CN101551333A - 用于检测膜上活细胞的包含nog、hmp、氯化铷和/或氯化锂的细胞透化组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于透化微生物的壁的组合物和一种使用所述组合物计数和鉴定膜上细胞的方法，其中所述组合物包含辛基－β－D－吡喃葡萄糖苷(NOG)、多聚磷酸钠(HMP)和选自氯化铝或氯化铷的盐的组合。
Description
本发明涉及一种用于细胞透化的新型组合物，其包含N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)、多聚磷酸钠(HMP)和选自氯化铷和氯化锂的盐的组合，该组合物可籍荧光标记物标记细胞，同时保存所述细胞的活力。
本发明还涉及一种检测和/或鉴定滤膜上液体或气体样品所含的活细胞的方法。
本发明特别适合于进入例如食品或药品生产链的液体和气体介质的微生物质量控制。
在该领域内，污染物可能以稀释在大量水或气体中的各种细胞形式存在，尤其是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
但仅检测这些细胞是不够的，还有必要对它们进行精确鉴定，确保它们是介质中的活细胞，而不是在其使用前可能对空气或水进行处理所造成的死细胞。例如，使用氯或臭氧进行水处理可导致介质中细胞死亡，这些细胞可被肉眼检测到，不会成为污染源。
现有技术中描述了许多检测方法，用于检测一定时间内滤膜上的液体或气体介质中的活细胞的存在。这些方法一般包括：
-通过滤膜过滤所述液体或气体介质的步骤；
-将与营养介质接触的所述膜与温育数小时的步骤，在此期间过滤后仍存留在滤膜上的细胞发生分裂，形成肉眼不可见的微集落；以及
-采用各种发光或荧光技术检测形成微集落的细胞克隆的步骤。
例如WO 01/59157描述了这种方法。该方法已被用于开发检测活细胞的通用试剂盒，名为“Milliflex Rapid”(Millipore)。在该方法中，检测细胞的步骤由裂解滤膜上过滤后和温育后的细胞组成，裂解的目的在于释放细胞的三磷酸腺苷(ATP)成分。释放的ATP被用作鉴定和定量活细胞(ATP-生物发光)的标记物，它充当可产生化学发光反应的酶(荧光素酶)的底物。该化学发光反应产生光信号，光信号被视频接口(CCD照相机)俘获，随后以合成图像的形式储存。该合成图像可原位显现膜上微生物显影的地方，所采用的方式与在培养皿上的琼脂培养基中进行的常规计数类似。
该技术具有可检测所有活细胞的优点，因为ATP是所有活生物体内大量存在的分子。因此它能可靠地指示受试样品中存在的污染物数目。
另一方面，提取ATP需要裂解，因此需要杀死细胞，无法随后培养微生物进行鉴定，即确定微生物的种。
因此关于污染所获得的信息只是定量而非定性。
专利申请FR 2289984描述了另一种检测膜上细胞的方法。在该方法中，使用特异杂交探针检测存留在滤膜上的细胞。采用聚乙烯亚胺(PEI)和乙醇的透化组合物，可使检测探针透过细胞壁，一旦这些探针进入细胞，所述探针与细胞内的基因组RNA或DNA序列发生特异杂交。这些探针一般为多聚核苷酸，经选择可与核酸特异杂交，以靶向污染物的一个或多个种。洗涤步骤后采用照相机检测标记有荧光剂或发光剂的探针，以定位滤膜上的细胞。
这种检测方法特异性虽然更高，但无法明确区分活细胞与死细胞。事实上，探针在活细胞和死细胞内均发生杂交，因此会导致假阳性。此外，即便透化组合物通常可保持细胞壁的完整性，但该方法的各个步骤却不能保持细胞是活着的，尤其是由于将细胞固定在纤维素膜上的步骤。
申请WO 2004/050902描述了另一种膜上检测的系统，它可检测污染血液样品的微生物的存在。设计该方法旨在避免微生物的裂解。该系统的特点在于过滤前使标记剂渗透进入微生物，进行微生物的检测，而此时微生物仍处于液体介质中。就这点而言，在膜上进行过滤和检测细胞之前，使用包含标记剂和透化剂的透化溶液稀释待测液体样品。
使用的标记剂为小分子，尤其是DNA嵌入化合物，例如花菁衍生物、碘化丙啶、吖啶橙或溴化乙锭。利用本领域技术人员知晓的透化剂例如聚乙烯亚胺(PEI)、毛地黄皂苷、nonensin、多粘菌素或苯扎氯铵的作用，这些化合物相对容易地渗透通过微生物的壁。所述嵌入剂在DNA转录或复制时附着到核酸内部，即只发生在样品所含的活细胞中。
该方法可标记所有活细胞，同时能保存细胞活力。但是，细胞在膜过滤前在液体介质中被标记，这会引起最终得到的计数结果不可靠。事实上，如果标记细胞时液相中的细胞正在分裂，膜上检测到的细胞数目可能是最初存在细胞数目的两倍。而且，透化和标记组合物对液体样品的稀释会导致最终结果出现显著的误差容限，该误差容限随着成功检测所需的流体操作引入的偶然污染的概率而增加。
此外，在这种情况下，被标记细胞在膜上逐个过滤和检测，即一个细胞接着一个细胞。结果是每个细胞的检测信号低。使用荧光标记物时更易出现这种问题。事实上，使用的膜一般由PVDF或纤维素组成，本身会产生部分荧光，从而屏蔽来自细胞的微弱荧光信号。
过去数年来已研制了所谓的“荧光”标记物。这些标记物具有事先被酶活化时只在荧光区域发出荧光的特点。这些复合分子一般包含一个可吸收光能并以特征性荧光发射光谱形式储存该能量的荧光基团，以及另一个可屏蔽或阻止所述荧光基团的荧光显现其自身的基团。所述酶具有修饰第二基团以使第一基团的荧光可被检测到的效应。
这些荧光标记物特别适合于以细胞计量术计数活细胞，例如申请WO98/55861所描述的细胞计数。但是，正如本发明指出，标记有荧光剂的细胞的荧光信号通常过低，难以在膜上单独检测到，这与使用DNA嵌入荧光剂所遇到的问题类似。
申请WO 96/14431描述了一种检测微生物的技术，具体而言是检测大肠菌，其依据是这些革兰氏阴性菌能够生成有可能活化荧光标记物的酶：β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶。使用的相应荧光底物是甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、4-三甲基氟甲基-伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(TFMU-gal)和4-三甲基氟甲基-伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(TFMUG)。该技术依据的原理与上述方法相同，其中首先过滤含有大肠菌的液体或气体样品，随后在滤膜上温育细菌，再以上述荧光底物检测形成的微集落。
但该技术具有某些局限性。
第一个局限是该检测方法只适用于某些合成β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的革兰氏阴性菌(大肠菌)。
第二个局限是细胞产生的β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的量通常过低，无法获得可检测的信号。因此，为了达到满意的敏感度，有必要使用β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的合成表达诱导物，例如异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)。
另一局限涉及荧光标记物对细胞的渗透，检测到的信号强度直接取决于此。由于标记物大小问题，且所述荧光标记物有被细胞经外排机制排出细胞的倾向，很难进行这种渗透。
为了促进标记物渗透进入细胞，现有技术教导使用细胞透化剂例如抗生素多粘菌素B和粘菌素以及溶菌酶，并在40℃下温育细胞。虽然这种透化方法可能足以对大肠菌有效，但对革兰氏阳性菌如寻找的致病菌金黄色葡萄球菌是远远不满意的。此外，将抗生素剂例如多粘菌素B和粘菌素用作透化剂不能保持细菌的活力[Petersen J.P等人.(2006)J.Antimicrobial.Chem.57：573-576]。
因此上述方法不仅只局限于检测大肠菌，也不能保持细胞是活着的。
因此，现有技术方法不能满意地满足以下两个要求，即用于评价介质中来自不同种的细胞数目的定量信息(检测所有活细胞)以及可鉴定存在的所述种的定性信息。
因此有必要有一种广谱透化组合物，即可透化许多各种类型的许多种的细胞而不会对较脆弱的细胞有太大的攻击性。
众所周知，革兰氏阳性微生物具有单层膜，其厚外层由肽聚糖(由肽和多糖链组成的多聚体)组成，其组织方式与革兰氏阴性菌不同，后者的细胞壁由更为脆弱的双层膜组成，其肽聚糖含量更低、更为分散，因此难以同时透化这两种类型的微生物。
本发明的目的是为了解决上述现有检测系统的局限，尤其是为了解决荧光标记活细胞时革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌整体的透化。
发明人意外观察到NOG、HMP和氯化铷和/或氯化锂的组合可在膜上获得革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的满意透化效果。
该透化具有保持受检细胞活力从而可随后培养受检细胞(特别是用于其鉴定)的优点。
本发明强调组合有效量的已知透化剂NOG和强效去垢剂HMP的重要性，其单独使用预计会对细胞壁产生破坏作用而非保护作用。
本发明还强调使用氯化铷和氯化锂可大大提高包含NOG和HMP组合的透化组合物的效果。
更具体而言，本发明的主题透化组合物允许使用以荧光化合物或探针标记膜上的细胞的方法。
图1：依据本发明方法检测荧光标记细胞的原理。
图2：采用表1列出的组合物1-7获得的检测结果的图示。Y轴表示使用每种组合物所获得的平均荧光强度。X轴并排显示了所述组合物，每种均用于检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。术语LiRb、NOG、HMP、LiRb/NOG、Chl/HMP、NOG/HMP和式(formule)分别对应于表1列出的组合物1-7。
图3：采用组合物11和12透化细胞(E.coli ATCC 8739)后以5/6-CFDA荧光标记微集落的照片。
A：采用组合物11透化的细胞的集落，组合物不含氯化铷。
B：采用组合物12透化的细胞的集落，组合物含氯化铷。
这些照片清楚表明，与组合物11相比，组合物12使细胞检测变得更为清晰。
图4：以组合物11和12处理的集落周围的荧光强度的拓扑分布。
A：采用本发明组合物11透化的细胞的集落，组合物不含氯化铷。
B：采用组合物12透化的细胞的集落，组合物含有氯化铷。
该分析清楚显示，使用本发明包含氯化铷的组合物12时，荧光更强，定位更佳。
本发明的第一方面由一种用于细胞透化的组合物组成，该组合物可使大分子渗透进入细胞内部。
大分子是来自几种类似或不同化学基团以共价键装配的复合分子，例如蛋白质、核酸、多糖，其分子量一般大于1000道尔顿，通常大于5000道尔顿。
本发明定义的细胞是一种包含被膜限定的细胞质和含有核酸形式的遗传物质的小型生物实体。
就本发明目的而言，术语微生物系指具有显微尺寸即大小位于0.5到5微米之间并具有代谢和繁殖潜力的细胞，例如藻类、单细胞真菌、原生动物、霉菌(mycete)、细菌或配子。
寻找的微生物更具体指假单胞菌属、埃希氏菌属、军团菌属、沙门氏菌属、李斯特菌属、芽孢杆菌属、链球菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、分枝杆菌属、志贺氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属或气单胞菌属的致病性革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌；贾第虫属、内阿米巴属、隐孢子虫属、环孢子虫属的原生动物；支原体属和脲原体属的支原体；酵母菌属、曲霉菌属、念珠菌属或青霉属的真菌。
更具体而言，本发明的目的是引起所谓荧光标记物渗透进入细胞内部，同时保持所述细胞的活力。
就本发明目的而言，所述细胞转移至营养培养基后进行分裂的能力决定了细胞的活力。
就本发明目的而言，荧光标记物是一种包含可吸收光能并以特征性荧光发射光谱形式储存该能量的荧光基团的大分子。所述荧光基团位于大分子中，使得预期波长处的荧光发射取决于大分子构型变化，而大分子构型变化又受特异酶的作用。一般而言，可进行该活化的所述酶具有针对大分子特异键的酯酶活性。因此，它是一种仅在特异酶的存在下时方可检测到的荧光标记物。该酶存在于细胞中，这提示细胞需要存活才能被标记上。
根据本发明可区分两种类型的荧光标记物：荧光化合物和荧光探针。
荧光化合物是上述定义的荧光标记物。它们可允许检测其渗透进入的任何活细胞，只要可活化它们的酶位于细胞内部。这些荧光化合物优选选自下列化合物：FDA(荧光素二乙酸酯)、6-CFDA(6-羧基荧光素二乙酸酯)、5-CFDA、5/6-CFDA、5-马来酰亚胺FDA、荧光素二月桂酸酯、荧光素二丁酸酯、5(6)2′，7′-二氯-CFDA、5(6)-磺基-FDA、5(6)2′，7′-二氯-FDA、5，6-CFDA-N-羟基丁二酰亚胺酯、荧光素二丙酸酯、二-β-D-半乳糖苷荧光素、3-O-甲基荧光素磷酸酯(3-o-methylfluorescein phosphate)、2′，7′-双(羧乙基)-5(6)-羧基-荧光素(BCECF/AM)的五乙酰氧基酯、叠氮荧光素二乙酸酯、氯甲基荧光素二乙酸酯、四溴荧光素二乙酸酯、羧基四溴荧光素二乙酸酯、4-甲基伞形酮乙酸酯、4-甲基伞形酮β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮壬酸酯、4-甲基伞形酮磷酸酯、甲基-1-伞形酮葡萄糖醛酸苷(methyl-1-umbelliferylglucoromide)、丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酰-L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、1，4-二乙酰氧基-2，3-二氰苯(ABD)、氢化乙啡啶(hydroethidine)、乙酸试卤灵(resorufinacetate)。
这些化合物为本领域技术人员所熟知[Manafi，M.，Fluorogenic andchromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests(1996)Journal of Food Microbiology 31：45-58]。
荧光探针是结合荧光化合物(优选为上述列出化合物之一)和探针的化合物，其中探针可与细胞所含核酸杂交以进行特异检测。最常见的特异探针包含一段长度一般为10至40个核苷酸的寡核苷酸片段，形成与微生物的DNA或RNA所含序列互补的序列。用于该类型探针的优选靶RNA是细胞的16S RNA，它一般包含对通常寻找的致病微生物特异的序列。
PNA(肽核酸)型的探针也可是该类检测的有用探针，因为它们的肽骨架对细胞内的降解酶不太敏感[Arghya等人，Peptide nucleic acid(PNA)：itsmedical and biotechnical applications and promise for the future(2000)TheFASEB Journal.14：1041-1060]。
一般而言，荧光探针经设计，可使荧光发射取决于所述探针与其靶序列的特异杂交，或取决于所述探针在细胞基因组复制期间对细胞基因组的整合。这些探针通常包含淬灭基团，即探针未发生杂交或未整合到细胞基因组时可吸收第一荧光基团荧光的第二荧光基团。这类探针例如BeaconTM探针为本领域技术人员知晓[Salvatore A.E等人，Real time assays withmolecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes(2005)European journal of internal medicine]。
使用荧光标记物检测细胞特别是检测膜上的微生物具有前述的几个局限，尤其是难以使这些一般体积较大的分子足量地渗透进入细胞而又不永久损害细胞壁。
本发明通过提供包含下列成分的组合物成功克服了这一问题：
-终浓度(重量体积)至少为0.01％的N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)；
-终浓度(重量体积)至少为0.1％的多聚磷酸钠(HMP)；以及
-终浓度(摩尔每升)至少为1mmol.l-1的氯化铷和/或氯化锂。
本发明的实验部分列出的各项实验清楚显示，组合NOG、HMP和氯化铷或氯化锂所得到的透化组合物借助于荧光标记物可检测广谱微生物，其中既包括革兰氏阳性菌也包括革兰氏阴性菌。
该组合物具有允许荧光标记物渗透进入细胞而不杀灭细胞的惊人效应，这样在检测步骤后有可能培养细胞。
N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)(C14H28O6)(CAS：29836-26-8)是一种膜蛋白增溶剂，现有技术领域已知其对革兰氏阴性菌有透化效应。但正如以下结果显示，它被认为不适合透化革兰氏阳性菌。
优选情况下，按组合物的总重计算，NOG的终浓度位于约0.03至0.2％之间，更优选位于约0.05至0.2％之间。
多聚磷酸钠(HMP)是一种基于通式为(NaPO3)6(CAS 50813-16-6)的多聚偏磷酸钠的盐混合物。先熔解磷酸二氢钠(mono-orthophosphate)，随后快速冷却制备得到这些盐。结果形成极易溶于水的结晶结构(Calgon S)，水解成为三偏磷酸钠和正磷酸钠形式。HMP被用作分散剂和去垢剂。有时它可籍此能力掺入到细胞透化组合物中。但含有HMP的组合物对细胞具有攻击性，无法保持细胞的活力。正如以下结果显示，单独使用HMP透化革兰氏阴性菌效果不够理想。
HMP的终浓度一般位于0.1％到2％重量之间，更通常位于约0.5％到1.5％重量之间，优选大于1％。
氯化锂(LiCl)和氯化铷(RbCl)是没有被广泛应用于微生物学的盐，因为它们一般具有与氯化钠(NaCl)相同的属性，而氯化钠便宜的多，应用也广泛的多。
但令人吃惊的是，就本发明而言，氯化锂和氯化铷可以迥异的比例更好地检测荧光化合物，尤其是标记膜上的微集落。尤其是使用这些盐可得到更为清晰的信号，以供荧光检测器解读。从图3的合成图可以看出这一效应，可能是因为细胞壁变得不那么脆弱，使得微集落周围的荧光标记物扩散程度较低。正如图4所示，比较微集落水平的荧光分布图可看出被标记细胞水平的荧光强度更高、定位更佳。
优选情况下，氯化铷的终浓度位于约1到20mmol.l-1之间。在适宜情况下，氯化铷的终浓度位于约10到15mmol.l-1之间。
优选情况下，氯化锂的终浓度位于约0.5到2mmol.l-1之间，更优选位于约1到2mmol.l-1之间。
正如上述实验证实这两种盐的混合物效果最佳，根据本发明的一个优选方面，所述透化组合物包含混合物形式的氯化锂和氯化铷。在该混合物中氯化锂和氯化铷的比率优选位于10到1000之间，优选位于50到200之间。
尚不完全清楚为什么NOG、HMP和选自氯化锂和氯化铷的盐的化合物组合特别适合于透化革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁。
根据本发明的一个优选方面，上述定义的透化组合物是一种配制于水、MOPS、MES或HEPES缓冲液的溶液。事实上该组合物不含PBS(磷酸缓冲液)型的缓冲液是有利的。发现PBS型的缓冲液不能与许多荧光化合物相容，例如CFDA或FDA，而它们是本发明的优选荧光标记物。
依据本发明的所述组合物可包含至少一种上述定义的荧光标记物。但荧光标记物也可单独存放，也可在检测被透化细胞时通过例如掺入到所谓的标记溶液中直接应用。
本发明特别涉及在细胞计数和/或鉴定的方法中使用上述定义的透化组合物。
所述组合物特别适合于检测荧光活细胞(通过荧光？)，尤其是希望同时检测各种类型的细胞，特别是革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物。
因此更具体而言，本发明的主题是一种计数和/或鉴定膜上活细胞的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)将一个或多个活细胞沉积在膜上；
b)使沉积在膜上的细胞与权利要求1到9任一项所述的透化组合物接触；
c)使被透化细胞同时或先后与可透过微生物壁的一种或多种荧光标记物接触；
d)通过荧光检测渗透进入微生物的标记物。
一般而言，在步骤a)中通过以所述膜过滤最初含有细胞的液体或气体介质，将细胞沉积在膜上。
术语“液体或气体介质”在本文中应理解为向膜两侧施加压力差后可过滤的任何流体，其中膜的平均孔径一般位于0.1到1.5微米之间，优选位于0.15到0.8微米之间，更优选位于0.2到0.6微米之间。这类流体可由进入无菌产品生产的纯溶液组成，但也可由复合溶液例如饮用水、饮料、医疗流体(血清、尿液、羊水等)组成。
因此本方法可应用于诊断领域，用于分析取自动物或患者的液体样品。
术语“膜”在本文中系指具有两个侧面的合成载体，其孔具有已知的平均直径。
本发明所使用的膜一般具有高表面/体积比和优选位于10到200微米之间的恒定厚度。
这类膜可为单层或多层形式。它一般由一种或多种选自聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、聚醚砜、醋酸纤维素和硝酸纤维素的材料组成。
优先选择这些材料，以与使用的溶剂、尤其是可在该方法各步使用的乙醇和乙醛相容。
在其上检测微生物的所述膜优选主要由PVDF(聚偏二氟乙烯)或
组成。更优选地，它是
公司销售的商品名为Milliflex的PVDF滤膜类型，产品货号为MXHVWP124或RMHVMFX24。若需过滤，可采用例如名为“
”的
过滤组件进行过滤。
当微生物过滤后被阻留在膜上时，可在该方法的步骤a)和b)之间引入一个任选步骤，即以适宜培养基培养微生物。该培养基优选为琼脂培养基，过滤后的膜置于其上。该任选步骤可获得最初过滤的每个微生物的集落，从而增加待检测细胞的数目。
根据本发明，随后在步骤b)中使所述微生物与本发明上述透化组合物接触。该步骤优选在少量溶液中进行，溶液在膜表面上形成薄膜。或者，可将膜放置在含有透化组合物的固相载体上，例如浸渍垫或琼脂，它们会限制液体在膜表面上的可能移动和由此导致的微生物混合。该步骤在20℃到45℃之间的温度下进行约5到60分钟。
在步骤c)中，根据具体情况，荧光标记物可被掺入到透化组合物，或者随后将被透化细胞与所述标记物接触，即将细胞与包含所述标记物的标记溶液进行接触。随后以标记溶液稀释或取代透化组合物。
当所述荧光标记物由特异探针组成时，根据选择的探针，可以靶向检测某些类型的细胞或微生物。
借助荧光传感器在标准条件下测量荧光，进行步骤d)的检测。一般在暗室内以CCD照相机俘获荧光，利用图像处理软件可测量荧光化合物发射的光能。
依据本发明的所述方法是有利的，因为它可允许直接在膜上检测活细胞。因此该方法可允许在检测步骤d)结束时以适宜培养基培养受测细胞，特别是用于受测微生物的更全面鉴定。因此有可能验证存在的细胞种类。
本发明的另一方面由试剂盒组成，藉此可施行上述方法检测和/或计数细胞。这类试剂盒一般包含透化细胞壁的上述组合物和任选的附加组分，例如荧光标记物或滤膜。
优选情况下，所述滤膜是一种主要由纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚醚砜组成的膜。
下文的实施例旨在例示本发明，而非对本发明加以任何限制。
实施例
1.1借助各种透化组合物进行的荧光检测：
受测的大肠杆菌(E.coli，革兰氏阴性菌)ATCC 8739和金黄色葡萄球菌(S.aureus，革兰氏阳性菌)ATCC 6538或枯草芽孢杆菌(B.subtilis，革兰氏阳性菌)ATCC 6633以冻存管(Dutscher，ref.028049)在-80℃下冷冻保藏，它们均来自菌种保藏库的冻干菌株。
生产冻存管时，在制备管当天接种一瓶100ml的TS肉汤(Biomérieux，ref.41146)，并在35-37℃温育。使用分光光度计(Eppendorf，Biophotometer ref.6131 000.012)定期测量600nm处的OD值，检测生长情况。OD值达到0.5时中断生长。向每支冻存管内分配600μl的冷冻保护剂(Sigma，以甘油冷冻细胞，ref.C6039)和600μl的培养物。混合冻存管，随后置于-80℃。
铺板10-5和10-6的稀释液，计数所述肉汤和未冷冻的冻存管。以蛋白胨水(Biomérieux，ref.42111)的9ml瓶制备这些稀释液。使用刮板将100μl的每种稀释液铺板在TSA琼脂(Biomérieux，ref.43011)上，35℃温育24小时。重复三次操作。次日，冻融冻存管，以相同方式进行计数。API gallery(Biomérieux)可允许鉴定和确认制备的冻存管的纯度。
对于所有的测试，细菌菌株均稀释在蛋白胨水(Biomérieux，ref.42111)试管中。向蛋白胨水的9ml管加入1ml冻存管菌株，进行逐级稀释，直至得到所需的稀释液。调节浓度以得到每个样品平均30个细菌的浓度。采用琼脂培养基常规计数试验在培养皿上验证该浓度。
使用Milliflex Plus真空泵(Millipore，ref.MXP PLUS01)、Milliflex漏斗和具有0.45μm孔径的纤维素酯膜或PVDF膜(Millipore，ref.MXHVWP124)进行过滤。将细菌加入到50-100ml的生理盐水0.9％NaCl(B.Braun，ref.0066570 E)。
将所述膜置于含有固体培养基Milliflex胰酶大豆琼脂(Millipore，ref.MXSM CTS48)或R2A(Millipore，ref.MXSM CRA 48)的盒(cassette)内，在32.5℃+/-2.5°的培养箱内温育一段时间，以使微生物足以形成微集落。
温育后，从琼脂培养基上分离所述膜，将其与2ml透化溶液在密封载体(用于Millipore液体培养基的盒吸收垫，ref.MX M CO120)上于室温或35℃下接触30分钟。
检测了下列透化溶液：
组合物1：
NaAc 50mM
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
水
组合物2：
NaAc 50mM
NOG 0.10％
水
组合物3：
NaAc 50mM
HMP 1％
水
组合物4：
NaAc 50mM
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
NOG 0.10％
水
组合物5：
NaAc 50mM
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
HMP 1％
水
组合物6：
NaAc 50mM
NOG 0.10％
HMP 1％
水
组合物7：
NaAc 50mM
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
NOG 0.10％
HMP 1％
水
组合物8：
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
NOG 0.10％
HMP 1％
HEPES缓冲液 20mM
组合物9：
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
NOG 0.10％
HMP 1％
MOPS缓冲液 0.1M
组合物10：
LiCl 1.13M
RbCl 10mM
NOG 0.10％
HMP 1％
水
组合物11：
NaAc 50mM
NaCl 1.13M
NOG 0.10％
HMP 1％
水
组合物12：
NaAc 50mM
RbCl 10mM
NOG 0.10％
HMP 1％
水
向透化组合物加入一种以DMSO稀释的通用荧光标记物即5/6-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)(Sigma 21879-100MG)，终浓度为100μg/ml。膜仍与标记底物在35℃下接触30分钟。随后从标记溶液中取出膜，将其放置在照明器内，该照明器配有照相机以测量520到530nm之间发射的荧光。
下表1-3列出的荧光强度结果对应于CCD照相机俘获并以最接近像素记录的光能(发光)，图像数据采用Sherlock图像分析软件(Insosys Inc.)分析。显示的数值是位于0到255之间的绝对光度值(测得的发光与背景噪声的发光比)。设置软件参数，使得0对应于膜上不含细胞时的荧光。测量的误差容限估计为±1.5。提及的各种透化组合物对应于细节已在上文列出的组合物1-7。
表1
受试组合物1-7的概况
| 组合物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| NaAc | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM |
| LiCl | 1.13M | / | / | 1.13M | 1.13M | / | 1.13M |
| RbCl | 10mM | / | / | 10mM | 10mM | / | 10mM |
| NOG | / | 0，10％ | / | 0，10％ | / | 0，10％ | 0，10％ |
| HMP | / | / | 1％ | / | 1％ | 1％ | 1％ |
| 水 | 水 | 水 | 水 | 水 | 水 | 水 | 水 |
表2
测得的组合物1-7的荧光强度
| 组合物 | 1 2 3 4 5 6 7 |
| 大肠杆菌 | 0 0 0 45 0 0 46 |
| 金黄色葡萄球菌 | 45 58 37 0 58 38 33 |
表3
测得的组合物8-10的荧光强度
| No. | 透化组合物 | 荧光强度金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性) | 荧光强度大肠杆菌(-革兰氏阴性) |
| 纤维素酯膜 | 0 | 0 | |
| 8 | LiCl：1.13MRbCl：10mMNOG：0.10％HMP：1％Hepes缓冲液：20mM | 24.8 | 40.4 |
| 9 | LiCl：1.13MRbCl：10mMNOG：0.10％HMP：1％MOPS缓冲液：0.1M | 31.9 | 51.6 |
| 10 | LiCl：1.13MRbCl：10mMNOG：0.10％HMP：1％缓冲液：水 | 24.9 | 44.4 |
表4
组合物7处理的各种微生物的回收率(rate of recovery)
| 微生物 | ATCC | 回收率(％) | 回收活力(％) |
| 大肠杆菌 | 8739 | 100 | 122 |
| 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 6633 | 104 | 104 |
| 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) | 6538 | 102 | 111 |
| 肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica) | 13314 | 117 | 117 |
| 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) | 9027 | 111 | 96 |
1.2结果阐释
使用组合物17获得的比较结果(图2和表2)表明：将HMP、NOG和氯化铷和/或氯化锂组合在同一透化组合物(本发明的组合物7)可获得对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)满意的检测结果。
使用组合物8、9和10得到的结果表明不含磷酸盐的缓冲液MOPS、MES或HEPES与水一样非常适合于本发明的组合物，并可取代现有技术领域使用的PBS缓冲液。
正如图3和图4所示，使用组合物11和12提示了氯化铷对荧光强度和分布的积极效应。图3的照片表明以本发明的组合物12处理细胞时标记更为清晰。该效应肉眼可见(使用滤镜可更好显现荧光)。图4给出了局部测量标记的微集落所得到的荧光强度差异。
上表4报道的回收结果表明无论使用哪种微生物(革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)都可以保存细胞活力；表4的回收结果对应于与未处理的相同细胞相比，以本发明组合物7处理细胞后存活细菌的数目。
Claims (35)
1.细胞透化组合物，其可用于使荧光标记物渗透进入细胞同时保持所述细胞的活力，其特征在于所述组合物包含：
a)终浓度(重量/体积)至少为0.01％的N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)；
b)终浓度(重量/体积)至少为0.1％的多聚磷酸钠(HMP)；以及
c)终浓度(摩尔每升)至少为1mmol.l-1的氯化铷和/或氯化锂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物包含氯化锂。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物包含氯化铷。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物包含氯化锂和氯化铷的混合物。
5.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于HMP在所述组合物中的终浓度位于0.1％到2％重量之间。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于HMP在最终组合物中的浓度大于1％重量。
7.如权利要求1至6任一项所述的组合物，其特征在于NOG的终浓度位于0.03到0.2％重量之间。
8.如权利要求1至7任一项所述的组合物，其特征在于氯化铷的终浓度位于1到20mmol.l-1之间。
9.如权利要求1至8任一项所述的组合物，其特征在于氯化锂的终浓度位于0.5到2mmol.l-1之间。
10.如权利要求1至9任一项所述的组合物，其特征在于其是配制于水或MOPS、MES或HEPES缓冲液的溶液。
11.如权利要求1至10任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物不包含PBS缓冲液(磷酸缓冲液)。
12.如权利要求1至11所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含至少一种荧光标记物。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于所述荧光标记物是荧光探针。
14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于所述荧光标记物是荧光化合物。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于所述荧光化合物选自：FDA、6-CFDA、5-CFDA、5/6-CFDA、5-马来酰亚胺FDA、荧光素二月桂酸酯、荧光素二丁酸酯、5(6)2′，7′-二氯-CFDA、5(6)-磺基-FDA、5(6)2′，7′-二氯-FDA、5，6-CFDA-N-羟基丁二酰亚胺酯、荧光素二丙酸酯、二-β-D-半乳糖苷荧光素、3-O-甲基荧光素磷酸酯、2′，7′-双(羧乙基)-5(6)-羧基-荧光素(BCECF/AM)的五乙酰氧基酯、2′，7′-双(羧乙基)-5(6)-荧光素(BCECF/AM)的五乙酰氧基酯、叠氮荧光素二乙酸酯、氯甲基荧光素二乙酸酯、四溴荧光素二乙酸酯、羧基四溴荧光素二乙酸酯、4-甲基伞形酮乙酸酯、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮壬酸酯、4-甲基伞形酮磷酸酯、甲基-1-伞形酮葡萄糖醛酸苷、丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酰-L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、1，4-二乙酰氧基-2，3-二氰苯(ABD)、氢化乙啡啶、乙酸试卤灵。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于所述荧光化合物是CFDA或FDA或它们的衍生物。
17.权利要求1至16任一项所述的透化组合物在细胞计数和/或鉴定方法中的应用。
18.权利要求1至16任一项所述的组合物在活细胞的荧光检测中的应用。
19.权利要求1至16任一项所述的透化组合物在革兰氏阳性微生物或革兰氏阴性微生物计数和/或鉴定方法中的应用。
20.计数和/或鉴定膜上活细胞的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：
a)将一个或多个活细胞沉积在膜上；
b)使沉积在膜上的细胞与权利要求1到9任一项所述的透化组合物接触；
c)使被透化细胞同时或先后与可透过微生物的壁的一种或多种荧光标记物接触；
d)通过荧光检测渗透进入所述微生物的所述标记物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于在步骤a)中通过以所述膜过滤最初含有细胞的液体或气体介质，将细胞沉积在所述膜上。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于在步骤a)和步骤b)之间在膜上培养微生物，使得步骤a)沉积的细胞以细胞微集落的形式出现在步骤b)。
23.如权利要求20至22任一项所述的方法，其特征在于步骤c)使用的所述荧光标记物是荧光探针。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于所述荧光探针是杂交探针，优选为寡核苷酸型或PNA型的杂交探针。
25.如权利要求20至23任一项所述的方法，其特征在于步骤c)使用的所述荧光标记物是荧光化合物。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于步骤b)使用的所述荧光化合物选自：FDA、6-CFDA、5-CFDA、5-马来酰亚胺FDA、荧光素二月桂酯、荧光素二丁酸酯，5(6)2′，7′-二氯-CFDA、5(6)-磺基-FDA、5(6)2′，7′-二氯-FDA、5，6-CFDA-N-羟基丁二酰亚胺酯、荧光素二丙酸酯、二-β-D-半乳糖苷荧光素、3-O-甲基荧光素磷酸酯、2′，7′-双(羧乙基)-5(6)-羧基-荧光素(BCECF/AM)的五乙酰氧基酯、2′，7′-双(羧乙基)-5(6)-荧光素(BCECF/AM)的五乙酰氧基酯、叠氮荧光素二乙酸酯、氯甲基荧光素二乙酸酯、四溴荧光素二乙酸酯、羧基四溴荧光素二乙酸酯、1-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷、4-甲基伞形酮乙酸酯、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮壬酸酯、4-甲基伞形酮磷酸酯、丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酰-L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、1，4-二乙酰氧基-2，3-二氰苯(ABD)、氢化乙啡啶、乙酸试卤灵。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于所述荧光化合物是CFDA或FDA或它们的衍生物。
28.如权利要求20至27任一项所述的方法，其特征在于借助于荧光传感器进行步骤d)的检测。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于直接在膜上检测细胞，所述细胞是活细胞。
30.如权利要求20至29任一项所述的方法，其特征在于其上沉积有细胞的所述膜主要由纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚醚砜组成。
31.如权利要求20至30任一项所述的方法，其特征在于其上沉积有细胞的所述膜的平均孔径位于0.1到1.5微米之间，优选位于0.2到0.6微米之间。
32.如权利要求20至31任一项所述的方法，其特征在于在检测步骤d)结束时培养受测细胞。
33.用于检测和/或计数细胞的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含：
a)至少一种荧光标记物；以及
b)一种权利要求1至11任一项所述的用于透化细胞壁的组合物。
34.用于检测和/或计数细胞的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含：
a)滤膜；以及
b)一种权利要求1至16任一项所述的用于透化细胞壁的组合物。
35.如权利要求33或34所述的试剂盒，其特征在于所述滤膜是主要由纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚醚砜组成的膜。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Massachusetts, USA Applicant after: Millipore Corp. Address before: Massachusetts, USA Applicant before: Millipore Corp. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: MILLIPORE CORP. TO: EMD MILLIPORE CORPORATION |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |