CN105647785B - 一种血培养瓶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血培养瓶，包括培养瓶瓶体、传感层、吸附树脂和培养基，所述的传感层包括荧光物质和基质，所述的荧光物质包括含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针，即Rh‑pH突光探针，所述的Rh‑pH荧光探针的结构通式如（I)所示。本发明的血培养瓶，具有如下技术效果：1）本发明的血培养瓶中的荧光物质更稳定、不易猝灭，显著降低诊断过程中出现假阴性或者假阳性的概率，且能耐受121℃以上高温，产品最终能进行高温高压灭菌；2）本发明较国外进口产品灵敏度更高，相同阳性标本可以在更短的时间能检测出结果。

Description

一种血培养瓶
技术领域
本发明涉及一种血培养瓶，属于医疗检测技术领域。
背景技术
自上世纪90年代以来，我国全自动血培养系统长期被美国BD公司和法国梅里埃公司的全自动血培养系统所垄断，与进口仪器配套的血液培养瓶带来的高昂检测费用给国民的医疗费支出带来了沉重的负担。近年来，随着医疗器械行业发展，国内相继出现能替代梅里埃血培养瓶的产品，而能替代BD荧光法血培养瓶且质量达标的产品却寥寥无几。
国外现有的同类产品在生产制造的过程中是在全无菌的环境中生产，由于荧光物质不能承受高温最终灭菌，生产过程中一点点的环境变化或操作失误就会引起产品失效。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种血培养瓶。
本发明的血培养瓶，包括培养瓶瓶体、传感层、吸附树脂和培养基，所述的传感层包括荧光物质和基质，
所述的荧光物质包括含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针，即Rh-pH突光探针，所述的Rh-pH荧光探针的结构通式如(I)所示：
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝—CH2CH3，R3＝—CH3；
或R1＝R2＝—CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝—CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝R3＝R4＝—(CH2)3—。
所述的荧光物质还包括磺基罗丹明B、罗丹明B和罗丹明6G的一种或几种。
所述的培养瓶瓶体为高硼硅玻璃瓶体。
所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针通过如下方法制备而成：
1)将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到乙腈中，保温反应3-5小时，冷却至室温后，加入氨基酸类化合物的乙腈溶液和三乙胺的乙腈溶液，室温下反应3-5小时，反应液用乙酸乙酯和水萃取，取有机层，干燥，浓缩，降温，析晶，得到白色固体；
2)将该白色固体溶于水中，加入氢氧化钠溶液，加热至50-60℃，反应过夜，降至室温，加入稀盐酸溶液，搅拌，再加入二氯甲烷溶液萃取，取有机层，干燥，浓缩，得到目标产物Rh-pH荧光探针；
所述罗丹明类化合物为罗丹明110、罗丹明6G、四甲基罗丹明TMR、罗丹明B或罗丹明101，所述氨基酸类化合物为谷氨酸二甲酯；
所述的罗丹明类化合物、三氯氧磷、氨基酸类化合物与三乙胺的摩尔比为1:(3-6):1:(3-6)。
本发明的血培养瓶，具有如下技术效果：
1)本发明的血培养瓶中的荧光物质更稳定、不易猝灭，显著降低诊断过程中出现假阴性或者假阳性的概率，且能耐受121℃以上高温，产品最终能进行高温高压灭菌；
2)本发明较国外进口产品灵敏度更高，相同阳性标本可以在更短的时间能检测出结果。
附图说明
图1是1号血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图2是2号血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图3是3号血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图4是4号血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图5是5号血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图6是进口血液培养瓶在5.08天的培养曲线；
图7是1号血液培养瓶在6.8天的培养曲线；
图8是进口血液培养瓶在6.8天的培养曲线。
图1-图8是在美国BD公司血液培养仪上检测读出结果图。
具体实施方式
实施例1制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明110与0.012摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.006摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：489.2.4(M+2),488.2(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml 30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：460.9(M+2),459.9(M+1)。
实施例2制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明6G与0.01摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.008摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：601.4(M+2),600.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml 30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：573.15(M+2),572.1(M+1)。
实施例3制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的四甲基罗丹明TMR与0.008摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.01摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：552.8(M+2),551.8(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml 30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：524.6(M+2),523.6(M+1)。
实施例4制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明B与0.006摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.012摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：601.4(M+2),600.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml 30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：573.15(M+2),572.1(M+1)。
实施例5制备含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针
本实施例的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
第一步：将0.002摩尔的罗丹明101与0.009摩尔的POCl3加入到20ml乙腈中，氮气保护下，加热到60度，保温反应3-5个小时，TLC监控至反应完全，原料消失。降至室温，缓慢加入0.002摩尔的谷氨酸二甲酯和0.009摩尔的三乙胺的乙腈(10ml)溶液,室温反应三个小时，TLC监控至酰氯完全消失。把反应液浓缩至干，加入30ml乙酸乙酯和20ml水，萃取分层，水层用20ml水萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩至液体体积剩余一半，停止浓缩，降温，析晶，得白色固体。LCMS结果：649.4(M+2),648.4(M+1)。
第二步：将上一步所得白色固体溶于20ml水中，加入10ml 30％氢氧化钠溶液，加热至50-60度，反应过夜，TLC监控至原料完全消失。降至室温，加入25ml10％稀HCl溶液，搅拌0.5h.加入80ml二氯甲烷溶液萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，得本实施例的目标产物。LCMS结果：621.2.2(M+2),620.2(M+1)。
实施例6制备血培养瓶
本实施例的血培养瓶，包括培养瓶瓶体、传感层、吸附树脂和培养基，所述的传感层包括荧光物质和基质。
血培养瓶的制备方法，参考公开号为“CN 101353622A”的中国发明专利申请“用于全自动血液培养系统的血液增菌培养瓶及其制备方法”，其中的实施例1的方法，将其中的“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成本发明的实施例1-5的荧光探针，还可以混入磺基罗丹明B、罗丹明B和罗丹明6G的一种或几种荧光物质。上述荧光物质使用之前，先溶于水配成0.01g/L-1g/L，并调节pH值至pH＝4-8。
将“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成实施例1的荧光探针，其pH范围4-8，最佳为PH＝8，浓度为0.5g/L，制成1号血培养瓶。
将“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成本发明的实施例2的荧光探针和罗丹明B的混合物，其中实施例2的荧光探针的pH＝4-8，最佳为PH＝8，浓度为0.1g/L，罗丹明B浓度为0.1g/L，制成2号血培养瓶。
将“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成本发明的实施例3的荧光探针和罗丹明B的混合物，其中实施例3的荧光探针的pH＝4-8，最佳为PH＝8，浓度为1g/L，罗丹明B浓度为0.03g/L，制成3号血培养瓶。
将“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成本发明的实施例4的荧光探针，其pH＝4-8，最佳为PH＝8，浓度为0.05g/L，制成4号血培养瓶。
将“pH＝8的1％溴甲酚紫指示剂”替换成本发明的实施例5的荧光探针和罗丹明6G的混合物，其中实施例5的荧光探针的pH＝4-8，最佳为PH＝8，浓度为0.01g/L，罗丹明6G浓度为0.07g/L，制成5号血培养瓶。
验证试验一
阴性对比：采用1-5号血培养瓶和不含本发明荧光探针的进口血培养瓶培养阴性血液；放入血液培养仪中培养5.08天。图1-图5是1-5号血液培养瓶的培养结果，图6为不含本发明荧光探针的进口血培养瓶的培养结果，可以看出1-5号血液培养瓶在5.08天的培养曲线比图6更加平滑稳定，特别是图1说明本发明的荧光物质更稳定。
阳性对比：采用1号血培养瓶和不含本发明荧光探针的进口血培养瓶培养阳性血液；放入血液培养仪中培养6.8天。图7是1号血液培养瓶的培养结果，在1.13天就报出阳性结果，图8为不含本发明荧光探针的进口血培养瓶的培养结果，大约在2天才报出阳性结果来，图7在6.8天的培养中曲线比图8更加平滑稳定，说明本发明的荧光物质更稳定。图8在报阳结果后图形上扬更大，说明进口的培养瓶荧光稳定性稍差，而在阳性结果方面，图7比图8大概提前了一天，说明本发明的荧光探针灵敏度比进口产品更高。
验证试验二
将1份新鲜血液分成30份，分别注入5个1号瓶、5个2号瓶、5个3号瓶、5个4号瓶、5个5号瓶和5个不含本发明荧光探针的进口血培养瓶，放入血液培养箱培养7天，观察试验结果。
将1份体液分成6份，分别注入1个1号瓶、1个2号瓶、1个3号瓶、1个4号瓶、1个5号瓶和1个不含本发明荧光探针的进口血培养瓶，放入血液培养箱培养7天，观察试验结果。
结果见下表：
由上表可以看出1-5号瓶和进口瓶在培养结果一致。总符合率：100％。

Claims (4)

1.一种血培养瓶，包括培养瓶瓶体、传感层、吸附树脂和培养基，所述的传感层包括荧光物质和基质，其特征在于，
所述的荧光物质包括含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针，即Rh-pH突光探针，所述的Rh-pH荧光探针的结构通式如(I)所示：
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝—CH2CH3，R3＝—CH3；
或R1＝R2＝—CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝—CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝R3＝R4＝—(CH2)3—。
2.根据权利要求1所述的血培养瓶，其特征在于，所述的荧光物质还包括磺基罗丹明B、罗丹明B和罗丹明6G的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的血培养瓶，其特征在于，所述的培养瓶瓶体为高硼硅玻璃瓶体。
4.根据权利要求1所述的血培养瓶，其特征在于，所述的含有谷氨酸结构的罗丹明pH荧光探针通过如下方法制备而成：
1)将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到乙腈中，保温反应3-5小时，冷却至室温后，加入氨基酸类化合物的乙腈溶液和三乙胺的乙腈溶液，室温下反应3-5小时，反应液用乙酸乙酯和水萃取，取有机层，干燥，浓缩，降温，析晶，得到白色固体；
2)将该白色固体溶于水中，加入氢氧化钠溶液，加热至50-60℃，反应过夜，降至室温，加入稀盐酸溶液，搅拌，再加入二氯甲烷溶液萃取，取有机层，干燥，浓缩，得到目标产物Rh-pH荧光探针；
所述罗丹明类化合物为罗丹明110、罗丹明6G、四甲基罗丹明TMR、罗丹明B或罗丹明101，所述氨基酸类化合物为谷氨酸二甲酯；
所述的罗丹明类化合物、三氯氧磷、氨基酸类化合物与三乙胺的摩尔比为1:(3-6):1:(3-6)。
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A new rhodamine B-based lysosomal pH fluorescent indicator;Hong-Shui Lv等;《Analytica Chimica Acta》;20130628;第788卷;第177-182页 *
A rhodamine B-based lysosomal pH probe;Shi-Li Shen等;《J.Mater. Chem. B》;20141120;第3卷;第919-925页 *

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