してはＭＦＩの測定は行わなかった。ＰＮ７４３、ＰＮ６９４、及び
ＰＮ７１４のＭＦＩ測定値はポジティブコントロールよりも著しく低かった。ポリヌクレ
オチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０、ＰＮ７０９、及びＰＮ６８２のＭＦＩ測定値は
ＰＮ６４３のポジティブコントロールと同等であり、一方ＰＮ６８１のＭＦＩはポジティ
ブコントロールの２倍であった。ＰＮ７６０及びＰＮ７５９のＭＦＩ測定値は、ポジティ
ブコントロールと比べてそれぞれ約１３倍及び６倍高かった。
以下のプロトコルを用いて、表２３に挙げたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを
テストした。完全培地中でトランスフェクションを行う前日に、マウス尾線維芽細胞（Ｍ
ＴＦ）を２４ウェルプレートの各ウェルに約８０，０００個ずつ播種した。ポジティブコ
ントロールを除く各送達ペプチドを、０．５μＭのＣｙ５抱合ｓｉＲＮＡの存在下で、０
．６３μＭ、２．５μＭ、１０μＭ、及び４０μＭの濃度でテストした。ｓｉＲＮＡ／ペ
プチド複合体については、Ｃｙ５抱合ｓｉＲＮＡとペプチドを別々にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（
登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、最終濃度の２倍まで希釈した。等容
量のｓｉＲＮＡとペプチドを混合し、室温で５分間複合体化させた。このｓｉＲＮＡ／ペ
プチド複合体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄済みの細胞へ添加した。細胞は３７℃
、５％ＣＯ２下で３時間トランスフェクトさせた。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで
処理後フローサイトメトリで分析した。ｓｉＲＮＡの細胞取り込み量は細胞内のＣｙ５の
蛍光強度により測定した。細胞生存率は、ヨウ化プロピジウム取り込み又はアネキシンＶ
−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）染色法を用いて測定した。標識ｓｉＲＮＡ（
又は蛍光標識ペプチド）の細胞による取り込みを膜挿入と区別するため、トリパンブルー
を用いて細胞膜表面の蛍光を消光した。トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度０．
０４％となるように細胞に添加して再度フローサイトメトリにかけ、蛍光が細胞膜に集中
していることを示唆する蛍光強度の変化が見られるかどうかを調べた。
実施例１８
ポリペプチドを有するｓｉＲＮＡのノックダウン活性
ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節するｓｉＲＮＡ／ペプチド化
合物の能力を評価した。
ヒト単球をモデルシステムとして用い、ｓｉＲＮＡ／ペプチド化合物のｈＴＮＦ−α遺
伝子発現に対する影響を測定した。ＱｎｅｇはランダムｓｉＲＮＡ配列を表し、ネガティ
ブコントロールとして機能した。観察されたＱｎｅｇによるノックダウン活性を１００％
（遺伝子発現レベル１００％）の基準とし、以下の各ｓｉＲＮＡ、Ａ１９Ｓ２１ ＭＤ８
、２１／２１ ＭＤ８、及びＬＣ２０のノックダウン活性はこのネガティブコントロール
に対する相対パーセントで表した。Ａ１９Ｓ２１ ＭＤ８、２１／２１ ＭＤ８、及びＬ
Ｃ２０はｈＴＮＦ−αｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。
ポリペプチドＰＮ６０２は前述の実施例において使用されたポジティブコントロールを
アセチル化したものであり、この例においては、ｓｉＲＮＡのヒト単球への有効な送達及
びｓｉＲＮＡの媒介によるｈＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルの許容ノックダウン活性の両方に
ついてのポジティブコントロールとして使用した。
データが示すのは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０がｓｉＲＮＡを
細胞内へ送達し、ｓｉＲＮＡ媒介による有効なジーンサイレンシングを可能とすることで
ある。ＰＮ６０２、ＰＮ６８０、及びＰＮ６８１のノックダウン活性を表２５に示す。「
＋」のマークは、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体がＱｎｅｇのネガティブコントロールｓｉ
ＲＮＡに対して８０％のノックダウン活性（Ｑｎｅｇネガティブコントロールと比較して
ｍＲＮＡレベルが２０％低下）を有していたことを意味する。「＋／−」は、ペプチド／
ｓｉＲＮＡ複合体がＱｎｅｇのネガティブコントロールｓｉＲＮＡに対して約９０％のノ
ックダウン活性（Ｑｎｅｇネガティブコントロールと比較してｍＲＮＡレベルが１０％低
下）を有していたことを意味する。最後に「−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ化合物がＱｎ
ｅｇネガティブコントロールと比較して有意なノックダウン活性を有していなかったこと
を意味する。
Figure 2016073290
表２５の結果は、ポジティブコントロールであるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチ
ドＰＮ６０２と１：５及び１：１０の比率で複合体化された三種類のｓｉＲＮＡはすべて
、同じポリペプチドと複合体化されたＱｎｅｇネガティブコントロールと比較してｈＴＮ
Ｆ−α遺伝子発現のレベルを中程度に低下させたことを示している。しかし、ポリヌクレ
オチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８１と１：５及び１：１０の比率で複合体化された同
じｓｉＲＮＡは、ＱｎｅｇネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡ／ＰＮ６８１複合体
と比べてほとんど乃至全くノックダウン活性を示さなかった。対照的に、ｈＴＮＦ−αに
特異的なｓｉＲＮＡのいずれかと１：５の比率で複合体化されたポリヌクレオチド送達促
進ポリペプチドＰＮ６８０は、Ｑｎｅｇ／ＰＮ６８０コントロール複合体と比べて有意な
ｈＴＮＦ−αｍＲＮＡのノックダウン活性を示した。さらに、１：１０の比率のＬＣ２０
／ＰＮ６８０複合体も、Ｑｎｅｇ／ＰＮ６８０コントロール複合体と比べて有意なノック
ダウン活性を示した。
健康なヒトの血液をＧｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（カリフォル
ニア州）から購入し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の勾
配を用いて末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液から分離した。次にＭｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社の磁気マイクロビーズを用い、ヒト単球をＰＢＭＣ分画から分離した。
単離したヒト単球は、４ｍＭのグルタミン、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、及び１
×ペニシリン−ストレプトマイシン（添加したＩＭＤＭ中に再懸濁し、使用するまで４℃
で保存した。
９６ウェル平底プレートを使い、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に
ヒト単球を１０００００個／ウェル／１００μｌで播種した。ポリヌクレオチド送達促進
ポリペプチドを、２０ｎＭのｓｉＲＮＡとモル比１：５又は１：１０にてＯｐｔｉＭＥＭ
培地中室温で５分間混合した。このインキュベーションの最後にＦＢＳをこの混合物へ添
加し（終濃度３％）、この混合物５０μｌを細胞へ添加した。細胞は３７℃で３時間温置
した。温置の後、細胞をＶ底プレートへ移し、１５００ｒｐｍで５分間かけてペレット化
した。細胞を増殖培地（グルタミン、非必須アミノ酸、及びペニシリン−ストレプトマイ
シンを含むＩＭＤＭ）中へ再懸濁した。一晩のインキュベーションの後、単球に１ｎｇ／
ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）を適用して３時間刺激し、ＴＮＦ−α発現レベルを増加さ
せた。ＬＰＳの導入後、ｍＲＮＡ定量のために細胞を上述のように回収し、上清はタンパ
ク質定量が必要な場合は保存した。
ｍＲＮＡの測定は、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社（カリフォルニア州）の分岐ＤＮＡ技術
を用いて製造元の説明書に従って行った。細胞中のｍＲＮＡレベルを定量するために、ハ
ウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡの両方を測定
し、ＴＮＦ−αの読み取りをｃｙｐＢに対して標準化して相対発光単位を得た。
様々なｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８濃度及び窒素／リン比（Ｎ／Ｐ）におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における３本の棒グラフにおいて、Ｇ１４９８濃度は左から１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌであった。Ｎ／Ｐ比０．２及び０．５において、Ｇ１４９８濃度が１０μｇ／ｍｌの時の粒子は非常に小さかった。 様々な窒素／リン比（Ｎ／Ｐ）におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における２本の棒グラフにおいて、左はボルテックス撹拌あり、右はボルテックス撹拌なしであった。データは混合後直ちに取得した。 様々な窒素／リン比（Ｎ／Ｐ）におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における２本の棒グラフにおいて、左はボルテックス撹拌あり、右はボルテックス撹拌なしであった。データは混合後３０分経過後に取得した。 様々な窒素／リン比（Ｎ／Ｐ）におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における２本の棒グラフにおいて、左はボルテックス撹拌あり、右はボルテックス撹拌なしであった。データは混合後６０分経過後に取得した。 様々な窒素／リン比（Ｎ／Ｐ）におけるｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における２本の棒グラフにおいて、左はボルテックス撹拌あり、右はボルテックス撹拌なしであった。データは混合後２４時間経過後に取得した。 ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８濃度１００μｇ／ｍｌにおける、様々なｐＨ値に対するＧ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。 塩化ナトリウム濃度を増加させた時の、ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。 様々なＮ／Ｐ比及び成分添加の順番における、ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子径を示す図である。各Ｎ／Ｐ比における２本の棒グラフにおいて、左はｓｉＲＮＡを先に加えて得られたもの、右はペプチドを先に加えて得られたものであった。 ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子の透過電子顕微鏡写真である。長さの指標記号は２００ｎｍを表す。 ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８とペプチドＰＮ１８３との縮合体粒子の透過電子顕微鏡写真である。長さの指標記号は２００ｎｍを表す。 ｓｉＲＮＡ Ｉｎｍ−４とペプチドＰＮ１８３及びＰＮ９３９との縮合体粒子を含む組成物の鼻腔内投与による、モデルマウスにおけるＬＰＳ刺激によるＴＦＮ−α発現（ｐｇ／ｍｌ）のノックダウンアッセイの結果を示す図である。一番左の棒グラフが緩衝液による対照実験、次がＩｎｍ−４／ＰＮ１８３／ＰＮ９３９縮合体のデータ、その右がグルタルアルデヒド（Ｇ）で架橋したＩｎｍ−４／ＰＮ１８３／ＰＮ９３９縮合体のデータである。プラセボはｓｉＲＮＡを含んでおらず、Ｑｎｅｇは不活性ｓｉＲＮＡを含む。 Ｌａｃ−ｚ ｓｉＲＮＡとペプチドＰＮ１８３及び異なる第二のペプチドとの縮合体を用いた、ラット膠肉腫線維芽細胞９Ｌ／ＬａｃＺにおけるｌａｃ−ｚ発現のインビトロノックダウンアッセイの結果を示す図である。一番左の棒グラフがＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州、バレンシア）を用いた比較データであり、それに続くのが本発明の様々な化合物によるデータである。Ｎ／Ｐ比は、ＰＮ１８３が０．７５、第二のペプチドが０．３であった。

Claims (1)

  1. 縮合粒子を含む化合物であって、各粒子が１又はそれ以上の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮ
    Ａ）及び１又はそれ以上のペプチドを具え、該粒子の直径が１０００ｎｍ未満であり、各
    ペプチドが配列番号２８乃至３７、４２乃至４３、及び６７乃至９５から選択される配列
    を具えることを特徴とする化合物。
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