KR20150102075A - 고정된 혈액 세포를 투과화시키기 위한 조성물 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고정된 혈액 세포를 투과화시키기 위한 세포 처리 조성물, 상기 조성물의 용도, 생물학적 샘플을 고정화시키고, 이어서 상기 생물학적 샘플을 상기 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 처리 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 세포 처리 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2013년 12월 23일 출원되었고, 2012년 12월 28일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 61/747,044를 우선권 주장하며, 이 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 고정된 혈액 세포를 투과화시키기 위한 세포 처리 조성물, 상기 세포 처리 조성물의 용도, 및 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프, 예를 들어 포스포-에피토프 분석을 위해 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 세포 처리 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
최근의 세포, 예컨대 혈액 세포 분석의 발전이 세포내 및 세포 표면상 둘 모두에서의 세포 구조에 관한 상세한 분석에 대해 가치있는 도구를 제공하였다. 일반적으로는 각각의 세포 구조의 존재를 검출하여 특정한 관심 세포를 확인하기 위하여 정의된 세포외 및/또는 세포내 마커에 특이적인 모노클로날 항체와 같은 다중 표지화된 결합제로 세포를 염색시킨다. 예를 들어, 백혈구의 상이한 서브세트는 보통 특이적인 세포 표면 마커에 의해 구별되며, 동시에 각종 세포내 마커, 예컨대 세포질 또는 핵 관련 구조는 연구되는 세포의 기능상의 특징을 연구하는데 있어 점점 더 중요해지고 있다. 이어서, 상기 특이적인 결합제에 의해 표지화된 세포는 각종 표지와 다른 세포 특성, 예컨대 입상 및 크기를 검출하고 그를 구별할 수 있는 적합한 장치, 바람직하게는 유동 세포측정기에 의해 분석될 수 있다.
초기에는 유동 세포측정법을 적용시키는 것이 각 항체를 통해 쉽게 접근이 가능했던 세포 표면 항원을 검출하는데 주로 관련이 있었지만, 세포내 표적 부위에 대해 특이적인 각 결합제에 대해 투과가능한 세포막을 만들기 위해서는 세포를 특수 전처리를 하여야 하기 때문에 세포내 표적 부위를 표지화시키는 것이 더욱 큰 도전 과제를 제기하고 있다. 세포막이 형광 표지화된 항체와 같은 큰 분자에 충분히 투과가능하도록 만들어야 하기 때문에 상기 투과화는 중요한 단계이다. 동시에, 상이한 세포 집단의 세포 구조는 그 상태 그대로 충분히 보존되어야 하며, 이로써 각각의 특징적인 광 산란 특성은 유지되고, 세포질 단백질은 세포외 공간으로 상실되지 않고, 세포내에 그대로 국재화된다. 고정화 단계는 상기 안정화를 위해 보통 투과화 단계 이전에 또는 그와 함께 사용된다. 이러한 구조적 보존은 보존 조건이 더욱 엄격할 때, 즉 더욱 강력한 단백질 변성 방법이 적용될 때에 더 어려워진다.
요구되는 고정화 반응은 빈번하게는 각 결합제를 통해 세포 하위유형을 구별하는데 사용되는 표현 항원의 접근가능성을 파괴시키거나 또는 적어도 그를 감소시킬 수 있는, 예컨대 포름알데히드와 같은 공격적인 시약을 사용하는 것을 포함한다. 그러므로, 일부 이전의 조기 방법들은 각각의 표지화된 결합제로 세포 표면 구조를 표지화시키는 초기 단계를 포함하였다. 이어서, 세포를 고정화시키고, 투과화시키고, 세포내 표적에 특이적인 상이한 결합제로 처리하였다. 이어서, 그렇게 표지화된 세포를 검출하고, 예컨대 유동 세포측정기로 분류하였다. 그러나, 투과화 방법에서, 현재도 사용되는 바와 같이, 필요한 성분들 (포름알데히드, 알콜 및 세제)은 서로 및 후속되는 결합제로서의 항체의 사용과 상용성을 띠지 않는다. 그러므로, 방해하는 시약 잔류물을 제거하기 위해서는 다회에 걸친 세포 세척 단계가 요구된다. 그러나, 그러한 엄격한 처리 조건이, 각각의 표적 집단, 예컨대 CD14를 확인하는데 빈번하게 사용되는 일부의 보다 감수성인 세포 표면 항원의 항원 반응성을 쉽게 파기시킬 수 있다.
세포 신호전달과 관련하여, 단백질은 대개 가역적으로 인산화된다. 이러한 역학적 인산화 과정은 인산화 및 탈인산화 반응과 경쟁하는 것을 포함하고, 임의의 주어진 순간에 인산화 수준은 그 순간의 상기 반응을 촉매화하는 단백질 키나제 및 포스파타제의 상대적인 활성을 반영한다. 그러므로, 포스포-에피토프 분석은 개별 세포 내의 신호화 및 대사 과정을 조절하는 것에 관하여 실시간으로 가치있는 통찰력을 제공할 수 있다. 따라서, 연구 및 진단 적용을 위해, 각종의 신호 전달 효소, 예컨대 포스포키나제, 예컨대 미토겐 활성화된 단백질 키나제의 인산화 상태 분석은 점점 더 중요해지고 있다. 상기 인산화 연구의 중요한 적용은, 예를 들어 암 또는 자가면역 질환의 치료인데, 여기서 특정 포스포-에피토프의 인산화 또는 탈인산화는 환자에게 투여되거나 또는 시험관내에서 시험되는 포스포키나제 억제제 약물의 효능을 나타낼 수 있다.
일반적으로는 포스포-에피토프를 각각의 특이적인 결합제에 노출시키는 것이 (또는 "비차폐화"시키는 것이) 어렵다는 것은 잘 확립되어 있다. 일부 경우에, 이들 에피토프는 효과적인 항체 결합을 위해서는 에피토프 부위에서의 단백질 변성이 필요할 수 있는 선형 에피토프이다. 인산화된 Stat-5 단백질의 포스포-에피토프가 노출이 특히 어려운 포스포-에피토프의 일례이다. 일반적으로, 매우 엄격한 변성 조건이 상기 에피토프에 노출되어야 할 것이다. 그러나, 세포 구조 뿐만 아니라 세포내 및 세포외 에피토프가 상기 공격적인 처리에 의해 심각하게 손상될 수 있는 상당한 위험이 있다.
종래 방법에 따라, 예컨대 p-Stat-5와 같은 포스포-에피토프를 검출하는 것은 상기 에피토프를 비차폐화시키기 위해 알콜과 함께 인큐베이션시키는 것을 필요로 한다. 그러나, 알콜은 또한 세포 구조를 변형시킬 수 있고, 세포 표면 마커를 파괴시킬 수 있다. 또한, 그의 사용은 후속되는 분석을 제한하고, 처리된 세포로부터 알콜을 분리하는데 적어도 하나의 원심분리 단계가 요구된다.
적혈구를 포함하는 샘플, 예를 들어 말초 혈액 샘플이 분석을 위해 사용되는 경우에는 언제나, 상기 적혈구를 용해시키는 것은 중요하기는 하지만, 번거로운 단계이다. 백혈구 및 적혈구가 전혈 중 약 1/1,000의 비율로 포함되어 있는 바, 바람직하게는 백혈구를 분별 또는 구별할 수 있도록 하기 위해서는 적혈구를 완전하게 용해시키는 것이 필요하다.
그러므로, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는, 세포외 에피토프의 상응하는 결합제에 대한 접근가능성은 유지시키면서, 세포내 에피토프, 예컨대 포스포-에피토프가 각각의 특이적인 결합제에 대해 접근가능하게 만들기 위한, 고정된 세포, 특히 백혈구 또는 그의 하위부류의 처리를 위한 개선된 조성물, 방법 및 키트를 제공하는 것이다. 세포외 표적과, 노출이 어려운 세포내 표적, 예컨대 특정의 포스포-에피토프를 동시에 분석할 수 있는 쉽고 실용적인 방법이 요구되고 있다. 바람직하게, 상기 방법은 신속하고, 용이하게 자동화할 수 있어야 하며, 매우 노동 집약적이지 않아야 하고, 알콜 처리 단계를 필요로 하지 않을 것이며, 세포내 표적 및 세포외 표적 둘 모두에 대한 결합제를 포함하는 결합제 칵테일 사용을 허용할 것이다.
상기 기술상의 문제점들에 대한 해결안은 본원에 기술된 고정된 혈액 세포의 투과화를 위한 세포 처리 조성물 및 청구범위에서 특징화된 실시양태에 의해 달성된다.
본 발명의 한 측면은
(a) 0.3% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로 조성물 중에 포함되어 있는 1종 이상의 음이온성 표면 활성제로서, 여기서 상기 음이온성 표면 활성제의 염은 하기 화학식 1로 표시되는 것인 음이온성 표면 활성제:
<화학식 1>
(상기 식에서,
Y는 R--O 또는 R이고, R은 8 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알킬렌, 아릴, 알킬렌-알킬, 아릴-알킬 또는 아릴-알킬렌 기를 나타내고, X는 1가 양이온을 나타냄), 및
(b) 0.2% (w/v) 내지 20% (w/v)의 농도로 조성물 중에 포함되어 있는 혈청 알부민
의 수용액을 포함하며, pH가 약 2 내지 약 6인, 고정된 혈액 세포의 투과화를 위한 세포 처리 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 측면에 따라, 상대적으로 고농도의 음이온성 표면 활성제는 세포의 보호 처리와 함께, 즉 산성 pH 값의 혈청 알부민의 사용과 함께 조합된다. 놀랍게도, 산성 pH에서 혈청 알부민은 단백질에 결합하여, 심지어 상승된 농도의 음이온성 표면 활성제의 강력한 변성 효과에 대해서도 충분히 보호할 수 있는 것으로 나타났다. 혈청 알부민의 이러한 보호 효과는 pH 값이 높을수록 훨씬 덜 뚜렷하게 나타나는 것으로 관찰되었다. 그러므로, 본 발명의 실시양태에 따라, 고도로 엄격한 변성 조건을 사용하여 다르게는 접근가능성이 열악한 에피토프, 예컨대 특정 포스포-에피토프, 예컨대 pStat-5, pStat-3, pStat-1, p-ERK1/2, 또는 p-S6을 변성시키고 노출시키는 반면, 분석되는 세포 및 그의 세포하 성분의 구조적 완전성은 산성 pH의 혈청 알부민을 동시에 사용함으로써 효과적으로 보호된다.
바람직한 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 pH 2 내지 6에서 0.2% (w/v) 내지 20% (w/v)의 혈청 알부민을 포함하며, 여기서 세포 처리 조성물의 pH는 2 내지 6이고, 2.5 내지 5.5일 수 있고, 3 내지 5일 수 있고, 3.5 내지 4.7일 수 있고, 4.0 내지 4.4일 수 있고, 대개는 약 4.2이다.
본 발명에 따른 세포 처리 조성물은 고정된 혈액 세포를 처리할 수 있도록 특별히 적합화된다. "고정된 혈액 세포"라는 용어는 전체 세포 및 세포하 구조를 안정화시키기 위해 충분한 양의 고정제, 즉 가교제, 예컨대 포름알데히드, 파라포름알데히드, 포르말린 등으로 처리된 혈액 세포를 포함한다. 통상의 기술자는 상기 목적에 적합한 고정 제제에 대해 잘 알고 있다. 사전에 고정화시키지 않을 경우, 세포는 본 발명의 세포 처리 조성물에 의해 제공되는 엄격한 변성 조건에 의해 심각하게 손상될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 백혈구의 투과화, 및 백혈구 내에 포함되어 있는 에피토프, 특히 포스포-에피토프의 비차폐화를 위해 사용된다. 세포 처리 조성물을 사용하기 전, 포름알데히드 또는 또 다른 알데히드가 2% (w/v) 내지 6% (w/v), 또는 3% (w/v) 내지 5% (w/v), 또는 바람직하게는 약 4% (w/v)의 농도로 구성되는 고정화제에 말초 혈액 샘플, 예를 들어 전혈 샘플로부터의 백혈구를 가함으로써 상기 백혈구를 고정시킨다. 고정화는 세포를 분해로부터 보호할 뿐만 아니라, 포스포-키나제 및 포스포릴라제의 작용을 차단하면서, 세포를 실제 활성화를 검출하는 목적에 필수적인 인산화 상태로, 즉 분석되는 포스포-에피토프의 인산화 상태로 동결시킨다. 다르게는, 특이적인 결합제로 상기 세포의 세포내 및/또는 세포외 구조를 표지화시키는 것과 같은 후속 세포 처리 단계가 분석되는 세포의 활성화 패턴을 변형시켜 수득되는 결과를 왜곡시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 세포 처리 조성물은 고정된 혈액 세포, 특히 백혈구(leukocyte) (이는 또한 백혈구(white blood cell)로도 불림) 및 단핵구, 림프구, 과립구, 호중구, 호산구 및 호염기구를 포함하나 이에 제한되지 않는 백혈구의 각종 하위분류와 함께 사용하는데 적합하다. 혈액 세포는 공지된 기법을 이용하여 특히 인간, 마우스, 래트, 염소 등을 비롯한 포유동물로부터의 말초 혈액 또는 조직으로부터 획득될 수 있다. 본 발명에 따른 세포 처리 조성물은 인간 말초 혈액 샘플로부터의 고정된 혈액 세포를 처리할 수 있도록 특별히 적합화된다. 적합한 조직 유래 샘플의 일례로는 뮤린 비장세포가 있다.
"음이온성 표면 활성제"라는 용어는 또한 음이온성 세제, 음이온성 계면활성제 및 음이온성 텐시드(tenside)를 포함하여야 한다. 음이온성 표면 활성제는 음이온성 작용기 및 친수성 부분을 포함한다. 음이온성 작용기는 바람직하게 술페이트 또는 술포네이트이다. 친수성 부분은 바람직하게 8 내지 18개의 탄소 원자로 이루어진 알킬 기, 아릴 기 또는 알킬-아릴 기를 포함한다.
상기 음이온성 표면 활성제는 0.3% (w/v) 내지 2% (w/v)의 상대적으로 고함량으로 세포 처리 조성물에 함유되어 있으며, 세포막 투과화 및 세포내 에피토프의 "비차폐화" 둘 모두에 있어서 주된 역할을 한다. "에피토프를 비차폐화시킨다"라는 용어는 "차폐화된" 버전의 에피토프와는 대조적으로, 상응하는 검출가능하게 표지화된 결합제에 대하여 "비차폐화된" 에피토프의 접근가능성이 확립되거나 또는 적어도 증가되도록 하는 것임을 나타내어야 한다. 다시 말해, "비차폐화" 과정을 통해 상기 과정 이전에 항체에 의해 인식될 수 없었던 세포 구조가, 예컨대 상기 항체를 통해 검출될 수 있게 된다.
본원에서 사용되는 바, "투과화"라는 용어는 세포의 전체 구조는 파괴시키지 않으면서, 상기 세포를 거대 분자, 예컨대 항체 및/또는 더욱 큰 형광단, 예컨대 피코에리트린 또는 알로피코시아닌 또는 이들의 접합체에 대해 투과가능하게 만드는 과정에 관한 것이다.
본원 내에서 "에피토프"라는 용어는 특이적인 결합제, 예컨대 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 그의 면역활성 단편, 예컨대 F(ab)'2, Fab 또는 Fab' 단편에 의해 인식될 수 있는 임의의 표적 결합 부위를 포함하여야 한다. "표적 결합 부위"는, 예를 들어 세포 내에 또는 세포 표면 상에 존재하는 단백질의 적어도 일부, 또는 또 다른 분자의 적어도 일부일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "특이적인 결합제"라는 용어는 기본적으로 다른 에피토프는 인식하지 못하고 그에 결합하지 않으면서, 단 하나의 에피토프 또는 제한된 개수의 유사 에피토프를 특이적으로 인식하고 그에 결합할 수 있는 결합제를 나타내어야 한다.
현 임상 연구는, 예를 들어 약물 투여에 대한 반응으로 세포 신호전달 경로 및 그의 조절에 관한 분석에 주력하고 있다. 상기 신호전달 경로는 하나 이상의 정의된 활성화가능한 분자, 대개는 인산화될 수 있는 신호전달 단백질의 활성화, 대개는 특이적인 인산화를 포함한다. 본원의 범주 내에서 "활성화가능한 분자"라는 용어는 외인성 영향, 예컨대 또 다른 분자에 의해 유발된 인산화 반응을 통해 활성화될 수 있는, 즉 불활성 상태에서 활성 상태로 전환될 수 있는 분자를 기술하여야 한다. 따라서, 일례로 활성화가능한 분자는 특이적인 위치에서 인산화될 수 있거나 또는 탈인산화될 수 있는 세포질 단백질일 수 있다.
인산화된 분자, 예컨대 포스포-단백질을 검출하는 것이 고도로 바람직하지만, 상기 분자의 특이적인 인산화된 부위는 빈번하게는 "차폐화되고," 예컨대 인산화 상태에 특이적인 항체를 통해 표적화되기 어렵다. 선행 기술의 방법들은 현재까지 상기 문제점들에 대해 만족할 만한 해결안을 제공하지 못하고 있다. 특히 포스포르-단백질을 비차폐화시키고 이어서 검출하는데 요구되는 고도로 엄격한 세포 처리 조건을 사용하는 것이 현재까지는 상기 조건이 세포 구조의 완전성 및 항원성 부위를 쉽게 파괴시키거나 심각하게 손상시킬 수 있다는 사실로 인해 제한을 받아왔다. 그러므로, 예컨대 고함량의 세제 사용을 통해 엄격한 세포 처리 조건을 사용하는 것이 현재까지는 적합한 옵션이 되지 못했다.
"포스포-에피토프," "인산화된 표적" 및 "인산화 부위"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 인산화된 상태 및 탈인산화된 상태로 존재할 수 있는, 바람직하게는 세포내 단백질의 세포 구조의 정의된 위치를 기술하여야 한다. "포스포-에피토프"는 인산화된 형태 또는 탈인산화된 형태를 특이적으로 인식할 수 있는 특이적인 결합제, 예컨대 모노클로날 항체에 대해 활성화 상태 특이적 인식 부위로서의 역할을 할 수 있다. 예컨대, 유동 세포측정 방법을 통해 "포스포-에피토프"의 인산화 상태를 검출함으로써, 인산화 기반 세포 신호전달은 편리하게 연구될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 세포 처리 조성물은 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 포타슘 도데실 술페이트, 암모늄 도데실 술페이트 및 소듐 도데실벤젠술포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성 표면 활성제의 1종 이상의 염을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 처리 조성물에 포함되어 있는 음이온성 표면 활성제는 도데실 술페이트, 바람직하게는 SDS 형태이다. 일반적으로, 화학식 1의 1가 양이온은 바람직하게 Li+, Na+ 및 K+ 및 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
한 실시양태에서, 음이온성 표면 활성제는 화학식 1로 표시되며, 여기서 R은 10 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알킬렌, 아릴, 알킬렌-알킬, 아릴-알킬 또는 아릴-알킬렌 기를 나타낸다. 바람직하게, R은 12 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴-알킬 기를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 음이온성 표면 활성제는 화학식 1로 표시되며, 여기서 R은 8 내지 16개의 탄소 원자, 바람직하게는 10 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타낸다.
한 실시양태에서, R은 선형 또는 분지형 알킬 기를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, R은 벤젠부 및 알킬부를 포함하고, 여기서 알킬부는 분지형 또는 선형이고, 벤젠부에 공유적으로 연결된다.
한 실시양태에서, R은 12 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 아릴 또는 아릴-알킬 기를 포함하고, 여기서 하나의 탄소 원자는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 원자로 치환된다.
알킬 기는 선형 또는 분지형일 수 있고 오직 단일 결합 탄소 및 수소 원자로 이루어진 작용기 또는 측쇄이다.
아릴 기는 방향족 고리, 예를 들어 페닐로부터 유도된 작용기 또는 치환기이다.
아릴-알킬 기는 알킬 기 및 알릴 기가 공유적으로 연결된, 알킬 기 및 아릴 기로 이루어진 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 세포 처리 조성물의 염 농도는, 고정된 생물학적 샘플 및 세포 처리 조성물이 조합되었을 때, 기본적으로 생리학적인 염 농도로 동조되도록 조정된다. 샘플 부피 및 유형이 달라짐에 따라, 세포 처리 조성물의 염 농도는 그에 따라 조정되어야 할 수도 있다. 기본적으로 생리학적인 염 농도의 이온 강도는 중간 정도이며, 따라서 세포 구조에 뿐만 아니라 후속 분석 동안 사용되는 항체에 보호 기능을 제공한다. 상기 중간 정도의 이온 강도를 제공하기 위해, 세포 처리 조성물의 전도도는 바람직하게 9 mS/cm 초과이다.
또 다른 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 본질적으로 알콜을 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 세포 처리 조성물의 pH 값은, 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플 및 세포 처리 조성물이 조합되었을 때, 상기 조합물의 pH 값이 5 내지 7, 또는 5.1 내지 6.8, 또는 5.2 내지 6.6, 또는 5.3 내지 6.4, 또는 5.35 내지 6.3, 또는 5.4 내지 6.2, 또는 5.45 내지 6.1, 또는 5.5 내지 6.0, 또는 5.55 내지 5.9, 또는 5.6 내지 5.8이 되도록, 또는 약 5.7이 될 수 있도록 조정된다.
산성 조건에서의 혈청 알부민의 보호 기능과는 별도로, 산성 환경은 또한 단백질 상의 음전하를 감쇄시키고, 소수성 상호작용을 지원하며, 이로써 세포의 추가의 고정화가 이루어지게 된다. 본 발명의 경우에, 세포 용해가 음이온성 세제의 존재하에서 수행될 때, 산성 조건은 또한 세제의 음전하를 감쇄시키고, 이로써 세제의 공격성이 약화된다.
따라서, 본 발명의 상기 측면에 따른 세포 처리 조성물은 유리하게는 하나의 단일 단계로 적혈구를 용해시키는 데, 세포막을 투과화시키는 데, 및 백혈구를 추가로 고정화시키고, 세포 에피토프, 특히 세포내 포스포-에피토프를 비차폐화/노출시키는 데 효과적이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 음이온성 표면 활성제가 상기 세포 처리 조성물 중에 0.3 내지 2% (w/v)의 농도로, 0.4 내지 1.9% (w/v)의 농도로, 또는 0.45 내지 1.8% (w/v)의 농도로, 또는 0.5 내지 1.7% (w/v)의 농도로, 또는 0.55 내지 1.6% (w/v)의 농도로, 또는 0.6% 내지 1.5% (w/v)의 농도로, 또는 0.65 내지 1.4% (w/v)의 농도로, 또는 0.7 내지 1.3% (w/v)의 농도로, 또는 0.8 내지 1.2% (w/v)의 농도로, 또는 0.3 내지 2% (w/v)의 농도로, 또는 0.9% 내지 1.1% (w/v)의 농도로, 또는 약 1.0% (w/v)의 농도로 포함되어 있는, 상기 제공된 바와 같은 세포 처리 조성물에 관한 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 놀랍게도 산성 조건의 혈청 알부민과 상승된 농도의 음이온성 표면 활성제를 조합하여 사용하였을 때, 세포 구조는 기본적으로 그대로 보존되면서, 세포 투과화가 성공적으로 이루어졌고, 세포내 에피토프의 비차폐화도 매우 효율적으로 이루어졌다는 것을 발견하게 되었다.
한 실시양태에서 세포 처리 조성물은 음이온성 표면 활성제로서 0.9% (w/v) 내지 1.3% (w/v), 바람직하게는 약 1 내지 1.1% (w/v)의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 상기 세포 처리 조성물은 비차폐화시키는 데 특히 효과적이었다. 농도가 2% (w/v) 초과인 음이온성 표면 활성제를 포함하는 세포 처리 조성물을 사용한 대조군 실험에서, 세포 구조의 안정성에 관하여 부정적인 효과가 관찰되었다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 음이온성 표면 활성제가 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 또는 소듐 도데실벤젠술포네이트 (SDBS)인, 상기 제공된 바와 같은 세포 처리 조성물에 관한 것이다.
SDS는 매우 일반적이고, 쉽게 이용가능하며, 비독성인 세제이다. 비용면에서도 효율적임과 동시에, SDS는 효력이 매우 강력한 세제이고, 이상적으로는 사용되는 본 세포 처리 조성물 중에서 음이온성 표면 활성제로서 포함되도록 적합화된다.
SDS 분자는 고도로 극성인 부분 및 고도로 소수성인 부분을 포함한다. 이는 가장 강력한 단백질 변성 음이온성 세제 중 하나로 간주된다. 세포 처리 조성물의 산성 환경하에서, SDS의 전하 및 극성은 다소 감쇄된다. 그러나, 세제는 단백질의 변성을 유도하면서 단백질에 음전하를 부가함과 동시에 관심 영역에 결합할 것이며, 이어서 하기 기술되는 바와 같이, 세포를 세척하고, 중성 인큐베이션 시약 중에 용해시킬 때, 그의 전체 용량을 회복하게 될 것이다. 덜 강력한 음이온성 세제, 비이온성 세제, 쯔비터이온 세제 또는 글리코시드, 예컨대 사포닌은 산성 환경에서 SDS가 단백질을 변성시키는 방식과 비교하였을 때, 음전하를 부가하지 않거나, 덜 부가할 것이며, 이로써 단백질을 변성시키지 않거나, 덜 효과적으로 변성시킬 것이다.
농도가 상승된 염 존재하에 산성 조건에서 SDS 및 혈청 알부민을 조합하였을 때, 일시적인 백색 침전을 관찰할 수 있다. SDS 및 혈청 알부민의 복합체는 불용성 상태에서 가용성 상태로 쉽게 변할 수 있다는 것은 명백하다. 이는 SDS가 응집된 미셀 상태에서 가용성 미셀 상태로 쉽게 전이된다는 이유에 기인한다는 것이 가능성이 가장 크다. 세포 단백질의 미세환경에서의 상기 복합체의 침전은 세포 성분 및 세포 구조를 전체적으로 추가로 고정시킬 수 있다. 본 발명에서, 산성 조건에서의 상기 추가의 고정화는 적혈구가 아닌 백혈구에 대해 이루어지게 되며, 적혈구는 처리에 의해 용해된다.
SDS와 비교하였을 때, SDBS는 고정된 세포를 투과시키고, 그 안에 함유되어 있는 포스포-에피토프를 비차폐화시키는 데 있어 유사한 잠재능을 가지고는 있지만, SDS는, 예를 들어 CD14 항원과 같은 감수성인 표면 구조에 대해서 더욱 우수한 보호 효과를 갖는 것으로 보인다 (실시예 4 참조).
추가의 실시양태에 따라, 세포 처리 조성물의 상기 음이온성 표면 활성제는 SDS 또는 SDBS, 또는 SDS 및 SDBS의 조합물이며, 여기서 상기 SDS, SDBS, 또는 SDS 및 SDBS의 누적 농도는 0.3 내지 2% (w/v), 또는 0.4 내지 1.9% (w/v), 또는 0.45 내지 1.8% (w/v), 또는 0.5 내지 1.7% (w/v), 또는 0.55 내지 1.6% (w/v), 또는 0.6% (w/v) 내지 1.5% (w/v), 또는 0.65 내지 1.4% (w/v), 또는 0.7 내지 1.3% (w/v), 또는 0.8 내지 1.2% (w/v), 또는 0.3 내지 2% (w/v), 또는 0.9% (w/v) 내지 1.1% (w/v) 또는 약 1.0% (w/v)이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 혈청 알부민이 포유동물 혈청 알부민, 바람직하게는 소 혈청 알부민인, 상기 제공된 바와 같은 세포 처리 조성물에 관한 것이다.
혈청 알부민은 천연적으로 포유동물 혈액 중에 존재한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 처리 조성물은 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 또는 다른 포유동물 공급원으로부터의 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다.
혈청 알부민은 특히 산성 pH에서 세포 및 항원에 대해 보호 효과를 가진다 (실시예 5 참조). 추가의 실시양태에서, 본 발명의 세포 처리 조성물은 0.2% (w/v) 내지 15% (w/v), 또는 0.4% (w/v) 내지 14% (w/v), 또는 0.6% (w/v) 내지 13% (w/v), 또는 0.8% (w/v) 내지 12% (w/v), 또는 1.0% (w/v) 내지 11% (w/v), 또는 1.2% (w/v) 내지 10% (w/v), 또는 1.4% (w/v) 내지 9% (w/v), 또는 1.6% (w/v) 내지 8% (w/v), 또는 1.8% (w/v) 내지 7% (w/v), 또는 2.0% (w/v) 내지 6% (w/v), 또는 2.1% (w/v) 내지 5% (w/v), 또는 2.2% (w/v) 내지 4% (w/v), 또는 2.3% (w/v) 내지 3% (w/v), 또는 2.4% (w/v) 내지 2.7% (w/v) 또는 약 2.5% (w/v)의 농도로 혈청 알부민을 포함한다. 0.2% (w/v) 미만의 농도로 혈청 알부민을 포함하는 세포 처리 조성물이 세포 구조 및 세포 항원을 보호하는데 있어 다소 비효과적이다. 농도가 3% (w/v) 미만일 경우, 포스포-단백질이 최적으로 비차폐화되는 반면, 농도가 2% (w/v) 이상일 때 최적으로 보호될 것이다. 혈청 알부민의 농도가 (20% (w/v) 초과로) 너무 높으면 포스포-단백질의 항원성 부위의 비차폐화에 대한 세제의 효과는 감쇄될 것이다.
바람직한 실시양태에 따라, 세포 처리 조성물 중에 포함된 혈청 알부민의 농도는 이와 같이 조정되며, 단계 (b)의 생성된 혼합물 중 분석되는 포유동물 생물학적 샘플에 포함된 포유동물 혈청 알부민, 및 단계 (b)에서 본 발명의 세포 처리 조성물을 통해 첨가된 혈청 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민의 조합된 혈청 알부민 농도는 0.2% (w/v) 내지 15% (w/v), 또는 0.4% (w/v) 내지 14% (w/v), 또는 0.6% (w/v) 내지 13% (w/v), 또는 0.8% (w/v) 내지 12% (w/v), 또는 1.0% (w/v) 내지 11% (w/v), 또는 1.2% (w/v) 내지 10% (w/v), 또는 1.4% (w/v) 내지 9% (w/v), 또는 1.6% (w/v) 내지 8% (w/v), 또는 1.8% (w/v) 내지 7% (w/v), 또는 2.0% (w/v) 내지 6% (w/v), 또는 2.1% (w/v) 내지 5% (w/v), 또는 2.2% (w/v) 내지 4% (w/v), 또는 2.3% (w/v) 내지 3% (w/v), 또는 2.4% (w/v) 내지 2.7% (w/v) 또는 약 2.5% (w/v)이다. 상기 혼합물의 pH는 5 내지 7, 또는 5.1 내지 6.8, 또는 5.2 내지 6.6, 또는 5.3 내지 6.4, 또는 5.35 내지 6.3, 또는 5.4 내지 6.2, 또는 5.45 내지 6.1, 또는 5.5 내지 6.0, 또는 5.55 내지 5.9, 또는 5.6 내지 5.8이어야 하고, 약 5.7일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 혼합물의 산성 혈청 알부민은 혈청 알부민 그 자체에 의해, 및 바람직하게는 또한 소량의 포스페이트 첨가에 의해 완충되며, 여기서 포스페이트는 혼합물 중에 20 mM 미만, 또는 16 mM 미만, 또는 12 mM 미만, 또는 9 mM 미만, 또는 6 mM 미만, 또는 4 mM 미만 또는 약 2 mM의 농도로 포함된다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 pH가 3 내지 5.5인, 상기 제공된 바와 같은 세포 처리 조성물에 관한 것이다. 추가의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 세포 처리 조성물의 pH는 3.8 내지 4.6, 바람직하게는 약 4.2이다.
바람직하게, 세포 처리 조성물의 pH는 2 내지 6, 또는 2.3 내지 5.8, 또는 2.6 내지 5.6, 또는 2.9 내지 5.4, 또는 3.2 내지 5.2, 또는 3.4 내지 5.0, 또는 3.6 내지 4.9, 또는 3.7 내지 4.7, 또는 3.8 내지 4.6, 또는 3.9 내지 4.5, 또는 4.0 내지 4.4, 또는 4.1 내지 4.3 또는 약 4.2이어야 한다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 카오트로픽 염을 추가로 포함하는, 상기 제공된 바와 같은 세포 처리 조성물에 관한 것이다.
"카오트로픽 염"이라는 용어는 거대분자, 예컨대 단백질 및 핵산을 변성시킴으로써 그의 구조를 파괴시킬 수 있는 물질을 나타내어야 한다. 카오트로픽 염은 또한 세포막의 지질 이중층의 소수성 영역을 파괴시킴으로써 세포막의 안정성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 특정 농도를 초과하는 경우, 상기 효과는 궁극적으로 세포 용해로 이어질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 클로라이드 염, 아이오다이드 염 및 퍼클로레이트 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 염화마그네슘, 구아니디늄 클로라이드, 아이오딘화나트륨, 리튬 퍼클로레이트 및 소듐 티오시아네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 처리 조성물 중에 포함되어 있는 카오트로픽 염은 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트 또는 이들의 조합이다. 상기 카오트로픽 염은 거대분자에서 국소적으로 pH를 감소시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여 본 발명의 범주 내에서 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
카오트로픽 염(들)은 유리하게는 SDS에 추가의 변성 잠재능을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 퍼클로레이트의 염 및 티오시아네이트의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 카오트로픽 염을 포함한다. 퍼클로레이트 및 티오시아네이트의 카오트로픽 염은 특히 포스포-에피토프, 예컨대 p-Stat5를 비차폐화시키는 데 효과적이다. 추가로, 고정된 혈액의 적혈구 용해는 퍼클로레이트 및 티오시아네이트 둘 모두에 의해 증진된다. 세포 처리 조성물의 엄격성을 증가시키는 대신, 단지 그 안에 함유되어 있는 음이온성 표면 활성제의 농도를 상승시킴으로써 퍼클로레이트 및/또는 티오시아네이트를 포함하는 세포 처리 조성물을 사용하는 것, 즉 세포 처리 조성물의 변성 잠재능을 사용하는 것이 바람직하다. 음이온성 표면 활성제의 농도가 과도하게 높을 경우, 세포 구조가 손상될 위험이 증가하게 된다. 따라서, 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트의 카오트로픽의 효과는 음이온성 표면 활성제, 예컨대 SDS의 기능과 마치 상호 보완적인 것처럼 보이며, 이는 포스포-에피토프, 예컨대 p-Stat5 에피토프를 비차폐화시키는 데 있어 더욱 특이적이다.
추가의 실시양태에서, 세포 처리 조성물은 20 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 230 mM, 또는 80 mM 내지 210 mM, 또는 110 mM 내지 190 mM, 또는 130 mM 내지 170 mM 또는 약 150 mM의 농도로 카오트로픽 염을 포함한다. 카오트로픽 염 농도가 250 mM 초과일 경우, 분석되는 세포의 완전성에 유해한 효과를 미칠 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 세포 처리 조성물은 퍼클로레이트 및/또는 티오시아네이트를 개별적으로 또는 조합하여 20 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 230 mM, 또는 80 mM 내지 210 mM, 또는 110 mM 내지 190 mM, 또는 130 mM 내지 170 mM, 또는 약 150 mM의 누적 농도로 포함한다. 상기 농도에서, 처리된 세포막의 완전성은 조절되는 방식으로 탈안정화되어 세포막의 투과화를 지원하게 된다. 또한, 상기 농도가 등삼투성 용액의 근사값에 가까울 경우, 인산화된 단백질, 예컨대 p-Stat5의 언폴딩은 촉진된다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 기술된 세포 처리 조성물 및 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 포함하며, 5.5 내지 7의 pH 값을 갖는 조합물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 조합물은 상기 기술된 세포 처리 조성물, 및 전혈 샘플, 백혈구의 단리된 하위집단을 포함하는 샘플 및 골수 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물, 바람직하게는 인간 기원의, 임의로 항응고제, 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)으로 처리된 전혈 샘플이다.
바람직한 실시양태에서, 조합물은 1,000 ㎕의 상기 기술된 세포 처리 조성물, 및 100 내지 400 ㎕, 바람직하게는 160 내지 250 ㎕, 가장 바람직하게는 약 200 ㎕의 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 포함하며, 여기서 상기 조합물의 pH 값은 5.5 내지 7, 바람직하게는 pH 약 5.6 내지 6, 가장 바람직하게는 pH 5.7이다.
"백혈구(white blood cell)"라는 용어는 림프구, 단핵구 및 과립구를 비롯한, 모든 종류의 백혈구(leukocyte)를 포함한다. 본 발명은 본 발명에 따른 세포 처리 조성물 및 관련된 방법을 사용함으로써 비차폐화될 수 있는 세포내 활성화가능한 포스포르-단백질을 포함하는 모든 백혈구에 적용가능하다.
한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고정된 림프구를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고정된 단핵구를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고정된 과립구를 포함한다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 고정된 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플의 처리를 위한, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명은 단리된 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플에 포함되어 있는 고정된 백혈구의 투과화를 위한, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다. 한 실시양태에 따라, 전혈 샘플을 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 포르말린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고정제로 처리함으로써 고정된 백혈구를 수득하였다. 바람직하게, 60 ㎕의 포름알데히드 용액 (10% (w/v))을 첨가함으로써 약 100 ㎕의 전혈 샘플을 고정시킨다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 단리된 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플에 포함되어 있는 고정된 백혈구의 투과화를 위한, 및 단리된 생물학적 샘플에 포함되어 있는 적혈구의 용해를 위한, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명은 추가로 단리된 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플에 포함되어 있는 고정된 백혈구의 투과화를 위한, 및 단리된 생물학적 샘플에 포함되어 있는 적혈구의 용해를 위한, 및 고정된 백혈구의 추가의 안정화를 위한, 및 고정된 백혈구에 포함되어 있는 세포내 에피토프의 비차폐화를 위한, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명은 추가로 고정된 백혈구의 투과화, 적혈구의 용해, 고정된 백혈구에 포함되어 있는 세포내 에피토프의 비차폐화 및 고정된 백혈구의 추가의 안정화가 단일 단계에서 동시에 이루어지도록 하기 위한, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도로서, 여기서 고정된 백혈구의 세포 표면 에피토프는 세포 처리 조성물을 상기와 같이 사용하는 동안 대개 보존되는 것인, 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 실시양태에 따라, 본 발명은 추가로 본질적으로 어떤 알콜도 세포 처리 조성물에 포함되어 있지 않은, 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 한 실시양태에 따라, 알콜 처리를 필요로 하는 현 방법에서와 같이 더 적은 회차의 원심분리 단계가 요구된다. 그러므로, 상기 종래 방법과 비교하였을 때 본 발명의 방법은 수행하기 더 쉽고, 더 빠르다.
본 발명은 추가로 고정된 백혈구를 상기 기술된 세포 처리 조성물에 의해 투과화시키고, 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제에 의해 표지화시키는 것인, 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 고정된 백혈구는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 또는 그의 면역활성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제로 표지화되고, 여기서 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제는, 예를 들어 형광 유동 세포측정법을 통해 형광 표지를 검출하는 적합한 검출 기술을 통해 상기 결합제를 확인할 수 있게 하는 검출가능한 표지, 바람직하게는 형광 표지로 표지화된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 1종 이상의 결합제의 검출가능한 표지는 형광성 표지, 비-형광성 발색단으로 이루어진 표지, 라만 분광법 표지, 방사성 표지 및 질량 분광측정 검출에 적합한 표지로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 검출가능한 표지, 바람직하게는 모든 검출가능한 표지는 사용되는 다른 검출가능한 표지로부터 분별가능하여야 하며, 이로써 표지를 검출함으로써 상응하는 결합제 및 궁극적으로 상기 결합제에 의해 처리되는 상응하는 항원성 구조를 명백하게 확인할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 고정된 백혈구가 세포내 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제 및 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제로 표지화되는 것인, 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 세포내 에피토프에 특이적인 다중 검출가능하게 표지화된 결합제, 및 세포외 에피토프에 특이적인 다중 검출가능하게 표지화된 결합제가 사용된다.
검출가능하게 표지화된 결합제의 예로는 제한 없이 하기 항체를 포함한다: 마우스 항-Stat5 (pY694)-PE (BD 바이오사이언시즈 파르민겐(BD Biosciences Pharmingen: 미국 캘리포니아주 산호세)), 마우스 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (E10) 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(®) 647 (셀 시그널링 테크놀로지 인크(Cell Signaling Technology Inc.: 미국 매사추세츠주 댄버스)), 포스포-p38 MAPK (T180/Y182) 알렉사 플루오르(®) 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스), 포스포-Stat1 (Tyr701) (58D6) 알렉사 플루오르(®) 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스), 포스포-Stat3 (Tyr705) (3E2) 알렉사 플루오르(®) 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스), 포스포-Akt (Ser473) (베크만 쿨터 인크.(Beckman Coulter Inc.: 미국 캘리포니아주 브레아), 제품 번호 A88915), 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (베크만 쿨터 인크., 제품 번호 A88921), 포스포- Stat3 (Tyr705) (베크만 쿨터 인크.: 미국 캘리포니아주 브레아, 제품 번호 A88925), 포스포-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (베크만 쿨터 인크.: 미국 캘리포니아주 브레아, 제품 번호 A88933), 포스포-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236) (베크만 쿨터 인크.: 미국 캘리포니아주 브레아, 제품 번호 A88936), 포스포-Stat1 (Tyr701) (베크만 쿨터 인크.: 미국 캘리포니아주 브레아, 제품 번호 A88941), 포스포-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (베크만 쿨터 인크.: 미국 캘리포니아주 브레아, 제품 번호 A88944).
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 추가로 인산화된 상태의 또는 탈인산화된 상태의 포스포-에피토프, 바람직하게는 세포내 포스포-에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제에 의해 표지화되는 것인, 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, Stat-5, 바람직하게는 그의 인산화된 형태의 것에 특이적인 검출가능하게 표지화된 결합제가 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 검출가능하게 표지화된 결합제(들)는 별개로 제공되고, 본 발명에 따른 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플 및 세포 처리 조성물의 조합물에 첨가된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 검출가능하게 표지화된 결합제(들)는 먼저 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 조합된다. 이어서, 검출가능하게 표지화된 결합제(들) 및 세포 처리 조성물의 수득된 조합물이 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플에 첨가된다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 추후 검출가능하게 표지화된 결합제로 표지화시키고, 유동 세포측정 장치, 바람직하게는 형광 유동 세포측정 장치로 분석하기 위하여 적어도 부분적으로 노출된 세포내 포스포-에피토프를 포함하는 투과화된 백혈구를 제조하기 위한 상기 기술된 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에피토프(들)를 비차폐화시키는 데 고정된 백혈구의 어떤 알콜 처리도 필요하지 않는 것인, 세포내 에피토프, 바람직하게는 하나 이상의 포스포-에피토프를 비차폐화시키기 위한 세포 처리 조성물의 용도에 관한 것이다. 알콜은 다른 검정용 시약을 방해할 수 있고, 세포 표면 마커가 알콜에 의해 파괴될 수 있으며, 처리된 세포를 분석 이전에 알콜로부터 다시 분리시키기 위해서 추가의 원심분리 단계가 요구될 수 있는 바, 알콜 사용을 피하는 것이 이롭다.
본 발명의 추가의 측면은
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계
를 포함하는, 적어도 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 바람직하게, 유동 세포측정기를 통한 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 유동 세포측정 분석을 위한 단리된 생물학적 샘플을 제조하기 위하여, 상기 생물학적 샘플에 대해 고정화 단계를 수행한 후, 이어서 그에 대해 투과화 단계를 수행함으로써 단리된 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 하나 이상의 세포내 에피토프 및 하나 이상의 세포외 에피토프 둘 모두 각각 특이적인 결합제로 표지화되고, 이어서 세포측정기 장치로 분석된다.
한 실시양태에 따라, 고정화 단계 (a)는 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을, 상기 백혈구의 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양의 고정제 (고정화 시약)와 접촉시켜, 이로써 구조상 보존되는 고정된 백혈구가 수득되는 것을 포함한다. 이와 관련하여, "충분한 양"이라는 용어는 고정제 농도가, 고정제 및 생물학적 샘플이 조합되었을 때, 후속되는 투과화 단계 (b)에서 상기 세포의 파괴 또는 투과화된 세포막을 통한 세포질 분자의 손실을 막기 위해, 생성된 고정제의 농도가 백혈구를 안정화시키는 효과적인 농도가 되도록 선택된다는 것을 의미하여야 한다.
바람직하게, 알데히드 기재 고정제, 예컨대 포름알데히드, 파라포름알데히드 등이 사용된다. 한 실시양태에 따라, 고정제는 생성된 혼합물이 1% (w/v) 내지 10% (w/v), 또는 1% (w/v) 내지 10% (w/v), 또는 1.5% (w/v) 내지 9% (w/v), 또는 2% (w/v) 내지 8% (w/v), 또는 2.5% (w/v) 내지 7% (w/v), 또는 3% (w/v) 내지 6% (w/v), 또는 3.5% (w/v) 내지 5% (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 고정제, 예컨대 포름알데히드를 포함하도록 하는 비율로, 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플과 혼합된다. 바람직한 실시양태에 따라, 단계 (a)는 50 내지 150 ㎕, 바람직하게는 약 100 ㎕의 전혈 샘플을 약 30 ㎕ 내지 90 ㎕, 바람직하게는 약 60 ㎕의 10% 포름알데히드 용액과 접촉시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에 따라, 단리된 생물학적 샘플을 처리하는 방법은, 생물학적 샘플에 함유되어 있는 고정된 백혈구를 투과화시키고, 고정된 백혈구에 포함되어 있는 세포내 에피토프, 바람직하게는 포스포-에피토프를 비차폐화시켜 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 세포를 제조하기 위하여 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계를 포함한다.
본원 내에서 사용되는 바, "단계 X에 후속되는 단계 Y"라는 표현은 단계 Y가 단계 X 직후, 또는 단계 X 이후의 하나 이상의 다른 단계 후인, 시간 순서대로 단계 X 이후에 수행된다는 것을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추가로 활성화 단계 (x)를 포함하며, 여기서 활성화 단계 (x)는 활성인자 시약을 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 활성화 시약은 생물학적 샘플에 포함되어 있는 백혈구 내의 하나 이상의 신호 전달 경로를 유발/활성화시키도록 적합화된다. 예를 들어, 제한 없이, 적합한 활성인자 시약은 리포폴리사카라이드 (LPS), CD40L, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA), 형질전환 성장 인자 (TGF), 톨(Toll) 유사 수용체 4 (TLR4) 및 종양 괴사 인자 (TNF-알파)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추가로 단계 (b) 이전에 또는 그와 동시에 수행되는 세포 표면 표지화 단계 (y)를 포함하며, 여기서 세포 표면 표지화 단계 (y)는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제를 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 적합한 세포외 에피토프는 CD-3, CD-4, CD-8, CD-14, CD-15, CD-19 및 CD-45로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게, 단계 (y)는 세포외 에피토프에 특이적인 다중 검출가능하게 표지화된 결합제를 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에 따라, 전혈 샘플은 단계 (a)에 따라 고정화 시약, 바람직하게는 10% 포름알데히드 용액과 조합되고, 여기서 고정화 시약의 부피는 전혈 샘플 부피의 약 40% 내지 80%, 바람직하게는 약 60%이다. 임의로 단계 (x)에 따른 활성인자 시약 및 임의로 단계 (y)에 따른 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제가 생물학적 샘플에 첨가되며, 여기서 첨가되는 활성인자 시약의 첨가되는 부피는 전혈 샘플 부피의 약 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 약 1%이고, 각 검출가능하게 표지화된 결합제의 첨가되는 부피는 전혈 샘플 부피의 약 5% 내지 40%, 바람직하게는 약 20%이다.
세포 처리 조성물에 포함된 혈청 알부민이 세포 내로 유입될 수 있도록 허용하기 위해 약 0.3% (w/v)-2% (w/v)의 음이온성 표면 활성제가 본 발명의 세포 처리 조성물에 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, 단계 (b)에서 생물학적 샘플을 0.7% (w/v) 내지 1.5% (w/v), 바람직하게는 1% (w/v) 내지 1.1% (w/v)의 누적 농도의 SDS 또는 SDBS, 또는 SDS 및 SDBS의 조합물을 포함하는 세포 처리 조성물과 접촉시킨다. 산성 혈청 알부민에 의한 보호는 적혈구가 아닌 백혈구에 제공되며, 그러므로 적혈구는 세포 처리 조성물에 의해 용해된다.
한 실시양태에 따라, 투과화 단계 (b) 또한 세포내 에피토프, 바람직하게는 포스포-에피토프를 노출시키고, 각각의 특이적인 결합제, 예컨대 모노클로날 항체에 의한 후속된 검출을 위해 상기 에피토프를 접근가능하게 만드는 데 ("비차폐화시키는 데") 효과적이다. 잠재능이 있는 관심 포스포-에피토프의 예로는 일반적으로 노출시키기 어려운 것으로 알려져 있는 p-Stat5 에피토프가 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단계 (b)는 세포 내에서 인산화된 상태 및 탈인산화된 상태로 존재할 수 있는 하나 이상의 세포내 에피토프를 비차폐화시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 다중 세포내 에피토프가 본 발명의 단계 (b)에서 비차폐화된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 방법은 관심 세포내 항원을 비차폐화시키기 위해 알콜 단계를 필요로 하지 않는다. 상기에서 더욱 상세하게 기술된 본 발명에 따른 세포 처리 조성물은 알콜을 자극성이 더 작은 다른 작용제로 대체할 수 있게 허용하며, 그러므로 알콜 사용과 상용성이 아닌, 예컨대 세포 표면 항원 CD14와 같이 감수성인 세포 구조를 보존함과 동시에, 세포내 에피토프의 철저한 비차폐화를 촉진시킨다.
한 실시양태에 따라, 본 발명의 방법은 후속되는 활성화 상태의 활성화가능한 세포내 분자를 검출하기 위해 상기 활성화가능한 세포내 분자, 예컨대 포스포-단백질의 비차폐화된 세포내 에피토프, 바람직하게는 에피토프를 가진 고정화 및 투과화된 백혈구를 제조하기 위하여 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플을 처리하도록 적합화된다. 본 실시양태에 따라, 검출가능하게 표지화된 활성화 상태 특이적 결합제는 각 세포내 표적에 결합하도록 허용되고, 이어서 바람직하게는 유동 세포측정법을 통해 검출된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 고정화 단계 (a) 이후, 및 투과화 단계 (b) 이전에 고정된 세포의 세척/원심분리 단계를 필요로 하지 않는다. 사용되는 고정제는 세포 처리 조성물에 의해 중화되고, 후속되는 방법 단계를 어떤 문제도 일으키지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 생물학적 샘플을 처리하는 방법은 오직 단일의 원심분리/세척 단계만을, 즉 투과화 단계 (b) 직후에만 상기 단계를 포함한다. 세포외 및 세포내 표적 구조, 바람직하게는 인산화된 단백질의 유동 세포측정 분석을 위해 백혈구를 제조하는 종래 방법에서는 요구되었던 임의의 다른 원심분리/세척 단계는 본 발명의 본 실시양태에 따르면 더 이상 요구되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가로
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계, 및
(c) 상기 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (b)에 후속되는 표지화 단계
를 포함하는, 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위하여 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
투과화 단계 (b) 이후, 즉 생물학적 샘플에 포함된 고정된 세포의 투과화 이후, 1종 이상의 검출가능한 결합제, 바람직하게는 형광 표지화된 항체를 상기 생물학적 샘플과 접촉시킨다.
바람직한 실시양태에서, 표지화 단계 (c)에서 세포 표면 항원에 대한 1종 이상의 검출가능한 결합제 및 세포내 항원에 대한 1종 이상의 검출가능한 결합제가 사용된다. 검출가능한 결합제는 2종 이상의 결합제의 혼합물 형태로 함께 또는 별개로 첨가될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 추가로 이전 단계의 잔류 시약 성분 및 세포 파쇄물로부터 고정화 및 투과화된 백혈구를 분리시키기 위해, 단계 (c) 이전에 원심분리 단계를 포함한다. 상기 원심분리 단계는 특히 전혈 샘플이 생물학적 샘플로서 사용되었을 때에 유익하다. 상청액 제거 후 세포 펠릿을 항체 반응이 일어나는 적합한 인큐베이션 시약에 용해시킨다.
추가의 실시양태에서, 결합제(들)를 단계 (b) 이후에 적합한 인큐베이션 시약과 함께, 또는 그와 별개로 생물학적 샘플에 첨가한다. 바람직하게, 사용되는 검출가능한 결합제(들)를 상기 인큐베이션 시약을 첨가할 때 동시에 또는 그 이후에 생물학적 샘플에 첨가한다.
본 발명은 또한 중성 pH 범위의 pKa를 갖는 완충 물질 (예컨대, HEPES 또는 MES, ADA, PIPES, ACES, 콜아민 클로라이드, BES, TES, 아세트아미도글리신, 트리신, 글리신아미드, 비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 또 다른 '우수 완충제(Good Buffer)')을 1 내지 50 mM, 바람직하게는 10 mM의 농도 범위로, 소 또는 다른 포유동물 혈청 알부민을 0.2 내지 20% (w/v), 바람직하게는 4% (w/v) 농도 범위로, 소듐 퍼클로레이트 또는 소듐 티오시아네이트를 50 내지 250 mM, 바람직하게는 100 내지 160 mM, 가장 바람직하게는 약 120 mM의 농도 범위로, 임의로 염화칼슘을 5 mM 이하, 바람직하게는 1 mM의 농도로, 및 플로클린(Proclin)® 300 또는 유사 보존제를 0.01 내지 0.2% (v/v), 바람직하게는 0.05% (v/v)의 농도 범위로 포함하는 인큐베이션 시약에 관한 것이다. 본 발명의 인큐베이션 시약의 pH는 바람직하게 수산화나트륨을 사용하여 6 내지 9, 또는 6.3 내지 8.7, 또는 6.5 내지 8.5, 또는 6.7 내지 8.3, 또는 6.9 내지 8.1, 또는 7.1 내지 7.9, 또는 7.3 내지 7.7, 또는 약 7.5의 값으로 조정된다. 본 발명의 따른 인큐베이션 시약의 적합한 조성에 관한 예는 실시예 1에서 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가로
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(a1) 15℃ 내지 30℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 5 내지 15분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (a)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계, 및
(c) 임의로, 상기 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (b)에 후속되는 표지화 단계
를 포함하는, 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위하여 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
인큐베이션 단계 (a1) 동안 단계 (a)에서 수득된 것과 같은 생물학적 샘플을 약 5 내지 약 15분 동안 휴지시켜, 바람직하게는 세포의 완전한 고정화가 이루어질 수 있도록 할 수 있다. 인큐베이션 시간이 짧을수록 고정화 반응은 불완전할 수 있고, 인큐베이션 시간이 15분 초과로 연장되면, 고정화가 과다하게 일어날 수 있으며, 따라서 세포내 에피토프의 비차폐화는 더욱 큰 도전 과제가 된다. 약 8 내지 약 12분의 인큐베이션 기간에 대해 최상의 결과를 얻게 될 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (a1)은 섭씨 약 15 내지 약 30도 범위, 바람직하게는 섭씨 약 20 내지 약 25도 범위의 온도에서 8 내지 12분 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 사용되는 인큐베이션 온도가 더 높을 때에는 필요한 인큐베이션 시간이 어느 정도 단축될 것이며, 그 반대의 경우도 그렇다는 것을 이해하여야 한다.
세포 손상을 막기 위해서는 인큐베이션 단계 (a1) 동안 철저하게 혼합시키는 것을 피하여야 한다. 대신 처리되는 생물학적 샘플을 함유하는 시험관을, 예컨대 수동으로 또는 간이 롤러 로커상에서 온화하게 혼합하거나 피봇팅시키는 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가로
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(a1) 임의로, 15℃ 내지 30℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 5 내지 15분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (a)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계;
(b1) 20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 2 내지 10분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (b)에 후속되는 인큐베이션 단계; 및
(c) 임의로, 상기 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (b) 또는 (b1)에 후속되는 표지화 단계
를 포함하는, 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위하여 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
인큐베이션 단계 (b1)은 확실하게 고정된 백혈구에 대해 가장 일관되고, 철저한 투과한 반응이 이루어질 수 있도록 하여야 한다. 상기 단계의 온도는 20 내지 50℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃, 가장 바람직하게는 약 37℃이어야 한다. 상기 온도에서, 인큐베이션 시간은 2 내지 10분, 바람직하게는 3 내지 7분, 가장 바람직하게는 약 5분인 것이 적합하다. 인큐베이션 시간이 더 짧을수록, 뿐만 아니라 20℃ 미만의 인큐베이션 온도를 사용하면 투과화 효율은 감소될 수 있고, 투과화 반응 동안 너무 낮은 온도는 세제와 표적 에피토프 사이의 소수성 상호작용을 감소시킬 것이다. 그러므로, 특히 강력한 소수성 상호작용을 필요로 하는 특정 에피토프, 예컨대 p-Stat5의 경우, 약 37℃의 온도가 권고된다.
다른 한편으로는, 50℃ 초과의 인큐베이션 온도 및 10분 초과의 연장된 인큐베이션이 세포 및 혈청 단백질의 변성 및 침전을 일으킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (b1)에서 37℃의 인큐베이션 온도가 약 5분 동안 유지된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가로
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(a1) 임의로, 15℃ 내지 30℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 5 내지 15분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (a)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계;
(b1) 임의로, 20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 2 내지 10분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (b)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b2) 단계 (b) 또는 (b1)에 후속되는 세척 단계; 및
(c) 임의로, 상기 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (b1)에 후속되는 표지화 단계
를 포함하는, 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위하여 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
세척 단계 (b2)는 후속되는 표지화 단계 (c)를 방해할 수 있는, 단계 (b) 또는 (b1)의 생성물에 존재하는 시약 성분으로부터 고정화 및 투과화된 세포를 정제하도록 적합화된다. 그러므로, 본 발명의 한 실시양태에서, 세척 단계 (b2)는 단계 (b) 또는 (b1)에 후속하여, 단계 (c) 이전에 수행된다.
"세척" 단계라는 용어는 "정제" 단계라는 의미에서 해석되어야 하고, 공지된 세포 정제 기법, 예컨대 투석, 원심분리 또는 다른 적합한 방법을 포함하여야 한다. 바람직하게, 세척 단계 (b2)는 단계 (b) 또는 (b1)에서 수득된 세포 반응 혼합물을, 세포를 펠릿화하는데 충분한 원심분리력, 바람직하게는 약 300 g에 약 5분 동안 가함으로써 수행된다. 이어서, 상청액을 폐기하고, 펠릿을 인큐베이션 시약에 용해시킨다. 인큐베이션 시약에 함유되어 있는 혈청 알부민은 음이온성 표면 활성제, 예컨대 SDS, 및 고정제, 예컨대 포름알데히드 (둘 모두가 면역 반응을 방해할 수 있음)의 잠재적으로 그대로 남아있는 잔류물을 중화시키는 데 효과적이다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, 인큐베이션 시약은 소듐 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트 또는 이들의 혼합물을 생리학적 농도로 함유한다. 상기 농도의 소듐 퍼클로레이트 및/또는 티오시아네이트를 사용하면 기본적으로 이미 비차폐화된 에피토프, 특히 포스포-에피토프가 인큐베이션 반응 동안 차폐화된 상태로 복귀되는 것을 막을 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가로
(a) 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(a1) 임의로, 15℃ 내지 30℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 5 내지 15분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (a)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b) 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (a)에 후속되는 투과화 단계;
(b1) 임의로, 20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 2 내지 10분 동안 인큐베이션시키는 것인, 단계 (b)에 후속되는 인큐베이션 단계;
(b2) 단계 (b) 또는 (b1)에 후속되는 세척 단계; 및
(c) 상기 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (b1)에 후속되는 표지화 단계;
(c1) 상기 생물학적 샘플을 세척 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단계 (c)에 후속되는 희석 단계
를 포함하는, 후속되는 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위하여 적어도 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 임의적인 인큐베이션 단계는 표지화 단계 (c) 이후에 수행될 수 있다. 임의적인 인큐베이션 단계는 실온에서 5 내지 25분, 바람직하게는 10 내지 20분, 가장 바람직하게는 약 15분 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 상기 임의적인 인큐베이션 단계는 상기 세포내 및/또는 세포외 에피토프의 철저한 표지화를 촉진시킨다.
이어서, 단계 (c)로부터 생성된 반응 혼합물은 1:5 내지 1:15의 비율로, 바람직하게는 1:10의 비율로 단계 (c1)에 따라 세척 조성물에 용해된다.
본 발명은 추가로 포스페이트 완충 염수 (PBS, 칼륨 무함유) 또는 또 다른 생리학적 세척 매질, 포름알데히드 용액 (37%)을 0.1 내지 2% (v/v), 바람직하게는 0.5% (v/v)의 농도 범위로, 플루로닉(Pluronic) F68을 0.01 내지 1% (v/v), 바람직하게는 0.1% (v/v)의 농도 범위로, 및 소듐 라우로일 사르코시네이트를 0.005% (v/v) 내지 0.5% (v/v), 바람직하게는 0.05% (v/v)의 농도 범위로 포함하는 세척 조성물에 관한 것이다. 세척 조성물의 pH는 수산화나트륨 또는 염산을 사용하여 7.0 내지 7.5, 바람직하게는 7.2로 조정된다. 세척 조성물 중에 포함되어 있는 포름알데히드는 샘플이 확실히 분석 이전에 충분히 보존되게 한다. 세포가 다른 세포에 및 사용되는 세포측정기 장치의 배관에 부착되지 못하도록 막기 위해 플루로닉 F68 및 라우로일 사르코시네이트를 세척 조성물에 첨가한다.
또 다른 실시양태에서, 과량의 항체를 제거하기 위해 생물학적 샘플을 먼저 원심분리한다. 이어서, 펠릿을 50 내지 200 ㎕, 바람직하게는 약 100 ㎕의 세척 조성물에 용해시킨다. 이어서, 샘플을 세포측정기 상에서 분석할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 상기 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제, 바람직하게는 형광성 표지로 표지화된 결합제는 인산화된 단백질, 예컨대 p-Stat-5에 특이적이다. 상기 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제를 검출하는 것은 유동 세포측정법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 백혈구 하위집단 및 세포내 인산화된 단백질에 특이적인 세포외 에피토프는 본 발명에 따른 방법에 의해 검출된다. 바람직하게, 처리된 샘플을 유동 세포측정 장치 상에서 분석하기 전, 완전한 세포 처리 절차 동안 단계 (c) 직전에 단 한번의 원심분리/세척 단계를 사용한다.
본 발명의 추가의 측면은
a) 본 발명에 따른 세포 처리 조성물,
b) 혈청 알부민 및 퍼클로레이트를 포함하는 인큐베이션 시약,
c) 세포내 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제, 및
d) 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 키트는 본 발명에 따른 세포 처리 조성물, 본 발명에 따른 인큐베이션 시약, 세포내 에피토프, 바람직하게는 포스포-에피토프에 특이적인 검출가능하게 표지화된 결합제, 및 백혈구를 확인하는데 적합한, 세포외 에피토프에 특이적인 검출가능하게 표지화된 결합제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 추가로 바람직하게 포름알데히드 또는 파라포름알데히드를 1% (w/v) 내지 37% (w/v), 또는 2% (w/v) 내지 33% (w/v), 또는 3% (w/v) 내지 37% (w/v), 또는 4% (w/v) 내지 30% (w/v), 또는 5% (w/v) 내지 25% (w/v), 또는 6% (w/v) 내지 20% (w/v), 또는 7% (w/v) 내지 15% (w/v), 또는 8% (w/v) 내지 12% (w/v), 또는 9% (w/v) 내지 11% (w/v) 또는 약 10% (w/v)의 농도로 포함하는 고정화 시약을 포함한다.
한 실시양태에 따라, 검출가능하게 표지화된 결합제 중 적어도 1종은 생물학적 세포 내에 인산화된 형태 및 탈인산화된 형태로 존재할 수 있는, 활성화가능한 에피토프, 바람직하게는 포스포-에피토프에 대한 형광 표지화된 항체이며, 여기서 상기 형광 표지화된 항체 또는 상기 포스포-에피토프는 인산화된 형태 또는 탈인산화된 형태를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 인큐베이션 시약은 세포내 에피토프 및 세포외 에피토프 둘 모두에 대한 손상을 막기 위해, 및 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제가 그의 상응하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있도록 허용하기 위해 적합화된다. 예를 들어, 적합한 인큐베이션 시약은 생리학적 농도의 HEPES 완충 퍼클로레이트 중 4%의 혈청 알부민을 포함한다. 혈청 알부민, 바람직하게는 BSA는 항체 반응을 방해할 수 있는 SDS 및 포름알데히드의 잔류물을 흡착시키는 데 유용하다. 노출된 항원이 폐쇄되는 것을 막기 위해, 생리학적 조건을 제공하는 염은 적합한 카오트로픽 염, 예를 들어 소듐 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트이다.
퍼클로레이트가 인큐베이션 시약 중에서 생리학적 농도로 사용된 경우, 신호 대 잡음 비가 더 높다는 점에서 포스포-단백질의 표지화 특성은 더 우수한 것으로 관찰되었다. 이러한 방식으로, 퍼클로레이트 염의 카오트로픽 효과는, 세포 표면 단백질의 표지화를 방해하지 않으면서, 용해 시약으로부터 인큐베이션 시약으로 확장되었다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 키트에 포함되고, 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플을 고정화시키는, 본 발명의 방법에서 사용되는 고정화 시약은 수용액 중 150 mM 염화나트륨 및 10% (w/v) 포름알데히드 (메탄올 무함유)를 포함한다. 유사한 양의 포름알데히드 또는 유사한 알데히드를 포함하는 고정화제를 포함하는, 복수 개의 상이한, 예컨대 상업적으로 이용가능한 고정화 완충제는 본 발명의 키트에 포함되도록 동등하게 적합화되고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 유사하게, 본 발명의 세포 처리 조성물의 상기 언급된 용도는 고정화 시약의 상기의 구체적인 실시양태로 제한되지 않는다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 키트에 포함되고, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포 처리 조성물은 수용액 중 34.7 mM 소듐 도데실 술페이트, 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 1% (w/v), 임의로 2 mM 인산이수소나트륨, 임의로 150 mM 소듐 퍼클로레이트 및 임의로 0.05% (v/v) 플로클린® 300을 포함한다. 세포 처리 조성물의 최종 pH는 NaOH를 첨가함으로써 4.2로 조정된다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 키트에 포함되고, 본 발명의 방법에서 사용되는 인큐베이션 시약은 수용액 중 10 mM HEPES, 4% (w/v) 소 혈청 알부민, 120 mM 소듐 퍼클로레이트, 임의로 1 mM 염화칼슘 및 임의로 0.05% (v/v) 플로클린® 300을 포함한다. pH는 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정된다. 유사한 양의 BSA 및 카오트로픽 염, 예컨대 소듐 퍼클로레이트를 포함하는, 복수 개의 상이한, 예컨대 상업적으로 이용가능한 인큐베이션 시약은 본 발명의 키트에 포함되도록 동등하게 적합화되고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 유사하게, 본 발명의 세포 처리 조성물의 상기 언급된 용도는 인큐베이션 시약의 상기의 구체적인 실시양태로 제한되지 않는다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 키트에 포함되고, 본 발명의 방법에서 사용되는 세척 조성물은 포스페이트 완충 염수 (칼륨 무함유) 수용액 중 0.5% (w/v)의 37% 포름알데히드 용액, 임의로 0.1% (v/v) 플루로닉 F68 및 임의로 0.05% (w/v) 소듐 라우로일 사르코시네이트를 포함한다. 유사한 양의 포름알데히드 및 세제를 포함하는, 복수 개의 상이한, 예컨대 상업적으로 이용가능한 세척 조성물은 본 발명의 키트에 포함되도록 동등하게 적합화되고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 유사하게, 본 발명의 세포 처리 조성물의 상기 언급된 용도는 세척 조성물의 상기의 구체적인 실시양태로 제한되지 않는다. 본원은 하나 이상의 추가의 측면 및/또는 실시양태를 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 상기 측면 및/또는 실시양태는 상기 기술된 특징들 중 하나 이상을 별개로 또는 서로 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
값이 범위로 제공될 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 그 사이에 있는 각각의 값 (문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 하한 단위의 1/10까지), 및 언급된 임의의 다른 값 또는 상기 언급된 범위 사이에 있는 값이 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되며, 언급된 범위에서 임의의 한계가 구체적으로 배제된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 경우, 상기 포함된 한계 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 배제시킨 범위 또한 본 발명에 포함된다.
도 1: 전혈의 CD14-FITC 및 Stat5-PE 염색의 유동 세포측정 분석 및 혈액의 GM-CSF 활성화 효과.
도 1은 전혈 샘플을 본 발명에 따른 방법에 처리하고 (실시예 2 참조), 이어서 FC500 세포측정기 (베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아) 상에서 분석함으로써 수득된 4개의 유동 세포측정 분석 플롯을 보여주는 것이다. 플롯 A는 비-활성화된 전혈의 분석을 보여주는 것이다. 플롯 B는 CD14-FITC 염색된 단핵구의 525 nm 형광 분석을 보여주는 것이다. 플롯 C에는 비-활성화된 혈액의 p-Stat5-PE 염색이 제시되어 있다. 플롯 D에서는 전혈 샘플을 고정화시키기 전에 GM-CSF에 의해 활성화시킨다. 플롯 C와 비교하였을 때, 플롯 D에서 알 수 있는 바와 같이, 단핵구 및 호중구는 GM-CSF 활성화 이후에 p-Stat5를 발현한다. I = 과립구; II = 림프구; III = CD14+ 단핵구; IV = p-Stat-5+ 단핵구.
도 1은 전혈 샘플을 본 발명에 따른 방법에 처리하고 (실시예 2 참조), 이어서 FC500 세포측정기 (베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아) 상에서 분석함으로써 수득된 4개의 유동 세포측정 분석 플롯을 보여주는 것이다. 플롯 A는 비-활성화된 전혈의 분석을 보여주는 것이다. 플롯 B는 CD14-FITC 염색된 단핵구의 525 nm 형광 분석을 보여주는 것이다. 플롯 C에는 비-활성화된 혈액의 p-Stat5-PE 염색이 제시되어 있다. 플롯 D에서는 전혈 샘플을 고정화시키기 전에 GM-CSF에 의해 활성화시킨다. 플롯 C와 비교하였을 때, 플롯 D에서 알 수 있는 바와 같이, 단핵구 및 호중구는 GM-CSF 활성화 이후에 p-Stat5를 발현한다. I = 과립구; II = 림프구; III = CD14+ 단핵구; IV = p-Stat-5+ 단핵구.
실시예
실시예
1:
본 발명에 따른 조성물의 제조에 관한 예
하기 조성물은 본 발명의 범주 내에 포함되는 적합한 시약의 일례를 제공한다.
백혈구를 포함하는 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플의 고정화를 위한 고정화 시약 (시약 A)은 수용액 중
염화나트륨 150 mM
포름알데히드 (메탄올 무함유) 10% (w/v)를 포함한다.
시약 A는 중성 pH이고, 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 여과하였다.
백혈구를 포함하는 생물학적 샘플, 바람직하게는 전혈 샘플의 처리를 위한 세포 처리 조성물 (시약 B)은 수용액 중
소듐 도데실 술페이트
34.7 mM
소 혈청 알부민 (BSA)
1% (w/v)
인산이수소나트륨
2 mM
소듐 퍼클로레이트
150 mM
플로클린® 300
0.05% (v/v)를 포함한다.
소듐 도데실 술페이트를 물에 용해시킴으로써 시약 B를 제조하였다. 소듐 퍼클로레이트를 제외한 모든 성분을 혼합하고, pH를 4.4로 조정하였다. 이어서, 소듐 퍼클로레이트를 첨가하고, 철저히 혼합함으로써 임의로 발생된 침전물을 용해시켰다. NaOH를 첨가함으로써 최종 pH를 4.2로 조정하였다. 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 조성물을 여과하였다. 플로클린® 300을 수펠코(Supelco), 시그마 알드리치(SIGMA Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다.
고정화 및 투과화된 세포의 인큐베이션를 위한 인큐베이션 시약 (시약 C)은 수용액 중
HEPES
10 mM
소 혈청 알부민
4% (w/v)
소듐 퍼클로레이트
120 mM
염화칼슘
1 mM
플로클린® 300
0.05% (v/v)를 포함한다.
수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 시약 C를 여과하였다. 플로클린® 300은 수펠코, 시그마 알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다.
시약 C에서의 인큐베이션 이후 세포의 세척 및 보존을 위한 세척 조성물 (시약 D)은 수용액 중
포스페이트 완충 염수 (칼륨 무함유)
포름알데히드 용액 (37%)
0.5% (w/v)
플루로닉 F68
0.1% (v/v)
소듐 라우로일 사르코시네이트
0.05% (w/v)를 포함한다.
0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 시약 D를 여과하였다.
실시예 2:
세포 표면 항원의 표지화
항응고제로서 0.7 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)으로 처리된 100 ㎕ 부피의 전혈에 65 ㎕의 고정화 시약 (실시예 1의 시약 A)을 첨가하였다. 혼합물을 볼텍싱시킨 후, 실온 (18-25℃)에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 10분 후, 1 ml의 세포 처리 조성물 (실시예 1의 시약 B)을 첨가하였다. 혼합물을 짧게 볼텍싱시키고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
항-응고된 혈액의 pH는 대략 7.2였다. 10분간 고정화한 후, 혈액의 pH는 아미노 기의 파괴에 기인하여 대략 6.1이었다. 세포 처리 조성물을 첨가하고, 5분간 인큐베이션시킨 후, 혼합물의 pH는 대략 5.6이었다.
이어서, 수득된 혼합물을 대략 300 g으로 원심분리시키고, 액체 상을 제거하였다. 펠릿을 100 ㎕의 인큐베이션 시약 (실시예 1의 시약 C)에 용해시키고, 볼텍싱시킴으로써 용해시켰다. 수득된 혼합물의 pH는 대략 7.0이었다.
인큐베이션 혼합물에 하기 접합된 모노클로날 항체 생성물을 하나의 시험으로서 제조사가 지시한 바와 같은 부피로 첨가하였다.
IgG1 FITC 이소형 대조군 (IM0639U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
IgG1 PE 이소형 대조군 (IM0670U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD14 FITC (IM0645U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD14 APC (IM2580U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD45 FITC (IM0782U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD45 KO (A96416, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD3 FITC (IM1281U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD19 PE (IM1285U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아)
CD34 PE (IM1871U, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아).
실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 샘플을 세척하고, 세척 조성물 (실시예 1의 시약 D)에 용해시키고, FC500 세포측정기 (베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아) 상에서 분석하였다. 본 실험 분석 결과는 도 1에 제시되어 있다. 본 데이터로부터, 본 발명에 따른 방법은 한편으로는 세포 표면 마커 CD14의 표지화를 방해하지 않으면서, 다른 한편으로는 본 발명에 따른 세포 처리 이전에 GM-CSF로 활성화시킨 (실험 2B 참조) 단핵구 및 (하기 표 1에서 일반적으로 과립구로 명시된) 호중구의 세포내 p-Stat5 에피토프로 접근할 수 있게 하였다는 것은 자명하다.
하기 표 1에는 실시예 2에 제공된 바와 같은 본 발명의 실시양태에 따라 세포 제제 처리된 림프구, 단핵구 및 과립구에 대한 일부 대표적인 세포 표면 항원의 신호 대 잡음 비 (S/N)가 제시되어 있다. S/N 비는 표지화된 하위집단의 평균 형광값을 이소형 대조군 항체로 처리된 동일한 하위집단의 평균 형광값으로 나눔으로써 계산하였다. CD34 항원의 경우, KG1 세포주 (ATCC: 미국 버지니아주 매너서스)의 세포를 처리하기 전에 혈액 샘플로 스파이킹하였다. 본 데이터는 사용된 세포 표면 마커 (CD3, CD14, CD19, CD34, CD45) 모두 상응하는 항체에 의해 쉽게 접근가능하였다는 것을 나타내며, 따라서 이는 세포 표면 항원이 본 발명에 따른 세포 처리 방법 과정에서 보존되고, 접근가능성이 그대로 유지된다는 것을 입증한다.
인산화된
세포내
항원의 표지화
(0.7 mM EDTA로 항응고 처리된) 분취량의 전혈을 하기 활성화제 중 하나의 존재하에 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다;
GM-SCF (rhGM-CSF, 10 ng/ml - R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스))
IL2 (rhIL2, 20 ng/ml - R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스)
PMA (포르볼 미리스테이트 아세테이트 PHA-L, 2 ㎍/ml - 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Corp.: 미국 미주리주 세인트루이스))
LPS (리포폴리사카라이드, 2 ㎍/ml - 시그마 케미칼 코포레이션: 미국 미주리주 세인트루이스)
인터페론 알파 (Rh 인터페론 알파, 20 ng/ml - PBL 바이오메디컬 래보러토리즈(PBL Biomedical Laboratories: 미국 뉴저지주 피스카타웨이))
IL6 (rhIL6, 200 ng/ml - R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스).
이어서, 활성화된 혈액을 실시예 2에 따라 프로세싱하였다. 인큐베이션 혼합물에 하기 접합된 모노클로날 항체 생성물을 하나의 시험으로서 제조사가 지시한 바와 같은 부피로 첨가하였다.
마우스 항-Stat5 (pY694)-PE (BD 바이오사이언시즈 파르민겐: 미국 캘리포니아주 산호세)
마우스 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (E10) 알렉사 플루오르® 647 (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스)
포스포-p38 MAPK (T180/Y182) 알렉사 플루오르® 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스)
포스포-Stat1 (Tyr701) (58D6) 알렉사 플루오르® 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스)
포스포-Stat3 (Tyr705) (3E2) 알렉사 플루오르® 488. (셀 시그널링 테크놀로지 인크.: 미국 매사추세츠주 댄버스)
포스포-Stat5 RPE (B23139, 베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아).
샘플을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 샘플을 세척하고, 세척 시약에 용해시키고, FC500 세포측정기 (베크만 쿨터: 미국 캘리포니아주 브레아) 상에서 분석하였다. 수득된 실험 데이터는 도 1의 플롯 C 및 D로 제공한다. 본 데이터는 본 발명의 방법에 따라 처리된 고정된 세포의 세포내 인산화된 에피토프가 상응하는 항체에 의해 쉽게 접근가능하다는 것을 시사한다.
하기 표 2에는 상이한 항-포스포-에피토프 항체로 표지화된 백혈구 하위집단의 신호/잡음 (S/N) 비가 제시되어 있다. S/N 비는 활성화된 혈액 분취물 중 하위집단의 평균 형광값을 동일 혈액의 비-활성화된 분취물 중 각 하위집단으로부터의 평균 형광값으로 나눔으로써 계산하였다.
3개의 주요 백혈구 집단: 림프구, 단핵구 및 호중구 (과립구의 하위유형)의 상이한 포스포-단백질의 표지화에 관하여 비-활성화된 혈액과 적절한 활성인자로 활성화시킨 이후의 혈액을 비교하였다.
실시예 3:
음이온성 표면 활성제 농도의 영향을 평가하기 위해, 단 SDS 농도를 달리하면서, 실시예 1에 개요된 바와 같이 다양한 세포 처리 조성물을 제조하였다. 하기 표 3은 세포 처리 조성물 중의 SDS 농도가 포스포-에피토프, 예컨대 p-Stat5의 비차폐화에 미치는 영향을 입증하는 관련된 실험 데이터를 포함한다. 본 설정 환경에서, 농도가 1% w/v (34.7 mM)인 세포 처리 용액을 사용하였을 때, p-Stat5는 최적으로 비차폐화되고, 염색되었다.
실시예
4:
상이한 음이온성 표면 활성제를 비교하기 위한 이유에서, 본 발명에 따른 2가지 상이한 세포 처리 조성물을 제조하였는데, 하나는 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함하고, 나머지 다른 하나는 소듐 도데실벤젠 술포네이트 (SDBS, 알드리치 기술 등급, 시그마 케미칼 코포레이션: 미국 미주리주 세인트루이스)를 포함하였으며, 여기서 상기 두 시약은 모두 34.7 mM로 세포 처리 조성물 중에 함유되어 있었다. SDS를 함유하는 세포 처리 조성물의 pH는 실시예 1에 명시되어 있는 바와 같았다. 침전 및 안정화를 이유로, SDBS를 함유하는 세포 처리 조성물의 pH는 5.95였고, 이는 전혈 샘플 첨가 후에 6.6으로 증가하였다. 다르게는, 샘플을 실시예 2A 및 2B에 제시된 바와 같이 프로세싱하고, 분석하였다.
하기 표 4에 제시된 바와 같이, 두 시약 모두 p-Stat5에 대해 유사한 발현 값을 제공하였다. 그러나, 세포 보호는 SDBS를 포함하는 시약에서 덜 효율적이었다. 이는 가능하게는 세포 보호를 수행하는 보다 높은 pH에 기인하는 것일 수 있다.
실시예 5:
본 실험은 세포 및 항원과 관련하여 산성 pH의 혈청 알부민의 보호 효과를 입증하여야 한다. 본 목적을 위해 수개의 세포 처리 조성물을 실시예 1에 개요된 바와 같이, 단 하기와 같이 변형시켜 제조하였다:
1. BSA를 생략하고, 하기 농도에서 실시예 1의 세포 처리 조성물과 유사한 완충 능력을 갖는 20 mM 산성 포스페이트로 대체된, 실시예 1의 세포 처리 조성물. 상기 시약의 pH는 2.5였다.
2. pH가 4.15인 실시예 1의 세포 처리 조성물.
3. 실시예 1의 세포 처리 조성물. 시약의 pH를 5.6으로 조정하였다.
4. 실시예 1의 세포 처리 조성물. 시약의 pH를 6.28로 조정하였다.
5. 실시예 1의 세포 처리 조성물. 시약의 pH를 7.4로 조정하였다.
샘플을 실시예 2에 개요된 바와 같이 프로세싱하되, 단 예외적으로 샘플을 고정화 이후에 PBS로 세척하였다.
고정된 혈액 세포를 첨가한 후, 고정된 혈액 및 상기 제공된 5가지 상이한 세포 처리 조성물의 혼합물의 pH를 각각 하기 값으로 조정하였다:
1. pH = 5.7
2. pH = 5.7
3. pH = 6.4
4. pH = 6.7
5. pH = 7.0
CD14 항원은 특히 변성 조건에 대해 감수성이고, 보호 파라미터로서 선택되어 왔다. 또한, 단핵구의 측방 산란 및 회수된 세포의 개수를 파라미터로서 명시하였다. 전혈을 실시예 2A 및 2B에 제시된 바와 같이 프로세싱하고, 분석하였다.
분석되는 혼합물의 pH가 5.7일 때, 혈청 알부민의 보호 효과는 가장 높은 것으로 관찰되었다. 하기 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 산성 효과는 혈청 알부민과 관련이 있을 수 있다. 혈청 알부민이 존재하지 않을 때, 산성 조건하에서는 어떤 보호 증가도 없었다. CD14의 신호/잡음 비를 실시예 2에 제시된 바와 같이 계산하였다.
산성 조건의 혈청 알부민은 또한 추가의 고정화 효과도 제공하는 것으로 보였다. 중성 조건에서의 혈액 용해 후 단핵구의 단핵구 측방 산란 값과 비교하였을 때, 산성 조건에서의 혈액 용해 후 단핵구의 측방 산란 값은 더 높은 경향을 보였다 (표 5 참조). 상기 더 높은 측방 산란은 혈청 알부민의 존재와는 상관이 없었다. 측방 산란은 세포의 불투명도 및 세포내 거대분자 응집량에 따라 증대된다. 거대분자 응집량이 세포의 고정화 강도의 척도가 되는 바, 이에 산성 조건하에서 혈청 알부민을 사용하는 것이 더욱 우수한 고정화 효과를 제공할 수 있다는 결론을 도출해 낼 수 있었다.
실시예
6:
다른 수용성 단백질에 대하여 혈청 알부민의 보호 효과를 비교하기 위해, BSA 대신 소 우유 카세인 (시그마)을 포함하는 대체 세포 처리 조성물을 제조하였다. 상기 세포 처리 조성물의 다른 성분들은 실시예 1의 시약 B와 동일하였다.
전혈을 실시예 2A에 제공된 바와 같이 프로세싱하고, 분석하였다.
하기 표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 표면 항원 CD14 보호와 관련하여 혈청 알부민이 카세인보다 우수하였다. CD14의 신호/잡음 비를 실시예 2에 제시된 바와 같이 계산하였다. 단핵구 및 전체 백혈구에 대한 측방 산란 값 둘 모두 BSA 또는 카세인에 의한 세포 단백질의 고정화의 함수로서 제공하였다. 또한, 본 결과는 여기서 BSA가 카세인보다 더욱 효과적이라는 것을 시사한다. 또한, 세포 처리 조성물에 BSA 대신 카세인을 사용하였을 때, 수득된 단핵구 및 전체 백혈구의 개수는 유의적으로 감소되었는데, 이는 혈청 알부민의 보호 효과가 카세인보다 우수하다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 7:
본 발명의 일부 실시양태에서, 카오트로픽 염, 예컨대 퍼술페이트 또는 티오시아네이트를 세포 처리 조성물에 포함시킬 수 있다. 예컨대, 소듐 퍼술페이트의 효과를 설명하기 위해, 하기 세포 처리 조성물을 제조하였다:
(1) 소듐 퍼술페이트를 생략하고, 150 mM 염화나트륨으로 대체된, 실시예 1의 세포 처리 조성물.
(2) 소듐 퍼술페이트를 생략하고, 150 mM 염화나트륨으로 대체된, 실시예 1의 세포 처리 조성물. 상기 시약 중 SDS 농도는 1% 대신 1.5%로 변형시켰다.
(3) 실시예 1의 세포 처리 조성물.
전혈을 실시예 2A 및 B에 제시된 바와 같이 프로세싱하고, 분석하였다. 신호 대 잡음 비 (s/n)를 실시예 2A 및 B에 제시된 바와 같이 계산하였다.
세포 처리 조성물 (1)에서 소듐 퍼술페이트를 염화나트륨으로 교체하였을 때, 적혈구는 불완전하게 용해되었다. 이러한 효과는 세포 처리 조성물의 SDS 농도를 1.5% SDS로 증가시킴으로써 (용액 (2)) 보상될 수 있었으며, (1)을 사용하였을 때 얻은 것과 유사한 용해 효과를 얻을 수 있었다. 또한, p-Stat5 발현은 유사하였다. 그러나, 보다 고농도의 SDS 대신 카오트로픽 염 퍼술페이트를 사용하였을 때의 장점은 CD14 항원이 더욱 잘 보호된다는 것으로 자명해졌다 (표 4 참조).
실시예 8:
하기는 본 발명에 따른 시스템 및 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 용액을 제시한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 전혈을 고정화시키기 위한 조성물은 중성 pH의 염화나트륨 (150 mM) 및 포름알데히드 메탄올 무함유 (10% (w/v))의 수용액일 수 있다. 조성물을 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 여과하였다.
추가로, 본 발명에 따른 고정된 전혈을 용해 및 변성시키기 위한 조성물은 소듐 도데실 술페이트 (34.7 mM), 메탄올 (1% v/v), 소 혈청 알부민 (1% w/v), 인산이수소나트륨 (2 mM) 및 소듐 퍼클로레이트 (150 mM)의 수용액일 수 있다. pH는 염산을 사용하여 4.2로 조정하였다.
본 발명에 따른 고정된 전혈을 용해 및 변성시키기 위한 조성물은 소듐 퍼클로레이트를 제외한 성분들을 혼합함으로써 제조하였다. 부피는 최종 부피의 85%가 되도록 하였다. 이어서, pH를 4.4로 조정하였다. 1 M 소듐 퍼클로레이트 용액을 최종 부피에 첨가하였다. 이후, 최종 pH가 4.2가 되도록 하기 위해 조성물을 철저히 혼합하여 침전물을 용해시켰다. 최종적으로, 조성물을 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 여과하였다.
추가로, 항체와 함께, 본 발명에 따른 용해된 및 투과화된 세포를 인큐베이션시키기 위한 조성물은 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산 (HEPES) (10 mM), 소 혈청 알부민 (2% (w/v)), 염화나트륨 (150 mM) 및 플로클린® 300 (0.05%)의 수용액일 수 있다. 혼합한 후, 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. 최종적으로, 조성물을 0.22 ㎛ 공극 크기의 나일론 필터를 통해 여과하였다. 플로클린® 300을 수펠코, 시그마 케미칼 코포레이션 (미국 미주리주 세인트루이스)으로부터 입수하였다.
본 발명에 따른 항체 염색된 세포의 세척 및 보존을 위한 조성물은 포스페이트 완충 염수 (칼륨 무함유) 및 포름알데히드 메탄올 무함유 (0.5% (w/v))의 수용액일 수 있다.
Claims (31)
- (a) 0.3% (w/v) 내지 2% (w/v)의 농도로 조성물 중에 포함되어 있는 1종 이상의 음이온성 표면 활성제로서, 여기서 상기 음이온성 표면 활성제의 염은 하기 화학식 1로 표시되는 것인 음이온성 표면 활성제:
<화학식 1>
(상기 식에서,
Y는 R--O 또는 R이고, R은 8 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알킬렌, 아릴, 알킬렌-알킬, 아릴-알킬 또는 아릴-알킬렌 기를 나타내고, X는 1가 양이온을 나타냄), 및
(b) 0.2% (w/v) 내지 20% (w/v)의 농도로 조성물 중에 포함되어 있는 혈청 알부민
의 수용액을 포함하며, pH가 약 2 내지 약 6인, 고정된 혈액 세포의 투과화를 위한 세포 처리 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 음이온성 표면 활성제가 0.6% (w/v) 내지 1.5% (w/v)의 농도로 상기 조성물 중에 포함되어 있는 것인 세포 처리 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 음이온성 표면 활성제가 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 또는 소듐 도데실벤젠술포네이트 (SDBS)인 세포 처리 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 알부민이 포유동물 혈청 알부민인 세포 처리 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 혈청 알부민이 소 혈청 알부민인 세포 처리 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 3 내지 5.5인 세포 처리 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 카오트로픽 염을 추가로 포함하는 세포 처리 조성물.
- 제7항에 있어서, 20 내지 250 mM 농도의 카오트로픽 염을 포함하는 세포 처리 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 퍼클로레이트, 티오시아네이트 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 세포 처리 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포 처리 조성물 및 고정된 백혈구를 포함하는 생물학적 샘플을 포함하며, 5.5 내지 7의 pH 값을 갖는 조합물.
- 제10항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 전혈, 골수, 또는 백혈구의 단리된 하위집단을 포함하는 것인 조합물.
- 제10항에 있어서, 상기 백혈구가 림프구 또는 단핵구를 포함하는 것인 조합물.
- 고정된 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플의 처리를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포 처리 조성물의 용도.
- 제13항에 있어서, 고정된 백혈구를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포 처리 조성물에 의해 투과화시키고, 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제에 의해 표지화시키는 것인, 세포 처리 조성물의 용도.
- 제13항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 전혈, 골수, 또는 백혈구의 단리된 하위집단을 포함하는 것인, 세포 처리 조성물의 용도.
- 제13항에 있어서, 상기 백혈구가 림프구 또는 단핵구를 포함하는 것인, 세포 처리 조성물의 용도.
- (a) 적어도 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플을 고정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정화 단계로서, 여기서 상기 고정제는 단백질, 지단백질 및 핵산 분자의 적어도 부분적인 가교를 달성하는데 충분한 양으로 첨가되는 것인, 고정화 단계;
(b) 상기 고정된 생물학적 샘플을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포 처리 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 투과화 단계
를 포함하는, 적어도 백혈구를 포함하는 단리된 생물학적 샘플을 처리하는 방법. - 제17항에 있어서,
(c) 상기 투과화된 생물학적 샘플을 세포내 및/또는 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는 표지화 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 생물학적 샘플을 상기 고정제와 함께 15℃ 내지 30℃의 온도에서 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 5 내지 15분 동안 인큐베이션시키는 것인 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정된 생물학적 샘플을 상기 세포 처리 조성물과 함께 20℃ 내지 50℃의 온도에서 인큐베이션시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 샘플을 바람직하게는 2 내지 10분 동안 인큐베이션시키는 것인 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 투과화된 생물학적 샘플을 세척하는 것을 포함하는 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 처리 조성물이 상기 백혈구를 투과화시키고, 상기 백혈구의 세포내 에피토프를 비차폐화시키는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 세포내 에피토프가 포스포-에피토프를 포함하는 것인 방법.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 전혈, 골수, 또는 백혈구의 단리된 하위집단을 포함하는 것인 방법.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백혈구가 림프구 또는 단핵구를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세포 처리 조성물; 및
혈청 알부민 및 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트를 포함하는 세포 인큐베이션 시약
을 포함하는 키트. - 제26항에 있어서, 상기 세포 인큐베이션 시약이
중성 pH 범위의 pKa를 갖는 완충제로서, 농도가 1 내지 50 mM인 완충제;
농도가 0.2 내지 20% (w/v)인 혈청 알부민;
농도가 50 내지 250 mM인 퍼클로레이트 또는 티오시아네이트; 및
농도가 0.01 내지 0.2% (v/v)인 보존제
를 포함하며, 6 내지 9의 pH를 갖는 것인 키트. - 제26항 또는 제27항에 있어서, 포름알데히드를 포함하는 고정제 시약을 추가로 포함하는 키트.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 결합제를 추가로 포함하는 키트.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 에피토프에 특이적인 1종 이상의 검출가능하게 표지화된 작용제를 추가로 포함하는 키트.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 7 내지 7.5의 pH를 갖는 세척 조성물을 추가로 포함하며, 상기 세척 조성물은
포스페이트 완충 염수;
농도가 0.1 내지 2% (v/v)인 포름알데히드;
농도가 0.01 내지 1% (v/v)인 플루로닉(Pluronic) F68; 및
농도가 0.005 내지 0.05% (v/v)인 라우로일 사르코시네이트를 포함하는 것인 키트.
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