CN112251488B - 一种毛细管电泳检测dna四面体载药系统的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种毛细管电泳检测DNA四面体载药系统的方法，属于生物分析领域。首先将4条DNA单链等摩尔浓度混合，经过变质过程，形成DNA四面体结构。然后向DNA四面体中加入药物，在室温、避光的条件下进行共孵育。通过毛细管电泳，经荧光光谱仪对DNA四面体以及DNA四面体‑药物复合物在毛细管中进行在线检测。上述技术方案操作简单，可重复性高，建立了一种新的高灵敏的DNA四面体载药系统的检测技术。

Description

一种毛细管电泳检测DNA四面体载药系统的方法
技术领域
本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种毛细管电泳检测DNA四面体载药系统的方法。
背景技术
近年来，DNA纳米材料基于其良好的生物相容性和纳米级可控制性等优点被进一步应用于生物成像、生物传感和药物递送。DNA四面体具有良好的结构刚性，因其制备方法简单、细胞毒性低，及具有良好的生物相容性而备受关注，其在抗肿瘤药物递送方向具有独特的优势。
毛细管电泳作为一种快速有效、高灵敏、低样品消耗的技术，在生物分析领域有着广阔的应用前景。同时，将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大扩宽了毛细管电泳技术的应用。
DNA四面体药物递送系统常用于抗肿瘤治疗，检测药物是否成功载入四面体对于构建抗肿瘤递药系统具有重要意义。DNA四面体载药系统检测现采用离心法沉淀纳米材料，测定上清液中游离药物间接反映DNA四面体与药物的结合情况，不能更直观反映DNA四面体的载药情况，并且不能同时检测DNA四面体及其载药系统。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中无法同时检测DNA四面体及其载药系统的问题，提供一种毛细管电泳检测DNA四面体载药系统的方法，通过向DNA四面体中加入不同浓度的药物，从而获得DNA四面体以及DNA四面体-药物复合物，利用荧光毛细管电泳，实现对DNA四面体及其与药物的复合物的检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先选择组成DNA四面体的DNA单链，其中，链4在5’端带有荧光染料修饰；荧光染料为FAM，TAMRA或者ATTO。
将选择的DNA单链溶解于TM缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，使DNA单链的浓度为100μM。再将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，配成DNA单链的终浓度为1μM的样品，在95℃下变性10min，随后迅速降温到4℃，保持3h，获得DNA四面体结构；
形成DNA四面体的四条单链序列分别为:
S1:5’-AGG CAG TTG AGA CGA ACA TTC CTA AGT CTG AAA TTT ATC ACC CGC CATAGT AGA CGT ATC ACC-3’
S2:5’-CTT GCT ACA CGA TTC AGA CTT AGG AAT GTT CGA CAT GCG AGG GTC CAATAC CGA CGA TTA CAG-3’
S3:5’-GGT GAT AAA ACG TGT AGC AAG CTG TAA TCG ATT TTA ATG CCA AAG ACACTC GCT ACA TTG GCA TAA ATA ACT ACT ATG GCG-3’
S4:FAM-5’-TAA AAA CGG TAT TGG ACC CTC GCA TGA CTC AAC TGC CTG GTG ATACGA TAT TT-3’。
向获得的DNA四面体结构中加入药物，经室温、避光孵育后，得到DNA四面体及其与药物的复合物；最后利用毛细管电泳检测。
药物为阿霉素、姜黄素、二甲基姜黄素或紫杉醇。
DNA四面体与药物的摩尔浓度比为1:20-1:250；共孵育的时间为2-14h。
毛细管电泳检测的具体条件为：25mM硼酸缓冲液(pH 9.3)，运行电压16kV，毛细管有效长度：35cm，毛细管总长度：60cm。
采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果：本发明提供的用于检测DNA四面体载药系统的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了毛细管电泳技术的应用。
附图说明
图1：不同浓度的阿霉素与DNA四面体共孵育后的电泳图。
其中：a，仅DNA四面体；DNA四面体：阿霉素b，1：20；c，1：40；d，1：60；e，1：80；f，1：100。
图2：DNA四面体与阿霉素共孵育不同时间后的电泳图。
其中：a，仅DNA四面体；孵育时间b，2h；c，4h；d，6h；e，8h；f，10h；g，12h。
图3：DNA四面体-阿霉素复合物在pH＝5时随时间变化的电泳图；其中：a，仅复合物；孵育时间b，1h；c，2h；d，4h；e，6h；f，12h；g，18h。
图4：DNA四面体-阿霉素复合物在pH＝7时随时间变化的电泳图；其中：a，仅复合物；孵育时间b，1h；c，2h；d，4h；e，6h；f，12h；g，18h。
图5：不同浓度的二甲基姜黄素与DNA四面体共孵育后的电泳图。a,仅DNA四面体；DNA四面体与二甲基姜黄素的摩尔比：b,1：250；c,1:120；d,1:25；e,仅二甲基姜黄素。(实线，520nm，FAM-DNA四面体的检测通道，虚线，480nm，二甲基姜黄素的检测通道)
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
实施例1
1、DNA四面体的合成：
将购买的(生工(上海，中国))DNA单链用离心机(8000r/min，3min)离心，然后加入适量TM缓冲液，使DNA单链的浓度为100μM。将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，配成DNA单链的终浓度为1μM的样品；将配好的样品在95℃水浴锅中加热10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃冰箱中保持3h，即可得到DNA四面体结构。
2、取DNA四面体5μL与阿霉素1μL均匀混合，在室温、避光的条件下共孵育14h，得到游离的DNA四面体与DNA四面体-阿霉素复合物。
3、毛细管电泳检测：采用无涂层的石英毛细管，有效长度35cm(总长60cm，内径75μm)，分离缓冲液为硼酸缓冲溶液(25mM，pH 9.3)，通过16kV的高压电源使待测样品在毛细管内流动。将步骤2的样品用荧光毛细管电泳检测。在700s内，通过毛细管电泳可以将游离DNA四面体与DNA四面体-阿霉素复合物分离开(依据DNA四面体与DNA四面体-阿霉素复合物电泳淌度的差异进行分离)。并且随着DNA四面体与阿霉素浓度比的变化，电泳图中出现的游离DNA四面体的峰(P1)强度越来越小，最后，游离DNA四面体的峰完全消失(图1)。
实施例2
按照实施例1的方法，将DNA四面体结构与过量的阿霉素(浓度比为1:150)均匀混合，在室温、避光的条件下共孵育不同的时间。可以看出，随着孵育时间的延长，电泳图中出现的DNA四面体-阿霉素复合物的峰(P2)强度越来越大(图2)。
实施例3
按照实施例1的方法，将DNA四面体-阿霉素复合物(浓度比为1:150)置于pH＝5或者pH＝7的溶液(去离子水，用1M HCl调pH值)中，通过监测不同时间游离DNA四面体峰强度的变化，反映DNA四面体-阿霉素复合物在不同条件下的药物释放。可以看出，DNA四面体载药系统在酸性条件下药物释放的更快(图3)，而在中性条件下有相对较好的稳定性(图4)。
实施例4
按照实施例1的方法，将DNA四面体与不同浓度的二甲基姜黄素混合，在室温条件下共孵育14h。采用毛细管电泳对各条件下(DNA四面体与二甲基姜黄素的摩尔比不同)制备获得的样品进行分析，从图5可以看出，毛细管电泳法可将DNA四面体与游离药物分离开，可为探究DNA四面体载二甲基姜黄素的能力奠定基础。
通过上述实施例可以看出，通过毛细管电泳可以有效快速地检测DNA四面体载药系统。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (1)

1.一种毛细管电泳检测DNA四面体载药系统的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
步骤1：选择组成DNA四面体的DNA单链，其中，链4在5’端带有荧光染料修饰；
形成DNA四面体的四条单链序列分别为:
S1: 5’-AGG CAG TTG AGA CGA ACA TTC CTA AGT CTG AAA TTT ATC ACC CGC CATAGT AGA CGT ATC ACC-3’
S2: 5’-CTT GCT ACA CGA TTC AGA CTT AGG AAT GTT CGA CAT GCG AGG GTC CAATAC CGA CGA TTA CAG-3’
S3: 5’-GGT GAT AAA ACG TGT AGC AAG CTG TAA TCG ATT TTA ATG CCA AAG ACACTC GCT ACA TTG GCA TAA ATA ACT ACT ATG GCG-3’
S4: FAM-5’-TAA AAA CGG TAT TGG ACC CTC GCA TGA CTC AAC TGC CTG GTG ATACGA TAT TT-3’；
所述的荧光染料为FAM；
步骤2：将步骤1所述的DNA单链溶解于TM缓冲液，再将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，在95℃下变性10 min，随后迅速降温到4℃，保持3 h，获得DNA四面体结构；
所述的四条单链混合在TM buffer中的终浓度为1 μM；
步骤3：向步骤2 所述的DNA四面体结构中加入药物，在室温、避光的条件下共孵育，得到DNA四面体-药物复合物；
所述的药物为阿霉素、二甲基姜黄素、姜黄素或紫杉醇；
所述的DNA四面体与药物的摩尔浓度比为1:20-1:250；DNA四面体结构与药物的共孵育时间为2-14 h；
步骤4：将步骤3所述的复合物用荧光毛细管电泳检测。
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