CN109295205A

CN109295205A - 一种可以快速同时检测多种miR的方法

Info

Publication number: CN109295205A
Application number: CN201811207675.8A
Authority: CN
Inventors: 余章斌
Original assignee: Nanjing Ningbeixin Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Ningbeixin Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-10-17
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明涉及一种一步法同时检测miR‑19b、miR‑22、miR‑29c和miR‑375的方法及其应用。该方法通过设计一种DNA四面体，四个顶端分别包含四个miR‑19b、miR‑22、miR‑29c和miR‑375的互补序列的茎环结构的探针。四个茎环结构5′和3′端修饰了分别标记荧光基团和淬灭基团。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。实现了对四种miRNA的快速同时检测，具有良好的灵敏度和特异性。

Description

一种可以快速同时检测多种miR的方法

技术领域

本发明涉及一种可以快速同时检测多种miR的方法。

背景技术

先天性心脏病（Congenital heart defects, CHD）是最常见的一种先天性畸形，包括心脏和大血管的许多结构和功能上的异常，大约每1000名新生儿中有8人患病。尽管以往有很多研究探讨了先心病的病因，但此类缺陷仍是一个严重的健康问题，大约占围产期死亡的40%，在妊娠首月中的夭折数占总死亡数的五分之一以上。既往的多项研究已经证实：在胎儿死亡中，CHD的发生率与胎儿流产时的妊娠年龄有关。早期死亡的主要原因是存在各种复杂的先天性心脏缺陷。此外，先心病的诊断越早，预后越好。因此，胎儿先心病的产前检测是降低死亡率、改善预后的关键。

虽然已有胎儿超声心动图作为冠心病的筛查工具，在常规产前护理期间，胎儿心脏异常仍然被忽略，检出率低至6%到35%不等。此外，由于缺乏标准，各个检测中心的超声检查结果也不同。许多研究报告指出，影响产前超声检测冠心病准确性的因素很多，如操作者的经验、超声设备的质量、病变类型、不同的部门政策和指导方针。近来，已发现与先心病相关并在子宫内可检测的生物标志物，包括子宫颈半透明度、游离β-人绒毛膜促性腺激素水平的升高和妊娠相关血浆蛋白-A的低水平。然而，这些CHD生物标志物的差异不足以作为胎儿CHD筛查的生物标志物。

microRNAs是一类大小为19到23nt的小型非编码RNA。迄今为止，在动物细胞中已鉴定出800多个microRNA，并已报道它们参与各种生物学过程，包括细胞生长、分化、增殖和凋亡过程。越来越多的研究表明，循环中的miRNA水平很可能作为许多癌症的新的预后和预测性的生物标志物或治疗结果的评估指标。它们具有独特的优点，包括它们的丰富性、稳定性、易于检测和发现疾病特异性。miRNA与心脏病变之间的关系已被证实。此外，已在胎儿CHD胎盘组织中发现与胎儿CHD有关的特异性miRNA, 孕妇外周血中也可检测出源于胎盘的miRNA。我们前期鉴定并证实了四种孕妇血清miRNA，miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375可作为胎儿先心病产前检测的新型无创性生物标志物（Zhu S, Cao L, Zhu J, Kong L, JinJ, Qian L, Zhu C, Hu X, Li M, Guo X, Han S, Yu Z. Clin Chim Acta. 2013,424,66-72.）。

迄今为止，检测miRNA的方法主要有实时定量PCR（quantitative Real-TimePCR）、Northern印迹分析等。这些方法往往需要昂贵的仪器，操作复杂，耗时长，并且一次操作只能检测单一的miRNA。因此，急需开发一种操作简单、灵敏度好、响应快速，可同时检测多种miRNA的新方法。

近年来，随着纳米技术的发展，利用纳米材料开发可同时检测多种目标分子的检测方法是当前开发新型传感器的一个热门方向，例如，Wang小组报道了一种利用磁纳米颗粒的多通道微芯片来实现同时检测多种疾病标志物（参考文献：Gaster, R. S., Hall, D.A.; Nielsen, C. H., Osterfeld, S. J., Yu, H., Mach, K. E., Wilson, R. J.,Murmann, B., Liao, J. C.; Gambhir, S. S., Wang, S. X. Nat. Med. 2009, 15,1327-1332）；Fan小组利用微流控技术和具有不同发射光的量子点纳米颗粒，报道了一种基于量子点的微流控平台来同时检测两种肿瘤标志物的方法（参考文献：Hu, M.; Yan, J.,He, Y.; Lu, H., Weng, L., Song, S.; Fan, C., Wang, L. Acs Nano, 2010, 4, 488-494）；但是，迄今为止，还没有可以快速同时检测miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以快速同时检测多种miR的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下机理：设计一种DNA四面体，四个顶端分别包含四个miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的互补序列的茎环结构的探针。DNA四面体四条链的序列分别为：5’ – ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAGAGCCGC CAT AGT A- BHQ-1 -AAAAA ACACGTTTAGGTACGTTTTGACT TTTTT-6-FAM - 3’; 5’ -TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGCGAG GGT CCA ATA C -BHQ-2-AAAAA TTCGACGGTCAACTTCTTGACA TTTTT-Cy3- 3’; 5’ - TCA ACT GCC TGG TGATAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACTATG GCG GCT CTT C- BHQ-2-AAAAAATCGTGGTAAACTTTAGCCAAT TTTTT-ROX- 3’; 5’ - TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCCACG TAG TGT CGT TTG TATTGG ACC CTC GCA T-BHQ-3-AAAAA AAACAAGCAAGCCGAGCGCACTTTTTT-Cy5- 3’. 四个茎环结构5′和3′端修饰了分别标记荧光基团和淬灭基团（图1）。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

1.DNA 四面体准备：将形成DNA四面体的四条链等比例地混合于TM缓冲液。将该溶液加热至95℃10分钟，然后迅速冷却至4℃。用原子力显微镜（AFM）和凝胶电泳对合成的DNA四面体进行表征。

2.浓度梯度测定：取经步骤a 获得的DNA四面体，加入浓度范围为1pM~100nM的miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375。室温孵育10min后进行四种荧光强度检测。各荧光分子的激发和发射波长如下：6-FAM为495 nm和521 nm；Cy3为550 nm 和 570 nm；ROX为587nm和607nm；Cy5为649 nm和670 nm。得到荧光强度与miRNA浓度的线性关系。

3.利用步骤b所得的标准曲线法对待测样本进行分析检测，分析miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的含量。

附图说明

图1为本发明的方法原理图；

图2本发明中DNA四面体结构的AFM表征图；

图3是本发明应用于同时分析四种miRNA的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

含有四种miRNA探针的DNA四面体的合成

加适量TM缓冲液分别溶解合成DNA四面体的四条链，至100μM的终浓度。

再取适量TM缓冲液分别稀释三种miRNA探针至10μM，置于95°C金属浴热击10分钟，然后迅速置于4°C。

利用上述DNA四面体检测四种miRNA

将待检测样本与上述DNA四面体在37 °C下孵育30min。然后进行孵育产物的荧光检测。荧光测量均由F2500荧光光谱仪（日立）实现。6-FAM在495 nm处激发，Cy3的激发光为550nm，ROX激发光为587nm，Cy5激发光为649 nm，在521 nm处测量6-FAM荧光信号，570 nm检测Cy3荧光信号，607nm处检测ROX信号，670 nm处检测Cy5荧光信号。所有激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm，PMT电压为800 V。所有这些检测都记录在室温下。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims

1.一种含有miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375探针的四面体DNA设计方法。

2.DNA四面体四条链的序列分别为：5’ – ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAGAGC CGC CAT AGT A- BHQ-1 -AAAAA ACACGTTTAGGTACGTTTTGACTTTTTT-6-FAM - 3’; 5’ - TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGATGCGAG GGT CCA ATA C -BHQ-2-AAAAA TTCGACGGTCAACTTCTTGACA TTTTT-Cy3- 3’; 5’ -TCA ACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACTATG GCG GCT CTT C-BHQ-2-AAAAA ATCGTGGTAAACTTTAGCCAAT TTTTT-ROX- 3’; 5’ - TTC AGA CTT AGG AATGTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TATTGG ACC CTC GCA T-BHQ-3-AAAAAAAACAAGCAAGCCGAGCGCACT TTTTT-Cy5- 3’.

一种一步法同时检测miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的方法，其特征在于,该方法的具体步骤为：

步骤1：DNA 四面体准备：将形成DNA四面体的四条链等比例地混合于TM缓冲液。

3.将该溶液加热至95℃10分钟，然后迅速冷却至4℃。

4.用原子力显微镜（AFM）和凝胶电泳对合成的DNA四面体进行表征。

5.步骤2：浓度梯度测定：取经步骤a 获得的DNA四面体，加入浓度范围为1pM~100nM的miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375。

6.室温孵育10min后进行四种荧光强度检测。

7. 各荧光分子的激发和发射波长如下：6-FAM为495 nm和521 nm；Cy3为550 nm 和570 nm；ROX为587nm和607nm；Cy5为649 nm和670 nm。

8.得到荧光强度与miRNA浓度的线性关系。

9.步骤3：利用步骤b所得的标准曲线法对待测样本进行分析检测，分析miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的含量

一种同时检测miR-19b、miR-22、miR-29c和miR-375的方法应用于孕妇外周血中胎儿先心病产前检测。