CN105074418B - 用于透化固定的血细胞的组合物及其用途 - Google Patents

用于透化固定的血细胞的组合物及其用途 Download PDF

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Abstract

本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述组合物的用途，和一种处理生物样品的方法，所述方法包含固定所述样品以及随后使所述生物样品与所述细胞处理组合物接触。本发明进一步涉及一种包含所述细胞处理组合物的试剂盒。

Description

用于透化固定的血细胞的组合物及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请作为PCT国际专利申请于2013年12月23日提交申请，并主张2012年12月28日申请的61/747,044号美国专利申请为优先权，此处通过引用方式包含其全部公开内容。
技术领域
本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述细胞处理组合物的用途以及一种用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含用于后续细胞内和/或细胞外表位如磷酸表位分析的固定的白细胞。本发明进一步涉及一种含有所述细胞处理组合物的试剂盒。
背景技术
细胞(例如，血细胞)分析领域的最近的发展，已经能够提供有价值的工具用于对细胞内和细胞表面的细胞结构进行详细分析。为了检测特定的细胞结构的存在，通常使用多标记的结合剂例如对细胞外和/或细胞内确定的标记物具有特异性的单克隆抗体，对细胞进行染色，以此来区分特定的目标细胞。例如，通常通过使用特异性细胞表面标记物来区分不同亚类的白细胞，然而多种细胞内标记物，例如与细胞质或细胞核相关的结构，对于研究所研究的细胞的功能特性变得更加重要。可以通过合适的设备，优选流式细胞仪，对通过所述特异性结合剂标记的细胞进行分析，所述流式细胞仪能够检测并区分多种标记和其它的细胞特性，如粒度和尺寸。
然而，早期的流式细胞仪的应用主要涉及对细胞表面抗原的检测，其利用各自的抗体是容易实现的，对细胞内靶表位的标记构成了更大的挑战，这是因为为了使细胞膜对各自的结合剂是可渗透的，其需要对细胞进行特殊的预处理，所述结合剂对细胞内目标位置具有特异性。由于必须使细胞膜对于大分子如荧光标记的抗体是充分可渗透的，因此这种透化是关键步骤。同时，不同细胞群的细胞结构需要维持足够的保全，从而保持各自的特征性光散射性能，并且胞质蛋白不流失到细胞外而是保存在自身细胞内。在透化步骤之前或与透化步骤同时通常进行固定步骤以提供这种稳定性。当保全条件变得更严谨，即当使用更强的蛋白变性工序时，这种结构上的保全变得更加困难。
所需要的固定反应经常包含对侵蚀剂(aggressive reagent)，如甲醛的利用，其可以破坏或至少降低通过各自的结合剂区分细胞亚型的表面抗原的可达性(accessibility)。因此，一些早期方法包含利用各自的标记结合剂来标记细胞表面结构的初始步骤。然后，细胞被固定、透化并被对细胞内靶标具有特异性的不同的结合剂处理。接着这些被标记的细胞在，如流式细胞仪中被检测和分类。然而，在目前使用的透化工序中，所需要的成分(甲醛、乙醇和清洁剂(detergent))彼此之间、以及与后续使用的作为结合剂的抗体之间是不兼容的。因此，为了除去干扰试剂的残留物，细胞需要多个清洗步骤。然而，这种处理的严格条件可能较容易地消除一些一些较敏感的细胞表面抗原的抗原反应活性，所述细胞表面抗原经常用于识别各自的靶细胞群，如CD14。
在细胞信号传导的情况中，蛋白质经常要经受可逆的磷酸化。这种动态的磷酸化工序涉及竞争性的磷酸化和去磷酸化反应，在任何一个给定时刻磷酸化水平反映出催化这些反应的蛋白激酶和磷酸酶在此时刻的相对活性。因此，磷酸-表位的分析可以对单个细胞中的信号和代谢过程的调节给出有价值的实时的了解。因此，对于研究和诊断应用来说，对多种信号传导酶如磷酸激酶，例如丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化状态的分析变得越来越重要。例如，对这种磷酸化作用的研究的一个重要应用是对癌症和自身免疫疾病的治疗，其中，特定磷酸-表位的磷酸化或去磷酸化可以指示给患者施用的或体外实验用的磷酸激酶抑制药物的有效性。
已经公认的是磷酸-表位难以露出(或“暴露”)于各自的结合剂。在一些情况中，这些表位是线性表位，为了有效的抗体结合，所述线性表位可能需要对位于表位上的蛋白质进行变性。磷酸化的Stat-5蛋白质的磷酸-表位是特别难以暴露的磷酸-表位的一个例子。为了暴露这些表位，通常需要非常严格的变性条件。然而，一个显著的风险是在这样激烈的处理下，细胞结构及细胞内和细胞外的表位会被严重地破坏。
磷酸-表位，如p-Stat-5的常规检测方法需要使用醇类进行温育从而使这些表位暴露。然而，醇类也可能会改变细胞结构和破坏细胞表面标记物。另外，醇类的使用限制了后续的分析而且至少需要一个离心步骤从处理后的细胞中分离醇。
每当包含红细胞的样品，例如外周血液样品，被用于分析时，这些红细胞的裂解是很重要的但又很麻烦的步骤。由于全血中白细胞与红细胞的比例约为1/1000，优选的是需要溶解全部的红细胞以能够区分或区别于白细胞。
因此，本发明的根本技术问题在于提供一种用于处理固定的细胞、特别是白细胞或其亚类的改善的组合物、方法和试剂盒，使得细胞内表位，例如磷酸-表位，可被各自的特异性结合剂接近的同时维持细胞外表位对于相应的结合剂的可达性。存在对一种简便、实用的用于同时对细胞外目标和细胞内难以暴露的目标，例如特定的磷酸-表位分析的方法的需求。优选地，这种方法应该是快速的、易于自动化的、非劳动密集型的、不需要醇类处理工序且允许使用结合剂混合物，包括针对细胞内和细胞外目标的结合剂的方法。
发明内容
通过此处和权利要求中表征的实施例中所述的透化固定的细胞的细胞处理组合物来实现解决上述技术问题的方案。
本发明的一个方面涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物，其包含下列物质的水溶液：
(a)至少一种阴离子表面活性剂，其以0.3％至2％(w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中，其中所述阴离子表面活性剂的盐由式(1)表示：
Y--SO3-X+ (1)
其中，Y为R--O或R中的一种，R代表具有8至18个碳原子的烷基、亚烷基、芳基、亚烷基-烷基、芳基-烷基或芳基-亚烷基的组，X代表一价阳离子，和
(b)血清白蛋白，其以0.2％至20％(w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中，其中所述细胞处理组合物的pH在约2至约6之间。
根据本发明的这一方面，较高浓度的阴离子表面活性剂与细胞保护处理相结合，即在酸性pH值下利用血清白蛋白。意外的是我们发现，在酸性pH下，血清白蛋白可与蛋白质结合，以及提供充分的保护甚至可以对抗浓度增高的阴离子表面活性剂的强变性作用。在较高pH值下，观察到血清白蛋白的这种保护作用不太明显。因此，根据本发明的实施例，利用高度严谨的变性条件去变性和暴露否则很难接近的表位，例如特定的磷酸-表位，如pStat-5、pStat-3、pStat-1、p-ERK1/2、或p-S6，同时在酸性pH下同时使用血清白蛋白可以有效地保护被分析细胞的结构完整性和亚细胞组件。
在优选的实施例中，所述细胞处理组合物包含pH在2至6之间的0.2％至20％(w/v)的血清白蛋白，其中所述细胞处理组合物的pH为2至6，可以是2.5至5.5，可以是3至5，可以是3.5至4.7，可以是4.0至4.4，通常约为4.2。
本发明所述的细胞处理组合物特别适于处理固定的血细胞。术语“固定的血细胞”包含为了稳定整体的细胞和亚细胞结构，而使用足够的固定剂，即交联剂例如甲醛、多聚甲醛、福尔马林或类似物处理的血细胞。技术人员熟悉适于此目的的固定剂。没有预先固定，在本发明的细胞处理组合物所提供的严谨的变性条件下，细胞可能会被严重地破坏。
在优选的实施例中，所述细胞处理组合物用于透化白细胞和暴露表位，特别是包含在白细胞中的磷酸-表位。在使用细胞处理组合物前，利用包含浓度为2％至6％或3％至5％，优选为约4％(w/v)的固定剂的甲醛或其它醛将来自外周血样品，例如全血样品中的白细胞固定。该固定不仅保护细胞免于降解还可以将细胞冻结在磷酸化的状态，阻断磷酸激酶和磷酸化酶的活性，这对于检测真实的激活，即被分析的磷酸-表位的磷酸化状态来说是必要的。否则在后续的细胞处理步骤中，例如使用特异性结合剂标记所述细胞内和/或细胞外结构，可能更改被分析细胞的激活方式，从而歪曲获得的结果。
本发明所述的细胞处理组合物适于与固定的血细胞一起使用，尤其是白细胞(也称为“白血细胞”)和多种白细胞的子类，包括但不限于单核白细胞、淋巴细胞、粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。可以使用已知的技术从外周血或组织中，特别是从哺乳动物，包括人类，小鼠，大鼠，山羊等中获得血细胞。本发明所述的细胞处理组合物特别适于处理源于人的外周血液样品的固定的血细胞。源于合适的组织的样品的例子是鼠的脾细胞。
术语“阴离子表面活性剂(anionic surface active agent)”也包含阴离子洗涤剂(anionic detergent)、阴离子表面活化剂(anionic surfactant)、和阴离子表面活性剂(anionic tensides)。阴离子表面活性剂包含阴离子功能基团和亲水性部分。阴离子功能基团优选为硫酸盐或磺酸盐。亲水性部分优选包含8～18个碳原子的烷基、芳基或烷基-芳基。
细胞处理组合物中包含相对较高含量的0.3％至2％(w/v)的所述阴离子表面活性剂，两者其在细胞膜的透化以及“暴露”细胞内表位中均发挥主要作用。术语“暴露表位”表示的应该是相对于“遮蔽”类型的表位，确立了或者至少提高了所述暴露的表位与相应的可检测的标记的结合剂的可接近性。换句话说，“暴露”工序允许通过，例如抗体检测细胞结构，而所述细胞结构在此工序之前不能被所述抗体识别。
这里使用的术语“透化”是指在不破坏所述细胞整体结构的情况下，使细胞膜能够透过大分子，如抗体和/或较大的荧光团，如藻红蛋白或别藻蓝蛋白或其偶联物的过程。
本申请中的术语“表位”包含任意的可被特异性结合剂，例如多克隆抗体或单克隆抗体或其免疫活性的片段，如F(ab)’2、Fab或Fab’片段识别的靶结合位点。“靶结合位点”例如可以是蛋白质的至少一部分或在细胞内或表面存在的另一种分子的至少一部分。这里使用的术语“特异性结合剂”表示能够识别并特异性结合仅仅一种或有限数量的类似表位，并且基本不识别和不结合其他表位的结合剂。
目前的临床研究集中在对细胞信号途径和它们的调控的分析上，例如对于药物施用的响应。这种信号途径包含一种或多种限定的可激活的分子，通常是可磷酸化的信号蛋白的激活，所述激活经常是特异性磷酸化。在本申请的范围内，术语“可激活的分子”描述的是通过外在的影响，例如由另一个分子引发的磷酸化反应而被激活的分子，即从非活化状态切换到活化状态的分子。因此，在一个例子中可激活的分子可能是在特定位置上可以被磷酸化或去磷酸化的胞质蛋白。对磷酸化的分子，如磷酸蛋白的检测是高度需求的，但是这种分子的特异性的磷酸化位点往往是“遮蔽”的且难以利用如对磷酸化位点具有特异性的抗体来靶向。针对该问题，现有技术中的方法没有提出满意的解决方案。特别是磷酸-蛋白的暴露和后续检测所必须的高度严谨的细胞处理条件的应用目前受限于以下事实：该(处理)条件会容易地破坏或严重地破坏细胞结构和抗原位点的完整性。因此，严谨的细胞处理条件的应用，例如使用大量的清洁剂迄今并不是合适的方案。
术语“磷酸-表位”、“磷酸化的靶标”和“磷酸化位点”在本文中可以互换使用，其表示的是细胞结构，优选细胞内蛋白的一个限定的位置，其可以以磷酸化或去磷酸化状态存在。“磷酸-表位”可视作是特异性结合剂，如单克隆抗体，的处于活化状态的特异性识别位点，所述特异性结合剂能够特异性识别磷酸化或去磷酸化的形式。通过检测“磷酸-表位”的磷酸化状态，例如通过流式细胞法可以方便地研究基于细胞信号传导的磷酸化。
根据本发明的一个实施例，细胞处理组合物包含至少一种阴离子表面活性剂的盐，所述阴离子表面活性剂选自由十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸钾、十二烷基硫酸铵和十二烷基苯磺酸钠构成的组。在优选的实施例中，包含在细胞处理组合物中的阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸，优选为SDS的形式。通常，式(1)的一价阳离子优选为选自由Li+、Na+和K+和铵构成的组中的一种或多种。
在实施例中，阴离子表面活性剂由式(1)表示，其中，R代表具有10至18个碳原子的烷基、亚烷基、芳基、亚烷基-芳基、芳基-烷基或芳基-亚烷基。R优选代表具有12至18个碳原子的烷基或芳基-烷基。
在优选实施例中，阴离子表面活性剂如式(1)所示，其中，R代表具有8至16个碳原子的烷基，优选具有10至14个碳原子的烷基。
在实施例中，R代表直连或支链的烷基。在另一个实施例中，R包含苯基部分和烷基部分，其中烷基部分为通过共价键与苯基部分连接的支链或直链。
在实施例中，R包含具有12至18个碳原子的烷基、芳基或芳基-烷基，其中，单个碳原子可以被选自由O、N和S构成的组中的一个原子取代。
烷基是呈直链或支链的官能团或是旁链，并仅由通过单键连接的碳原子和氢原子构成。
芳基是官能团或源自芳香环，如苯基的取代基。
芳基-烷基由烷基和芳基构成，其中所述烷基和所述芳基通过共价键连接。
在本发明的另一个实施例中，调节细胞处理组合物的盐浓度以便于当固定的生物样品与细胞处理组合物混合时，可以调和基本的生理盐浓度。细胞处理组合物的盐浓度需要根据不同样品的体积和类型进行调整。基本的生理盐浓度的离子强度适中，因而为后续分析中使用的细胞结构和抗体提供了保护功能。为了提供这种适中的离子强度，细胞处理组合物的电导率优选为9mS/cm以上。
在另一个实施例中细胞处理组合物基本不含醇。
根据本发明的另一个实施例，调节细胞处理组合物的pH值以便当包含固定的白细胞的生物样品与细胞处理组合物混合时，该混合后的pH值在5至7之间或5.1至6.8之间或5.2至6.6之间或5.3至6.4之间或5.35至6.3之间或5.4至6.2之间或5.45至6.1之间或5.5至6.0之间或5.55至5.9之间或5.6至5.8之间或约为5.7。
除了血清蛋白在酸性条件下的保护功能，酸性环境也可以减少蛋白上的负电荷从而有利于疏水相互作用，产生额外的细胞固定。在本发明的中，当在阴离子洗涤剂的存在下进行细胞裂解时，酸性环境也可以减少洗涤剂的负电荷因而使得洗涤剂表现出较弱的侵蚀性。
因此，本发明这方面所述的细胞处理组合物的优点在于在一个步骤中可以有效裂解红细胞、透化细胞膜，且提供额外的白细胞固定、和暴露/露出细胞表位，尤其是细胞内的磷酸-表位。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂以下述浓度包含在所述细胞处理组合物中：0.3％至2％(w/v)之间或0.4至1.9％(w/v)之间或0.45至1.8％(w/v)之间或0.5至1.7％(w/v)之间或0.55至1.6％(w/v)之间、0.6％至1.5％(w/v)之间或0.65至1.4％(w/v)之间或0.7至1.3％(w/v)之间或0.8至1.2％(w/v)之间或0.3至2％(w/v)之间或0.9％至1.1％(w/v)之间或约1.0％(w/v)。
如上文所讨论的，我们惊奇地发现酸性环境下的血清蛋白与浓度升高的阴离子表面活性剂的组合应用导致了细胞透化的成功和细胞内表位的有效露出，与此同时细胞结构基本保持保全。
在一个实施例中，细胞处理组合物包含0.9％至1.3％(w/v)，优选约1至1.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)作为阴离子表面活性剂。这种细胞处理组合物对于暴露是特别地有效。在对比试验中，观察到含有浓度在2％(w/v)以上的阴离子表面活性剂的细胞处理组合物的使用对于细胞结构的稳定性有消极的影响。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基苯磺酸钠(SDBS)。
SDS是一种非常常见的、容易获得且无毒的洗涤剂。在成本效益的同时，SDS也是一种非常有效的洗涤剂且非常适合于包含在本细胞处理组合物中用作阴离子表面活性剂。
SDS分子包含高极性部分和高疏水性部分。其被认为是变性阴离子洗涤剂的最强的蛋白之一。在细胞处理组合物的酸性环境中，SDS的电荷和极性被一定程度的减弱。然而，洗涤剂将结合到目标区域向蛋白质添加负电荷从而诱导它们的变性，并且当细胞被随后冲洗并被中性培养试剂占据后，洗涤剂会恢复它的全部功能。稍弱一些的阴离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性洗涤剂或糖苷如皂苷，与SDS变性蛋白质的方法相比，它们在酸性环境下不会引入或极少引入负电荷，以及对于蛋白质变性无效或效果没那么有效。
当SDS和血清白蛋白在盐浓度升高的酸性条件下结合时，可以观察到暂时性的白色沉淀。显然，SDS和血清白蛋白的复合物可容易地从不溶状态转变为可溶状态。最可能的原因是SDS可较容易地从聚集的胶束状态转变为可溶性的胶束状态。在细胞蛋白质的微环境中，这些复合物的沉淀可以作为整体为细胞组分和细胞结构提供额外的固定。在本发明中，这种酸性条件下的额外的固定被提供给白细胞上，而非通过该处理被裂解的红细胞上。
而与SDS相比，SDBS具有相似的透化固定的细胞和暴露其所含有的磷酸-表位的潜能，SDS好像对于敏感的表面结构如CD14抗原具有更好的保护作用(参见实施例4)。
根据进一步的实施例，所述的细胞处理组合物的阴离子表面活性剂为SDS或SDBS或SDS和SDBS的组合，其中，所述SDS、SDBS或者SDS和SDBS的累积浓度在0.3％至2％(w/v)之间或0.4％至1.9％(w/v)之间或0.45％至1.8％(w/v)之间或0.5％至1.7％(w/v)之间或0.55％至1.6％(w/v)之间或0.6％至1.5％(w/v)之间或0.65％至1.4％(w/v)之间或0.7％至1.3％(w/v)之间或0.8％至1.2％(w/v)之间或0.3％至2％(w/v)之间或0.9％至1.1％(w/v)之间或约为1.0％(w/v)。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物，其中所述血清白蛋白为哺乳动物的血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白。
血清白蛋白天然存在于哺乳动物血液中。在实施例中，本发明的细胞处理组合物包含一种或多种选自由人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白或来源于其它哺乳动物的血清白蛋白构成的组。
血清白蛋白对于细胞和抗原具有保护作用，特别是在酸性pH环境下(参见实施例5)。在进一步的实施例中，本发明的细胞处理组合物包含的血清白蛋白的浓度在0.2％至15％(w/v)之间或0.4％至14％(w/v)之间或0.6％和13％(w/v)之间或0.8％至12％(w/v)之间或1.0％至11％(w/v)之间或1.2％至10％(w/v)之间或1.4％至9％(w/v)之间或1.6％至8％(w/v)之间或1.8％至7％(w/v)之间或2.0％至6％(w/v)之间或2.1％至5％(w/v)或2.2％至4％(w/v)或2.3％至3％(w/v)之间或2.4％至2.7％(w/v)之间或约为2.5％(w/v)。包含的血清白蛋白的浓度低于0.2％(w/v)的细胞处理组合物对于保护细胞结构和细胞抗原来说几乎是无效的。在至少2％(w/v)的浓度下会获得最佳保护而磷酸蛋白的最佳暴露会发生在3％(w/v)的浓度以下。血清白蛋白过高(超过20％(w/v))会减弱洗涤剂对磷酸-蛋白的抗原位点的暴露作用。
根据优选的实施例，调节细胞处理组合物中包含的血清白蛋白的浓度，即步骤(b)所得的混合物中，已分析的哺乳动物的生物样品中包含的哺乳动物的血清白蛋白和通过本发明的细胞处理组合物在步骤(b)中添加的血清白蛋白，例如牛血清白蛋白的混合的血清白蛋白的浓度在0.2％至15％(w/v)之间或0.4％至14％(w/v)之间或0.6％至13％(w/v)之间或0.8％至12％(w/v)之间或1.0％至11％(w/v)之间或1.2％至10％(w/v)之间或1.4％至9％(w/v)之间或1.6％至8％(w/v)之间或1.8％至7％(w/v)之间或2.0％至6％(w/v)之间或2.1％至5％(w/v)之间或2.2％至4％(w/v)之间或2.3％至3％(w/v)之间或2.4％至2.7％(w/v)之间或约为2.5％(w/v)(about or between)。所述混合物的pH应在5至7之间或5.1至6.8之间或5.2至6.6之间或5.3至6.4之间或5.35至6.3之间或5.4至6.2之间或5.45至6.1之间或5.5至6.0之间或5.55至5.9之间或5.6至5.8之间或约为5.7(about or between)。在优选实施例中，使用血清白蛋白本身，也优选添加少量的磷酸盐来缓冲所述混合物的酸性血清白蛋白，其中混合物中包含的磷酸盐的浓度低于20mM、或低于16mM、或低于12mM、或低于9mM、或低于6mM、或低于4mM、或约为2mM。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物，其中所述处理组合物的pH在3至5.5之间。根据进一步的实施例，本发明所述的细胞处理组合物的pH在3.8至4.6之间，优选为4.2左右。
细胞处理组合物的pH优选应在2至6之间、或2.3至5.8之间、或2.6至5.6之间、或2.9至5.4之间、或3.2至5.2之间、或3.4至5.0之间、或3.6至4.9之间、或3.7至4.7之间、或3.8至4.6之间、或3.9至4.5之间、或4.0至4.4之间、或4.1至4.3之间、或约为4.2。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物，其中所述处理组合物进一步包含离液盐。
术语“离液盐”表示的是一种能够使大分子例如蛋白质和核苷酸变性，从而破坏其结构的物质。离液盐也能够通过破坏细胞膜的脂双层的疏水部分从而对细胞膜的稳定性产生消极的影响。超过一定的浓度，这种作用最终会导致细胞裂解。
在本发明的实施例中，细胞处理组合物包含选自由氯盐、溴盐和高氯酸盐构成的组中的一种或多种。在实施例中，细胞处理组合物包含选自由氯化镁、氯化胍、碘化钠、高氯酸锂和硫氰酸钠构成的组中一种或多种。在优选的实施例中，细胞处理组合物中所包含的离液盐为高氯酸盐、硫氰酸盐或它们的组合。鉴于这些离液盐能够降低大分子内的pH，我们发现这些离液盐在本发明的范围内是特别适用的。
有利地，离液盐为SDS提供了额外的变性潜能。在优选的实施例中，细胞处理组合物包含选自由高氯酸盐和硫氰酸盐构成的组中的一种离液盐。高氯酸盐和硫氰酸盐的离液盐对于使磷酸-表位如p-Stat5的暴露特别地有效。另外高氯酸盐和硫氰酸盐均可以增强固定血液中红细胞的裂解。优选使用包含高氯酸盐和/或硫氰酸盐的细胞处理组合物而非通过仅仅增加其中包含的阴离子表面活性剂来提高细胞处理组合物的严谨性，即变性的潜能。浓度过高的阴离子表面活性剂会增加细胞结构被破坏的风险。由此看来，如果高氯酸盐或硫氰酸盐的离液作用与阴离子表面活性剂，如SDS的功能互补，其对于暴露磷酸-表位，例如p-Stat5表位更具特异性。
在进一步的实施例中，细胞处理组合物包含的离液盐的浓度在20mM至250mM之间、或50mM至230mM之间、或80mM至210mM之间、或110mM至190mM之间、或130mM至170mM之间、或约为150mM。浓度超过250mM的离液盐对于待分析细胞的完整性会产生不利的作用。
在实施例中，本发明的细胞处理组合物单独包含高氯酸盐和/或硫氰酸盐或它们的组合，所包含高氯酸盐和硫氰酸盐的累积浓度在20mM至250mM之间、或50mM至230mM之间、或80mM至210mM之间、或110mM至190mM之间、或130mM至170mM之间、或约为150mM。在对比方法中，这些浓度下的已处理的细胞膜的完整性是不稳定的，因此有助于细胞膜的透化。另外，接近于等渗溶液数值的浓度，有助于打开磷酸化蛋白，例如p-Stat5。
根据实施例，本发明涉及一种包含上述细胞处理组合物和含有固定的白细胞的生物样品的组合，其中所述组合具有的pH值在5.5和7之间。
在实施例中，该组合包含上述细胞处理组合物和含有固定的白细胞的生物样品，所述白细胞选自由全部血液样品、含有分离的白细胞亚型和骨髓样品的样品构成的组。在优选实施例中，生物样品为哺乳动物的，优选为人的全血样品，可选地可以使用抗血凝剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)进行处理。
在优选实施例中，所述组合包含1000μl的上述细胞处理组合物和100至400μl，优选为160至250μl且最优选为约200μl的含有固定的白细胞的生物样品，其中所述组合具有的pH值在5.5至7之间，优选的pH值约为5.6至6，最优选的pH为5.7。
术语“白细胞”包含所有种类的白细胞，包括白细胞、单核细胞和粒细胞。本发明可适用于含有细胞内可活化的荧光蛋白的所有白细胞，其中荧光蛋白可以使用本发明所述的细胞处理组合物和相关方法而暴露。
在一个实施例中生物样品包含固定的淋巴细胞。在另一个实施例中生物样品包含固定的单核细胞。在另一个实施例中生物样品包含固定的粒细胞。
根据另一个实施例，本发明涉及如上所述的细胞处理组合物在处理分离的含有固定的白细胞的生物样品的应用。
根据一个优选的实施例，本发明涉及如上所述的细胞处理组合物在透化包含了固定的白细胞的分离的生物样品，特别是全血样品中的应用。根据实施例，通过使用选自由甲醛、多聚甲醛和福尔马林构成的组中的一种或多种固定剂处理全血样品获得该固定的白细胞。100μl的全血样品优选添加60μl的甲醛溶液(10％(w/v))来固定。
根据另一个实施例，本发明涉及如上所述的细胞处理组合物在透化分离的生物样品，特别是全血样品中包含的固定的白细胞中的应用，以及在在裂解分离的血液样品中包含的红细胞中的应用。
根据优选实施例，本发明涉及如上所述的细胞处理组合物的下述应用，该细胞处理组合物在透化分离的生物样品，优选全血样品中的固定的白细胞中的应用；在裂解分离的生物样品中包含的红细胞中的应用；在固定的白细胞的额外稳定以及在固定的白细胞中包含的细胞内表位的暴露中的应用。
根据优选的实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物的下述应用，该细胞处理组合物在一个步骤中透化分离的生物样品，优选全血样品中包含的固定白细胞；裂解分离的血液样品中包含的红细胞；暴露固定的白细胞中包含的细胞内表位以及该固定的白细胞的额外稳定，其中在该细胞处理组合物的这些应用中，该固定的白细胞的细胞表面表位很大程度上是保存的。
根据进一步的实施例，本发明还涉及一种如上所述的细胞处理组合物的应用，其中所述细胞处理组合物基本不含醇。
另外，根据本发明的实施例，与目前需要醇处理的工序相比需要更少的离心步骤。因此，与这种常规的方法相比本发明的方法的执行更容易、更快速。
本发明还涉及一种细胞处理组合物的应用，其中，固定的白细胞通过如上所述的细胞处理组合物而透化，并且通过至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测的标记的结合剂而被标记。
在实施例中，使用至少一种可检测地被标记的结合剂来标记固定的白细胞，所述结合剂选自由多克隆抗体、单克隆抗体或它们的免疫活性片段构成的组，其中使用可检测的标记物，优选荧光标记物来标记所述的至少一种可检测地被标记的结合剂，使得通过适当的检测技术识别所述结合剂成为可能，例如通过荧光流式细胞仪检测荧光标记物。在本发明的实施例中，至少一种结合剂的可检测的标记物为选自由荧光标记物、由非荧光生色团构成的标记物、拉曼光谱标记物、放射性标记物和适于质谱检测的标记物构成的组中的一种或多种。
在优选实施例中，至少两个，优选全部的可检测的标记物应与其它所使用的可检测的标记物区分，以便通过检测标记物使得明确地区分相应的结合剂，和最终使得与所述结合剂相对应的抗原结构成为可能。
本发明的实施例涉及一种细胞处理组合物的应用，其中所述固定的白细胞被至少一种对细胞内表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂和至少一种对细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂所标记。优选使用多个对细胞内表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂和多个对于细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。
可检测地被标记的结合剂的例子包括但不限于如下抗体：小鼠抗-Stat5(pY694)-PE(BD生物制药，圣何塞，加利福尼亚州)、小鼠磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(E10)Alexa 647(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)、磷酸-p38MAPK(T180/Y182)Alexa 488.(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)、磷酸-Stat1(Tyr701)(58D6)Alexa 488.(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)、磷酸-Stat3(Tyr705)(3E2)Alexa 488.(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)、磷酸-Akt(Ser473)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88915)、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(贝克曼考尔特公司,产品编号No.A88921)、磷酸-Stat3(Tyr705)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88925)、磷酸-p38MAPK(Thr180/Tyr182)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88933)、磷酸-S6Ribosomal Protein(Ser235/236)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88936)、磷酸-Stat1(Tyr701)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88941)、磷酸-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州,产品编号No.A88944)。
在另一个实施例中，本发明还涉及一种细胞处理组合物的应用，其中利用至少一种对磷酸-表位，优选对磷酸化或去磷酸化状态的细胞内的磷酸表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂来标记固定的白细胞。在优选的实施例中，使用对Stat-5具有特异性的可检测地被标记的结合剂，优选使用其磷酸化的形式。
根据本发明的一个实施例，可检测地被标记的结合剂被单独提供并加入到含有固定的白细胞的生物样品和细胞处理组合物的组合中。根据本发明的另一个实施例，首先将可检测地被标记的结合剂与本发明所述的细胞处理组合物相混合。然后将获得的可检测地被标记的结合剂与细胞处理组合物的组合加入到含有固定的白细胞的生物样品中。
根据实施例，本发明涉及一种如上所述的细胞处理组合物在制备透化的白细胞中的应用，所述白细胞具有至少部分暴露的细胞内磷酸-表位，所述磷酸-表位用于后续的由可检测地被标记的结合剂标记以及在流式细胞仪，优选荧光流式细胞仪中分析。
在一个实施例中，本发明涉及一种细胞处理组合物的在暴露细胞内表位，优选至少一个磷酸表位中的应用，其中暴露所述表位不需要醇处理固定的白细胞。避免使用醇是有利的，因为醇会干扰其它的检测试剂，细胞表面的标志物会被醇破坏，此外，为了在分析前再次从醇中分离已处理的细胞需要额外的离心步骤。
本发明的另一个方面涉及处理分离的生物样品的方法，所述生物样品包含至少白细胞，其包含下列步骤：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中加入足量的固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；
(b)透化步骤，在步骤(a)之后，其包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触。
根据实施例，本发明涉及一种处理分离的生物样品的方法，所述方法包括使生物样品经过固定步骤之后再经过透化步骤，从而制备用于细胞内和/或细胞外表位的细胞分析，优选通过流式细胞仪分析的所述生物样品。优选地，分别使用特异性的结合剂标记至少一种细胞内表位和至少一种细胞外表位，然后在流式细胞仪中进行分析。
根据实施例，固定步骤(a)包含使含有至少白细胞的生物样品与足量的固定液(固定剂)接触以实现所述白细胞的蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联，由此获得固定的白细胞，其是结构性保守的。在本文中术语“足量”意味着选择固定剂的浓度以便当固定剂与生物样品结合时，为了避免在后续透化步骤(b)中这些细胞被破坏和细胞质分子通过透化的细胞膜而损失，所得的固定剂的浓度对于稳定白细胞是有效的。
优选使用基于醛的固定剂，例如甲醛、多聚甲醛或类似物。根据实施例，固定液与含有至少白细胞的生物样品以一定比例混合使得所得的混合物包含1％至10％(w/v)、或1％至10％(w/v)、或1.5％至9％(w/v)、或2％至8％(w/v)、或2.5％至7％(w/v)、或3％至6％(w/v)、或3.5％至5％(w/v)、或约4％(w/v)的固定剂，如甲醛。根据优选实施例，步骤(a)包含使50至150μl，优选约100μl的全血样品与约30μl至90μl，优选约为60μl的10％的甲醛溶液接触。
根据实施例，用于处理分离的生物样品的方法包含透化步骤，在步骤(a)之后，其包含使生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触以透化生物样品中包含的固定的白细胞和暴露固定的白细胞中包含的细胞内表位，优选磷酸表位，由此制备用于细胞内和/或细胞外表位后续分析的细胞。
本申请中的表述“步骤Y，在步骤X之后”表示的是步骤Y按顺序在步骤X之后执行，直接在步骤X之后或在步骤X之后的一个或多个步骤之后。
在实施例中，本发明的方法还包含一个活化步骤(x)，其中所述活化步骤(x)包含向含有白细胞的分离的生物样品中添加活化剂，其中所述活化剂适于触发/激活生物样品中包含的白细胞内的至少一种信号传导途径。例如但不限于，合适的活化剂可以是选自由脂多糖(LPS)、CD40L、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、转化生长因子(TGF)、Toll-样受体4(TLR4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)构成的组中的一种或多种。
在实施例中，本发明的方法还包含在步骤(b)之前或与步骤(b)同时进行的细胞表面标记步骤(y)，其中细胞表面标记步骤(y)包含添加至少一种对于细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。例如但不限于，合适的细胞外表位可以是选自由CD-3、CD-4、CD-8、CD-14、CD-15、CD-19和CD-45构成的组中的一种或多种。优选地，步骤(y)包含添加对细胞外表位具有特异性的多个可检测地被标记的结合剂。
根据本发明的方法的优选实施例，将全血样品与固定剂混合，优选为10％的甲醛溶液；根据步骤(a)，其中固定剂的体积约为全血样品体积的40％至80％，优选约为60％。可选地，将根据步骤(x)的活化剂和根据步骤(y)的对细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂添加到生物样品中，其中添加的活化剂的体积约为全血样品体积的0.5％至10％，优选约为1％，且添加的每种可检测地被标记的结合剂的体积为全血样品体积的约5％至40％，优选约为20％。
为了使细胞处理组合物中包含的血清白蛋白进入细胞，本发明的细胞处理组合物中包含约0.3％-2％(w/v)的阴离子表面活性剂。根据本发明的实施例，在步骤(b)中生物样品与累积浓度为0.7％至1.5％(w/v)，优选为1％至1.1％(w/v)的SDS或SDBS或SDS和SDBS的组合的细胞处理组合物接触。酸性血清白蛋白为全血样品提供保护，但不为红细胞提供保护，因此红细胞被细胞处理组合物裂解。
根据实施例，透化步骤(b)对暴露细胞内表位，优选磷酸-表位也是有效的，使得它们对于后续检测中对各自特异性结合剂，例如单克隆抗体而言是可接近的(“暴露的”)。潜在的目标磷酸-表位的一个例子是通常难以暴露的p-Stat5表位。
在本发明的实施例中步骤(b)包含暴露至少一个细胞内表位，其可以磷酸化或去磷酸化状态存在于细胞内。在本发明的步骤(b)中，优选暴露多个细胞内表位。
根据本发明的另一个实施例，为了暴露目标细胞内抗原，本发明的方法不需要使用醇的步骤。根据本发明如上更详细地描述的细胞处理组合物，允许通过不同的、更温和的试剂代替醇，因此有助于在彻底暴露细胞内表位同时保存敏感的细胞结构，例如细胞表面抗原CD14，它与醇的使用是不兼容的。
根据实施例，本发明的方法适于处理生物样品，优选全血样品，为了制备用于所述分子活化状态的后续检测的固定的且透化的具有暴露的细胞内表位，优选可活化的细胞内分子的表位，例如磷酸蛋白，的白细胞。根据该实施例使被可检测地被标记的活化状态的特异性的结合剂允许与各自的细胞内靶位点结合，并随后被检测，优选通过流式细胞仪进行检测。
在实施例中，本发明的方法在固定步骤(a)之后，透化步骤(b)之前不需要固定的细胞的清洗/离心步骤。使用的固定剂被细胞处理组合物中和因而不会对后续的方法步骤产生影响。在本发明的一个实施例中，处理生物样品的方法仅包含一个离心/清洗步骤，即在透化步骤(b)之后直接进行。根据本发明的实施例，不再需要常规方法中用于细胞外和细胞内的靶结构，优选磷酸化蛋白的流式细胞分析的白细胞所需要的离心/清洗步骤。
在实施例中，本发明还涉及一种用于处理生物样品的方法，所述样品包含至少白细胞，所述方法包括下述步骤以便于制备用于细胞内和/或细胞外表位后续分析的生物样品：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中添加足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；
(b)透化步骤，其在步骤(a)之后，包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触，和
(c)标记步骤，其在步骤(b)之后，包含使所述生物样品与对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测的被标记的结合剂接触。
在透化步骤(b)之后，即在透化生物样品中包含的固定的细胞之后，使至少一种可检测的结合剂，优选荧光标记的抗体，与所述的生物样品接触。
在优选的实施例中，在标记步骤(c)中使用至少一个针对细胞表面抗原的可检测的结合剂和至少一个针对细胞内抗原的可检测得结合剂。可检测的结合剂可以以至少两种结合剂的混合物的形式或单独的形式添加。
在实施例中，本方法在步骤(c)之前还包含一个离心步骤用于从前述步骤中残留的试剂组分和细胞碎片中分离出固定的和透化的白细胞。当使用全血样品作为生物样品时，这种离心步骤是特别有益的。在去除上清液之后，将细胞沉淀吸取到抗体反应发生的合适的培养剂中。
在另外的实施例中，在步骤(b)之后，结合剂和合适的培养剂被分别地或同时地加入到生物样品中。优选在添加所述培养剂的同时或之后将所使用的可检测的结合剂加入到生物样品中。
本发明也涉及一种培养剂，其包含浓度范围在1至50mM，优选10mM的pKa值在中性pH范围内的缓冲物(例如，HEPES或其它的选自由MES、ADA、PIPES、ACES、乙醇胺氯化物、BES、TES、乙酰氨基甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，甘氨酰胺、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)构成的组中的“良好缓冲剂”)；浓度范围为0.2至20％，优选4％(w/v)的牛或其它哺乳动物的血清白蛋白；浓度范围在50至250mM，优选100至160mM且最优选约为120mM的高氯酸钠或硫氰酸钠；可选择地，浓度范围在5mM以下，优选1mM的氯化钙和300或浓度范围在0.01至0.2％，优选0.05％(v/v)的类似防腐剂。优选使用氢氧化钠将本发明的培养剂的pH调节至6至9、或6.3至8.7、或6.5至8.5、或6.7至8.3、或6.9至8.1、或7.1至7.9、或7.3至7.7、或约7.5。在表1中给出根据本发明示例性的培养剂的合适组合物。
在实施例中，本发明还涉及一种用于处理生物样品的方法，所述样品包含至少白细胞，所述方法包括下述步骤以便于制备用于细胞内和/或细胞外表位后续分析的所述生物样品：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中添加足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；
(a1)培养步骤，其在步骤(a)之后，包含在15℃至30℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养5至15分钟；
(b)透化步骤，其在步骤(a)之后，包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触，和
(c)可选的标记步骤，其在步骤(b)之后，包含使所述生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂接触。
在培养步骤(a1)过程中，使得在步骤(a)中获得的生物样品静置约5至15分钟，以便可以实现优选的细胞的完全固定。培养时间越短固定反应越不完全，而培养时间延长超过15分钟可能导致过-固定，因此使得暴露细胞内表位更具有挑战性。培养时间约8至12分钟可以得到最好的结果。
在优选实施例中，步骤(a1)包含在温度范围从约15至30摄氏度，优选从约20至25摄氏度的温度范围下培养8至12分钟之间。应当理解，当使用的培养温度越高，所需要的培养时间在一定程度上减少，反之亦然。
为了避免破坏细胞，在步骤(a1)中应当避免过度的混合。相反地，优选温和地混合或旋转含有待处理的生物样品的试管，例如使用手或简单的滚动摇臂(roller rocker)。
在一个实施例中，本发明还涉及一种用于处理生物样品的方法，所述样品包含至少白细胞，所述方法包括下述步骤以便于制备用于细胞内和/或细胞外表位的后续分析的所述生物样品：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中添加足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；
(a1)可选的培养步骤，其在步骤(a)之后，包含在15℃至30℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养5至15分钟；
(b)透化步骤，其在步骤(a)之后，包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触；
(b1)培养步骤，其在步骤(b)之后，包含在20℃至50℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养2至10分钟，和
(c)可选的标记步骤，其在步骤(b)或步骤(b1)之后，包含使所述生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂接触。
培养步骤(b1)应该保证固定的白细胞经历最一致的和完全地透化反应。该步骤的温度应在20℃至50℃之间，优选在约30℃至45℃之间且最优选约为37℃。在该温度下，培养的时间为2至10分钟，优选为3至7分钟且最优选为约5分钟。培养时间越短以及培养温度在20℃以下可能会降低透化效率，而透化反应过程中过低的温度会减少洗涤剂和靶表位之间的疏水相互作用。因此，特别是需要强的疏水相互作用的特定表位，例如p-Stat5，建议的温度为37℃左右。
另一方面，培养温度在50℃以上以及培养时间延长至10分钟以上会导致细胞和血清白蛋白的变性和沉淀。
在优选实施例中，在步骤(b1)中在37℃的温度下保持约5分钟。
在一个实施例中，本发明还涉及一种用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含至少白细胞，所述方法包括下述步骤以便于制备用于细胞内和/或细胞外的表位的后续分析的所述生物样品：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中添加足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；
(a1)可选的培养步骤，其在步骤(a)之后，包含在15℃至30℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养5至15分钟；
(b)透化步骤，其在步骤(a)之后，包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触；
(b1)可选的培养步骤，其在步骤(b)之后，包含在20℃至50℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养2至10分钟；
(b2)清洗步骤，其在步骤(b)或步骤(b1)之后，和
(c)可选的标记步骤，其在步骤(b1)之后，包含使所述生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂接触。
清洗步骤(b2)适于从步骤(b)或(b1)的产物中存在的试剂组分中纯化固定的且透化的细胞，其可能会影响后续的标记步骤(c)。因此，在本发明的实施例中，清洗步骤(b2)在步骤(b)或(b1)之后和步骤(c)之前进行。
术语“清洗”步骤应解释为“纯化”步骤的意思，应包含已知的细胞纯化技术如透析、离心或其它合适的方法。为了沉淀细胞，清洗步骤(b2)的实施优选将步骤(b)或(b1)中获得的细胞反应混合物经足够的离心力来沉淀细胞，优选在约300g下离心约5分钟来完成。然后弃去上清液并取沉淀于培养剂中。培养剂中包含的血清白蛋白对于中和潜在的阴离子表面活性剂如SDS的残留物，和固定剂如甲醛的残留物是有效的，上述两者均能够阻碍免疫反应。根据本发明的实施例，培养剂包含生理浓度的高氯酸钠或硫氰酸钠或它们的混合物。该浓度的高氯酸钠和/或硫氰酸钠的应用基本能够防止已经暴露的表位，特别是磷酸-表位，在培养反应过程中再回复至遮蔽的状态。
在一个实施例中，本发明还涉及一种用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含至少白细胞，所述方法包括下述步骤以便于制备用于细胞内和/或细胞外的表位的后续分析的所述生物样品：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中添加足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸的至少部分交联；
(a1)可选的培养步骤，其在步骤(a)之后，包含在15℃至30℃之间的温度下所述生物样品的培养，其中所述样品优选培养5至15分钟；
(b)透化步骤，其在步骤(a)之后，包含使所述生物样品与本发明所述的细胞处理组合物接触；
(b1)可选的培养步骤，其在步骤(b)之后，包含在20℃至50℃之间的温度下培养所述生物样品，其中所述样品优选培养2至10分钟；
(b2)清洗步骤，其在步骤(b)或步骤(b1)之后，和
(c)标记步骤，其在步骤(b1)之后，包含使所述生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂接触。
(c1)稀释步骤，其在步骤(c)之后，包含使所述生物样品与清洗组合物接触。
根据本发明的实施例，可选的培养步骤在标记步骤(c)之后进行。该可选的培养步骤包含在室温下培养5至25分钟，优选10至20分钟且最优选约15分钟。该可选的培养步骤促进所述的细胞内和/或细胞外表位的充分标记。
然后，取步骤(c)中生成的反应混合物置于根据步骤(c1)的清洗组合物中，其比例为从1:5至1:15，优选的比例为从1:10。
本发明还涉及一种含有磷酸缓冲液(PBS，不含钾)或其它的生理清洗介质的清洗组合物、浓度范围从0.1至2％，优选为0.5％(v/v)的甲醛溶液(37％)、浓度范围从0.01至1％，优选约为0.1％(v/v)的普朗尼克F68和浓度范围从0.005％至0.5％的月桂酰基肌氨酸钠。使用氢氧化钠或盐酸将清洗组合物的pH调节至7.0至7.5，优选至7.2。清洗组合物中包含的甲醛保证在分析前样品是足够保守的。为了防止细胞粘连到其它细胞和所使用的细胞仪设备的管上，将普朗尼克F68和月桂酰基肌氨酸钠添加到该清洗组合物中。
在另一个实施例中，首先离心生物样品用于去除多余的抗体。然后取出沉淀置于50至200μl，优选约100μl的清洗组合物中。然后用血细胞计数器分析该样品。
在本发明的另外实施例中，所述的至少一种可检测地被标记的结合剂，优选被荧光标记物标记，对磷酸化蛋白，如p-Stat5具有特异性。可以通过流式细胞仪对所述至少一种可检测地被标记的结合剂进行检测。
在本发明的实施例中，通过本发明所述的方法检测针对白细胞亚群具有特异性的细胞外表位和细胞内磷酸化的蛋白质。在使用流式细胞仪上分析处理后的细胞之前的整个细胞处理工序中，优选仅在步骤(c)之前使用一个离心/清洗步骤。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含：
(a)根据本发明所述的细胞处理组合物
(b)包含血清白蛋白和高氯酸盐的培养剂，
(c)至少一种对细胞内表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂，和
(d)至少一种对细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。
在优选实施例中，试剂盒包含根据发明的细胞处理组合物，根据本发明的培养剂，对细胞内表位，优选磷酸-表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂以及对适于白细胞鉴别的细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。在另一个实施例中，试剂盒包含的固定剂优选含有浓度在1％至37％(w/v)之间、或2％至33％(w/v)之间、或3％至37％(w/v)之间、或4％至30％(w/v)之间、或5％至25％(w/v)之间、或6％至20％(w/v)之间、或7％至15％(w/v)之间、或8％至12％(w/v)之间、或9％至11％(w/v)之间、或约为10％(w/v)的甲醛或多聚甲醛。
根据实施例至少一种可检测地被标记的结合剂为响应活化的表位，优选磷酸-表位的荧光标记的抗体，其可能以磷酸化或去磷酸化形式存在于生物细胞中，其中所述荧光标记的抗体能够特异性地检测所述磷酸-表位的磷酸化或去磷酸化形式。
根据本发明的培养剂适于避免对细胞内和细胞外表位的破坏且使得至少一种可检测地被标记的结合剂与其对应的表位特异性的结合。例如，合适的培养剂包含4％的以生理强度溶于HEPES缓冲的高氯酸盐的血清白蛋白。该血清白蛋白优选地，BSA对于吸收干扰抗体反应的SDS和甲醛的残留物是有用的。为了防止暴露的抗原的闭合，用于提供生理条件的盐是合适的离液序列高的盐，例如高氯酸钠或硫氰酸钠。
如果在培养剂中以生理浓度使用高氯酸盐，可以观察到信号噪声比越高，即磷酸蛋白的标记性能越好。以此方式，高氯酸盐的高离液序列效果从裂解剂扩展到培养剂，对细胞表面蛋白的标记无妨碍。
根据优选实施例，本发明的试剂盒中包含的且在本发明的方法中使用用于固定含有白细胞的生物样品，优选全血样品的固定剂包含150mM氯化钠和10％(w/v)的甲醛(不含甲醇)的水溶液。应当理解大量不同的，例如市售的含有类似含量的甲醇的固定剂或含有固定剂的类似的醛也同样适于被包含在本发明的试剂盒中，并且可以在本发明的方法中使用。同样地，本发明的细胞处理组合物的上述用途并不限于固定剂的特定的实施例。
根据优选实施例，本发明试剂盒中包含的且在本发明的方法中使用的试剂盒包含34.7mM的十二烷基硫酸钠、1％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)、可选的2mM的磷酸二氢钠、可选的150mM的高氯酸钠和可选的0.05％(v/v)的300的水溶液。通过添加NaOH将细胞处理组合物的最终pH调节至4.2。
根据优选实施例，本发明试剂盒中包含的且在本发明的方法中使用的培养剂包含10mM的HEPES、4％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)、120mM的高氯酸钠、可选的1mM的氯化钙和可选的0.05％(v/v)的300的水溶液。使用氢氧化钠将pH调节至7.5。应当理解大量不同的，例如市售的含有类似含量的BSA和离液序列高的盐，如高氯酸钠的培养剂也同样适于被包含在本发明的试剂盒中，并且可以在本发明的方法中使用。同样地，本发明的细胞处理组合物的上述用途并不限于培养剂的这种特定的实施例。
根据优选实施例，本发明的试剂盒中包含的且在本发明的方法中使用的清洗组合物0.5％(w/v)的磷酸盐缓冲液(不含钾)、37％的甲醛溶液、可选的0.1％(v/v)的普朗尼克F68和可选的0.05％(w/v)的月桂酰基氨酸钠的水溶液。应当理解大量不同的，例如市售的含有类似含量的甲醛和洗涤剂的清洗组合物也同样适于被包含在本发明的试剂盒中，并且可以在本发明的方法中使用。同样地，本发明的细胞处理组合物的上述用途并不限于清洗组合物的特定的实施例。应当理解本申请可能包含一种或多种其它的方面和/或实施例。这些方面和/或实施例可以涵盖一种或多种上述的单独或任意组合的特征。
当提供一个数值范围时，除非上下文另有明确说明，否则应该理解每个中间值，至下限单位的十分位，在该范围的上限和下限之间，和其他所述的或在所述范围的中间值，均包含在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围内，其也包括在本发明内，也适用所述范围中任何具体排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值，将任意一个或两个这些被包含的限值排除的范围也包含在本发明内。
附图说明
图1：CD14-FITC和Stat5-PE染色的全血的流式细胞分析以及血液的GM-CSF激活的效果。
图1显示了通过基于本发明的方法(参见实施例2)处理全血样品获得的四种流式细胞散点图以及之后的FC500血细胞计数器(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)上的分析。散点图A展示的是非活化的全血的分析。散点图B展示的是CD14-FITC染色的单核细胞在525nm下的荧光分析。在散点图C中，展示了p-Stat5-PE染色的非活化的血液。在散点图D中，在固定前通过GM-CSF激活全血样品。与散点图C相比，在散点图D中可以看到在GM-CSF活化之后单核细胞和中性粒细胞表达了p-Stat5。I＝粒细胞；II＝淋巴细胞；III＝CD14+单核细胞；IV＝p-Stat-5+单核细胞。
具体实施方式
实施例
实施例1：
根据本发明的组合物的示例性制备
在本发明的范围内，下列组合物提供合适的试剂的例子
用于固定含有白细胞的生物样品，优选全血样品的固定剂(试剂A)，其水溶液中包含下列物质：
氯化钠 150mM
甲醛(不含甲醇) 10％(w/v)
试剂A的pH为中性且使用孔径尺寸为0.22μm的尼龙滤器进行过滤。
用于处理含有白细胞的生物样品，优选全血样品的细胞处理组合物(试剂B)其水溶液中包含：
通过将十二烷基硫酸钠溶于水中制备试剂B。混合除高氯酸钠之外的所有成分将pH调节至4.4。然后加入高氯酸钠并通过充分地混合使任何产生的沉淀溶解。添加NaOH将终pH调节至4.2。使用孔径尺寸为0.22μm的尼龙滤器进行过滤。由色谱科，西格玛奥德里奇(圣路易斯，密苏里州，美国)获得300。
用于培养固定的且透化的细胞的培养剂(试剂C)的水溶液中包含：
使用氢氧化钠将pH调节至7.5。通过孔径尺寸为0.22μm的尼龙过滤器过滤试剂C。由色谱科，西格玛奥德里奇(圣路易斯，密苏里州，美国)获得300。
在试剂C中培养后，用于清洗和保护细胞的清洗组合物(试剂D)在水溶液中包含：
磷酸盐缓冲液(不含钾)
甲醛溶液(37％) 0.5％(w/v)
普朗尼克F68 0.1％(v/v)
月桂酰肌氨酸钠 0.05％(w/v)
透过孔径尺寸为0.22μm的尼龙过滤器过滤试剂D。
实施例2
细胞表面抗原的标记
向使用0.7mM的乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂处理的体积为100μl的全血中，加入65μl的固定剂(实施例1中的试剂A)。涡旋该混合物然后在室温下(18-25℃)下培养10分钟。10分钟后，加入1ml的细胞处理组合物(实施例1中的试剂B)。立刻涡旋混合该混合物并使其在37℃下培养5分钟。
该抗凝血液的pH约为7.2。在固定10分钟之后，由于氨基的破坏，血液的pH约为6.1。在加入细胞处理组合物并培养5分钟之后，该混合物的pH约为5.6。
然后以约300g的速度离心所获得的混合物以除去液相。取出沉淀置于100μl的培养剂(实施例1中的试剂C)中并通过涡旋溶解。获得的混合物的pH约为7.0。
在一次实验中，向培养的混合物中添加如制造商所示量的下述偶联的单克隆产品。
IgG1FITC同型对照(IM0639U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
IgG1PE同型对照(IM0670U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD14FITC(IM 0645U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD14APC(IM 2580U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD45FITC(IM0782U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD45KO(A96416,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD3FITC(IM1281U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD19PE(IM1285U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
CD34PE(IM1871U,贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
在室温下培养15分钟以后，清洗样品，取出置于清洗组合物中(实施例1中的试剂D)并用FC500血细胞计数器分析(贝克曼考尔特公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)。该实验分析的结果如表1所示。从这个数据可明显看出根据本发明的方法一方面不会妨碍细胞表面标记物CD14的标记，另一方面为单核细胞和中性粒细胞(一般被标记作为表1所示的粒细胞)的细胞内p-Stat5表位提供接近的路径，所述单核细胞和中性粒细胞的细胞内p-Stat5表位在基于本发明的细胞处理(参见实验2B)之前使用GM-CSF激活。
在表1中，提供了一些经过本发明实施例2所述的细胞制备处理的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的一些代表性的细胞表面抗原的信号噪声比(S/N)。该S/N通过区分标记的亚群和使用同型对照抗体处理的相同亚群的平均荧光值来计算。在CD34抗原的例子中，KG1细胞系(ATCC,马纳萨斯，弗吉尼亚州)的细胞在处理前添加到(spiked into)血样。该数据表明所有使用的细胞表面标记物(CD3、CD14、CD19、CD34、CD45)可被相应的抗体较容易地接近，因此表明在基于本发明的细胞处理方法的过程中，细胞表面抗原是保守的且保持可接近性。
表1
磷酸化的细胞内抗原的标记
将等分的全血(使用0.7mM的EDTA抗凝)在下列活化剂中的一种的存在下，在37℃下培养15分钟；
GM-SCF(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，10ng/ml，R&D系统，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)
IL2(重组人白细胞介素(rhIL2)，20ng/ml，R&D系统，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)
PMA(十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯PHA-L，2μg/ml，西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州)
LPS(脂多糖，2μg/ml，西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州)
干扰素α(重组人干扰素α，20ng/ml，PBL生物化学实验室,皮斯卡塔韦，新泽西州)
白介素-6(IL6)(重组白介素-6(rhIL6)，200ng/ml，R&D系统，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)
然后根据实施例2处理活化的血液。在一次实验中，添加生产商所示体积的下述偶联的单克隆抗体。
鼠抗-Stat5(pY694)-PE(BD生物制药，圣何塞，加利福尼亚州)
鼠磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(E10)Alexa 647(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)
磷酸-p38MAPK(T180/Y182)Alexa 488.细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)
磷酸-Stat1(Tyr701)(58D6)Alexa 488.(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)
磷酸-Stat3(Tyr705)(3E2)Alexa 488.(细胞信号科技公司，丹弗斯，麻萨诸塞州)
磷酸化Stat5RPE(B23139,贝克曼公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)
在室温下培养样品15分钟之后，清洗样品并取出置于清洗剂中，并用FC500血细胞计数器(贝克曼公司，布雷亚贝，加利福尼亚州)进行分析。图1中的散点图C和D提供了所得的实验数据，该数据表明，基于本发明的方法处理的固定的细胞的细胞内磷酸化表位是被相应的抗体较容易接触到的。
表2中显示了使用不同的抗-磷酸-表位抗体标记的白细胞亚群的信号/噪声(S/N)比。通过区分等分的活化的血液的亚群的平均荧光值以及来自相同血液的非活化的等分的各自亚群的平均荧光值来计算该S/N比。
表2
比较非活化的血液和使用适当的活化剂活化的血液中三种主要白细胞群：淋巴细胞、单核细胞和中心粒细胞(粒细胞的一个亚群)中不同的磷酸蛋白的标记。
实施例3
为了评价阴离子表面活性浓度的影响，使用不同的SDS浓度制备如实施例1所示多种细胞处理组合物。表3包含涉及表明在细胞处理组合物中的SDS浓度对暴露磷酸表位，如p-Stat5的影响的实验数据。在此设定中，使用具有1％w/v(34.7mM)浓度的细胞处理溶液获得p-Stat5的最佳暴露和染色。
表3
实施例4
为了比较不同的阴离子表面活性剂，制备两种基于本发明的细胞处理组合物，一种使用十二烷基硫酸钠(SDS)而另一种使用十二烷基苯磺酸钠(SDBS，Aldrich工业级，西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州)，其中两种试剂均以34.7mM包含在细胞处理组合物中。含有SDS的细胞处理组合物的pH值如实施例1所示。由于沉淀和稳定性的原因，含有SDBS的细胞处理组合物的pH为5.95且在加入全血样品之后上升至6.6。否则，按照实施例2A和2B所示处理并分析样品。
如表4所示，对于p-Stat5两种试剂给出了相似的表达值。然而，相似含有SDBS的试剂的细胞保护的效率较低。这可能是由于较高的pH会影响细胞保护。
表4
实施例5
本实验将论证在酸性pH下血清白蛋白对于细胞和抗原的保护作用。基于这个原因，制备如实施例1所示的若干细胞处理组合物，但是存在下列修改：
1.实施例1的细胞处理组合物，其中省去BSA并由20mM的具有缓冲能力的酸性磷酸盐代替，所述酸性磷酸盐具有与实施例1中的细胞处理组合物类似的浓度。该试剂的pH为2.5。2.实施例1的细胞处理组合物具有4.15的pH。
3.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至5.6。
4.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至6.28。
5.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至7.4。
除在固定之后使用PBS清洗样品之外，按照实施例2所述处理样品。
在加入固定的细胞之后，分别将固定的血液和上述五种不同细胞处理组合物的混合物的pH调节至下列值：
1.pH＝5.7
2.pH＝5.7
3.pH＝6.4
4.pH＝6.7
5.pH＝7.0
CD14抗原对于变性条件特别地敏感且已经被选作保护参量。另外，单核细胞的侧散射和回收细胞的数量被表示为参量。按照实施例2A和2B所示处理并分析全血液。
待分析混合物在5.7的pH下，观察到最强的保护作用。从表5看出，酸的作用和血清白蛋白有关。在酸性条件下，没有血清白蛋白时，没有增加的保护。CD14的信号/噪声比的计算如实施例2所示。
表5
酸性条件下的血清白蛋白似乎也可以提供额外的固定作用。与中性条件下血液裂解之后单核细胞的侧散射值相比，在酸性条件下血液裂解之后单核细胞的侧散射值趋于变高(参见表5)。较高的侧散射与血清白蛋白的是否存在无关。侧散射随着细胞的不透明性和细胞中大分子聚集的量而增强。由于大分子聚集的量是细胞的固定强度的度量，因而可以得出一个结论在酸性条件下使用血清白蛋白提供更好地固定作用。
实施例6
为了比较血清白蛋白相对于其它水溶性蛋白的保护作用，制备一种使用牛乳酪蛋白(西格玛)代替BSA的替代细胞处理组合物。该细胞处理组合物中的其它成分与实施例1中的试剂B相同。
按照实施例2A所示处理并分析全血。
从表6可以看出，对保护细胞表面抗原CD14而言，血清白蛋白优于酪蛋白。按照实施例2所示计算CD14的信号/噪声比。单核细胞以及所有白细胞的侧散射值均被作为通过BSA或酪蛋白为细胞蛋白提供的固定功能。再次，结果表明在BSA比酪蛋白更有效。另外，当在细胞处理组合物中使用酪蛋白代替BSA时，获得的单核细胞以及所有白细胞的数量明显降低，这表明血清白蛋白的保护作用优于酪蛋白。
表6
实施例7
在本发明的一些实施例中，细胞处理组合物可以包含离液序列高的盐例如高氯酸盐或硫氰酸盐。为了说明如高氯酸钠的效果，制备下列细胞处理组合物：
(1)实施例1中的细胞处理组合物，其中省去高氯酸钠并由150mM的氯化钠代替。
(2)实施例1中的细胞处理组合物，其中省去高氯酸钠并由150mM的氯化钠代替。并且将该试剂中SDS的浓度由1％改为1.5％。
(3)实施例1中的细胞处理组合物。
按照实施例2A和B所示处理并分析全血液。按照实施例2A和B所示计算信号与噪声比(s/n)。
细胞处理组合物(1)中将高氯酸钠改为氯化钠导致红细胞的不完全裂解。这种效应可以通过将细胞处理组合物中SDS的浓度提高至1.5％(溶液(2))来补偿，可以产生与(1)类似的裂解效果。另外，p-Stat5的表达也是类似的。然而，利用离液序列高的高氯酸盐代替较高浓度的SDS在更好地保护CD14抗原方面的优势变得明显(参见表4)。
表7
实施例8
以下显示可在基于本发明的系统和方法中使用的示例性溶液。
例如，用于固定基于本发明的全血的组合物可以是氯化钠(150mM)和不含甲醇的甲醛(10％(w/v))的具有中性pH的水溶液。透过孔径尺寸为0.22μm的尼龙过滤器过滤该组合物。
此外，用于裂解和变形基于本发明的全血的组合物可以是十二烷基磺酸钠(34.7Mm)、甲醇(1％v/v)、牛血清白蛋白(1％w/v)，磷酸二氢钠(2mM)、和高氯酸钠(150mM)的水溶液。使用盐酸将pH调节至4.2。
通过混合除高氯酸钠之外的成分来制备根据本发明的用于裂解和变性固定的全血的组合物。该体积应为终体积的85％。然后将pH调节至4.4。将1M的高氯酸钠溶液加入到终体积中。之后，充分地混合该组合物以溶解沉淀，以便获得4.2的最终pH。最后，透过孔径尺寸为0.22μm的尼龙过滤器过滤该组合物。
此外，用于和抗体培养基于本发明的裂解并透化的细胞的组合物可以是4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)(10mM)、牛血清白蛋白(2％(w/v))、氯化钠(150mM)、和300(0.05％)的水溶液。混合后使用氢氧化钠将pH调节至7.5。最后，透过孔径尺寸为0.22μm的尼龙过滤器过滤该组合物。300来自Supelco公司，西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州，美国。
用于清洗和保存基于本发明的抗体染色的细胞的组合物可以是磷酸盐缓冲液(不含钾)、和不含甲醇的甲醛(0.5％(w/v))的水溶液。

Claims (27)

1.一种用于透化固定的白细胞的细胞处理组合物，其包含下列成分的水溶液：
(a)至少一种阴离子表面活性剂，其以0.3％至2％(w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中，其中所述阴离子表面活性剂的盐如式(1)所示：
Y—SO3-X+ (1)
其中，Y为R--O或R中的一种，R代表具有8至18个碳原子的烷基、亚烷基、芳基、亚烷基-烷基、芳基-烷基或芳基-亚烷基，X代表一价阳离子，和
(b)血清白蛋白，其以0.2％至20％(w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中，
其中所述细胞处理组合物的pH在2至6之间。
2.如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂以0.6％至1.5％(w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中。
3.如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基苯磺酸钠(SDBS)。
4.如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述血清白蛋白为哺乳动物的血清白蛋白。
5.如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。
6.如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述细胞处理组合物的pH在3至5.5之间。
7.如权利要求1所述的细胞处理组合物，进一步包含离液序列高的盐。
8.如权利要求7所述的细胞处理组合物，其中所述组合物包含浓度为20至250mM的离液序列高的盐。
9.如权利要求7所述的细胞处理组合物，其中所述离液序列高的盐包含高氯酸盐、硫氰酸盐、或它们的组合。
10.一种包含如权利要求1所述的细胞处理组合物和含有固定的白细胞的生物样品的组合，其中所述组合的pH值在5.5和7之间。
11.如权利要求10所述的组合，所述生物样品包含全血、骨髓、或分离的白细胞的亚群。
12.如权利要求10所述的组合，所述白细胞包含淋巴细胞或单核细胞。
13.一种用于处理分离的生物样品的方法，所述样品包含至少白细胞，所述方法包含下列步骤：
(a)固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中加入足量的所述固定剂以实现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联；以及
(b)透化步骤，其包含使所述固定的生物样品与权利要求1所述的细胞处理组合物相接触。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包含：
(c)标记步骤，其包含使所述经透化的生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂相接触。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述方法包括将所述生物样品与所述固定剂在15℃至30℃的温度之间温育5至15分钟。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述方法包括将所述固定的生物样品与所述细胞处理组合物在20℃至50℃的温度之间温育2至10分钟。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述方法包括清洗所述透化的生物样品。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞处理组合物透化所述白细胞和暴露所述白细胞的细胞内表位。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞内表位包含磷酸表位。
20.如权利要求13所述的方法，所述生物样品包含全血、骨髓、或分离的白细胞的亚群。
21.如权利要求13所述的方法，所述白细胞包含淋巴细胞或单核细胞。
22.一种试剂盒，其包含：
如权利要求1所述的细胞处理组合物；和
包含血清白蛋白、和高氯酸盐或硫氰酸盐的细胞培养剂。
23.如权利要求22所述的试剂盒，所述细胞培养剂包含：
pKa在中性pH范围内的缓冲液，缓冲液的浓度为从1至50mM；
血清白蛋白，血清白蛋白的浓度为从0.2至20％(w/v)；
高氯酸盐或硫氰酸盐，高氯酸盐或硫氰酸盐的浓度为从50至250mM；和
防腐剂，防腐剂的浓度为从0.01至0.2％(v/v)；
以及所述细胞培养剂的pH为从6至9。
24.如权利要求22所述的试剂盒，进一步包含pH值为7至7.5的清洗组合物，所述清洗组合物包含：
磷酸盐缓冲液；
甲醛，甲醛的浓度为从0.1至2％(v/v)；
普朗尼克F68，普朗尼克F68的浓度为从0.01至1％(v/v)；以及
月桂酰肌氨酸，月桂酰肌氨酸的浓度为从0.005至0.05％(v/v)。
25.如权利要求22所述的试剂盒，进一步包含至少一种对细胞内表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。
26.如权利要求22所述的试剂盒，进一步包含至少一种对细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂。
27.如权利要求22所述的试剂盒，进一步包含固定剂，所述固定剂包含甲醛。
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