CN108048307A - 一种血液感染微生物的快速检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液感染微生物的快速检测系统，其包括：培养瓶，其具有一体成型的好氧培养部和厌氧培养部，所述好氧培养部和厌氧培养部分别内置有好氧培养液和厌氧培养液；检测板，其包括载体，所述载体内部形成有可容纳第一检测膜和第二检测膜的容置空腔；其中，所述好氧培养液在泵的驱动下循环流动于好氧培养部和第一检测膜之间，所述厌氧培养液在泵的驱动下循环流动于厌氧培养部和第二检测膜之间。本发明可实现血液样本的实时扫描和自动化检测分析，通过荧光值变化判断血液中的微生物污染情况，并且血液中微生物的检测灵敏度高，检测结果的报告时间短，操作方便，成本低，适用性广。

Description

一种血液感染微生物的快速检测系统
技术领域
本发明涉及微生物检测领域。更具体地说，本发明涉及一种血液感染微生物的快速检测系统。
背景技术
血液制品是临床疾病治疗和急救的重要成分，直接关系到患者的生命安全。但是目前临床上血液制品尤其是血小板细菌污染的问题却日益严峻。研究表明，大约每3000单位的血小板制品中就有1个单位发生细菌污染，主要来源有献血者皮肤菌群，献血者存在无症状的菌血症以及在制备过程中发生污染。发生细菌污染的血小板制品如果输注到患者体内，几乎无例外都要引起轻重程度不等的输血反应，甚至是致命的菌血症、败血症和脓毒症，严重者甚至发生死亡。由于我国人口老龄化和重大疾病(如癌症，白血病，再障等)患者数量增加，血小板需求量日益攀升，目前我国每年血小板输注量达1000万人份/年，且每年以10％的速度上升，其发生细菌污染的绝对值逐年递增，因此需对血小板制品细菌污染保持高度的警惕，输注前进行必要的细菌污染检测，尽可能降低患者输血败血症及脓毒症的的发生。
目前血小板制品细菌污染的检测还主要依靠细菌培养检测系统。在血小板制品细菌检测技术的研究方面，已经研究发展了多种检测技术。主要基于细菌生长繁殖的间接指标，如pH值变化、葡萄糖浓度异常等；细菌消耗O2和释放CO2原理；抗原抗体免疫学原理；分子生物学核酸检测原理等。其中通过FDA认证并应用于血小板制品细菌污染检测的有Bact/ALERT细菌培养监测系统、PalleBDS细菌检测系统、Scansystem系统和血小板PGD检测系统。具体如下：
Bact/ALERT细菌培养监测系统的原理是持续监测培养瓶中CO2的浓度，若培养瓶中有细菌生长则CO2的浓度增加，通过仪器自动判定实验结果。检测前需将产品保存至少24h，让细菌达到一定的数量，同时培养达到阳性结果一般需要48h到72h。而且整个过程需要2个时间段，如果三天后出现阳性结果，已发出的血小板制品要被召回，但可能已被用于临床。
PalleBDS细菌检测系统是通过连续测量留样袋中的的O2消耗量来检测细菌污染情况，该系统只对需氧菌和兼性厌氧菌有效，对绝对厌氧菌无效，由于培养系统是完全封闭的，所以外在污染导致的假阳性不会出现，但由于只培养24h，所以生长缓慢的细菌不能检出。
Scansystem系统是利用单抗聚集血小板滤过后，对留在样品中的细菌DNA用通透剂和荧光标记激光扫描确定污染情况,检测阳性报告时间缩短为90min，但其灵敏度只有103CFU/ml，该系统需要有经验的微生物学家区分荧光信号，所以在常规临床输血中可行性不强。
血小板PGD检测系统原理是制备靶向编码革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)和革兰阴性菌的脂多糖(LPS)的保守基因序列的单克隆抗体,与细菌细胞壁表面大量表达的抗原反应。该系统不能用作血小板质量控制检测方法，主要用于输血前对血小板进行床旁细菌检测，是提高接受血小板输血患者安全的一项重要措施。但是由于单克隆抗体的局限性，其对革兰阴性菌的检出率较低。
综上所述，目前细菌培养检测普遍存在检测耗时时长、检出率低和灵敏度差等问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种血液感染微生物的快速检测系统，其能够根据系统中待测样本荧光值的变化实现对微生物的实时检测，检测速度快，灵敏性高，适用性广。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种血液感染微生物的快速检测系统，其包括：
培养瓶，其具有一体成型的好氧培养部和厌氧培养部，所述好氧培养部和厌氧培养部分别内置有好氧培养液和厌氧培养液，分别用于血液样本中好氧菌和厌氧菌的快速增殖，缩短报告时间；
检测板，其包括载体，所述载体内部形成有可容纳第一检测膜和第二检测膜的容置空腔，分别用于检测血液样本中的好氧菌和厌氧菌，并且检测膜设于载体内部，相对封闭的结构可以避免操作或检测过程中由于微生物污染而造成的结果不准确，以及给操作者可能带来的潜在危害。
其中，所述好氧培养液在泵的驱动下循环流动于好氧培养部和第一检测膜之间，所述厌氧培养液在泵的驱动下循环流动于厌氧培养部和第二检测膜之间。
优选的是，其中，所述载体沿两侧分别向外延伸有前端连接有针头的柔性导管，所述针头插接于所述培养瓶的盖体，培养液通过柔性导管实现在培养瓶和检测膜之间的不断循环。
优选的是，其中，所述第一检测膜和第二检测膜均为包埋有荧光底物的凝胶膜，所述荧光底物可被微生物代谢消耗发生荧光，通过光电检测装置对所述荧光信号进行实时扫描和采集分析，可判断是否有细菌污染。
优选的是，其中，所述第一检测膜和第二检测膜均包括贯通连接的革兰氏阳性菌即G+菌检测膜和革兰氏阴性菌即G-菌检测膜。
优选的是，其中，所述G+菌检测膜中还包埋有磷脂壁酸抗体，所述G-菌检测膜还包埋有脂多糖抗体，所述磷脂壁酸抗体可将G+菌富集捕获，所述脂多糖抗体可将G-菌富集捕获，从而实现微生物中G+菌和G-菌的检测。
优选的是，其中，所述凝胶膜由94％的琼脂糖、4％乙酰化二淀粉磷酸酯和2％的二溴丙酮交联而成，琼脂糖凝胶是由高分子链段相互作用而形成的网状高聚物，其具有一定的孔径和交联度。在本申请文件中，利用琼脂糖包埋可富集微生物的抗体以及可被微生物消耗的荧光底物，并借助琼脂糖内部的孔径供混合有待测血液样本的培养液通过，但由于单一琼脂糖形成的交联网络机械性能较差，在实际检测过程中有琼脂破碎现象，由此申请人采用乙酰化二淀粉磷酸酯和二溴丙酮与琼脂糖进行交联反应，可显著提高凝胶膜网络结构的稳定性和凝胶强度。
优选的是，其中，所述荧光底物为4-甲基-伞形酮衍生物，利用不同4-甲基-伞形酮衍生物荧光底物对应的酶和所检测的微生物的不同，可实现某种或某类微生物的检测。
优选的是，其中，所述4-甲基-伞形酮衍生物选自4-甲基-伞形酮-β-D-葡糖苷酸、4-甲基-伞形酮-辛酸酯、4-甲基-伞形酮-α-D-半乳糖苷、4-三氟甲基伞形酮酮-β-D-木糖苷、4-甲基-伞形酮-丁酸酯、4-甲基-伞形酮-磷酸酯、苯甲酰基-L-精氨酰-7-羟基-4-甲基-伞形酮中的一种或几种，分别用于不同微生物的检测。
优选的是，其中，所述G+菌检测膜和G-菌检测膜的直径均为0.5～1.5cm，厚度均为2～8mm。
优选的是，其中，所述培养瓶瓶体和所述载体的材质为PDMS或PMMA，既保证培养瓶瓶体和载体的坚固耐用性，又防止玻璃材质的血液培养瓶在使用过程中由于意外而导致的生化污染现象。
优选的是，其中，所述好氧培养部填充有氧气，并且好氧培养液中添加有精氨酸，以保障好氧菌快速繁殖的环境；所述厌氧培养部填充有氮气，并且厌氧培养液中添加有L-半胱氨酸，以保障厌氧菌快速繁殖的环境。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本申请系统可适配全自动血培养仪，通过荧光值变化判断血液中的微生物污染情况，可实现血液样本的实时扫描和自动化检测分析，操作方便，成本低，适用性广；
(2)本申请系统通过样本循环，微生物被检测膜不断捕获富集，可显著提高血液中微生物的检测灵敏度，灵敏度≤10CFU，并且大幅度缩短了检测结果的报告时间，可在5小时内完成检测。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的一实例中血液感染微生物的快速检测系统的结构示意图；
图2为本发明的另一实例中检测膜包埋荧光底物和抗体的结构示意图；
图3为本发明的另一实例中检测膜中的抗体捕获微生物的示意图；
图4为本发明的另一实例中检测系统在不循环状态下用于检测沙门氏菌的荧光信号图；
图5为本发明的另一实例中检测系统在循环状态下用于检测产气荚膜梭菌的荧光强度图；
图6为本发明的另一实例中检测系统在循环状态下用于检测大肠埃希菌菌的荧光信号图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
图1示出了根据本发明的一种实现形式，其中包括：
培养瓶1，其具有一体成型的好氧培养部和厌氧培养部，所述好氧培养部和厌氧培养部分别内置有好氧培养液和厌氧培养液；
检测板2，其包括载体，所述载体内部形成有可容纳第一检测膜和第二检测膜的容置空腔，并且该技术方案包括多种实现形式，比如载体包括可拆卸的上下盖体或载体内部刻蚀有一体成型的容置空腔等等；
其中，所述好氧培养液在泵(未示出)的驱动下循环流动于好氧培养部和第一检测膜之间，所述厌氧培养液在泵(未示出)的驱动下循环流动于厌氧培养部和第二检测膜之间。并且，该技术方案包括多种实现形式，好氧培养液和厌氧培养液可以分别由不同的蠕动泵以相同或不同的速度驱动循环，也可以以相同的速度由同一台蠕动泵驱动循环。
在这种技术方案中，将相同的血液样本分别接种至好氧培养液和厌氧培养液中进行培养，血液样本中的好氧菌和厌氧菌分别得到快速繁殖，并在泵的驱使下循环至检测膜位置处经试剂纸法(活性指示剂指示与标准纸色板进行比较)、膜过滤法(吖啶橙染色)、生理指标法(酸碱度、含糖量等)、荧光信号(微生物酶代谢荧光底物)等方法进行检测。
在另一实例中，所述载体沿两侧分别向外延伸有前端连接有针头的柔性导管，所述针头(未示出)插接于所述培养瓶盖，所述厌氧培养液在所述循环泵的驱动下循环流动于厌氧培养部和第二检测膜之间。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求的实施培养瓶与检测膜之间循环连通的不同态样。
在另一实例中，参照图2，所述第一检测膜和第二检测膜均为包埋有荧光底物3的凝胶膜，凝胶材质有空隙，可使样本流过，所述荧光底物可被样本中的微生物代谢产生荧光，进而被专门的仪器所检测到。
在另一实例中，参照图1，所述第一检测膜和第二检测膜均包括贯通连接的G+菌检测膜和G-菌检测膜。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求的实施检测膜的不同态样。
在上述实例中，参照图2和图3，检测膜中还包埋有抗体4，用于捕获微生物，随着含有样本的培养液的不断循环，微生物5被检测膜中的抗体不断捕获富集，可显著增加单位面积内细菌密度，进而检测灵敏度。其中所述G+菌检测膜中包埋有磷脂壁酸抗体，G-菌检测膜还包埋有脂多糖抗体，进一步分别检测微生物的G+和G-菌。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求在检测膜中包埋不同的抗体。
在另一实例中，所述凝胶膜由94％的琼脂糖、4％乙酰化二淀粉磷酸酯和2％的二溴丙酮交联而成，通过乙酰化二淀粉磷酸酯和二溴丙酮与琼脂糖进行交联反应，显著提高凝胶膜网络结构的稳定性和凝胶强度。
在另一实例中，所述荧光底物为4-甲基-伞形酮衍生物，利用不同4-甲基-伞形酮衍生物荧光底物对应的酶和所检测的微生物的不同，可实现某种或某类微生物的检测。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求在检测膜中包埋不同的荧光底物。
在另一实例中，所述4-甲基-伞形酮衍生物选自4-甲基-伞形酮-β-D-葡糖苷酸(主要用于检测大肠埃希菌)、4-甲基-伞形酮-辛酸酯(主要用于检测沙门氏菌)、4-甲基-伞形酮-α-D-半乳糖苷(主要用于检测链球菌和肠球菌)、4-三氟甲基伞形酮酮-β-D-木糖苷(主要用于检测克雷伯式肠杆菌)、4-甲基-伞形酮-丁酸酯(主要用于检测布兰汉氏球菌)、4-甲基-伞形酮-磷酸酯(主要用于检测产气荚膜梭菌)、苯甲酰基-L-精氨酰-7-羟基-4-甲基-伞形酮(主要用于检测副溶血弧菌)中的一种或几种。
在另一实例中，所述G+菌检测膜和G-菌检测膜的直径均为0.5～1.5cm，厚度均为2～8mm，以保证检测体系的稳定性。
在另一实例中，所述培养瓶瓶体和所述载体的材质为PDMS或PMMA，以防止玻璃材质的血液培养瓶在使用过程中由于意外破碎而导致的生化污染现象。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求选择培养瓶瓶体和载体的材质。
在另一实例中，所述好氧培养部填充有氧气，并且好氧培养液中添加有精氨酸，以保障好氧菌快速繁殖的环境；所述厌氧培养部填充有氮气，并且厌氧培养液中添加有L-半胱氨酸，以保障厌氧菌快速繁殖的环境。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者需求提供好氧菌和厌氧菌的生长环境。
下面结合本申请文件技术方案在微生物检测中的具体应用，进一步阐述本发明：
应用例1(不循环)：
将不同浓度的沙门氏菌血液样本均匀喷涂于凝胶载体上，干燥固定后分别模拟检测膜富集微生物的状态：A：10000CFU/cm2；B：5000CFU/cm2；C：1000CFU/cm2；D：500CFU/cm2。然后将固定有沙门氏菌的凝胶载体分别浸润于4-甲基-伞形酮-辛酸酯的营养液中，保持37℃培养条件。采用365nm激发，每15min扫描一次检测孔，相应仪器采集荧光信号。
参照图4，可以看出在单位面积凝胶载体上，相对荧光信号强度与菌含量成正比，随着营养液中营养物质的消耗殆尽，相对荧光信号强度逐渐下降。
应用例2(循环)：
将产气荚膜梭菌置于厌氧培养瓶中，凝胶检测膜中固定有5mg/L的4-甲基-伞形酮-磷酸酯荧光底物，采用365nm激发，每30min扫描一次检测孔并拍照记录。
参照图5，可以看到随着样本的驱动循环，检测膜中富集的细菌逐渐增多，消耗荧光底物也逐渐增多，产生荧光信号随之越来越强。
此外，与上述应用例1相比，采用样本驱动循环的形式便于对微生物营养物质的持续供给，并且可提高对营养物质的利用效率。
应用3例(循环)：
配置如下浓度的大肠埃希菌血液样本：A：1000CFU/ml；B：100CFU/ml；C：10CFU/ml；D：1CFU/ml；E：0CFU/ml(对照)。
分别将上述含有不同浓度大肠埃希菌的血液样本作为检测对象，验证本检测系统的灵敏度，凝胶中含有荧光底物4-甲基-伞形酮-β-D-葡糖苷酸，采用365nm激发，每15min扫描一次检测孔，并计算荧光信号。
参照图6，可以看到含有1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml和1CFU/ml浓度大肠埃希菌的血液样本分别在40min、80min、120min和160min检测到信号快速上升。并且E血液样本(对照)没有检测到信号，这说明系统本身没有信号干扰。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的血液感染微生物的快速检测系统的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，本申请系统通过适配全自动血培养仪，通过荧光值变化判断血液中的微生物污染情况，并通过样本循环，微生物被检测膜不断捕获富集，可显著提高血液中微生物的检测灵敏度，并且大幅度缩短了检测结果的报告时间，可在5小时内完成检测，可实现血液样本的实时扫描和自动化检测分析，操作方便，成本低，适用性广。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，包括：
培养瓶，其具有一体成型的好氧培养部和厌氧培养部，所述好氧培养部和厌氧培养部分别内置有好氧培养液和厌氧培养液；
检测板，其包括载体，所述载体内部形成有可容纳第一检测膜和第二检测膜的容置空腔；
其中，所述好氧培养液在泵的驱动下循环流动于好氧培养部和第一检测膜之间，所述厌氧培养液在泵的驱动下循环流动于厌氧培养部和第二检测膜之间。
2.如权利要求1所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述载体沿两侧分别向外延伸有前端连接有针头的柔性导管，所述针头插接于所述培养瓶的盖体。
3.如权利要求1所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述第一检测膜和第二检测膜均为包埋有荧光底物的凝胶膜。
4.如权利要求1所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述第一检测膜和第二检测膜均包括贯通连接的G+菌检测膜和G-菌检测膜。
5.如权利要求4所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述G+菌检测膜中还包埋有磷脂壁酸抗体，所述G-菌检测膜还包埋有脂多糖抗体。
6.如权利要求3所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述凝胶膜由94％的琼脂糖、4％乙酰化二淀粉磷酸酯和2％的二溴丙酮交联而成。
7.如权利要求3所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述荧光底物为4-甲基-伞形酮衍生物。
8.如权利要求7所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述4-甲基-伞形酮衍生物选自4-甲基-伞形酮-β-D-葡糖苷酸、4-甲基-伞形酮-辛酸酯、4-甲基-伞形酮-α-D-半乳糖苷、4-三氟甲基伞形酮酮-β-D-木糖苷、4-甲基-伞形酮-丁酸酯、4-甲基-伞形酮-磷酸酯、苯甲酰基-L-精氨酰-7-羟基-4-甲基-伞形酮中的一种或几种。
9.如权利要求4述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述G+菌检测膜和G-菌检测膜的直径均为0.5～1.5cm，厚度均为2～8mm；所述培养瓶瓶体和所述载体的材质为PDMS或PMMA。
10.如权利要求1所述的血液感染微生物的快速检测系统，其特征在于，所述好氧培养部填充有氧气，并且好氧培养液中添加有精氨酸；所述厌氧培养部填充有氮气，并且厌氧培养液中添加有L-半胱氨酸。
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