CN102725418B - 联用荧光底物和pH-敏感性荧光团用于荧光法检测微生物的生长培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及联用荧光底物和pH?敏感性荧光团(特别是4?甲基伞形酮(4?MU)和荧光素衍生物的组合)的生长培养基。该生长培养基用于通过结合有关pH?敏感性荧光团的荧光检测和有关受微生物激活的荧光底物的荧光检测进行微生物的荧光检测。
Description
技术领域
本发明涉及用于测试特别是在药学产品和装置的制造中所使用的含水的或气态流体的无菌度的方法和装置。
具体地,本发明涉及包含荧光底物和pH-敏感性荧光团(特别是4-甲基伞形酮(4-MU)和荧光素衍生物的组合)的生长培养基,其用于通过荧光,特别通过结合有关pH-敏感性荧光团的荧光检测和有关荧光底物受微生物激活的荧光检测,进行检测微生物。
背景技术
医药业是无菌度限制非常高的那些领域之一,迫使持续监测产品质量和这些产品相关的所有活动。
对于微生物污染,按照药典中规定的法规和标准利用微生物学方法进行测试。
欧洲或美国药典定义了药物制剂的几种微生物学质量水平。
要求无菌的产品如胃肠外制剂(可注射产品、灌注用制剂等)和眼部产品的特点在于总体上没有能够自身繁殖或在宿主体内繁殖的微生物。
不要求无菌的产品可包含一定量的微生物,只要所含的微生物污染低于药典标准所限定的特定限值。这些微生物的存在并不代表对病患的任何危险,由于其涉及例如口服或直肠给药的药物。微生物菌落和胃部的酸性pH阻止微生物的生长,只要其数量不超过所述药典建议的标准。在药典中限定了各类非无菌性产品,按照它们的最终目的,在微生物学测试上各具有它们自身的要求。
此外,待测试的产品处于各种固体或液体形式,并且还处于各种体积和包装。就此而言,在可过滤性产品和不可过滤性产品之间可产生区别,可过滤性产品的微生物学测试可通过膜过滤进行,对于不可过滤性产品,药典推荐将测试对象直接接种入生长培养基的技术。
可通过生长培养基的直接接种进行测试的制剂一般是固体,但还可以是具有稠度的流体,例如,油状液剂,向其加入添加有10g/l聚山梨醇酯80的培养基;以及油膏剂和霜剂,向其加入合适的稀释剂或乳化剂。通常对象体积不大于生长培养基体积的10%。
根据法定要求,可进行各种类型的微生物学质量测试,从严格的无菌度测试至主要的需氧型和厌氧型微生物的特异性计数,还包括特定微生物的针对性检测。
通常,当希望相当准确地了解所遇到的微生物类型时,微生物学家优选在琼脂生长培养基上培养,由此可视觉观察在琼脂之中或之上形成微菌落的微生物的存在。如需要,该方法允许对形成这些菌落的微生物取样,并进行其他分析以进行验证。由此,当微生物性质不同时,能够在一定程度上确定遇到的各种类型微生物的相对比例。
尽管如此,在琼脂生长培养基上培养需要时间和人力。由此,为使微生物生长受氯处理抑制,在生长培养基,例如R2A培养基上缓慢生长的微生物,例如Methylobactersp.的分裂时间可能为48-72h[(GallegoV.,GarciaM.T.和VentosaA.(2006),Methylobacteriumadhaesivumsp.nov.,amethylotrophicbacteriumisolatedfromdrinkingwater.Int.J.Syst.EvolMicrobiol56,339-342)]。此外,研究表明,为了真实验证样品中不存在微生物,需要最短14天的孵育时间[Bathgate,H.等人.(1993)JournalofParenteralScienceandTechnology47(5):254-257]。
在工业生产链中进行检验测试的情境中,该时间段过长而难以快速地处理污染。这是因为如果在产品生产之后数日确定污染,则召回该产品进行检验可能造成高额经济损失。问题之一还可能是公众卫生健康,涉及在处理后快速分配的饮用水质量的测试。
在液体培养基中的培养物(就它们而言)能够在一定程度上减少培养微生物的人力和时间。但是,与滤膜和/或琼脂培养皿操作相关的假阳性的风险也更高。
在液体或气体样品过滤后进行无菌度测试的透明无菌制备单元已存在多年,例如本申请人(SteritestEZ,MilliporeCorporation,Billerica,MA01821,USA)研发的那些。其原理是在膜表面上保留被过滤样品中所含的可能污染物,然后一旦已进行样品过滤,在充有无菌生长培养基的过滤单元内孵育滤膜。
在存在一种或多种污染物的情况中,透明的培养基由于细胞生长而变得混浊。由此可视觉确定过滤单元中微生物的存在。
在液体培养基中检测与在琼脂生长培养基上检测相比通常需要略微更长的时间,因为在生长培养基中细胞浓度需要达到足以使生长培养基变混浊。但是,液体培养基中的培养物通常更有利于需氧型或厌氧型微生物的生长。
另一方面,在液体培养基中测试存在一定的限制,特别是不能估计初始存在于待测样品中的污染物的数量、性质和比例。
就此而言,在液体生长培养基中进行的测试仅可提供警告信息,但不提供关于所含微生物的性质的信息。
出于这些不同原因,希望能够具有可采用的在液体介质中进行的测试,其更快速,并能够给出关于所鉴别的微生物性质的第一手信息。
至少,在早期得到的关于所遇到的微生物类型的信息(一种或多种物种、需氧型或厌氧型、慢速生长或快速生长、革兰氏阳性或革兰氏阴性等)是有利的,使得技术人员可了解污染的程度,并确定其来源。
为了更快速地检测污染物,一些方法利用加入生长培养基中的荧光底物。
荧光底物是复合分子,其在接触微生物合成的酶时断裂,并显现荧光。在细胞密度足以使生长培养基混浊之前,利用在UV或可见光谱的辐射,通过照射生长培养基,利用分光光度计可容易地检测发出的荧光。因此它们可更快速检测污染物。
存在数种荧光底物类型。
但是,这些底物类型存在它们特有的缺点,并且限制它们在无菌度测试的情境中的使用。
荧光素衍生物(CFA、CFDA)是例如被宽范围的微生物激活的荧光底物;CFDA由此通常被认为是用于原核或真核细胞的成活力标记物。这些底物对存在于大多数微生物中的酶的酯酶活性敏感。但是,该酯酶活性在由药典规定的许多生长培养基中以残余性地表达,特别是在包含酵母提取物或蛋白提取物的那些中。因此,这些底物常进行不可忽略的非生物性水解[Clarke,J.M.等人,2001,Journalofmicrobiologicalmethods,46:261-267],故此并不是非常适用于液体培养基中的检测测试。此外,由这些底物发出的荧光强度对生长培养基的特定物理参数,特别是pH敏感,其可对检测的可靠性产生影响。
甲基伞形酮衍生物(甲基伞形酮基(methylumbelliferyl)),除了一些它们的乙酸酯或丁酸酯衍生物之外,较之荧光素衍生物,对非生物性水解的敏感性低得多,但具有窄得多的范围(spectrum)。但是,对于适合于一定数量的常见菌株的特异性检测的不同底物有相对宽的选择[Manafi,M.,Kneifel,W.和Bascomb,S.(1991)Fluorogenicandchromogenicsubstratesusedinbacterialdiagnostics.MicrobiolMolBiolRev.55(3):335-348]。
但是,这些不同的甲基伞形酮基底物的荧光发射光谱易于相互重叠,限制了它们一起用于鉴别相同生长培养基中同时存在的不同类型微生物。
由Biosynth公司最近研发的另一类荧光底物是AldolsTM。
这些底物具有与甲基伞形酮衍生物相似的性质。
具体地,aldols具有与甲基伞形酮化合物非常接近的荧光发射光谱。由此,它们不能区别相同生长培养基中存在的微生物,也不能确定其相对比例。
为了改善液体培养基中进行的无菌度测试的特异性和速度,本发明人想到利用上述各类底物的特异性,并将它们组合,从而快速实施无菌度测试并且可获得关于所检测的微生物类型的信息。
为此,本发明人选择并同时使用在常规生长培养基中稳定的Aldol或甲基伞形酮基荧光底物,并将它们与相反地对生长培养基的pH变化敏感的底物如荧光素衍生物或HPTS组合。
出人意料地是,本发明发现,一方面通过荧光底物(甲基伞形酮基或Aldol衍生物),并且另一方面通过pH-敏感性荧光团(荧光素或HPTS),测定发出的荧光,可检测早期的污染物,并在一定程度下评价污染所涉及的微生物类型。
因此,在一般原理下,本发明包括同时使用pH-敏感性和非pH-敏感性荧光团以达到微生物的早期通用性检测,分别针对pH-敏感性荧光团和受活细胞激活的荧光团得到的荧光测量的结合,使得可以获得遇到的微生物的识别特征。
附图说明
图1:本发明初步试验结果。各图表示有关各种pH-敏感性荧光团的荧光测量结果,该测试在使用不同浓度的各分子培养大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)24小时的过程中进行。1A:HPTS。1B:萘并荧光素。1C:荧光素。1D:羧基萘并荧光素。
图2:本发明的初步实验结果。该图给出在24小时的培养中,在不同微生物存在下,由HPTS发出的荧光。
图3:汇总本发明进行的各培养测试的表格以得到图4-7中的图表中显示的实验数据。
图4-7:图4-7的图表示对应于所用的荧光化合物的不同组合随着时间的荧光测量结果,分别是:
4-4MU-HPTS组合;
5-4MI-CF组合;
6-Aldol-HPTS组合;
7-Aldol-CF组合。
在这些图表中给出的测试为:
Lm1相当于由Aldol发出的荧光
Lm2相当于由HPTS发出的荧光
Lm3相当于由4-MU发出的荧光
Lm4相当于由羧基荧光素(CF)发出的荧光。
各图A-F相当于以下所述的微生物的培养:
A-大肠杆菌
B-铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)
C-枯草芽胞杆菌(B.subtilis)
D-金黄色葡萄球菌
E-巴西放线菌(A.brasiliensis)
F-白色念珠菌
图G相当于对照测试(包含上述组合的未受污染的生长培养基)。
图4:对比在甲基伞形酮基衍生物(4-MU磷酸酯、4-MUβ-吡喃葡糖苷、4-MUα-吡喃葡糖苷、4-MUβ-吡喃半乳糖苷)和8-羟基芘-1,3,6-三磺酸的混合物存在下各种微生物的生长。
(4-MU-HPTS组合)。
图5:在甲基伞形酮衍生物(4-MU磷酸酯、4-MUβ-吡喃葡糖苷、4-MUα-吡喃葡糖苷、4-MUβ-吡喃半乳糖苷)和5,6-羧基荧光素的混合物的存在下的各种微生物的生长对比。
(4MU–CF组合)
图6:在Aldol衍生物(Aldol470磷酸酯、Aldol470乙酸酯、Aldol455β-吡喃葡糖苷、Aldol455β-吡喃半乳糖苷)和8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)的混合物存在下的各种微生物的生长对比。
(Aldol-HPTS组合)
图7:在Aldol衍生物(Aldol470磷酸酯、Aldol470乙酸酯、Aldol455β-吡喃葡糖苷、Aldol455β-吡喃半乳糖苷)和5,6-羧基荧光素的混合物存在下的各种微生物的生长对比。
(Aldol-CF组合)
发明内容
由此本发明包括用于检测微生物的方法,其特别用于在液体生长培养基中进行无菌度测试,其特征在于它包括在合适的培养基中培养要确定它是否被活微生物污染的样品。
该方法适用于任何形式的可过滤或不可过滤的样品,具体地通过将所述样品直接接种于上述的无菌生长培养基中。
就此而言,可使用膜来过滤液体样品如水、或气体如空气。然后将该膜接种于液体生长培养基中,如同形成固体样品。
根据本发明,所述检测方法包括以下步骤中的一步或多步:
(i)在允许待测微生物生长的条件下将如上定义的样品放置在生长培养基中,所述生长培养基包含:
-至少一种荧光底物或荧光底物的组合,其可被微生物的至少一种酶激活,和
-至少一种荧光团,其荧光指示所述生长培养基的pH;
(ii)根据荧光分析所述生长培养基,以测定与所述生长培养基中所含的荧光底物被所述微生物激活相关的荧光,并且测定由其荧光指示生长培养基的pH的荧光团所发出的荧光;
(iii)分析由其荧光指示pH的荧光团的荧光测量结果以及荧光底物的荧光测量结果,以确定在所述生长培养基中待测的微生物类型存在或不存在。
术语“荧光底物”是指包含能够吸收光能并以荧光发射光谱的形式释放全部或部分的该能量的荧光基团的分子,其还包含掩蔽所述荧光基团的荧光的“淬灭剂”基团。
在与微生物的特定酶接触时,所述荧光底物采用不同形式,其能使荧光团发出荧光。该激活导致形成底物的分子的构象改变,或者导致形成荧光残基的所述分子分解。
根据本发明可想到各种荧光底物。本发明优选的荧光底物在酶促激活之后产生4-甲基伞形酮化合物,对于约360±10nm的激发波长,其荧光发射在约460±10nm。本发明优选的该类荧光底物是例如甲基伞形酮(4-MU)衍生物,特别是选自以下的一种或多种底物:
4-甲基伞形酮基乙酸酯(CAS:2747-05-9)
4-甲基伞形酮基辛酸酯(CAS:2067-66-3)
4-甲基伞形酮基α-D-吡喃葡糖苷(CAS:17833-43-1)
4-甲基伞形酮基β-D-吡喃葡糖苷(CAS:18997-57-4)
4-甲基伞形酮基α-D-吡喃半乳糖苷(CAS:38597-12-5)
4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷(CAS:6160-78-7)
4-甲基伞形酮基磷酸酯(CAS:3368-04-5)
由于这些底物对微生物类型是相对特异的,即仅被并非存在于所有微生物的某些酶激活,所以根据本发明有利地选择其中的数种以拓宽检测范围。
更具体地,本发明人已确定选自以上化合物的4种甲基伞形酮基衍生物的组合是有利的,特别是包括4-MU磷酸酯、4-MUα-D-吡喃葡糖苷(或α-D-葡糖苷)、4-MUβ-D-吡喃葡糖苷(或β-D-葡糖苷)和4-MUβ-D-吡喃半乳糖苷(或β-D-半乳糖苷)的组合。该组合可检测大多数常测的微生物,特别是以下:革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性细菌枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌、以及真菌白色念珠菌和巴西放线菌。
但是,本发明不仅限于这些物种,术语“微生物”应理解为表示任何能够自发繁殖的活细胞。术语“细胞”是指被膜限定的细胞质,其包含基因。
以名称AldolTM(BiosynthAG,Rietlisstrasse4,9422Staad,Switzerland)销售的化合物是本发明优选的底物,以与前述相同的方式,特别是化合物Aldol470(1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)和Aldol455(1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基)及它们的衍生物,特别是所述化合物的乙酸酯、磷酸酯、β-半乳糖苷和β-葡糖苷衍生物。这些化合物在以第09159639号提交的欧洲专利申请中有述。这些化合物的优点是,正如它们在厌氧条件下一样,在需氧条件下可激活,而对微生物不产生任何毒性。
出于本发明的目的,“荧光指示所述生长培养基的pH的荧光团”表示荧光发射强度根据生长培养基中的pH改变而变化,或者对于不变的激发波长,发射波长根据此相同的pH改变而变化的分子,所述分子在培养基中的浓度基本保持不变。优选地,在3-10,优选5-9,更优选6-8的pH范围中观察到所述荧光变化。对于例如某些花菁衍生物已描述了解释这些荧光变化作为pH的函数的分子机理[BriggsM.S.等人(2000)Chem.Commun.2323-2324]。
术语“荧光变化”是指,对于1个pH单位的变化,至少10%、优选至少20%、更优选至少30%的RFU(相对荧光单位)的变化。
本发明优选的荧光指示所述生长培养基的pH的荧光团选自:8-羟基芘-1,3,6-三磺酸或其盐、花菁化合物或其衍生物,特别是五甲炔(pentamethine)花菁或包含荧光素或其衍生物、盐或酯的化合物。
在包含荧光素的化合物中,优选羧基荧光素,特别是5(6)-羧基荧光素(CAS72088-94-9)。
本发明的优选荧光团还有8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(HPTS)(CAS27928-00-3)。
根据本发明优选CF和4-MU的组合。特别地,对这些化合物的荧光发射光谱中之一或另一个相关地进行荧光检测的结合,允许早期且特异性地检测微生物。
优选地,根据本发明,4-MU化合物不用作指示pH的荧光分子,因为它们一般是不可靠的pH指示剂。
如本申请中随后给出的试验例所示,对于各微生物类型,与一种或另一种荧光化合物相关的各自的荧光经时变化是不同的,这构成它们中每一个的独特识别特征,由此可在检测微生物方法的早期进行检测。
根据本发明,还发现一种或多种Aldol化合物和羧基荧光素、或HPTS和一种或多种甲基伞形酮基衍生物的组合与检测并得到微生物特异性特征相关。所得曲线(profile)可至少部分地由各种微生物之间的代谢差异(对培养基pH、生长速率、荧光底物激活强度等的影响)进行解释。
在其基本方面之一中,本发明涉及将在相同生长培养基中分别源自荧光底物和pH-敏感性荧光团的激活的荧光测量结合(coupling),其目的为鉴别该生长培养基中存在的微生物类型。术语“结合”是指确定归因于荧光底物的激活的荧光测量与归因于生长培养基pH的改变的另一荧光测量之间的关系。优选地,通过计算或以图示的形式,根据时间变量(t)建立该关系。根据本发明的一个优选方面,对pH、时间和微生物酶活性的变量进行积分,这些数据的结合能够得到对不同类型微生物特有的生长培养基变化的描述。
由此,本发明的用于检测微生物的方法可包括,在上述的步骤ii)中,以规则的间隔检测荧光以得到荧光随着时间的变化。优选地,每30秒,更优选每分钟,甚至更优选每2分钟检测荧光。相似地,在步骤iii)中,可将荧光测量结果与数据库中标注的标准测试结果比对,从而能够更清楚地区别不同类型的微生物。
在一个方面,本发明涉及用于更具体地实施本发明的方法的生长培养基,其由液体或固体营养载体形成,其中均匀溶解有分别如上定义的至少一种荧光底物或这些底物的组合、以及至少一种其荧光指示所述生长培养基的pH的荧光团。
营养载体是最常见的、已描述的常规培养基,其不含荧光剂。
此外,所述营养载体特有的荧光优选地对所述生长培养基的pH变化不敏感,并且对向所述生长培养基加入所述微生物也不敏感。也就是说,应优选注意,生长培养基本身不发生能够干扰由荧光团发出荧光的荧光变化。
培养微生物的条件与文献中,特别是在药典中对于常规培养基所述的那些基本相同。
尽管初始设计是针对在液体培养基中培养,但并不妨碍使用本领域技术人员已知的合适的测量荧光的装置(例如扫描细胞计数器)使用琼脂生长培养基实施本发明。
本发明的生长培养基优选包含上述化合物或化合物的组合作为荧光底物和荧光团。
根据本发明的一个优选方面,用于检测微生物的方法可包括步骤i),其中在置于生长培养基中之前将所述微生物预先过滤在膜上。
本发明还涉及用于检测微生物的试剂盒,其特征在于它包括本发明的生长培养基,可选地以用于混合的独立包装的形式:
-常规的微生物用生长培养基;
-可溶于所述生长培养基的至少一种荧光底物或荧光底物的组合;和
-可溶于所述生长培养基的至少一种荧光团,其荧光指示所述生长培养基的pH。
出于储存或方便的需要,所述生长培养基可以以脱水形式包装。
该检测试剂盒还可包括用于实施过滤步骤之后的无菌度测试的膜。该滤膜可以是单层或多层的。通常由选自以下的一种或多种材料构成:聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、聚醚砜、乙酰纤维素和硝基纤维素。该类膜的一个实例是由本申请人以编号HAWGMilliflex,Millipore销售的膜。
本发明的试剂盒还可包括过滤单元、瓶或袋,其优选是无菌的,用于容纳进行无菌度测试的生长培养基。
以下实施例旨在补充本发明的描述,但绝非对其进行任何限制。
实施例
1生长培养基的制备
按照生产商的建议制备100mL的液体TSB(Biomerieux)培养基,并对其灭菌。然后,按照下述的各组合,在无菌条件下向TSB培养基加入以下pH-敏感性荧光团和荧光底物的溶液。
pH-敏感性荧光团:
HTPS:
-30μL的10mM的8-羟基芘1,3,6-三磺酸的储备液,或
CF:
-20μL的100μM的5,6-羧基荧光素的无菌储备液;
荧光底物:
Aldols:
-200μL的Aldol衍生物(Aldol470磷酸酯、Aldol470酸酯、aldol455β-D-吡喃葡糖苷、aldol455β-D-吡喃半乳糖苷)的无菌混合物,其中各衍生物的储备浓度为25mg/mL;或
4-MU:
-200μL的4-甲基伞形酮基衍生物(4-MU磷酸酯、4-MUβ-D-吡喃葡糖苷、4-MUα-D-吡喃葡糖苷、4-MUβ-D-吡喃半乳糖苷)(4-MU)的无菌混合物,其中各衍生物的储备浓度为50mg/mL。
预先使用配有0.22μm孔的滤膜的Stericup过滤单元对荧光团溶液和荧光底物灭菌,而后加入以制备待测生长培养基。
所用产品的编号(目录号#):
TSB:Biomerieux#41146
HPTS:Fluka#56360
5,6-羧基荧光素:Sigma#21877
Aldol470磷酸酯:Biosynth#A-4678
Aldol470乙酸酯:Biosynth#A-4680
Aldol455β-D-吡喃葡糖苷:Biosynth#A-4689
Aldol455β-D-吡喃半乳糖苷:Biosynth#A-4684
4-MU磷酸酯:Glycosynth#44093
4-MUβ-D-吡喃葡糖苷:Glycosynth#44059
4-MUα-D-吡喃葡糖苷:Glycosynth#44051
4-MUβ-D-吡喃半乳糖苷:Glycosynth#44045
2微生物悬浮液的制备
使用以下微生物进行测试:
A大肠杆菌ATCC8739
B铜绿假单胞菌ATCC9027
C枯草芽胞杆菌ATCC6633
D金黄色葡萄球菌ATCC6538
E西放线菌ATCC16404
F白色念珠菌DSMZ1386
稀释各微生物菌株以得到103-104个细胞/mL(对于巴西放线菌为102个细胞/mL)的初始浓度。
3在96孔板上制备培养物
将编号655090的96孔GreinerBio-OneμClearPlate用于测试。
将各菌株的接种物加入各生长培养基系列的第一列中,然后以1/10°成系列地稀释。
图3汇总了使用下述生长培养基进行的不同生长培养基的测试。
对于4MU-HPTS组合:
-TSB
-甲基伞形酮基衍生物(4-MU磷酸酯、4-MUβ-吡喃葡糖苷、4-MUα-吡喃葡糖苷、4-MUβ-吡喃半乳糖苷)的混合物和
-8-羟基芘-1,3,6-三磺酸。
对于4MU-CF组合:
-TSB
-甲基伞形酮基衍生物(4-MU磷酸酯、4-MUβ-吡喃葡糖苷、4-MUα-吡喃葡糖苷、4-MUβ-吡喃半乳糖苷)的混合物和
-5,6-羧基荧光素(CF.)。
对于Aldol-HPTS组合:
-TSB
-Aldol衍生物(Aldol470磷酸酯、Aldol470乙酸酯、aldol455β-吡喃葡糖苷、aldol455β-吡喃半乳糖苷)的混合物和
-8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)。
对于Aldol-CF组合:
-TSB
-Aldol衍生物(Aldol470磷酸酯、Aldol470乙酸酯、aldol455β-吡喃葡糖苷、aldol455β-吡喃半乳糖苷)的混合物和
-5,6-羧基荧光素(CF)。
使用3种不同稀释液对各微生物测试上述每种生长培养基。
将商标Gemini的96孔板读板仪(platereader)编程从而在72h中每30分钟进行一次采样,即145个测量点。
从孔底部,通过光学读板仪进行荧光值的采集。
对各孔进行10次测量,并记录平均值。
对于各孔,进行4类测量:
1-Lm1:Exc:355nmEm:555nm截止:530nm
2-Lm2:Exc:403nmEm:451nm截止:435nm
3-Lm3:Exc:360nmEm:455nm截止:435nm
4-Lm4:Exc:485nmEm:525nm截止:595nm
Lm1通道上的采集能够测量aldols的荧光。
Lm2通道上的采集能够测量HPTS的荧光。
Lm3通道上的采集能够测量4-MU的荧光。
Lm4通道上的采集能够测量CF的荧光。
使用softmaxPro软件制作采集动力学图。
4所得结果的分析
在图4-7中以图表的形式显示荧光检测的结果。
图4A-4G涉及4-MU+HPTS组合。
图5A-5G涉及4-MU+CF组合。
图6A-6G涉及Aldol+HPTS组合。
图7A-7G涉及Aldol+CF组合。
标为G的图对应于未受污染的阴性对照。
在所有情况中,在能够测量pH(HPTS或CF)下降、以及能够测量代谢活性(4-MU或Aldol)的通道上得到微生物的特征曲线。特别地,在铜绿假单胞菌的情况中得到非常非典型的曲线,与HPTS的使用相关的信号增大,而pH降低(图4B和6B)。
对于金黄色葡萄球菌,以相似的方式,与4-MU的使用相关的信号形成峰,然后基本上呈线性增大(图4D和5D)。
对于羧基荧光素(CF)的使用,可注意到根据菌株而变化的pH下降的曲线(图5和7)。
Claims (20)
1.用于检测微生物存在的生长培养基,所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)和巴西放线菌(A.brasiliensis),其特征在于它由液体营养载体形成,所述液体营养载体中均匀溶解有:
-荧光底物的混合物,其可被所述微生物的至少一种酶激活,
其中所述荧光底物的混合物为以下化合物的混合物:
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃葡糖苷,
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃半乳糖苷,
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)乙酸酯,和
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)磷酸酯;以及
-至少一种荧光团,其荧光指示所述生长培养基的pH,
其中所述至少一种荧光团选自8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)、花菁化合物或其衍生物之一、或荧光素化合物或其衍生物之一;
所述载体本身的荧光对所述生长培养基的pH变化不敏感,并对向所述生长培养基添加所述微生物不敏感。
2.根据权利要求1的生长培养基,其特征在于所述荧光素化合物的衍生物为盐或酯。
3.根据权利要求1的生长培养基,其特征在于其荧光根据所述生长培养基的pH变化的所述荧光团是羧基荧光素或其盐或酯之一。
4.检测微生物的非诊断方法,其特征在于它包括在根据权利要求1-3中任一项所述的生长培养基中培养要确定它是否被活微生物污染的样品,所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)和巴西放线菌(A.brasiliensis)。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述样品是预先用于过滤一定体积的水或气体的过滤器或膜。
6.检测一种或多种微生物的非诊断方法,所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)和巴西放线菌(A.brasiliensis),其特征在于它包括以下步骤:
(i)在允许待测微生物生长的条件下将样品放置在生长培养基中,所述生长培养基包含:
-荧光底物的混合物,其可被所述微生物的至少一种酶激活,
其中所述荧光底物的混合物为以下化合物的混合物:
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃葡糖苷,
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃半乳糖苷,
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)乙酸酯,和
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)磷酸酯;以及
-至少一种荧光团,其荧光指示所述生长培养基的pH,
其中所述至少一种荧光团选自8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)、花菁化合物或其衍生物之一、或荧光素化合物或其衍生物之一;
(ii)根据荧光分析所述生长培养基,以测定与所述生长培养基中所含的荧光底物被所述微生物激活相关的荧光,并且测定由其荧光指示生长培养基的pH的荧光团所发出的荧光;
(iii)分析由其荧光指示pH的荧光团的荧光测量结果以及荧光底物的荧光测量结果,以确定在所述生长培养基中待测的微生物类型存在或不存在。
7.根据权利要求6的方法,其特征在于所述生长培养基为权利要求1-3中任一项限定的生长培养基。
8.根据权利要求6的方法,其特征在于,在步骤i)中,在置于生长培养基中之前将所述微生物预先过滤在膜上。
9.根据权利要求7的方法,其特征在于,在步骤i)中,在置于生长培养基中之前将所述微生物预先过滤在膜上。
10.根据权利要求6的方法,其特征在于,在步骤ii)中,以规则的间隔测量荧光以得到荧光随着时间的变化。
11.根据权利要求7的方法,其特征在于,在步骤ii)中,以规则的间隔测量荧光以得到荧光随着时间的变化。
12.根据权利要求8的方法,其特征在于,在步骤ii)中,以规则的间隔测量荧光以得到荧光随着时间的变化。
13.根据权利要求9的方法,其特征在于,在步骤ii)中,以规则的间隔测量荧光以得到荧光随着时间的变化。
14.根据权利要求6的方法,其特征在于,在步骤iii)中,将荧光测量结果与数据库中标注的标准测试结果比对。
15.根据权利要求7的方法,其特征在于,在步骤iii)中,将荧光测量结果与数据库中标注的标准测试结果比对。
16.根据权利要求8的方法,其特征在于,在步骤iii)中,将荧光测量结果与数据库中标注的标准测试结果比对。
17.根据权利要求9的方法,其特征在于,在步骤iii)中,将荧光测量结果与数据库中标注的标准测试结果比对。
18.用于检测微生物的试剂盒,所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)和巴西放线菌(A.brasiliensis),其特征在于它包括:
-微生物用生长培养基;
-可溶于所述生长培养基的荧光底物的混合物,
其中所述荧光底物的混合物为以下化合物的混合物:
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃葡糖苷,
-1-(2-苯甲酰基苯基)-6-氯-1H-吲哚-3-基-β-吡喃半乳糖苷,
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)乙酸酯,和
-1-[2-(2,4-二甲氧基苯甲酰基)苯基]-1H-吲哚-3-基)磷酸酯;以及
-可溶于所述生长培养基的至少一种荧光团,其荧光指示所述生长培养基的pH,
其中所述至少一种荧光团选自8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(HPTS)、花菁化合物或其衍生物之一、或荧光素化合物或其衍生物之一。
19.根据权利要求18的试剂盒,其特征在于所述荧光素化合物的衍生物为盐或酯。
20.根据权利要求18的试剂盒,其特征在于所述生长培养基以脱水形式包装。
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