CN104655857A - 一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，它包括样品的前处理与制备、微生物胞内多聚磷酸盐含量测定、菌体总蛋白测定和微生物胞内多聚磷酸盐poly P的定量。与现有技术相比，本发明样品前处理及反应过程简单，样品需求量极小且可同时检测多个样品。同时，本发明方法中poly P的最低检测限可达ng级，对于基础科研意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法。
背景技术
多聚磷酸盐(Polyphosphate，poly P)是一种线性多聚体，由几个至上千个磷酸盐残基通过磷酸酐键聚合而成，广泛存在于细菌、真菌以及高等哺乳动物细胞中。研究显示poly P的生物学功能主要包括：(1)细胞能量储存的一种方式；(2)磷的储存库；(3)金属离子的螯合剂；(4)碱性离子的缓冲剂；(5)抵御外界环境压力的调控子；(6)基因表达调控的辅助因子之一。在微生物中，poly P还与以下生理过程直接相关：(1)细菌的运动性；(2)生物被膜的形成；(3)细菌的群体效应(Quorum sensing)；(4)严紧反应(Strigent response)；(5)孢子的形成；(6)捕食能力；(7)细菌毒性。除涉及生命科学的方方面面，能合成poly P的微生物也是环境科学中污水处理和生物修复的重要组成部分，弄清环境中poly P的循环及其在微生物体内的代谢，对于生物强化除磷意义重大。这就需要对环境样品(自然水体、污染水体以及活性污泥等)和微生物中的polyP含量进行测定，但到目前为止依然缺乏一种专门针对poly P的快速准确的直接定量方法，究其原因有以下两点：一是样品自身的非均一性和化学成份的复杂性；二是poly P链长的多样性。
目前poly P主要的定量方法包括31P-核磁共振检测法(31P Nuclear MagneticResonance，31P-NMR)、化学分离和提纯法、外切聚磷酸酶(Exopolyphosphatase，ppx)水解法、电子电离质谱分析法(Electron Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS)和离子色谱法(Ion Chromatography，IC)等。纵观目前的这些定量方法，还没有一种适合于常规实验室使用的相对快速准确且重现性良好的poly P直接定量方法，这严重限制了对于poly P的基础科学研究。
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)是由Dann等人于1971年合成的一种能够与富含A-T碱基对的双链DNA强力结合的荧光染料，它可以透过完整的细胞膜，快速进入活细胞与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用。DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm，而与双链DNA结合后，最大吸收波长变为358nm，最大发射波长变为461nm，在此条件下DAPI-DNA复合物可以产生比DAPI自身强20多倍的典型蓝色荧光，因此其多被用于细胞生物学和细胞遗传学的研究。除用于DNA染色外，早在1982年Tijssen JP等人发现DAPI同样可以与poly P结合形成DAPI-poly P复合物，该复合物使用360nm激发后可在525nm处观察到典型的黄绿色荧光，因此早期被用于脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)等富含poly P微生物的染色观察。鉴于DAPI-DNA复合物在360nm激发时也能发出高强度的荧光从而造成检测或观察DAPI-poly P复合物时荧光背景值过高，一直以来，基于该原理的各种实验方法仅限于高浓度poly P(0.5-10mM)的检测和富含poly P微生物胞内poly P的定性观察，与上述的poly P定量方法相比也没有显著的优势。直至2008年Aschar Sobbi等人从光谱分析方法的角度，优化了DAPI-poly P复合物的激发波长和检测波长，使得ng级的poly P可以被检测到。紧接着2010年DIAZ等人在Aschar Sobbi的工作基础之上，以不同链长的poly P标准品为主要研究对象，对检测过程中的可能影响因素进行了全面的分析和讨论，完善了该方法。2013年Anna N.Kulakova等人使用完善后的方法以及传统的先提取再分析的方法，对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)以及活性污泥样品中poly P的含量分别进行了测定比较，进一步确认了该方法的可行性和优越性。
尽管在诸多定量方法中，DAPI染色法在微生物胞内poly P定量方面具有诸多显见的优势，但到目前为止依然未被各国科研工作者广泛使用，国内也没有相关的报道。鉴于学科间的差异，尽管从事光谱分析或化学分析的学者从自身的角度出发，对影响实验准确性和重现性的各种因素(如标准品及样品的保存方式、样品的前处理方法、检测体系中各种离子及其浓度的影响、检测时各种对照的设置等等)进行了详尽的分析，但对于非本专业的普通科研工作者来说，当面对纷繁复杂的样品来具体应用该方法时，这似乎有些晦涩难以理解，不知从何下手，因此开发一种基于该原理的简单高效的，适合普通生物学实验的微生物胞内poly P的直接定量方法十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单迅速，高效准确的适合普通生物学实验的微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，它包括如下步骤：
(1)样品的前处理与制备：
将待测微生物接种于废水培养基中培养，取菌液测其OD600，测完后将菌液离心后弃去上清液，用HEPES缓冲液重悬菌体，离心后弃去上清液，得到待检测样品；
(2)微生物胞内多聚磷酸盐含量测定：
(2a)将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液混合后立刻涡旋混匀，孵育后再次涡旋混匀，继续孵育，得到样品组混合液；
(2b)用超纯水代替DAPI染液，重复(2a)中的操作，得到样品对照组混合液；
(2c)将样品组混合液与样品对照组混合液分别按每孔200μl的上样量上样至96孔板；
(2d)将步骤(2c)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于415nm处激发，于550nm处测定其荧光强度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于poly P标准曲线中读出样品中poly P的含量YP；
(3)菌体总蛋白测定：
(3a)将待检测样品上样至96孔板，加入DC Protein Reagents Package试剂盒中所提供的Reagent A，轻轻混匀，15-25℃下孵育5min后加入试剂盒中所提供的Reagent B，立刻吸吹混匀，显色15min后，得到样品组混合液；
(3b)用HEPES代替待检测样品，重复(3a)中的操作，得到样品对照组混合液；
(3c)将步骤(3a)和(3b)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于750nm处测定其吸光度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于BSA标准曲线中读出样品中蛋白的含量YA；
(4)微生物胞内多聚磷酸盐的定量
获得YP值和YA值后，按以下公式将微生物胞内的多聚磷酸盐含量准确定量，最终定量的单位为：μg(磷)/mg(菌体蛋白)；
其中，微生物胞内多聚磷酸盐poly P含量TPP＝(YP×3×30.9738×10-3)/(YA×3×10-3)，即TPP＝30.9738YP/YA。
步骤(1)中，所述的废水培养基的配方为：葡萄糖0.3g、胰蛋白胨0.1g、酵母提取物0.01g、无水乙酸钠0.15g、氯化钠0.05g、七水合硫酸镁0.262g、三水合磷酸氢二钾1.472g、氯化铵0.18g和去离子水1L，115℃下灭菌30min。
步骤(1)、(2a)、(2b)和(3)中，所述的HEPES缓冲液为20mmol/L、pH7.0的HEPES缓冲液。
步骤(1)中，菌液与重悬菌体所用的HEPES缓冲液的体积比为1.5：OD600值；其中，优选菌液体积为1.5mL，HEPES缓冲液体积为OD600mL。
步骤(1)中，离心的速率为12000rpm，离心的时间为2min。
步骤(2a)中，DAPI染液的制备方法为将DAPI用超纯水溶解定容，配制得到100μM的DAPI水溶液，-20℃避光保存。
步骤(2a)中，将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液的体积比为3：900：100；其中，优选待检测样品体积为3μl，HEPES缓冲液体积为900μl，DAPI染液体积为100μl。
步骤(2a)中，孵育的温度为15-25℃，孵育的时间为10-120min。
步骤(3a)中，待检测样品、Reagent A和Reagent B的体积比为1：5：40，其中，优选待检测样品体积为5μl，Reagent A体积为25μl，Reagent B体积为200μl。
其中，poly P标准曲线的构建方法为：
a.标准品分子量折算
Polyp Type45分子量的计算方法参照2010年DIAZ等人文章中所采用的公式PnO(3n+1)Na(n+2)来折算，对于Polyp Type45而言这里的n＝45，其分子量约为4647.5。基于此，1μg/ml的Polyp Type45中正磷酸盐的浓度约为9.7μM。
b.标准品母液的配制及储存
由于Polyp Type45晶体接触空气后易吸潮而变得非常粘稠，而且颗粒几乎无法破碎，因此最终的定容体积由实际的称量量决定，如单次称量了38mg，则用HAPES缓冲液将其定容至38ml(终浓度1μg/μl)。待其全部溶解后，分装成12μl/管，-80℃保存备用以防止其降解。同时鉴于Polyp Type45的分子量非常大，易沉降，因此在整个分装过程中应边摇匀边分装。
c.标准品工作液的配制
取-80℃冻存的标准品母液一管，室温融化后，取10μl至29.07ml的HAPES缓冲液中，涡旋混匀备用。根据上述计算方法，该工作液中正磷酸盐的终浓度约为3.3μM。
d.标准曲线的构建
准备6个干净的1.5ml离心管，按表1所列体积(单位：μl)依次加入除DAPI染液以外的其他三种溶液并混匀，最后同时加入DAPI染液，使各自的终体积均为1ml，立刻涡旋混匀，室温孵育5min，再次涡旋混匀，室温继续孵育5min以保证DAPI和Polyp充分结合达到稳定状态。上样时96孔板每孔的上样量为200μl，每种样品包括Blank在内至少需要两个平行。样品于415nm处激发，于550nm处测定其荧光强度，取每种样品在此检测条件下荧光强度的平均值来构建标准曲线。如上所述及表中试剂配比所示，1U＝3μM正磷酸盐，因此将根据该标准曲线折算出来的数值(命名为YP)乘以3x10-6即为上样体系中正磷酸盐或者说是磷酸基团(Pi)的摩尔浓度。为便于理解以及计算方便本文将其统一折算成Pi的质量，以μg表示，将YP乘以3得出Pi浓度(μM/L)，再乘以Pi的相对原子质量30.9738以及体积数10-3L，即用YP x 3x 30.9738x10-3就可计算出这1ml体系中含有多少μg的Pi。需要注意的是，由于Polyp的分子量非常大且在体外环境中不是非常稳定，因此整个实验过程中除了需要将溶液不时地混匀外，每一块用于测定样品的96孔板上均需同时构建一次标准曲线。
表1 poly P标准曲线构建各溶液体积配比表
其中，BSA标准曲线的构建方法为：
a.BSA母液的配制及存储
称取0.1g BSA以HEPES缓冲液定容至100ml使其终浓度为1mg/ml(即1μg/μl)，分装成800μl/管，-20℃保存。使用时提前取出，室温融化备用。
b.BSA工作液的配制
准备5个干净的1.5ml离心管，按表2所列体积(单位：μl)依次配制浓度分别为0.2μg/μl、0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl的工作液，其中浓度为1μg/μl的BSA工作液无需配制，使用剩余的300ul即可。
表2 BSA工作液各溶液体积配比表
c.标准曲线的构建
准备一块清洁的96孔板，每种工作液每孔上样量为5μl，每种工作液包括Blank在内至少需要两个平行。各浓度工作液全部上样完毕后，同时加入DC Protein ReagentsPackage试剂盒中所提供的Reagent A 25μl，轻轻混匀，室温孵育5min后同时加入试剂盒中所提供的Reagent B 200μl，立刻吸吹混匀，室温下显色15min，于750nm处测定样品的吸光度，取每种浓度工作液在此检测条件下吸光度的平均值来构建标准曲线。如表中试剂配比所示，根据该标准曲线折算出来的数值(命名为YA)为5μl上样体系中的蛋白浓度(单位为μg/μl)。鉴于该反应体系的微量性，单孔的总反应体积合计仅为255μl，易受个人操作的影响，因此对于每一块用于测定样品的96孔板也建议同时构建一次标准曲线。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、样品前处理及反应过程简单，几乎是直接定量。对于微生物样品，仅需一次简单的冻融。DPAI与poly P的充分结合仅需室温孵育10miin，蛋白检测反应仅需室温孵育15min。
2、样品需求量极小。poly P检测时样品总上样量仅为6μl，蛋白检测时样品总上样量仅为10μl，对于珍贵样品来说是最佳的选择。
3、可以同时检测多个样品。该方法可同时测定1-14个样品中的poly P含量，以及1-42个样品中的蛋白含量，对于poly P的直接定量可以说是一种高通量的方法。
4、poly P的最低检测限可达ng级。基于poly P浓度和Rfu之间良好的线性关系，低至ng级含量的poly P可以被灵敏地检测到，因此可以对样品中poly P存在与否、含量高低做出精准判断，这对于基础科研意义重大。
附图说明
图1为实施例1DAPI-poly P复合物的荧光检测图。
图2为实施例1中poly P标准曲线图。
图3为实施例2中BSA标准品及样品的蛋白浓度检测图。
图4为实施例2中BSA标准曲线图。
图5a为实施例4中CF-WT异染粒染色图。
图5b为实施例4中CF-MCS2异染粒染色图。
图5c为实施例4中CF-MPPK异染粒染色图。
图6为实施例4中弗氏柠檬酸杆菌不同菌株胞内poly P含量随时间变化曲线图。
图7a为实施例5中KT2440异染粒染色图。
图7b为实施例5中KT2440-0异染粒染色图。
图7c为实施例5中KT2440-1异染粒染色图。
图7d为实施例5中KT2440-10异染粒染色图。
图8为实施例5中恶臭假单胞菌不同菌株胞内poly P含量随时间变化曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 poly P标准曲线的构建及样品中poly P浓度的检测
以日常实验中的一次取样为例，如图1所示，它包含了DAPI-poly P复合物检测的全部参数，数据A1-B6为该次检测标曲构建的原始数据，数据C1-H11为该次检测样品及其对照的原始数据，所有数据的单位均为相对荧光值(Relative fluorescence unit，Rfu)。
鉴于1U＝3μM正磷酸盐，为方便以图表描述，我们将标准品的不同浓度梯度称为poly P的相对浓度(Relative Concentration)。对A1-B6标准品原始数据进行处理后，可得出表3中所列数据，如第一列“0U”所对应的数据为A2B2的平均值减去A1B1的平均值，其余以此类推。
表3 不同浓度的poly P标准品经DAPI染色后所对应的Rfu
依据表4的数据，使用origin 8.0软件进行线性拟合，可以获得如图2所示的标准曲线，其公式为YP＝2991.2+39585.2X，R2＝0.99723，线性关系良好。
再对11个样品(分别被命名为S1-S11)对应的C1-H11原始数据进行处理，如S1的Rfu数值为C1D1E1的平均值减去F1G1H1的平均值，然后代入YP的计算公式，即可计算出S1对应的YP值为0.7754，其余以此类推，详细数据见表4。
表4 样品S1-S11的YP值
实施例2 BSA标准曲线的构建及样品蛋白浓度的检测
在获得样品的YP值后，还需要获得各自对应的YA值。如图3所示，它包含了蛋白浓度检测的全部参数，数据A1-B6为该次检测标曲构建的原始数据，数据C1-H11为该次检测样品的原始数据(其中G1-H11为样品S1-S11对应的数据，其余数据为同批次其他样品的数据)，所有数据的单位均为在样品在750nm处的吸光度。
对A1-B6标准品原始数据进行处理后，可得出表5中的数据，如第一列“0.2”所对应的数据为A2B2的平均值减去A1B1的平均值，其余以此类推。
表5 不同浓度BSA标准品在750nm处所对应的吸光度
依据表5的数据，使用origin 8.0软件进行线性拟合，可以获得如图4所示的标准曲线，其公式为YA＝0.1525X-0.0007，R2＝0.99777，线性关系良好。
再对11个样品对应的G1-H11原始数据进行处理，如S1的A750数值为G1H1的平均值减去A1B1的平均值，然后代入YA的计算公式，即可计算出S1对应的YA值为0.2756，其余以此类推，详细数据见表6。
表6 样品S1-S11的YA值
实施例3 微生物胞内poly P的最终定量
在获取所有样品的YP和YA值后，按照poly P的最终定量公式：TPP＝30.9738YP/YA即可计算出每种微生物样品胞内poly P的含量，详细数据见表7。
表7 样品S1-S11胞内Polyp的含量
实施例4 对异染粒分布区别显著的不同菌株胞内poly P的直接定量
实验所使用的三种菌株分别为CF-WT、CF-MCS2、CF-MPPK——它们最显著的特征为不同菌株胞内poly P含量差异显著，使用染色法可以对各自的聚磷能力做出直接的定性评价，通过测定培养基中总磷含量的方法也可以对各自的聚磷能力做出间接的定量评价。按常规微生物培养方法，将三种不同菌株分别接种至总磷含量为20mg/L的合成废水培养基中培养数小时，取样按常规方法制片，使用改良Albert染色法染色，并于1000倍油镜下观察，如图5所示，CF-MPPK胞内两端存在显见的异染粒，而CF-WT、CF-MCS2胞内未见明显的异染粒。
同时每隔2小时取样，按上述方法对3种不同菌株胞内的poly P进行了直接定量，如图6所示，结果与染色结果一致，即CF-MPPK胞内poly P含量显著高于CF-WT、CF-MCS2，约是后两者的2.5倍。
实施例5 对异染粒分布区别不显著的不同菌株胞内poly P的直接定量
实验所使用的四种菌株分别为KT2440、KT2440-0、KT2440-1以及KT2440-10——它们最显著的特征为使用染色法对各自的聚磷能力做定性评价时，几乎无法直接判定孰优孰劣。我们按常规微生物培养方法，将三种不同菌株分别接种至总磷含量为10mg/L的合成废水培养基中培养数小时，取样按常规方法制片，使用改良Albert染色法染色，并于1000倍油镜下观察，实验结果如图7所示。
同时在采用测定培养基中总磷含量的方法对各菌株的聚磷能力做出间接的定量评价时，由于各自的生物量存在微小差异，得出的结果是各菌株所在合成废水培养基上清中总磷含量无差异，聚磷效果无变化。那么基因敲除对宿主的聚磷能力是否真的没有任何影响？为了一探究竟，同时每隔2小时取样，按上述方法对4种不同菌株胞内的poly P进行了直接定量。如图8所示，直接定量结果表明，三种基因敲除株系较野生型聚磷能力均有不同程度的增加，其中株系KT2440-1和KT2440-10胞内的poly P的最高含量较KT2440增加了约20％。
Claims (9)
1.一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品的前处理与制备：
将待测微生物接种于废水培养基中培养，取菌液测其OD600，测完后将菌液离心后弃去上清液，用HEPES缓冲液重悬菌体，离心后弃去上清液，得到待检测样品；
(2)微生物胞内多聚磷酸盐含量测定：
(2a)将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液混合后立刻涡旋混匀，孵育后再次涡旋混匀，继续孵育，得到样品组混合液；
(2b)用超纯水代替DAPI染液，重复(2a)中的操作，得到样品对照组混合液；
(2c)将样品组混合液与样品对照组混合液分别按每孔200μl的上样量上样至96孔板；
(2d)将步骤(2c)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于415nm处激发，于550nm处测定其荧光强度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于poly P标准曲线中读出样品中poly P的含量YP；
(3)菌体总蛋白测定：
(3a)将待检测样品上样至96孔板，加入DC Protein Reagents Package试剂盒中所提供的Reagent A，轻轻混匀，15-25℃下孵育5min后加入试剂盒中所提供的Reagent B，立刻吸吹混匀，显色15min后，得到样品组混合液；
(3b)用HEPES代替待检测样品，重复(3a)中的操作，得到样品对照组混合液；
(3c)将步骤(3a)和(3b)中处理后的96孔板放入酶标仪中，于750nm处测定其吸光度；将样品组读数减去样品对照组读数，所得数据于BSA标准曲线中读出样品中蛋白的含量YA；
(4)微生物胞内多聚磷酸盐的定量
获得YP值和YA值后，按以下公式将微生物胞内的多聚磷酸盐含量准确定量，最终定量的单位为：μg(磷)/mg(菌体蛋白)；
其中，微生物胞内多聚磷酸盐poly P含量：
TPP＝30.9738YP/YA。
2.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的废水培养基的配方为：葡萄糖0.3g、胰蛋白胨0.1g、酵母提取物0.01g、无水乙酸钠0.15g、氯化钠0.05g、七水合硫酸镁0.262g、三水合磷酸氢二钾1.472g、氯化铵0.18g和去离子水1L，115℃下灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(1)、(2a)、(2b)和(3)中，所述的HEPES缓冲液为20mmol/L、pH7.0的HEPES缓冲液。
4.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(1)中，菌液与重悬菌体所用的HEPES缓冲液的体积比为1.5：OD600值。
5.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(1)中，离心的速率为12000rpm，离心的时间为2min。
6.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(2a)中，DAPI染液的制备方法为将DAPI用超纯水溶解定容，配制得到100μM的DAPI水溶液，-20℃避光保存。
7.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(2a)中，将待检测样品、HEPES缓冲液和DAPI染液的体积比为3：900：100。
8.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(2a)中，孵育的温度为15-25℃，孵育的时间为10-120min。
9.根据权利要求1所述的细胞内多聚磷酸盐的直接定量测定方法，其特征在于，步骤(3a)中，待检测样品、Reagent A和Reagent B的体积比为1：5：40。
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